專利名稱：用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾rna及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小分子干擾RNA(即shRNA)，尤其涉及一種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾RNA;另外，本發(fā)明還涉及該小分子干擾 RNA的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
STAT3蛋白作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族(STATs)的一個(gè)重要成員，對細(xì)胞的存活，侵襲和凋亡及血管生成起到了重要的調(diào)控作用，并與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，故亦稱神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤。腫瘤起源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，即神經(jīng)膠質(zhì)、室管膜、脈絡(luò)叢上皮和神經(jīng)實(shí)質(zhì)細(xì)胞，即神經(jīng)元。大多數(shù)腫瘤起源于不同類型的神經(jīng)膠質(zhì)，但根據(jù)組織發(fā)生學(xué)來源及生物學(xué)特征類似，對發(fā)生于神經(jīng)外胚層的各種復(fù)查腫瘤病，一般都稱為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)瘤的分類方法很多，臨床工作者往往采用的是分類比較簡單的Kernohan分類法。各型膠質(zhì)瘤中，以星形細(xì)胞瘤最多，其次為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其后依次為髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、少枝膠質(zhì)瘤、松果體瘤、混合性膠質(zhì)瘤、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤、未分類膠質(zhì)瘤及神經(jīng)元性腫瘤。各型膠質(zhì)瘤的好發(fā)部位不同，如星形細(xì)胞瘤成人多見于大腦半球，兒童則多發(fā)在小腦；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤幾乎均發(fā)生于大腦半球；髓母細(xì)胞瘤發(fā)生于小腦蚓部；室管膜瘤多見于第4腦室；少枝膠質(zhì)瘤大多發(fā)生于在腦半球。膠質(zhì)瘤以男性較多見，特別在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤，男性明顯多于女性。各型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多見于中年，室管膜瘤多見于兒童及青年，髓母細(xì)胞瘤幾乎都發(fā)生在兒童。膠質(zhì)瘤的部位與年齡也有一定關(guān)系，如大腦星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多見于成人， 小腦膠質(zhì)瘤(星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤)多見于兒童。膠質(zhì)瘤大多緩慢發(fā)病，自出現(xiàn)癥狀至就診時(shí)間一般為數(shù)周至數(shù)月，少數(shù)可達(dá)數(shù)年。 惡性程度高的和后顱窩腫瘤病史較短，較良性的或位于靜區(qū)的腫瘤病史較長。腫瘤若有出血或囊變，癥狀會(huì)突然加重，甚至有類似腦血管病的發(fā)病過程。膠質(zhì)瘤的臨床癥狀可分兩方面，一是顱內(nèi)壓增高癥狀，如頭痛、嘔吐、視力減退、復(fù)視、精神癥狀等；另一是腫瘤壓迫、浸潤、破壞腦組織所產(chǎn)生的局灶癥狀，早期可表現(xiàn)為刺激癥狀如局限性癲癇，后期表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺失癥狀如癱瘓。膠質(zhì)瘤的診斷，根據(jù)其生物學(xué)特征、年齡、性別、好發(fā)部位及臨床過程進(jìn)行分析，在病史及體征基礎(chǔ)上，采用電生理、超聲波、放射性核素、放射學(xué)及核磁共振等輔助檢查，定位正確率幾乎是100%，定性診斷正確率可在90%以上。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指由雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制。RNA干擾(RNAi)的基本原理是利用具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)迅速阻斷序列特異的目標(biāo)基因的表達(dá)活性，是實(shí)驗(yàn)室中是一種有效的阻斷基因表達(dá)的工具。
目前，尚未見有關(guān)用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的STAT3基因的小分子干擾 RNA的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾RNA。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供該小分子干擾RNA的制備方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供該小分子干擾RNA的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案在本發(fā)明的一方面，提供一種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾RNA， 其對應(yīng)的序列為正義鏈5，-ACACCG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTG CTT GAA TTG CAT GTCTCC TTG ACT CT-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示；反義鏈5，-AAAAAG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTC AAG CAA TTG CAT GTCTCC TTG ACT CG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備上述用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾RNA的方法，該方法的具體步驟為步驟一、根據(jù)SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設(shè)計(jì)的具體要求， 設(shè)計(jì)對應(yīng)于STAT3基因780-798位，即GAG TCA AGG AGA CAT GCA A的shRNA的寡核苷酸序列(各為53bp)并進(jìn)行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的堿基序列；步驟二、根據(jù)SilenCircle TM RNAi Transcription Kit基因質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒中載體設(shè)計(jì)的具體要求，將設(shè)計(jì)的shRNA的寡核苷酸序列引物和SilenCircle質(zhì)粒進(jìn)行連接， 得到用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾RNA。在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述小分子干擾RNA在制備抑制膠質(zhì)瘤增殖及促其凋亡的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)對膠質(zhì)瘤增殖與凋亡有關(guān)聯(lián)的基因STAT3基因的RNAi，并應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型研究其對抗膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的促進(jìn)作用，為RNAi在膠質(zhì)瘤的治療應(yīng)用提供了一種新方法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染Mat3RNA干擾質(zhì)粒組中的腫瘤生長受到抑制，細(xì)胞凋亡顯著增加，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的小分子干擾RNA能下調(diào)膠質(zhì)瘤中的Mat3基因表達(dá)，能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤的生長并促進(jìn)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤的凋亡。


圖1是本發(fā)明shRNA的寡核苷酸序列引物和質(zhì)粒的連接示意圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中Mat3-RNAi對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響示意圖，其中， Control表示轉(zhuǎn)染空載體組；Stat3 RNAi表示轉(zhuǎn)染Mat3 RNA干擾質(zhì)粒組。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中Mat3_RNAi對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響示意圖，其中， mock表示未轉(zhuǎn)染組；empty vector表示轉(zhuǎn)染空載體組；Stat3 RNAi表示轉(zhuǎn)染Mat3 RNA干擾質(zhì)粒組。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1一、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞系(購買自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心)培養(yǎng)于37°C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化脫壁，之后加入適量培養(yǎng)液并反復(fù)吹打以混勻細(xì)胞；將得到的細(xì)胞懸液移入15ml離心管中，1500rpm離心^iin ；去上清； 用5ml無菌IXPBS將細(xì)胞懸起，吹打混勻；加約Iml細(xì)胞懸液于裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約2天左右傳代1次(主要查看細(xì)胞有無鋪滿培養(yǎng)瓶)。二、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分離取人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本，浸入4°C的KRBB溶液(普通Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液)中，清洗二次，然后將標(biāo)本剪成小塊，轉(zhuǎn)移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，于恒溫?fù)u床中37°C保溫，搖床轉(zhuǎn)速lOOr/min，每IOmin玻璃管反復(fù)吹打一次，放置30min。將該懸液離心500-1000rpm，5min，最后剩下為膠質(zhì)瘤細(xì)胞。用細(xì)胞培養(yǎng)液懸起沉淀，在黑背景的顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)到呈圓形的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。三、STAT3-RNAi質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染1. STAT3-RNAi 質(zhì)粒的設(shè)計(jì)根據(jù) SilenCircle TM RNAi Transcription Kit (購自 Allebe Biotechnology 公司)中載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對應(yīng)于STAT3基因780-798位，即GAG TCAAGG AGA CAT GCA A的shRNA的寡核苷酸序列，各為5!3bp，送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行合成。STAT3-RNAi對應(yīng)的序列為Sense (正義鏈)5，-ACA CCG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTG CTT GAATTG CAT GTC TCC TTG ACT CT-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示；Anti-sense (反義鏈)5，_AAA AAG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTC AAG CAATTG CAT GTC TCC TTG ACT CG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示；*艮據(jù) SilenCircle TM RNAi Transcription Kit (購自 Allebe Biotechnology 公司)中載體設(shè)計(jì)的具體要求，將設(shè)計(jì)的STAT3-RNAi的干擾片段和SilenCircle質(zhì)粒 (購自Allebe Biotechnology公司)連接，參見圖1，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。圖1為 SilenCircle 質(zhì)粒原理的圖解，它使用基于RNA的U6聚合酶III啟動(dòng)子和優(yōu)化的終止子， 從而在靶細(xì)胞內(nèi)可精確地形成小分子干擾RNA (shRNA)。shRNA的表達(dá)質(zhì)粒是一個(gè)預(yù)切好的備用載體。通過質(zhì)粒上攜帶的篩選標(biāo)記，進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染，建立shRNA表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。通過兩個(gè)Silencircle 質(zhì)粒各自與正義的DNA插入片段及反義的DNA插入片段相連接，便可介導(dǎo)shRNA的產(chǎn)生?；蛘邌蝹€(gè)質(zhì)粒與一個(gè)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA插入片段相連接，也可介導(dǎo)shRNA的產(chǎn)生。無論哪種方法，首先必須合成兩段互補(bǔ)的DNA片段。而TO啟動(dòng)子(U6 Promoter)則控制著shRNA的生成(參見圖1)。對于需要進(jìn)行干擾的目的基因，選擇一段靶序列為A2GN17C的DNA片段(靶序列的正義序列)，其GC含量(在DNA4種堿基中，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率稱為GC含量)接近50 %。2. STAT3-RNAi 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，在含有5ml無抗生素的DMEM生長培養(yǎng)基(DMEM生長培養(yǎng)基是一種在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的，含各種氨基酸和葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)基)的60-mm培養(yǎng)皿里種上2X106個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(膠質(zhì)瘤細(xì)胞由上述一、培養(yǎng)得到)。鋪板后第二天準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染首先用500 μ 1無血清的培養(yǎng)基(DMEM)溶解8. 0μ g的STAT3_RNAi表達(dá)載體， 用 500 μ 1 培養(yǎng)基(DMEM 或 RPMI1640)溶解陽離子脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 (20 μ 1)， 輕輕地混勻，室溫孵育5分鐘。孵育后，為促使shRNA表達(dá)載體與Lipofectamine^OOO 充分結(jié)合，將它們輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，以形成DNA-LipofectamineTM2000的復(fù)合物。將DNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入到60mm培養(yǎng)皿，之后將含有 DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物的細(xì)胞培養(yǎng)皿放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6小時(shí)，換上正常細(xì)胞培養(yǎng)液。四、實(shí)驗(yàn)分組與檢測指標(biāo)正常對照組膠質(zhì)瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液為膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液；RNAi組轉(zhuǎn)染過STAT3_RNAi的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液為膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液。膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與凋亡的檢測將ImL用于轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞懸液置于M孔板中， 置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用MTS實(shí)驗(yàn)檢測3d后各組細(xì)胞增殖的情況，如圖2 ； 轉(zhuǎn)染3d后用TUNEL法檢測各組細(xì)胞凋亡的情況，如圖3。圖2表示Mat3_RNAi對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，圖2為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖。由圖 2可知，轉(zhuǎn)染Mat3RNA干擾質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖顯著低于轉(zhuǎn)染空載體組的細(xì)胞增殖率(**p < 0. 01)。圖2中Control-轉(zhuǎn)染空載體組；Stat3RNAi_轉(zhuǎn)染Mat3RNA干擾質(zhì)粒組。圖3表示Mat3對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響，圖3為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖。由圖可知，轉(zhuǎn)染乂站3 RNA干擾質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡率高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組的細(xì)胞凋亡率(**p <0.01)。圖3中mock-未轉(zhuǎn)染組；empty vector-轉(zhuǎn)染空載體組Jtat3 RNAi-轉(zhuǎn)染Mat3 RNA干擾質(zhì)粒組。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)染Mat3 RNA干擾質(zhì)粒組中的腫瘤生長受到抑制，細(xì)胞凋亡顯著增加。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過RNAi技術(shù)下調(diào)膠質(zhì)瘤中的Stat3基因表達(dá)，能夠抑制膠質(zhì)瘤的生長并促進(jìn)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤的凋亡。序列表<110>上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司<120>用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾RNA及其制備方法和應(yīng)用<130>NP-10-14597<160>2<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>53
<212>RNA<213>人工序列<220><221>misc_RNA<222>(1). . (53)<223>shRNA<400>1acaccgagtc aaggagacat gcaattgctt gaattgcatg tctccttgac tct 53<210>2<211>53<212>RNA<213>人工序列<220><221>misc_RNA<222>(1). . (53)<223>shRNA<400>2aaaaagagtc aaggagacat gcaattcaag caattgcatg tctccttgac tcg 5權(quán)利要求
1.一種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾RNA，其對應(yīng)的序列為 正義鏈5’ -ACA CCG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTG CTT GAA TTG CAT GTCTCC TTGACT CT-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示；反義鏈5’ -AAA AAG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTC AAG CAA TTG CAT GTCTCC TTG ACT CG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子干擾RNA的制備方法，其特征在于，該方法的具體步驟為步驟一、根據(jù)SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對應(yīng)于STAT3基因780-798位，即GAG TCA AGG AGA CAT GCA A的shRNA的寡核苷酸序列并進(jìn)行合成，所述的shRNA的寡核苷酸序列序列為如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的堿基序列；步驟二、依據(jù)SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中載體設(shè)計(jì)的要求，將設(shè)計(jì)的 shRNA序列和SilenCircle質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的一種小分子干擾RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子干擾RNA在制備抑制膠質(zhì)瘤增殖與促其凋亡的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡的小分子干擾RNA、其制備方法及其應(yīng)用。該小分子干擾RNA為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的堿基序列。本發(fā)明設(shè)計(jì)對抑制膠質(zhì)瘤增殖并促其凋亡有作用的基因的小分子干擾RNA，應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型研究其對膠質(zhì)瘤增殖的抑制作用和其對膠質(zhì)瘤凋亡的促進(jìn)作用，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供了一種新方法。
文檔編號A61K48/00GK102433336SQ20101029650
公開日2012年5月2日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者夏清梅, 潘謳東, 趙俊玲, 鄭大 申請人:上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司