專利名稱：一種急性全身性猴帕金森病模型及其藥物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種急性全身性猴帕金森病模型及其藥物篩選方法。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinson’ s disease,PD)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型已有多種，包括小鼠、大鼠的外科損傷或6-羥多巴立體定向注射毀損的模型等。最有價(jià)值的模型動(dòng)物應(yīng)是和人類神經(jīng)系統(tǒng)尤其是中腦基底節(jié)區(qū)有著相似結(jié)構(gòu)、功能和復(fù)雜程度的物種。靈長(zhǎng)類PD動(dòng)物模型能夠反映PD癥狀的基本特征，是目前最接近人類PD的動(dòng)物模型，為PD的基礎(chǔ)研究提供了良好的基礎(chǔ)和平臺(tái)。MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)黑質(zhì)-紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損害。雖然偏側(cè)猴帕金森病模型建模簡(jiǎn)單，建模成本低、模型成活率高， 被廣泛采用，但是，該模型癥狀僅局限于一側(cè)，與疾病呈雙側(cè)發(fā)展不相符合，不能體現(xiàn)中晚期帕金森病的臨床特征。因此，亟需建立全身性帕金森病猴模型以供實(shí)驗(yàn)研究需要。1984 年，Jenner 等[Jenner P. , Rupniak N. Μ. , Rose S. , et al. l-Methyl-4-phenyl-l, 2, 3, 6-tetrahyropyridineinduced parkinsonism in the common mramoset. Neurosci Lett, 1984,50 :85-90. 1]首次報(bào)道了使用MPTP注射建立全身性猴帕金森病模型的方法。盡管當(dāng)時(shí)建立的動(dòng)物模型僅表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)減少和僵直，并沒有見到肢體震顫，但是，組織生化研究顯示紋狀體內(nèi)多巴胺分泌減少了 63-100 %。之后，有學(xué)者提出了連續(xù)注射MPTP建立全身性帕金森病模型的方法，該方法可造成黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元損失超過95%， 與終末期帕金森病患者腦病理改變相類似[Kunikowska G. , Jenner P. . Alteraion in m-RNA expression for Cu, Zn-superoxide dismutase and glutathione peroxidase in the basal ganglia ofMPTP-treated marmosets and patients with parkinson' s disease. BrainRes, 2003，968 :206-218.]。目前，建立急性全身性帕金森病猴模型的給藥途徑包括肌肉注射、皮下注射和靜脈注射三種。由于靜脈注射更接近人類應(yīng)用MPTP的方式，并且不受組織吸收率等因素的影響，藥物可快速進(jìn)入顱內(nèi)，容易控制用藥量。因此， 國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用靜脈注射的方法建立急性全身性帕金森病模型。但是，值得注意的是， 各個(gè)研究報(bào)道的靜脈給藥方式和給藥劑量有很大的不同。Manley等Btanley B. R., Chuang C. C. , Sanford D. Μ. , et al. Aprimate model of parkinsonism :selective destruction of dopaminergic neuronsin the pars compacta of the substantia nigra byN-methyl-4-phenyl-l,2，3,6-tetrahydropyridine. Proc Natl AcadSci,1983， 80 :4546-4550.]對(duì)四只猴分別通過分次靜脈注射1. 75_2. 49mg/kgMPTP溶液，建立了急性重度全身模型。國(guó)內(nèi)陳生弟等[陳生弟，徐德隆，余慧貞等.MTPT在恒河猴帕金森病模型上的應(yīng)用及其作用機(jī)制的研究.中華神經(jīng)精神科雜志，1990二3(1) :23-27.]分次為兩只猴注射2. 45mg/kg和3. 5mg/kgMPTP后，出現(xiàn)嚴(yán)重的帕金森病癥狀。Hansard等 [Hansard Μ. J.，Smith L. Α.，Jckson Μ.J, et al. Dopamine, but not norepinephrineor serotonin， reuptake inhibition reserves motor deficits inl-methyl-4-phenyl—l，2,3,6-tetrahydropyridine treatmented primates.J PharmacolExp Ther,2002, 303 :952-958, MJ Hansard, LA Smith, MJ Jackson, et al. Dopamine reuptake inhibition and failure to evoke dyskinesia in MPTP—treatedprimates, Eur. J. Pharmacol. 451 (2002) 157-160.]報(bào)道在5天內(nèi)連續(xù)注射總劑量為2mg/kg的MPTP建立急性全身模型的方法。由于該模型癥狀明顯而典型，被認(rèn)為特別適合于左旋多巴引起的運(yùn)動(dòng)不能的病理生理機(jī)制的研究[MP Hill,P Ravenscroft,E Bezard,et al. Levetiracetam potentiates the antidyskinetic actionof amantadine in the l_methyl_4_phenyl_l， 2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)-Iesioned primate model of Parkinson' s disease. J Pharmacol ExpTher，2004，310 :386-394.，P Jenner. The MPTP-treated primate as a model ofmotor complicationsin PD :primate model of motor complications. Neurology, 2003,61 :S4_S11.]；也可用于帕金森病神經(jīng)保護(hù)藥及多巴胺受體激動(dòng)劑等 [CJ Hille， SH Fox, YP Maneuf， et al. Antiparkinsonianaction of a delta opioid agonist in rodent and primate models of Parkinson' sdisease， Exp. Neurol. 172(2001) 189-198. ； [10]MM IravaniiS Costa，MJJackson，et al.⑶NF reverses priming for dyskinesia in MPTP—treated，l-D0PA-primed common marmosets. Eur J Neurosci,2001 13 :597-608. ；RKPearce,M Jackson, DR Britton,et al. Actions of the Dl agonists A—77636 andA—86929 on locomotion and dyskinesia in MPTP—treated 1-dopa-primed commonmarmosets. Psychopharmacology,1999,142 :51-60. ]，{0 是，i亥方法建立的猴帕金森病模型癥狀嚴(yán)重，模型猴活動(dòng)能力受到嚴(yán)重影響，并出現(xiàn)飲水和進(jìn)食困難，需要使用左旋多巴類藥物治療，因此飼養(yǎng)難度大，模型猴容易死亡。為解決這一問題， Iravani 等[M Iravani, E Syed, MJ Jackson, et al. A modifiedMPTP treatment regime produces reproducible partial nigrostriatal lesions incommon marmosets. Eur J Neurosci，2005，21 :841-854.]降低MPTP用量，使用lmg/kg MPTP建立的猴帕金森病模型， 其多巴胺能神經(jīng)元損失只有60%，模型猴癥狀輕微，容易存活，適合于疾病早期階段的各項(xiàng)研究；但是，該模型由于癥狀輕微，在短期內(nèi)出現(xiàn)癥狀消失。和占龍，等，恒河猴帕金森氏病模型的建立和重組人NTN對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)觀察，《中國(guó)現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志》，2005年4卷5期，其中公開了恒河猴帕金森氏病模型的建立方法為猴下肢隱靜脈注射MPTP，用藥劑量和時(shí)間為首先按0. 3mg/kg給藥，1次/d，共4d，然后按0. 38mg/kg, 1次/d，共3d，總共給MPTP7d。雖然降低了劑量，但制備的動(dòng)物模型穩(wěn)定性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種急性全身性猴帕金森病模型及其藥物篩選方法。本發(fā)明提供了一種急性全身性猴帕金森病模型的制備方法，將劑量為0. 36mg/kg 的MPTP施用于猴，每隔一天施用一次，連續(xù)施用5次。所述的施用方式是靜脈注射。本發(fā)明還提供了該方法制備的動(dòng)物模型在篩選治療急性帕金森病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種篩選治療急性帕金森病的藥物的方法，它包括如下步驟a、將劑量為0. 36mg/kg的MPTP經(jīng)外周靜脈穿刺施用于猴，每隔一天注射一次，連續(xù)注射5次，建立急性全身性猴帕金森病模型；
b、將候選藥物施用于動(dòng)物模型；C、觀察候選藥物對(duì)急性帕金森病的量化指標(biāo)的影響情況，并進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)潛在治療急性帕金森病的藥物。本發(fā)明制備動(dòng)物模型的方法與“和占龍，等，恒河猴帕金森氏病模型的建立和重組人NTN對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)觀察，《中國(guó)現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志》，2005年4 卷5期”報(bào)道的方法相比，給藥方式不相同本方法為隔日給藥，每次給藥劑量相同，連續(xù)給藥5次后停止給藥；單次給藥劑量也不同。本發(fā)明經(jīng)外周靜脈連續(xù)注射MPTP可以建立癥狀表現(xiàn)類似中晚期帕金森病患者的急性全身性猴帕金森病模型。該模型建模后1-4個(gè)月癥狀較為穩(wěn)定，其后快速恢復(fù)。


圖1 建模前實(shí)驗(yàn)猴活動(dòng)及姿勢(shì)正常圖2 :MPTP注射后2周出現(xiàn)身體屈曲、運(yùn)動(dòng)遲緩、尾巴直立、肌張力增高和面具臉表現(xiàn)圖3 :MPTP注射后1個(gè)月出現(xiàn)身體嚴(yán)重屈曲、肌張力增高、木僵表現(xiàn)圖4 :MPTP注射后1個(gè)月模型猴雙側(cè)肢體肌張力顯著增高，活動(dòng)困難，影響進(jìn)食圖5 =MPTP注射后3個(gè)月(B)，猴全腦腦糖代謝較建模前(A)顯著降低；且糖代謝水平較偏側(cè)猴帕金森病模型(C)更低。圖6 急性全身性模型猴全腦代謝降低，在尾狀核區(qū)域仍可見相對(duì)活躍糖代謝活動(dòng)(B)圖7:猴動(dòng)態(tài)行為學(xué)評(píng)分圖8 右側(cè)丘腦HE X 400圖9 左側(cè)丘腦HE X 400圖10 實(shí)驗(yàn)猴左右側(cè)丘腦-紋狀體區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)均顯著降低圖11 實(shí)驗(yàn)猴左右側(cè)紋狀體區(qū)TH染色THX 100圖12 實(shí)驗(yàn)猴左右側(cè)紋狀體區(qū)TH染色THX 400圖13 實(shí)驗(yàn)猴左右側(cè)紋狀體D2受體染色；D2X 100圖14 實(shí)驗(yàn)猴左右側(cè)紋狀體D2受體染色；D2X400
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明急性全身性猴帕金森病模型的制備1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕Y狀典型的全身性MPTP猴帕金森病模型模型并對(duì)模型進(jìn)行綜合評(píng)估，使其適用于新藥評(píng)估等各類研究。2、實(shí)驗(yàn)方法2. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入選參照實(shí)驗(yàn)猴納入標(biāo)準(zhǔn)(見后述)，由成都平安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心購(gòu)入3只健康成年獼猴。年齡5-7歲，體重5. 0-6. lKg，兩雄一雌，分別以Ml、M2、Fl代表。經(jīng)檢驗(yàn)、檢疫合格后，置于國(guó)家(成都)中藥安全性評(píng)估中心(GLP)大動(dòng)物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)猴納入標(biāo)準(zhǔn)①、年齡4-7歲；②、有血液常規(guī)、生化和傳染病等檢測(cè)報(bào)告，且檢查結(jié)果正常，無傳染病；③、既往未接受其他實(shí)驗(yàn)研究；④、體重4_7Kg;⑤、軀干、肢體及頭面部活動(dòng)自如；⑥、對(duì)外界環(huán)境及刺激反應(yīng)正常。2. 2建模前實(shí)驗(yàn)猴飼養(yǎng)滿足實(shí)驗(yàn)要求的猴在進(jìn)行建模手術(shù)前3周移入GLP中心大動(dòng)物飼養(yǎng)中心進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，使其適應(yīng)新的生活環(huán)境。所有實(shí)驗(yàn)猴采用專用猴籠，單籠飼養(yǎng)，參照動(dòng)物福利要求和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求，為實(shí)驗(yàn)猴提供全價(jià)飼料和水果，并由專職飼養(yǎng)人員照顧實(shí)驗(yàn)猴日常生活和飲食。飼養(yǎng)環(huán)境提供12小時(shí)照明，供應(yīng)充足的食物和飲用水，并保持猴房通風(fēng)、清潔，維持室內(nèi)溫度15-25攝氏度。定期對(duì)飼養(yǎng)間進(jìn)行消毒處理，并對(duì)實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行隔離， 禁止與實(shí)驗(yàn)無關(guān)人員進(jìn)入飼養(yǎng)間。2. 3建模前實(shí)驗(yàn)猴行為評(píng)估實(shí)驗(yàn)猴在大動(dòng)物飼養(yǎng)中心單籠飼養(yǎng)3周，飼養(yǎng)期間，固定猴籠及猴籠位置。3周后， 待實(shí)驗(yàn)猴熟悉飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)人員及實(shí)驗(yàn)人員后，采用猴帕金森病行為評(píng)分表(詳見表I) 對(duì)實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，記錄基礎(chǔ)評(píng)分值。使用攝像機(jī)記錄實(shí)驗(yàn)猴活動(dòng)情況并存檔。表1 帕金森病猴行為學(xué)評(píng)分表
權(quán)利要求
1.一種急性全身性猴帕金森病模型的制備方法，其特征在于將劑量為0. 36mg/kg的 MPTP施用于猴，每隔一天施用一次，連續(xù)施用5次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的急性全身性猴帕金森病模型的制備方法，其特征在于所述的施用方式是靜脈注射。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法制備的動(dòng)物模型在篩選治療急性帕金森病的藥物中的用途。
4.一種篩選治療急性帕金森病的藥物的方法，它包括如下步驟a、將劑量為0.36mg/kg的MPTP施用于猴，每隔一天施用一次，連續(xù)施用5次，建立急性全身性猴帕金森病模型；b、將候選藥物施用于動(dòng)物模型；c、觀察候選藥物對(duì)急性帕金森病的量化指標(biāo)的影響情況，并進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)潛在治療急性帕金森病的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選藥物的方法，其特征在于a步驟所述的施用方式是靜脈注射。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種急性全身性猴帕金森病模型的制備方法，將劑量為0.36mg/kg的MPTP施用于猴，每隔一天施用一次，連續(xù)施用5次。所述的施用方式是靜脈注射。本發(fā)明提供了一種篩選治療急性帕金森病的藥物的方法。本發(fā)明經(jīng)外周靜脈連續(xù)注射MPTP可以建立癥狀表現(xiàn)類似中晚期帕金森病患者的急性全身性猴帕金森病模型，該模型建模后1-4個(gè)月癥狀較為穩(wěn)定，其后快速恢復(fù)。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102379873SQ20101027401
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者劉文科, 徐策, 李宏霞, 李鵬, 王偉, 王莉 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院, 國(guó)家成都中藥安全性評(píng)價(jià)中心, 成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司