專利名稱：納米顆粒的制備方法及用該方法制備的納米顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米顆粒的制備方法以及利用該方法制備的納米顆粒。
背景技術(shù)：
生物體作為復(fù)雜的有機(jī)體，其天然防御系統(tǒng)在維持機(jī)體的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定過(guò)程中具有極其重要的意義。網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等都發(fā)揮著重要作用。然而在保護(hù)機(jī)體的同時(shí)，一些治療疾病的藥物分子則可能因?yàn)闄C(jī)體的這些保護(hù)機(jī)制而在到達(dá)靶器官前即被清除或降解，難以實(shí)現(xiàn)靶向器官或在靶標(biāo)部位實(shí)現(xiàn)有效蓄積。因此，在疾病的治療過(guò)程中，藥物在機(jī)體內(nèi)部的穩(wěn)定性、循環(huán)時(shí)間或半衰期、以及其能否快速到達(dá)靶器官并形成有效蓄積對(duì)于快速有效地治愈疾病發(fā)揮著關(guān)鍵作用?；谠谔鎿Q功能紊亂基因和一些重大疾病治療方面的潛在應(yīng)用，基因治療在近年來(lái)受到廣泛關(guān)注?；蛑委熂磳⑼庠椿?qū)爰?xì)胞，從而修復(fù)細(xì)胞喪失的功能或功能紊亂， 或?yàn)榧?xì)胞引入其他新的功能。外源基因要進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用需要克服以下幾種屏障細(xì)胞膜、內(nèi)吞體或溶酶體、核膜。自從疫苗問(wèn)世以來(lái)，其對(duì)于降低人類的發(fā)病率和死亡率發(fā)揮著極其重要的作用。 對(duì)于一些重大疾病尤其是傳染病如肝炎、艾滋病等，開(kāi)發(fā)安全、高效、長(zhǎng)效的疫苗則顯得更為重要。在疫苗的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，除了抗原方面的優(yōu)化篩選外，疫苗載體的開(kāi)發(fā)研究也是其中一個(gè)重要工作。疫苗載體一般分為病毒載體和非病毒載體。就目前而言，臨床上批準(zhǔn)使用的疫苗也基本上以滅活的或毒力弱化的病毒作為主要的疫苗載體。然而，滅活或弱化的病毒載體仍有恢復(fù)毒力的可能，同時(shí)具有一定的毒副作用，甚至可將其基因片段整合至機(jī)體。 這也因此限制了病毒疫苗載體在臨床的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)。因此，近年來(lái)非病毒載體尤其是納米顆粒載體方面的開(kāi)發(fā)研究受到了廣泛的關(guān)注。而相對(duì)于其他非病毒載體來(lái)說(shuō)，納米顆粒載體也具有很大的優(yōu)勢(shì)。例如納米顆粒易于制備、修飾加工且可控性好，可保護(hù)藥物、基因或功能性分子免受機(jī)體或一些酶類的降解作用等。某些納米顆粒在充當(dāng)“載體”角色的同時(shí)， 還具有免疫佐劑的功能。目前，聚合物納米顆粒、樹(shù)形分子、金納米顆粒、富勒烯和生物源性納米結(jié)構(gòu)等已有大量研究。與其他納米顆粒相比，磷酸鈣納米顆粒的安全性高、生物相容性好。與鋁佐劑相比，其具有相同或更強(qiáng)的免疫佐劑作用且所引起的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)， 同時(shí)磷酸鈣納米顆粒還是潛在的黏膜免疫佐劑，其可刺激機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫反應(yīng)和黏膜免疫反應(yīng)。然而，磷酸鈣納米顆粒作為基因或疫苗載體時(shí)，其基因轉(zhuǎn)染的重復(fù)性較差。化學(xué)合成法由于其成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而成為納米材料的主要合成方法，反相膠束法則由于其在合成過(guò)程中對(duì)納米材料的可控性好且所合成的納米材料穩(wěn)定性好、粒徑分布狹窄等優(yōu)勢(shì)而得到廣泛應(yīng)用。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)為非離子型表面活性劑，無(wú)毒、無(wú)抗原性、無(wú)致敏性、無(wú)刺激性，還可促進(jìn)DNA的入胞和核運(yùn)輸過(guò)程、 促進(jìn)基因在肌肉中的表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間。研究顯示，其主要通過(guò)活化NF-κ β信號(hào)途徑來(lái)增強(qiáng)基因表達(dá)水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決疫苗或藥物載體的安全性問(wèn)題，同時(shí)為了提高DNA在體外的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、促進(jìn)蛋白質(zhì)抗原或藥物進(jìn)入細(xì)胞或機(jī)體，從而實(shí)現(xiàn)DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物作用的有效發(fā)揮，提供一種磷酸鈣或碳酸鈣納米顆粒的制備方法、以及利用該方法制備的納米顆粒。本發(fā)明提供一種納米顆粒的制備方法，該方法包括將第一微乳液與第二微乳液混合，得到納米顆粒a ；所述第一微乳液含有表面活性劑、有機(jī)溶劑和第一反應(yīng)物的水溶液， 所述第二微乳液含有表面活性劑、有機(jī)溶劑和第二反應(yīng)物的水溶液；所述第一反應(yīng)物和第二反應(yīng)物接觸后能夠形成沉淀；所述第一微乳液中的表面活性劑和所述第二微乳液中的表面活性劑相同，為油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑的混合物，或者為十六烷基三甲基溴化銨。本發(fā)明還提供根據(jù)上述制備方法制備的納米顆粒。本發(fā)明以反相膠束法合成納米顆粒，將反應(yīng)物限定在納米級(jí)反應(yīng)器-反相微乳液滴中，通過(guò)在微乳液滴相互碰撞的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)反應(yīng)物之間的作用，從而合成納米顆粒。在合成過(guò)程中可以添加藥物分子、蛋白質(zhì)抗原或功能基因，從而將其包裹在納米顆粒中，同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)藥物、蛋白質(zhì)抗原或功能基因長(zhǎng)期、有效的釋放，進(jìn)而發(fā)揮其治療或預(yù)防疾病的作用。本發(fā)明以聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)或十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)等陽(yáng)離子型表面活性劑作為反相膠束或反相微乳體系中的表面活性劑，從而在實(shí)現(xiàn)對(duì)納米顆?？煽睾铣傻耐瑫r(shí)，保證納米顆粒的安全性，并且在防止納米顆粒團(tuán)聚的同時(shí)，促進(jìn)藥物、蛋白質(zhì)抗原或DNA等進(jìn)入細(xì)胞且可使藥物、蛋白質(zhì)抗原或DNA在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)高效表達(dá)，從而有效發(fā)揮其作用。本發(fā)明通過(guò)以改性聚乙二醇(PEG)修飾納米顆粒，從而避免其過(guò)早的被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，延長(zhǎng)其在機(jī)體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，將促進(jìn)顆粒進(jìn)入細(xì)胞的功能分子如轉(zhuǎn)鐵蛋白等或促進(jìn)顆粒入核的功能分子如一些核定位信號(hào)等成功連接在納米顆粒表面，實(shí)現(xiàn)藥物分子的大量入胞從而發(fā)揮其作用或一些功能基因在細(xì)胞內(nèi)的有效表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物或功能基因治療或預(yù)防疾病的目的。本發(fā)明通過(guò)在納米顆粒表面修飾靶向抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的特異性抗體，尤其是樹(shù)突狀細(xì)胞的特異性抗體，從而更加有效地將抗原呈遞至T細(xì)胞、B細(xì)胞，使得該納米顆粒能廣泛應(yīng)用于疫苗領(lǐng)域成為可能。


圖1是實(shí)施例1的納米顆粒的電位檢測(cè)結(jié)果。圖2是實(shí)施例4的納米顆粒的電位檢測(cè)結(jié)果。圖3是實(shí)施例1的納米顆粒的掃描電鏡圖。圖4是實(shí)施例1的納米顆粒的粒徑分布圖。圖5是實(shí)施例16的納米顆粒對(duì)HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染圖片(放大倍數(shù)IOX 10)。圖6是表示實(shí)施例1所制備的納米顆粒的對(duì)HEK293細(xì)胞活力的影響的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種納米顆粒的制備方法，該方法包括將第一微乳液與第二微乳液混合，得到納米顆粒a ；所述第一微乳液含有表面活性劑、有機(jī)溶劑和第一反應(yīng)物的水溶液， 所述第二微乳液含有表面活性劑、有機(jī)溶劑和第二反應(yīng)物的水溶液；所述第一反應(yīng)物和第二反應(yīng)物接觸后能夠形成沉淀；所述第一微乳液中的表面活性劑和所述第二微乳液中的表面活性劑相同。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)納米顆粒的可控合成并防止其團(tuán)聚，所述表面活性劑使用油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑(Pluronic)和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑(Pluronic)的混合物，也可以使用十六烷基三甲基溴化銨等陽(yáng)離子型表面活性劑。當(dāng)表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨時(shí)，為了保證微乳液良好的穩(wěn)定性，第一微乳液和第二微乳液中還含有助表面活性劑。在本發(fā)明的納米顆粒的制備方法中，所述第一微乳液和第二微乳液的重量比使得所述第一微乳液中的第一反應(yīng)物與所述第二微乳液中的第二反應(yīng)物的摩爾比可以為 1-2 1。在本發(fā)明的第一微乳液中，相對(duì)于1重量份的表面活性劑，所述有機(jī)溶劑的含量可以為0. 1-15重量份，優(yōu)選為0. 11-0. 25重量份，所述第一反應(yīng)物的水溶液的含量可以為 0. 008-2. 3重量份，優(yōu)選為0. 008-1重量份，更優(yōu)選為0. 0125-0. 0625重量份，所述第一反應(yīng)物的水溶液的濃度可以為ImM-lM，優(yōu)選為12. 5mM_0. 5M。在本發(fā)明的第二微乳液中，相對(duì)于1重量份的表面活性劑，所述有機(jī)溶劑的含量可以為0. 1-15重量份，優(yōu)選為0. 11-0. 25重量份，所述第二反應(yīng)物的水溶液的含量可以為 0. 008-2. 3重量份，優(yōu)選為0. 008-1重量份，更優(yōu)選為0. 0125-0. 0625重量份，所述第二反應(yīng)物的水溶液的濃度為0. 5mM-0. 5M，優(yōu)選為6. 25mM-0. 25M。在所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑的混合物中，油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑的重量比可以為0.1-10 1，優(yōu)選為0.1-3. 75 1。所述表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨時(shí)，第一微乳液和第二微乳液中還含有助表面活性劑，且相對(duì)于1重量份的表面活性劑，所述助表面活性劑可以為 0. 72-5. 6重量份，優(yōu)選為0. 72-2. 8重量份。本發(fā)明中的所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑中聚氧乙烯和聚氧丙烯的重量比為0. 15-0. 56 1，優(yōu)選為0.15 1或0. 56 1，更優(yōu)選為0.56 1。 所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑可以使用市售商品，例如德國(guó)BASF 公司的 Pluronic L61、Pluronic P103、Pluronic P123 等。本發(fā)明中的所述水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑中聚氧乙烯和聚氧丙烯的重量比為0. 56-5. 26 1，優(yōu)選為0.88 1,1. 32 1或3. 03 1，更優(yōu)選為 1.32 1。所述水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑可以使用市售商品，例如德國(guó) BASF 公司的 Pluronic L64, Pluronic F127 和 PluronicP85 等。在本發(fā)明中使用的所述助表面活性劑可以為碳原子數(shù)為2-6的醇中的一種或多種，優(yōu)選為丙二醇、正丁醇、丁二醇、正戊醇、異戊醇和正己醇中的一種或多種，更優(yōu)選為正戊醇或正己醇。
本發(fā)明中的所述第一反應(yīng)物為氯化鈣。所述第二反應(yīng)物為選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二氨、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鈉和碳酸氫鈉中的一種。本發(fā)明中的所述有機(jī)溶劑可以選用烷烴化合物或酯化合物，其中所述烷烴化合物為選自碳原子數(shù)為6-12的烷烴化合物中的一種或多種，例如，環(huán)己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷、十一烷和十二烷，優(yōu)選為環(huán)己烷或正己烷；所述酯化合物為選自肉豆蔻酸肉豆蔻酯、棕櫚酸異辛酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、乙二醇雙硬脂酸酯、乙二醇單硬脂酸酯、丙二醇單硬脂酸酯、十六酸十六酯和十八酸十八酯中的一種或多種，優(yōu)選為肉豆蔻酸異丙酯。由于在上述納米顆粒的制備原料中含有如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)等陽(yáng)離子型表面活性劑，所以所述的納米顆粒表面帶正電荷，本發(fā)明中的所述納米顆?？梢詭в?10-30毫伏的正電荷。因此，本發(fā)明的納米顆粒，既可在制備納米顆粒a的過(guò)程中包裹DNA、 蛋白質(zhì)抗原或藥物，亦可在制備完納米顆粒a后，使其與DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物相互吸附， 得到載有DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的納米顆粒b。在第一微乳液和第二微乳液中還分別含有DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的情況下，將含有DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的第一微乳液與含有DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的第二微乳液接觸，得到納米顆粒a，且在第一微乳液中，相對(duì)于1重量份的所述第一反應(yīng)物，所述DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的用量為0. 0003-0. 6重量份，優(yōu)選為0. 001-0. 45重量份；在第二微乳液中， 相對(duì)于1重量份的所述第二反應(yīng)物，所述DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的用量為0. 0004-0. 9重量份，優(yōu)選為0. 0015-0. 8重量份。在制備完納米顆粒a后，使其與DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物相互吸附的情況下，在溶劑存在下，將所得到的納米顆粒a與DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物進(jìn)行接觸，得到納米顆粒b，且相對(duì)于1重量份的所述第一反應(yīng)物，所述DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的用量為0. 0003-0. 6重量份。所述溶劑為能夠溶解DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的溶劑。由于在本發(fā)明中的DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物是被包裹在納米顆粒中，或通過(guò)靜電吸附作用與納米顆粒表面結(jié)合，因此，在本發(fā)明中，對(duì)DNA、蛋白質(zhì)抗原和藥物沒(méi)有特別的限定。為了實(shí)現(xiàn)納米顆粒免受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的過(guò)早吞噬，延長(zhǎng)其在血液循環(huán)中的時(shí)間， 本發(fā)明的制備方法還包括在嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將所述納米顆粒a與碳二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行混合后離心，在PBS緩沖溶液中，將離心后的沉淀與改性聚乙二醇進(jìn)行混合，得到納米顆粒c，且相對(duì)于1重量份的所述納米顆粒a，所述碳二亞胺鹽酸鹽的用量可以為0. 1-0. 5 重量份，所述改性聚乙二醇的用量可以為0. 1-0. 5重量份；優(yōu)選情況下，相對(duì)于1重量份的所述納米顆粒a，所述碳二亞胺鹽酸鹽的用量為0. 2-0. 4重量份，所述改性聚乙二醇的用量為0. 2-0. 4重量份。本發(fā)明的制備方法還包括在嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將所述納米顆粒b與碳二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行混合后離心，在PBS緩沖溶液中，將離心后的沉淀與改性聚乙二醇進(jìn)行混合，得到納米顆粒d，且相對(duì)于1重量份的所述納米顆粒b，所述碳二亞胺鹽酸鹽的用量可以為0. 1-0. 5重量份，所述改性聚乙二醇的用量可以為0. 1-0. 5重量份；優(yōu)選情況下，相對(duì)于1重量份的所述納米顆粒b，所述碳二亞胺鹽酸鹽的用量為0. 2-0. 4重量份，所述改性聚乙二醇的用量為0. 2-0. 4重量份。
在本發(fā)明中，所述改性聚乙二醇的骨架為聚乙二醇骨架、兩個(gè)端基分別為氨基和羧基或兩個(gè)端基均為氨基，所述改性聚乙二醇的重均分子量可以為370-1150，所述改性聚乙二醇可以使用例如上海炎怡生物科技有限公司的NH2-PEG-COOH。在本發(fā)明的制備方法中還包括，在MES緩沖液中，將納米顆粒c與核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子和靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體中的任意一種或多種一次或分多次接觸，每次接觸的時(shí)間為2-12h，且相對(duì)于1重量份的納米顆粒c，所述NLS的用量可以為0-1 重量份，優(yōu)選0-0. 5重量份，所述促進(jìn)入胞功能分子的用量可以為0-1重量份，優(yōu)選0-0. 5 重量份，所述靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的用量可以為0-1重量份，優(yōu)選0-0. 5重量份，NLS、促進(jìn)入胞功能分子和靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的總用量為0. 1-3重量份。在本發(fā)明的制備方法中還包括，在MES緩沖溶液中，將納米顆粒d與核定位信號(hào)、 促進(jìn)入胞功能分子和靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體中的任意一種或多種一次或分多次接觸，每次接觸的時(shí)間為2-12h，且相對(duì)于1重量份的納米顆粒d，所述NLS的用量可以為 0-1重量份，優(yōu)選0-0. 5重量份，所述促進(jìn)入胞功能分子的用量可以為0-1重量份，優(yōu)選 0-0. 5重量份，所述靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的用量可以為0-1重量份，優(yōu)選0-0. 5 重量份，NLS、促進(jìn)入胞功能分子和靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的總用量為0. 1-3重量份。上述NLS為一簇堿性氨基酸序列，例如SV40T抗原、被間隔區(qū)分開(kāi)的兩簇帶正電的氨基酸殘基序列、c-MYC原癌基因的核定位信號(hào)及其他類型核定位信號(hào)如核糖體蛋白等中的一種；上述促進(jìn)入胞功能分子為含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的肽類物質(zhì)、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、葉酸等中的一種；所述靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體為 anti-DEC205 等。本發(fā)明的制備方法中還包括將上述納米顆粒進(jìn)行冷凍干燥的步驟，所述冷凍干燥采用本領(lǐng)域常規(guī)的冷凍干燥方法，并沒(méi)有特別的限制。本發(fā)明還提供根據(jù)上述制備方法制備的納米顆粒。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖具體說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1納米顆粒的制備(1)第一微乳液的制備取 3.3g Pluronic L64 (德國(guó) BASF 公司)、0· 3g Pluronic L61 (德國(guó)BASF公司)和0. 4g肉豆蔻酸異丙酯(美國(guó)ACROS公司)混合均勻后，滴加45 μ 1 氯化鈣水溶液(12. 5mM)，攪拌12h。(2)第二微乳液的制備取 3.3g Pluronic L64 (德國(guó) BASF 公司)、0· 3g Pluronic L61 (德國(guó)BASF公司)和0. 4g肉豆蔻酸異丙酯(美國(guó)ACROS公司)混合均勻后，滴加45 μ 1 磷酸氫二鈉水溶液(12. 5mM)，攪拌12h。(3)在25°C下，將第二微乳液加入到第一微乳液中，繼續(xù)攪拌12h ；以SOOOrpm，離心30min后，以無(wú)水乙醇洗滌2次，最后以Iml雙蒸水分散即可得到納米顆粒溶膠。利用激光粒度儀對(duì)所得到納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，納米顆粒表面呈中性， 帶有0. 08毫伏電荷。實(shí)施例2納米顆粒的制備
(1)第一微乳液的制備取 2. 14g Pluronic P123 (德國(guó) BASF 公司)、1. 29g Pluronic P85 (德國(guó)BASF公司)和0. 57g正己烷混合均勻后，滴加135 μ 1氯化鈣水溶液 (0. 1Μ)，攪拌 12h。(2)第二微乳液的制備取 2. 14g Pluronic P123 (德國(guó) BASF 公司)、1. 29g Pluronic P85 (德國(guó)BASF公司)和0. 57g正己烷混合均勻后，滴加135 μ 1磷酸氫二氨水溶液(0. 06Μ)，攪拌 12h。(3)在25°C下，將第二微乳液加入到第一微乳液中，繼續(xù)攪拌12h ；以SOOOrpm，離心30min后，以無(wú)水乙醇洗滌2次，最后以Iml雙蒸水分散即得納米顆粒溶膠。利用激光粒度儀對(duì)所得到納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例1相似，納米顆粒表面呈中性，帶有0.12毫伏的電荷。實(shí)施例3納米顆粒的制備(1)第一微乳液的制備取 0. 67g Pluronic F127 (德國(guó) BASF 公司)、2· 53g Pluronic L61 (德國(guó)BASF公司)和0. 8g肉豆蔻酸異丙酯(美國(guó)ACROS公司)混合均勻后， 滴加200 μ 1氯化鈣水溶液(0. 5Μ)，攪拌12h。(2)第二微乳液的制備取 0. 67g Pluronic F127 (德國(guó) BASF 公司)、2· 53g Pluronic L61 (德國(guó)BASF公司)和0. 8g肉豆蔻酸異丙酯(美國(guó)ACROS公司)混合均勻后， 滴加200 μ 1磷酸二氫鉀水溶液(0. 25Μ)，攪拌12h。(3)在25°C下，將第二微乳液加入到第一微乳液中，繼續(xù)攪拌12h ；以SOOOrpm，離心30min后，以無(wú)水乙醇洗滌2次，最后以Iml雙蒸水分散即得納米顆粒溶膠。利用激光粒度儀對(duì)所得到納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例1相似，納米顆粒表面呈中性，帶有0. 10毫伏電荷。實(shí)施例4納米顆粒的制備(1)第一微乳液的制備取0. 18g CTAB (美國(guó)Amersco公司)、0. 13g正戊醇、3. 3g 正己烷和45 μ 1氯化鈣水溶液(12. 5mM)混合均勻，以350rpm的速度攪拌，至澄清透明。(2)第二微乳液的制備取0. 18g CTAB (美國(guó)Amersco公司)、0. 13g正戊醇、3. 3g 正己烷和45 μ 1磷酸氫二氨水溶液(12. 5mM)混合均勻，以350rpm的速度攪拌，至澄清透明。(3)在25°C下，將第二微乳液加入到第一微乳液中，繼續(xù)攪拌4h ；之后SOOOrpm，離心30min，依此方法以無(wú)水乙醇洗滌2次，最后以Iml雙蒸水分散即得納米顆粒溶膠。利用激光粒度儀對(duì)所得到納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，納米顆粒表面帶有15 毫伏的正電荷。實(shí)施例5納米顆粒的制備(1)第一微乳液的制備取0. 18g CTAB (美國(guó)Amersco公司)、0. 22g正戊醇、4. 25g 肉豆蔻酸異丙酯和120 μ 1氯化鈣水溶液(0. 1Μ)混合均勻，以350rpm的速度攪拌，至澄清透明；(2)第二微乳液的制備取0. 18g CTAB (美國(guó)Amersco公司)、0· 22g正戊醇、4. 25g肉豆蔻酸異丙酯和120 μ 1磷酸二氫鈉水溶液(0. 06Μ)混合均勻，以350rpm的速度攪拌，至
澄清透明；(3)在25°C下，將第二微乳液加入到第一微乳液中，繼續(xù)攪拌4h ；之后SOOOrpm，離心30min，依此方法以無(wú)水乙醇洗滌2次，最后以Iml雙蒸水分散即得納米顆粒溶膠。利用激光粒度儀對(duì)所得到納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例4相似，納米顆粒帶有18毫伏的正電荷。實(shí)施例6納米顆粒的制備(1)第一微乳液的制備取0. 18g CTAB (美國(guó)Amersco公司)、0. 51g正己醇、3. 3g 正己烷和180 μ 1氯化鈣水溶液(IM)混合均勻，以350rpm的速度攪拌，至澄清透明；(2)第二微乳液的制備取0. 18g CTAB (美國(guó)Amersco公司)、0. 51g正己醇、3. 3g 正己烷和180 μ 1磷酸氫二鈉水溶液(0. 5Μ)混合均勻，以350rpm的速度攪拌，至澄清透明；(3)在25°C下，將第二微乳液加入到第一微乳液中，繼續(xù)攪拌4h ；之后SOOOrpm，離心30min，依此方法以無(wú)水乙醇洗滌2次，最后以Iml雙蒸水分散即得納米顆粒溶膠。利用激光粒度儀對(duì)所得到納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例4相似，納米顆粒帶有15毫伏的正電荷。實(shí)施例7納米顆粒的制備按照實(shí)施例1的方法制備納米顆粒，不同的是，在第一微乳液和第二微乳液的制備過(guò)程中，45 μ 1氯化鈣水溶液由30 μ 1氯化鈣水溶液(12. 5mM)和15 μ 1卵清蛋白(0VA， Sigma公司)溶液(1 μ g/ μ 1)的混合液代替，45 μ 1磷酸氫二鈉水溶液由30 μ 1磷酸氫二鈉水溶液(12. 5mM)和15 μ 1卵清蛋白(OVA，Sigma公司)溶液(1 μ g/ μ 1)的混合液代替， 得到包裹了卵清蛋白的納米顆粒溶膠。實(shí)施例8納米顆粒的制備按照實(shí)施例4的方法制備ImL納米顆粒溶膠后，將得到的納米顆粒溶膠與ImL卵清蛋白(OVA，Sigma公司)溶液(1 μ g/ μ 1)混合，于25°C下靜置30min，即得表面吸附卵清蛋白的納米顆粒溶膠。實(shí)施例9納米顆粒的制備按照實(shí)施例1的方法制備納米顆粒，不同的是，在第一微乳液和第二微乳液的制備過(guò)程中，45 μ 1氯化鈣水溶液由30 μ 1氯化鈣水溶液(12. 5mM)和15 μ 1 pEGFP (增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼基因，Biovector-08, Clontech公司)溶液(0. 3 μ g/μ 1)的混合液代替， 45 μ 1磷酸氫二鈉水溶液由30 μ 1磷酸氫二鈉水溶液(12. 5mM)和15 μ 1 pEGFP (增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼基因，Biovector-08, Clontech公司)溶液(0. 3 μ g/μ 1)的混合液代替， 得到包裹了 PEGFP質(zhì)粒DNA的納米顆粒溶膠。實(shí)施例10納米顆粒的制備按照實(shí)施例4的方法制備ImL納米顆粒溶膠后，將得到的納米顆粒溶膠與ImLpEGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼基因，Biovector-08，Clontech公司)溶液(0. 3μ g/μ 1) 混合，于25°C下靜置30min，即得表面吸附pEGFP質(zhì)粒DNA的納米顆粒溶膠。實(shí)施例11納米顆粒的制備取Iml實(shí)施例9制備的納米顆粒溶膠，用MES緩沖溶液離心洗滌(8000rpm， 30min/次)2次，每次用IOml MES緩沖溶液(pH 6. 0)；然后用2mlMES緩沖溶液重懸納米顆粒，加入30 μ g EDC (美國(guó)Sigma公司)，震蕩Ih后，用PBS緩沖溶液離心洗滌(8000rpm， 30min/次)2次，每次用IOml PBS緩沖溶液(pH7. 4)；然后用IOml PBS緩沖溶液重懸，加入 30ygNH2-PEG-C00H(上海炎怡生物科技有限公司，重均分子量為1148)，震蕩過(guò)夜。之后以 8000rpm,離心30min，并用IOml PBS緩沖液重懸納米顆粒，洗滌2次，重懸于100 μ 1 PBS緩沖液中，得到納米顆粒溶膠。實(shí)施例12納米顆粒的制備取100 μ 1實(shí)施例11制備的納米顆粒PBS緩沖液，加入15 μ g核定位信號(hào)(NLS， PAAKRVKLD，西安聯(lián)美生物科技有限公司合成)混合均勻，靜置30min。之后加入4°C的30 μ 1 EDC的MES緩沖液(EDC的含量為0. 5mg/ml)，并加入70 μ 1 MES緩沖液使反應(yīng)體系的最終體積為200μ 1，4°C下反應(yīng)2h。然后加入Iml PBS緩沖液，以8000rpm離心30min后，重懸于ΙΟΟμΙ PBS緩沖液中，得到納米顆粒溶膠。實(shí)施例13納米顆粒的制備取100 μ 1實(shí)施例12制備的納米顆粒PBS緩沖液，加入15 μ g轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Bpo-iTransferrir^Sigmaag )混合均勻，靜置 30min。之后加入41的3(^ IEDC 的 MES 緩沖液(EDC的含量為0. 5mg/ml)，并加入70 μ 1 MES緩沖液使反應(yīng)體系的最終體積為200 μ 1， 4°C條件下反應(yīng)2h。然后加入Iml PBS緩沖液，以8000rpm離心30min，并重懸于100μ 1 PBS 緩沖液中，得到納米顆粒溶膠。實(shí)施例14納米顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM)檢測(cè)利用SEM(日立公司，S-4800)對(duì)實(shí)施例1_13中獲得的納米顆粒進(jìn)行觀察。圖1 是實(shí)施例1的納米顆粒的掃描電鏡圖。實(shí)施例2-13的納米顆粒的SEM檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例 1的檢測(cè)結(jié)果相似。實(shí)施例1-13的納米顆粒的平均粒徑見(jiàn)表1。表 權(quán)利要求
1.一種納米顆粒的制備方法，其特征在于，該方法包括將第一微乳液與第二微乳液混合，得到納米顆粒a ；所述第一微乳液含有表面活性劑、有機(jī)溶劑和第一反應(yīng)物的水溶液， 所述第二微乳液含有表面活性劑、有機(jī)溶劑和第二反應(yīng)物的水溶液；所述第一反應(yīng)物和第二反應(yīng)物接觸后能夠形成沉淀；所述第一微乳液中的表面活性劑和所述第二微乳液中的表面活性劑相同，為油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑的混合物，或者為十六烷基三甲基溴化銨。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，所述第一微乳液中的第一反應(yīng)物與所述第二微乳液中的第二反應(yīng)物的摩爾比為1-2 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，在第一微乳液中，相對(duì)于1重量份的表面活性劑，所述有機(jī)溶劑的含量為0. 1-15重量份，所述第一反應(yīng)物的水溶液的含量為 0. 008-2. 3重量份，所述第一反應(yīng)物的水溶液的濃度為ImM-IM ；在第二微乳液中，相對(duì)于1重量份的表面活性劑，所述有機(jī)溶劑的含量為0. 1-15重量份，所述第二反應(yīng)物的水溶液的含量為0. 008-2. 3重量份，所述第二反應(yīng)物的水溶液的濃度為 0. 5mM-0. 5M。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其中，在第一微乳液中，相對(duì)于1重量份的表面活性劑，所述有機(jī)溶劑的含量為0. 11-0. 25重量份，所述第一反應(yīng)物的水溶液的含量為 0. 008-1重量份，所述第一反應(yīng)物的水溶液的濃度為12. 5mM-0. 5M ；在第二微乳液中，相對(duì)于1重量份的表面活性劑，所述有機(jī)溶劑的含量為0. 11-0. 25重量份，所述第二反應(yīng)物的水溶液的含量為0. 008-1重量份，所述第二反應(yīng)物的水溶液的濃度為 6. 25mM-0. 25M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，在所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑的混合物中，油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑的重量比為0. 1-10 1 ；所述表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨時(shí)，第一微乳液和第二微乳液中還含有助表面活性劑，且相對(duì)于1重量份的表面活性劑，所述助表面活性劑為0. 72-5. 6重量份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑中聚氧乙烯和聚氧丙烯的重量比為0.15-0. 56 1 ；所述水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑中氧化乙烯和氧化丙烯的重量比為0.56-5. 26 1 ；所述助表面活性劑為碳原子數(shù)為2-6的醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，所述第一反應(yīng)物為氯化鈣；所述第二反應(yīng)物為選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二氨、碳酸鉀、碳酸氫鉀、 碳酸鈉和碳酸氫鈉中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述有機(jī)溶劑為烷烴化合物或酯化合物，所述烷烴化合物為碳原子數(shù)為6-12的烷烴化合物；所述酯化合物為選自肉豆蔻酸肉豆蔻酯、 棕櫚酸異辛酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、乙二醇雙硬脂酸酯、乙二醇單硬脂酸酯、丙二醇單硬脂酸酯、十六酸十六酯和十八酸十八酯中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，在第一微乳液和第二微乳液中，還分別含有 DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物，且在第一微乳液中，相對(duì)于1重量份的所述第一反應(yīng)物，所述DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的用量為0. 0003-0. 6重量份；在第二微乳液中，相對(duì)于1重量份的所述第二反應(yīng)物，所述DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的用量為0. 0004-0. 9重量份。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其中，所述方法還包括，在嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將所述納米顆粒a與碳二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行混合后離心，在PBS緩沖溶液中，將離心后的沉淀與改性聚乙二醇進(jìn)行混合，得到納米顆粒c，且相對(duì)于1重量份的所述納米顆粒a，所述碳二亞胺鹽酸鹽的用量為0. 1-0. 5重量份，所述改性聚乙二醇的用量為0. 1-0. 5重量份； 所述改性聚乙二醇的骨架為聚乙二醇骨架、兩個(gè)端基分別為氨基和羧基或兩個(gè)端基均為氨基，所述改性聚乙二醇的重均分子量為370-1150。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其中，所述方法還包括，在嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將所述納米顆粒c與核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子和靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體中的任意一種或多種一次或分多次接觸，每次接觸的時(shí)間為2-12h，且相對(duì)于1重量份的納米顆粒c，所述核定位信號(hào)的用量為0-1重量份，所述促進(jìn)入胞功能分子的用量為0-1重量份，所述靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的用量為0-1重量份，核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子和靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的總用量為0. 1-3重量份。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，該方法還包括，在溶劑存在下，將所得到的納米顆粒a與DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物進(jìn)行接觸，得到納米顆粒b，且相對(duì)于1重量份的所述第一反應(yīng)物，所述DNA、蛋白質(zhì)抗原或藥物的用量為0. 0003-0. 6重量份。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備方法，其中，所述方法還包括，在嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將所述納米顆粒b與碳二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行混合后離心，在PBS緩沖溶液中，將離心后的沉淀與改性聚乙二醇進(jìn)行混合，得到納米顆粒d，且相對(duì)于1重量份的所述納米顆粒b，所述碳二亞胺鹽酸鹽的用量為0. 1-0. 5重量份，所述改性聚乙二醇的用量為0. 1-0. 5重量份； 所述改性聚乙二醇的骨架為聚乙二醇骨架、兩個(gè)端基分別為氨基和羧基或兩個(gè)端基均為氨基，所述改性聚乙二醇的重均分子量為370-1150。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其中，所述方法還包括，在嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將納米顆粒d與核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子和靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體中的任意一種或多種一次或分多次接觸，每次接觸的時(shí)間為2-12h，且相對(duì)于1重量份的納米顆粒d，所述核定位信號(hào)的用量為0-1重量份，所述促進(jìn)入胞功能分子的用量為0-1重量份， 所述靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的用量為0-1重量份，核定位信號(hào)、促進(jìn)入胞功能分子和靶向抗原呈遞細(xì)胞的特異性抗體的總用量為0. 1-3重量份。
15.一種納米顆粒，其特征在于，該納米顆粒是根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的制備方法制備的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種納米顆粒的制備方法，該方法包括將第一微乳液與第二微乳液混合；所述第一微乳液含有表面活性劑、有機(jī)溶劑和第一反應(yīng)物的水溶液，所述第二微乳液含有表面活性劑、有機(jī)溶劑和第二反應(yīng)物的水溶液；所述第一反應(yīng)物和第二反應(yīng)物接觸后能夠形成沉淀；所述第一微乳液中的表面活性劑和所述第二微乳液中的表面活性劑相同，為油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性劑的混合物，或者為十六烷基三甲基溴化銨等陽(yáng)離子型表面活性劑。本發(fā)明的納米顆粒安全性好且能明顯提高基因的轉(zhuǎn)染水平、促進(jìn)蛋白質(zhì)或藥物進(jìn)入細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K47/42GK102397266SQ20101027400
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者許利耕, 陳春英 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心