專利名稱：曼氏裂頭蚴病小鼠動(dòng)物模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種曼氏裂頭蚴病小鼠動(dòng)物模型的建 立方法。
背景技術(shù)：
衛(wèi)生部于200廣2004年在全國(guó)進(jìn)行的人體重要寄生蟲(chóng)病現(xiàn)狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)寄生 蟲(chóng)病的流行趨勢(shì)出現(xiàn)了新的變化，食源性寄生蟲(chóng)病及人獸共患寄生蟲(chóng)病的感染率明顯上 升。曼氏裂頭蚴病正是這樣一種食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，其發(fā)病率正在逐年升高，成為影 響我國(guó)食品安全和人民健康的主要因素之一。曼氏裂頭蚴(sparganum mansoni)為曼氏迭宮絳蟲(chóng)mansoni、飽彌 蟲(chóng)，可侵入人體引起曼氏裂頭蚴病。曼氏迭宮絳蟲(chóng)的生活史中需要3個(gè)宿主，終宿主主要是 貓和犬，第一中間宿主是劍水蚤，第二中間宿主主要是蛙。人可以作為曼氏迭宮絳蟲(chóng)的第二 中間宿主甚至終宿主。人感染曼氏裂頭蚴的途徑主要有用蛙肉或蛇貼敷皮膚傷口，裂頭蚴 從傷口侵入；生吞蝌蚪、生食或半生食蛙、蛇及其他轉(zhuǎn)續(xù)宿主的肉等；飲用生水時(shí)或游泳時(shí) 誤吞被感染的第一中間宿主劍水蚤。曼氏裂頭蚴侵入人體后，其生存期可長(zhǎng)達(dá)12年，甚至 有最長(zhǎng)存活30余年的報(bào)道。曼氏裂頭蚴寄生部位多變，侵入人體后可引起幼蟲(chóng)移行癥，致病的嚴(yán)重程度因移 行和寄居部位不同而異，裂頭蚴侵入皮膚黏膜組織可形成皮下包塊，也可侵入腹腔內(nèi)臟器、 穿過(guò)橫隔侵犯胸腔，最嚴(yán)重的危害是侵入眼部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可致殘疾甚至危及生命。由 于裂頭蚴病缺乏特異性臨床表現(xiàn)，誤診誤治較為普遍。曼氏裂頭蚴病的致病機(jī)理、裂頭蚴在 體內(nèi)的移行路徑是否存在一定規(guī)律、宿主感染后的免疫特點(diǎn)以及免疫病理?yè)p害等均尚不十 分清楚。病原學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)裂頭蚴是確診曼氏裂頭蚴病的主要依據(jù)，但由于人體的感染度通 常較低，有時(shí)僅感染1條裂頭蚴，尤其是蟲(chóng)體寄生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)或其他深部臟器時(shí)，病原 學(xué)檢查難以查見(jiàn)蟲(chóng)體，風(fēng)險(xiǎn)大且漏檢率高，故病原學(xué)診斷存在著很大的局限性。血清學(xué)檢測(cè) 方法是較理想且具有廣闊前景的診斷技術(shù)，可以彌補(bǔ)病原學(xué)診斷的不足，但是，如何長(zhǎng)期獲 得大量生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的特異性診斷抗原，是制約血清學(xué)診斷技術(shù)研究的瓶頸。對(duì)于曼氏裂頭蚴病患者的治療，目前主要采用手術(shù)摘除蟲(chóng)體或局部應(yīng)用40%的酒 精和2%普魯卡因2 4mL局部封閉殺蟲(chóng)，但對(duì)于深部臟器及腦部等不宜手術(shù)的曼氏裂頭蚴 病，目前尚無(wú)滿意的治療方法。吡喹酮及阿苯達(dá)唑等藥物已被應(yīng)用于曼氏裂頭蚴病的治療， 但口服藥物治療的效果還存在疑問(wèn)，療效尚不明確。對(duì)曼氏裂頭蚴病的致病機(jī)理、免疫特點(diǎn)、血清學(xué)診斷、臨床治療等方面的深入研 究，均需要穩(wěn)定的裂頭蚴病動(dòng)物模型和大量生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)化蟲(chóng)種資源。目前使用 的曼氏裂頭蚴蟲(chóng)種主要采集自第二中間宿主蛙或蝌蚪體內(nèi)，由于受到季節(jié)性因素的限制， 不能隨時(shí)獲得曼氏裂頭蚴活蟲(chóng)體，這使得曼氏裂頭蚴病的研究進(jìn)度受到了嚴(yán)重阻礙。因此， 迫切需要建立一種穩(wěn)定的曼氏裂頭蚴病動(dòng)物模型，為曼氏裂頭蚴病的研究提供穩(wěn)定的疾病模型和標(biāo)準(zhǔn)化的蟲(chóng)種資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的曼氏裂頭蚴病小 鼠動(dòng)物模型的建立方法，用以規(guī)范曼氏裂頭蚴蟲(chóng)種資源的保藏方法和活體保種操作技術(shù)， 保證保藏蟲(chóng)種生物學(xué)性狀的穩(wěn)定性，為科研、教學(xué)、檢疫及診斷抗原的生產(chǎn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的蟲(chóng) 種資源。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的曼氏裂頭蚴病小鼠動(dòng)物模型的建立方法，包括下述步驟 第一步，模式動(dòng)物選取選擇2月齡的健康SPF級(jí)昆明小鼠進(jìn)行接種，雌雄不限，接種前 禁食1天；
第二步，曼氏裂頭蚴的采集將從自然感染曼氏裂頭蚴的動(dòng)物體內(nèi)取出的曼氏裂頭蚴 用滅菌生理鹽水清洗后浸泡其中；
第三步，曼氏裂頭蚴的接種將浸泡在無(wú)菌生理鹽水中的曼氏裂頭蚴或剪取的帶有頸 節(jié)的頭節(jié)吸入灌胃器的吸頭內(nèi)，一手固定小鼠，另一手持灌胃器從小鼠的一側(cè)口角插入口 中，沿咽后壁慢慢將吸頭插入食管，將吸頭內(nèi)的裂頭蚴和生理鹽水一起注入小鼠食管；
第四步，感染動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)小鼠被接種后，置于小鼠飼養(yǎng)籠具中，并將其放置在 動(dòng)物房中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)； 第五步，曼氏裂頭蚴的轉(zhuǎn)種
1)選擇2月齡健康SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄不限，轉(zhuǎn)種前禁食1天；
2)將第四步中飼養(yǎng)一定時(shí)期的曼氏裂頭蚴保種小鼠按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例剖殺，分離 出曼氏裂頭蚴，用滅菌生理鹽水清洗后并浸泡在其中；
3)按照上述第三步的接種方法，采用灌胃法進(jìn)行轉(zhuǎn)種；
4)小鼠被轉(zhuǎn)種曼氏裂頭蚴后，置于小鼠飼養(yǎng)籠具中，放置在動(dòng)物房中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管 理?xiàng)l例進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)；
第六步，曼氏裂頭蚴的再次轉(zhuǎn)種
視保種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量多少或健康狀況，根據(jù)研究需要將飼養(yǎng)一定時(shí)期后的曼氏裂頭蚴 感染小鼠在3 12個(gè)月進(jìn)行一次新的復(fù)壯轉(zhuǎn)種保藏；再次轉(zhuǎn)種步驟如前所述，如此反復(fù)，即 可建立穩(wěn)定的曼氏裂頭蚴小鼠動(dòng)物模型，保證曼氏裂頭蚴蟲(chóng)種的延續(xù)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于規(guī)范了曼氏裂頭蚴蟲(chóng)種資源的保藏方法和活體保種操作技術(shù)， 為曼氏裂頭蚴病的免疫特點(diǎn)、免疫病理?yè)p傷、診斷和治療等研究提供了穩(wěn)定的疾病動(dòng)物模 型，為科研、教學(xué)、檢疫及診斷抗原生產(chǎn)單位提供了生物學(xué)性狀穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)化蟲(chóng)種資源，尤 其是使曼氏裂頭蚴病的特異性診斷抗原一排泄分泌(excretory-secretory，ES)抗原的 長(zhǎng)期大批量制備成為現(xiàn)實(shí)，而ES抗原作為曼氏裂頭蚴病診斷抗原時(shí)可顯著提高診斷的特 異性，避免了以往使用曼氏裂頭蚴粗抗原進(jìn)行診斷時(shí)交叉反應(yīng)率高的現(xiàn)象；采用灌胃法將 曼氏裂頭蚴接種及轉(zhuǎn)種到鼠體內(nèi)，操作方法簡(jiǎn)便，且以小鼠作為模式動(dòng)物有利于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)管理，易于掌握和推廣使用；本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)昆明小鼠，該小鼠 為曼氏迭宮絳蟲(chóng)的轉(zhuǎn)續(xù)宿主，對(duì)曼氏裂頭蚴的感染較為敏感，且飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，易于標(biāo)準(zhǔn)化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述的曼氏裂頭蚴病小鼠動(dòng)物模型的建立方法，它包括下述步驟
第一步，模式動(dòng)物選取選擇2月齡的健康SPF級(jí)昆明小鼠進(jìn)行接種，雌雄不限，接種前 禁食1天；
第二步，曼氏裂頭蚴的采集從自然界捕捉野生青蛙或蝌蚪(主要是澤蛙或黑斑蛙等)， 將從自然感染曼氏裂頭蚴的青蛙或蝌蚪體內(nèi)取出的曼氏裂頭蚴用滅菌生理鹽水清洗3次 后浸泡在滅菌的生理鹽水中；
第三步，曼氏裂頭蚴的接種將浸泡在無(wú)菌生理鹽水中的曼氏裂頭蚴完整蟲(chóng)體或剪取 的帶有頸節(jié)的頭節(jié)(剩余蟲(chóng)體可用于制作抗原等)吸入灌胃器的吸頭內(nèi)，一手固定小鼠，另 一手持灌胃器從小鼠的一側(cè)口角插入口中，沿咽后壁慢慢將吸頭插入食管，將吸頭內(nèi)的裂 頭蚴和生理鹽水一起注入小鼠食管；在注入曼氏裂頭蚴后先將被灌胃小鼠置于一未使用的 空白籠具中，仔細(xì)觀察3min以上，確定小鼠沒(méi)有將曼氏裂頭蚴吐出則可認(rèn)為接種成功；
第四步，感染動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)小鼠被接種后，置于小鼠飼養(yǎng)籠具中，籠具外貼置詳 細(xì)標(biāo)簽指示牌，標(biāo)簽指示牌標(biāo)注內(nèi)容須包括接種的蟲(chóng)種名稱、蟲(chóng)種來(lái)源、接種日期、小鼠種 系及級(jí)別、小鼠性別及出生日期、小鼠實(shí)驗(yàn)分組及編號(hào)、管理人員姓名等重要信息，之后將 其置于動(dòng)物房中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行飼養(yǎng)。灌胃后1周內(nèi)每天觀察保種動(dòng)物狀況， 如沒(méi)有出現(xiàn)保種動(dòng)物死亡，說(shuō)明曼氏裂頭蚴保種成功；
第五步，曼氏裂頭蚴的轉(zhuǎn)種
1)選擇2月齡健康SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄不限，轉(zhuǎn)種前禁食1天；
2)將第四步中飼養(yǎng)1個(gè)月以上(一般不超過(guò)1年)的曼氏裂頭蚴保種小鼠按照實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物管理?xiàng)l例剖殺，分離出曼氏裂頭蚴，用滅菌生理鹽水清洗后并浸泡在其中；
3)按照上述第三步的接種方法，采用灌胃法進(jìn)行轉(zhuǎn)種，轉(zhuǎn)種時(shí)可以使用完整蟲(chóng)體，最好 使用帶頸節(jié)的頭節(jié)；因?yàn)橛袝r(shí)候完整蟲(chóng)體較大，沒(méi)有只用帶頸節(jié)的頭節(jié)轉(zhuǎn)種起來(lái)方便，同時(shí) 為了獲得蟲(chóng)體抗原，有時(shí)候在轉(zhuǎn)種之前就把除帶頸節(jié)的頭節(jié)之外的蟲(chóng)體已剪下來(lái)了 ；
4)小鼠被轉(zhuǎn)種曼氏裂頭蚴后，置于小鼠飼養(yǎng)籠具中，籠具外貼置標(biāo)簽指示牌，標(biāo)簽指示 牌標(biāo)注內(nèi)容須包括轉(zhuǎn)種的蟲(chóng)種名稱、轉(zhuǎn)種日期、轉(zhuǎn)種次數(shù)、小鼠種系及級(jí)別、小鼠性別及出 生日期、小鼠實(shí)驗(yàn)分組及編號(hào)、管理人員姓名等重要信息，之后將其放置在動(dòng)物房中按照實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)；
第六步，曼氏裂頭蚴的再次轉(zhuǎn)種
曼氏裂頭蚴在感染小鼠動(dòng)物模型體內(nèi)每月可增長(zhǎng);T5cm左右，一般視保種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù) 量多少或健康狀況，根據(jù)研究需要將飼養(yǎng)一定時(shí)期后的曼氏裂頭蚴感染小鼠在;Γ12個(gè)月 進(jìn)行一次新的復(fù)壯轉(zhuǎn)種保藏；再次轉(zhuǎn)種步驟如前所述，如此反復(fù)，即可建立穩(wěn)定的曼氏裂頭 蚴小鼠動(dòng)物模型，保證曼氏裂頭蚴蟲(chóng)種的延續(xù)，同時(shí)可獲得大量曼氏裂頭蚴活蟲(chóng)體，并可長(zhǎng) 期為曼氏裂頭蚴病研究提供穩(wěn)定的疾病模型。
權(quán)利要求
一種曼氏裂頭蚴病小鼠動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于它包括下述步驟第一步，模式動(dòng)物選取選擇2月齡的健康SPF級(jí)昆明小鼠進(jìn)行接種，雌雄不限，接種前禁食1天；第二步，曼氏裂頭蚴的采集將從自然感染曼氏裂頭蚴的動(dòng)物體內(nèi)取出的曼氏裂頭蚴用滅菌生理鹽水清洗后浸泡其中；第三步，曼氏裂頭蚴的接種將浸泡在無(wú)菌生理鹽水中的曼氏裂頭蚴或剪取的帶有頸節(jié)的頭節(jié)吸入灌胃器的吸頭內(nèi)，一手固定小鼠，另一手持灌胃器從小鼠的一側(cè)口角插入口中，沿咽后壁慢慢將吸頭插入食管，將吸頭內(nèi)的裂頭蚴和生理鹽水一起注入小鼠食管；第四步，感染動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)小鼠被接種后，置于小鼠飼養(yǎng)籠具中，并將其放置在動(dòng)物房中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)；第五步，曼氏裂頭蚴的轉(zhuǎn)種1)選擇2月齡健康SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄不限，轉(zhuǎn)種前禁食1天；2)將第四步中飼養(yǎng)一定時(shí)期的曼氏裂頭蚴保種小鼠按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例剖殺，分離出曼氏裂頭蚴，用滅菌生理鹽水清洗后并浸泡在其中；3)按照上述第三步的接種方法，采用灌胃法進(jìn)行轉(zhuǎn)種；4)小鼠被轉(zhuǎn)種曼氏裂頭蚴后，置于小鼠飼養(yǎng)籠具中，放置在動(dòng)物房中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)；第六步，曼氏裂頭蚴的再次轉(zhuǎn)種視保種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量多少或健康狀況，根據(jù)研究需要將飼養(yǎng)一定時(shí)期后的曼氏裂頭蚴感染小鼠在3~12個(gè)月進(jìn)行一次新的復(fù)壯轉(zhuǎn)種保藏；再次轉(zhuǎn)種步驟如前所述，如此反復(fù)，即可建立穩(wěn)定的曼氏裂頭蚴小鼠動(dòng)物模型，保證曼氏裂頭蚴蟲(chóng)種的延續(xù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種曼氏裂頭蚴病小鼠動(dòng)物模型的建立方法，包括將從自然感染曼氏裂頭蚴的動(dòng)物體內(nèi)取出的蟲(chóng)體用滅菌生理鹽水清洗浸泡；采用灌胃法將蟲(chóng)體注入健康小鼠食管進(jìn)行接種；將接種小鼠飼養(yǎng)一定時(shí)期后再采用灌胃法將其進(jìn)行轉(zhuǎn)種，并對(duì)轉(zhuǎn)種小鼠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，然后根據(jù)需要，將飼養(yǎng)一定時(shí)期后的感染小鼠在3~12個(gè)月進(jìn)行一次新的復(fù)壯轉(zhuǎn)種保藏；如此即可建立穩(wěn)定的曼氏裂頭蚴小鼠動(dòng)物模型。本發(fā)明規(guī)范了曼氏裂頭蚴蟲(chóng)種資源的保藏方法和活體保種操作技術(shù)，為曼氏裂頭蚴病的免疫特點(diǎn)、免疫病理?yè)p傷、診斷和治療等研究提供了穩(wěn)定的疾病動(dòng)物模型，為科研、教學(xué)、檢疫及診斷抗原生產(chǎn)單位提供了生物學(xué)性狀穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)化蟲(chóng)種資源。
文檔編號(hào)A61K49/00GK101926307SQ201010283149
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者姜鵬, 崔晶, 李楠, 王中全, 王書(shū)偉, 王燁 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)