專利名稱：腦炎病毒蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腦炎病毒蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
腦炎是由病毒直接侵犯或由病毒或其他異種蛋白引發(fā)的超敏反應所致的大腦急 性炎癥性疾病。腦炎可以是病毒性感染原發(fā)的臨床表現(xiàn)，或者是繼發(fā)的臨床表現(xiàn)，引起原 發(fā)的腦炎的病毒有脊髓灰質(zhì)炎病毒，?？刹《尽⒖滤_奇病毒等流行性病毒，或散發(fā)性的通過 蚊子、蜱等節(jié)肢動物傳播的黃病毒屬的森林腦炎和批膜病毒科甲病毒屬的東方馬腦炎病毒寸。甲病毒為披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員，以蚊蜱等吸血 昆蟲為傳播媒介，可引起多種人畜共患傳染病。近年來，國外已對多株甲病毒部分或全部序 列測序。國內(nèi)對這類病毒的分子生物學研究亦取得一定的結(jié)果。已有的研究結(jié)果表明該 病毒屬中和抗體決定簇主要集中在結(jié)構(gòu)蛋白El和E2等糖蛋白上，其中E2蛋白上所占比例 更高。加之近年來腺病毒載體因具有安全性好、宿主范圍廣、感染效率高等多種優(yōu)點，被廣 泛用于基因治療和基因工程疫苗研究，為此我們分析比較了多株甲病毒核苷酸序列，人工 合成了同源性較高的3kb的核苷酸，利用腺病毒載體構(gòu)建重組基因工程疫苗，為預防和治 療疾病奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種與腦炎病毒疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白E2E3，人工合成，是如下1)或2)的蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由529個氨基酸殘基組成，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白質(zhì)E2E3的編碼基因也是本發(fā)明保護的范圍，所述編碼基因為如下1)_4) 中任一所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5，末端第1-1589位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。含有上述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌、表達盒或重組病毒也是本 發(fā)明保護的范圍。所述重組載體為pAdeasy-Ι和重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)過同源重組得到的；所述重組穿梭 質(zhì)粒是在載體PShuttle-CMV的KpNI和HindIII酶切位點間插入所述編碼基因得到的。
所述重組病毒為重組腺病毒；所述重組腺病毒為將上述蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)染宿主 細胞獲得的重組腺病毒。所述宿主細胞為真核細胞，優(yōu)選為離體的哺乳動物細胞，尤其優(yōu)選為HEK-293細 胞。本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗。本發(fā)明提供的疫苗，其活性成分為如下任意一種1)所述的蛋白；2)所述編碼基因；3)所述重組腺病毒。 上述重組腺病毒在制備疫苗中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述疫苗為腦炎病毒疫苗。上述重組腺病毒在制備提高IFN- Y活性的增強劑中的應用也是本發(fā)明保護的范 圍。本發(fā)明的實驗證明，人工合成E2E3通過轉(zhuǎn)染HEK-293細胞而組裝成攜帶有目標 抗原基因的重組腺病毒vAd-E2E3。重組腺病毒vAd-E2E3感染293細胞能有效表達目的蛋 白；通過滴鼻途徑接種BalB/C小鼠，利用間接免疫熒光技術(shù)檢測特異性抗體水平，結(jié)果表 明，所構(gòu)建的重組腺病毒雖然產(chǎn)生特異性抗體的時間和維持的水平有所不同，但均產(chǎn)生了 較好體液免疫反應，為進一步開展免疫保護實驗提供了重要的數(shù)據(jù)支持。由于病毒在機體 內(nèi)極微量的蛋白表達即可激起免疫反應，因此構(gòu)建的攜帶有腦炎病毒結(jié)構(gòu)基因的重組腺病 毒vAd-E2E3，有希望成為腦炎基因工程疫苗的候選疫苗株。


圖1為pAd_E2E3酶切鑒定2為重組質(zhì)粒Pac I酶切和PCR鑒定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。東部馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalomyelitis virus) (HE Jing ；CHANG GuoHui ；WU Jin Song；LI ZhongDuo ；ZHU QingYu :Cloning and expression of E2 gene of eastern equine encephalomyelitis virus. Bulletin of The Academy of Military Medical Sciences. 2002. 02.公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究 所獲得。)HEK-293細胞(Invitrogen公司產(chǎn)品，Cat. No. R750-07)；實驗所需限制性內(nèi)切 酶分別購自TaKaRa和Biolabs公司；脂質(zhì)體Lipofectamin 2000購自Invitrogen公司； Platinum pfx Taqase _ 自 Invitrogen 公司。實施例1、重組腺病毒(vAd_E2E3)的獲得1、含有目的基因pAdtrack-E2E3的構(gòu)建及鑒定根據(jù)東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus) (NC-001547) 的基因組序列，突變序列中的多個位點，設(shè)計出序列表中的序列1，人工合成出序列1。設(shè)計引物擴增編碼E2E3蛋白的基因，引物序列(引物分別含有KpNI和HindIII酶切位點)見下E2E3-F 5' -ACGGggtaccATGTCACTAGTGACCACCATGTGTCT-3’E2E3-R 5' -ACCCaagcttACTAAAAAAGGCACGACACAG-3，以人工合成出序列1的DNA為模板，利用E2E3-F和E2E3-R引物對進行PCR反應， 得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到了預期大小一致的片段，約為1.5Kb。經(jīng)測序，該PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列1自5’末端第1-1589位核苷酸，將該 PCR產(chǎn)物的基因命名E2E3，其OFR為序列1的自5’末端第1-1589位核苷酸，該基因編碼的 蛋白命名為E2E3，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2，序列2由529個氨基酸殘基組 成?；厥誔CR產(chǎn)物，對PCR產(chǎn)物進行加“A”處理，處理后的PCR樣品與pMD_18T載體 (TaKaRa公司產(chǎn)品，Code =DlOlA. Lot CK3201A)相連，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落 提取質(zhì)粒后測序驗證，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列1的自5’末端第1-1589位核苷酸 插入PMD-18T得到的，命名為pTE2E3。用KpNI 和 HindIII 雙酶切重組質(zhì)粒 pTE2E3 和質(zhì)粒 pShuttle-CMV(Invitrogen 公司產(chǎn)品，Catalog#240007)，酶切產(chǎn)物分別用凝膠回收試劑盒切膠回收，并在T4DNA連 接酶作用下于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB(Invitrogen公司產(chǎn)品，Cat. No. 18290-015)后挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒進行測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列1的 自5’末端第1-1589位核苷酸插入pShuttle-CMV的KpnI和HindIII酶切位點間得到的載 體，命名為 pAdtrack-E2E3。2、重組腺病毒載體的構(gòu)建菌BJ5183購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，貨號為GMS12223. 2。將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1 (Invitrogen 公司產(chǎn)品，Catalog#240005，含有 GFP 報告基因)經(jīng)過PacI(購自Biolabs公司，貨號為R05647S)酶切后，轉(zhuǎn)入宿主菌BJ5183 中，得到含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι的宿主菌BJ5183。將上述pAdtrack_E2E3 和穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV 用 PmeI (購自 Biolabs 公司，貨 號為:R0560S)經(jīng)37°C充分消化，使用Gel Extraction kit試劑盒(購自O(shè)MGEA公司，貨號 為D2500-01)回收線性化的 pAdtrack-E2E3 和 pShuttle-CMV。將線性化的質(zhì)粒pAdtrack-E2E3電轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι的宿主 菌BJ5183感受態(tài)細胞中，由于大腸桿菌BJ5183具有Sm抗性，pAdeasy-Ι具有Amp抗性，而 重組質(zhì)粒pAdtrack-E2E3和穿梭載體質(zhì)粒pShuttIe-CMV具有Kan抗性，在重組過程中穿梭 質(zhì)粒上的Kan抗性取代了 pAdeasy-Ι上的Amp抗性，因此根據(jù)Kan和Sm雙重抗性來篩選陽 性克隆，得到的陽性克隆。提取轉(zhuǎn)入線性化的質(zhì)粒pAdtrack-E2E3的陽性克隆的質(zhì)粒進行PacI酶切鑒定， DNA凝膠電泳結(jié)果見圖1所示1 :PAdTrack-E2E32 陽性克隆質(zhì)粒3 :pShuttle_CMV4
pAdeasy-15 :DL15000Marker，從圖中可以看出泳道1重組穿梭質(zhì)粒pAdTack-QE經(jīng)過Pac I酶切后，產(chǎn)生2個片段，其中一個含有目的基因E2E3約7Kb，另一個片段含有穿梭質(zhì)粒 pShuttIe-CMV上的復制子和卡那霉素抗性基因大小約3Kb，泳道2經(jīng)過Pac I酶切后，產(chǎn) 生2個片段，所產(chǎn)生的小片段的大小為4. 5Kb，含有復制子和卡那霉素抗性基因，大片度 為含有目的基因的E2E3的病毒骨架大小約為35Kb (病毒骨架大小約33. 5Kb而目的基因E2E31. 5Kb)。將該重組質(zhì)粒命名為重組質(zhì)粒pAd-E2E3。提取轉(zhuǎn)入線性化的質(zhì)粒pAdtraCk-E2E3的陽性克隆的質(zhì)粒進行PCR鑒定，引物 為 E2E3-F、E2E3-R，結(jié)果見圖 2 所示，1 :pShuttle_CMV 2 :pAdTrack_E2E3 3 :pAd_E2E3 4 pAdeasy-1 5 :DL15000Marker,可以看出，重組質(zhì)粒pAd_E2E3可擴增出與預期的目的片 度1.5Kb，進一步說明說明已經(jīng)成功構(gòu)建攜帶有目的基因E2E3的重組腺病毒骨架質(zhì)粒 pAd-E2E3。3、組裝成重組腺病毒將HEK-293細胞接種到6孔板中，37 °C培養(yǎng)，細胞生長至60 % -70 %，用脂質(zhì)體 Lipofectamin 2000 (購自Invitrogen公司)介導重組腺病毒骨架質(zhì)粒pAd_E2E3轉(zhuǎn)染入細 胞中，轉(zhuǎn)染完成7-10天后，收集細胞，經(jīng)3輪反復凍融，離心收集上清液，即為含有目的基因 的重組腺病毒vAd-E2E3。轉(zhuǎn)染實驗按照說明書進行，培養(yǎng)7-10天，定期在熒光顯微鏡下檢 測是否產(chǎn)生熒光，判斷轉(zhuǎn)染是否成功，由于該重組病毒上含有綠色熒光蛋白(GFP)的報告 基因。4、重組腺病毒vAd_E2E3的擴增及目的蛋白的表達1)重組腺病毒vAd_E2E3的擴增將上述3獲得的轉(zhuǎn)染完成7-10天后，收集細胞，經(jīng)3輪反復凍融，離心收集上清 液，即為重組腺病毒vAd-E2E3，進行下一代擴增，連續(xù)擴增3代，第二次收集上清液，比第一
次數(shù)量增多。2)目的蛋白的表達取200ul上述獲得的第二次收集的上清液(重組腺病毒vAd_E2E3，病毒的濃度為 LgTCID5(1/0. 2ml = 8. 0)感染5xl06的HEK-293細胞，4天后，收集細胞。細胞經(jīng)處理后進行 SDS-PAGE電泳。結(jié)果為經(jīng)SDS電泳，得到大小為110KD的蛋白(E2E3蛋白)，與預期蛋白 的大小一致。說明重組腺病毒有效的介導E2E3在細胞中表達。采用同樣的方法將上述線性化的pShuttIe-CMV和pAdeasy-Ι共同轉(zhuǎn)入宿主菌 BJ5183感受態(tài)細胞中，得到重組腺病毒載體，記作pAd-GFP ；將pAd_GFP轉(zhuǎn)染HEK-293細胞， 獲得陰性對照腺病毒vAd-GFP。對照腺病毒vAd-GFP中無E2E3蛋白表達。實施例2、重組腺病毒(vAd_E2E3)的滴鼻接種中和抗體測定6-7周齡的BALB/c小鼠隨機分為3組，分別為vAd_GFP對照組和vAd_E2E3免疫 組，每組20只小鼠。vAd-GFP對照組拭鼻方式感染20ul由實施例1獲得對照腺病毒 vAd-GFP(108pfu)。vAd-E2E3免疫組拭鼻方式感染20ul由實施例1獲得的重組腺病毒(vAd_E2E3) (108pfu)。PBS對照組拭鼻方式感染20ulPBS溶液(0. 01M/L pH7. 2)一、血清和淋巴細胞檢測將3個小組在第一次免疫后的第4周加強免疫一次。在免疫后每間隔一周時間通 過尾靜脈采集小鼠血液，離心后分別收集血清和淋巴細胞沉淀。1、間接免疫熒光試驗測定免疫小鼠血清中病毒的抗體反應用東部馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalomyelitis virus)感染的HEK-293制備抗原片，制備的方法如下所述實驗前準備把抗原片擺放在抗原架上，每個架上排放2排，1排4個，完畢后用罩 子蓋上防止灰塵的進入。之后按照下面步驟進行1)待75cm2方瓶的HEK-293細胞生長至80%左右的時候，用東部馬腦炎病毒2ml 感染細胞1小時后，吸出吸附液，補加新鮮的細胞維持液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)當細胞出現(xiàn)細胞病變的時候(約25%-50%)，按照細胞傳代的方法消化細胞， 用適量體積的培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的DMEM細胞生長液，具體配方向500mlDMEM液 體中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA、lOOulHEPES，之后用 實驗室配制的經(jīng)過0. 22um濾膜過濾除菌的7. 5% (質(zhì)量百分含量)NaHCO3調(diào)節(jié)溶液的pH 值至7. 0-7. 2，上述液體均為GIBCO公司產(chǎn)品)；3ml)懸浮細胞，每個抗原孔加入40ul細胞 懸液，蓋上蓋子后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8小時；3)取一燒杯內(nèi)盛PBS溶液(0. 01mol/L pH = 7. 2)，將吸附后的抗原片緩緩放入溶 液中，浸泡Imin左右，取出放在工作臺內(nèi)晾干，約需30min ；4)將抗原片放入盛有丙酮(國藥集團化學試劑有限公司分析純濃度99. 5% )的 燒杯中，-20°C 30min或者過夜；5)取出晾干后保存于低溫(-40°C以下)冰箱中備用。間接免疫熒光法采集小鼠全血后放置于37°C培養(yǎng)箱孵育30min，經(jīng)SOOrpm離心 15min后吸取上清得到血清。之后將血清按照實驗要求進行稀釋后進行間接免疫熒光實驗， 具體實驗步驟如下1)從冰箱中取出抗原片，肉眼觀察上面的細胞是否脫落，如果有脫落孔，放棄不 用；2)在抗原片上用蠟筆在吸附有抗原的畫圈周圍劃一圈，防止所加樣品溢流；3)根據(jù)實驗的需要稀釋所檢測的血清后加樣，每孔20-25ul，一般需要做復孔，故 需要50ul，根據(jù)需要做倍比稀釋；首濃度按照1 10，故需要加入IOul血清+90ul抗體稀釋液，在漩渦混合器上充 分混勻后取出50ul 1 10稀釋液+50ul血清稀釋液(1 20)，依此稀釋下去，一般稀釋至 1 160 ；4)把已經(jīng)加樣的抗原片放入鋪有塑料板的飯盒中，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵 育 30min ；5)取出抗原片，放入洗板槽內(nèi)，向里面加入洗滌液(0. 005M PBS+0. 02% (體積百 分含量)Tween 20)，在水平振蕩器上洗滌5min，重復3次；6)待抗原片完全風干后，加入1 50稀釋的熒光抗體25ul/孔，放入飯盒后在 37°C>5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min ；熒光抗體的稀釋取出針對所加入血清來源的適量熒光抗體，用0.02% (質(zhì)量百分含量)伊文斯蘭溶液按照1 50稀釋抗體，該實驗所使用的抗體為 FITC-conjugate-GoatAnti-Human IgG 購自 Sigma 公司。7)重復步驟5)；8)風干后，滴加無菌水在熒光顯微鏡下觀察熒光情況并記錄結(jié)果。利用間接免疫熒光試驗測，結(jié)果顯示在首次免疫2周后小鼠血清抗體水平開始升高，效價達至1 80，3周后降至較低水平；血清效價為1 30。加強免疫后，抗體水平再 次迅速升高，升高幅度比首次免疫整體要高。加免后1周達至達到1 160，并持續(xù)至4周 左右，而對照組vAd-GFP和PBS始終未檢測出特異性抗體。2、流式分析淋巴細胞中⑶/、⑶/數(shù)流式分析淋巴細胞中⑶/、⑶/數(shù)，結(jié)果如下免疫小鼠中，vAd_E2E3免疫1周后⑶4+淋巴細胞占總淋巴細胞的8%，2周以后恢 復至正常水平約占5%，加強免疫后，vAd-E2E3免疫組⑶/淋巴細胞開始持續(xù)升高，由占總 淋巴細胞的5%上升至25%，而PBS對照組以及vAd-GFP組⑶/淋巴細胞一直占總淋巴細 胞的5%，無明顯的改變。免疫組小鼠中，vAd_E2E3免疫1周后達至高峰，CD8+淋巴細胞占總淋巴細胞的 17%，隨后恢復至正常水平約占2%，在首免后3周OT8+淋巴細胞數(shù)量再次升高占總淋巴細 胞的3 % ；加強免疫后，vAd-E2E3免疫組OT8+淋巴細胞開始持續(xù)升高，在免疫2周后達至峰值 約占總淋巴細胞的12 %，3周后下降至正常水平2 %，4周后又緩慢升至較高水平約占8 %， 而PBS對照組以及vAd-GFP組OT8+淋巴細胞一直占總淋巴細胞的7%。二、利用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISP0T)對細胞因子生成細胞進行定量加強免疫4周后，每組隨機挑選4只小鼠，處死后立即無菌采取脾臟，加入 IOml含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液向500ml RPMIMEDIUM1640 液體中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA, IOOul HEPES，之后用實驗室配置的經(jīng)過過濾除菌的7. 5% NaHCO3(質(zhì)量百分比)調(diào)節(jié)溶液 的 PH值為 7. 0-7. 2 ；上述 RPMI MEDIUM1640、胎牛血清、lOOXAntibiotic-Antimycotic、100X NEAA、HEPES均為GIBCO公司產(chǎn)品；RPMI MEDIUM1640GIBC0公司產(chǎn)品，LOT :8109086)，將脾組 織通過200目銅網(wǎng)制成細胞懸液，收集到無菌的離心管中，15000rpm/min離心5min，棄上清 液后用1640培養(yǎng)基離心洗滌細胞兩次，最后將脾細胞稀釋成2 X IO7個/ml，制成細胞懸液 備用。以細胞培養(yǎng)的東部馬腦炎病毒作為特異刺激因子(將2X IO7個/ml個脾細胞IO8Pfu 的東部馬腦炎病毒混合，共同孵育48小時，按照ELISP0T實驗的操作，脾細胞與特異的刺激 因子要分別加入到孔中，之后在孔內(nèi)反應，不能在孔外混合后加入其內(nèi))，利用酶聯(lián)免疫斑 點試驗(ELISP0T)對細胞因子生成細胞進行定量。具體的實驗步驟1. Coating antibody (包被抗體)無菌條件下進行用 Coating buffer (1 X PBS ρΗ7· 2)稀釋 capture 抗體(200 倍)，終濃度 5ug/ml 包被板子，每孔加IOOul稀釋的capture抗體4°C過夜。2. Blocking(封閉)無菌條件下進行吸干孔中包被液，洗板子，每孔加入200ul Blocking溶液，洗孔一次。(在滅菌吸 水紙上扣干)3. Cell Activation(刺激細胞)無菌條件下進行3. 1棄Blocking溶液，準備刺激用的抗原，用組織完全培養(yǎng)基稀釋適宜濃度50ug/ ml，每孔加入IOOul ；(不要拍板子)3. 2準備1 X IO6個脾細胞懸液，每孔加入IOOul ；(注避免震動)3. 3蓋上蓋子，板子放置37°C，5% C02，99%濕度的培養(yǎng)箱根據(jù)細胞情況培養(yǎng)48小時。(注時刻避免碰撞)4. Detection antibody ()4. 1在無菌條件下吸去細胞懸液，用去離子水(冰冷的去離子水，低滲法裂解細 胞)洗2遍，每遍浸泡3-5min，以下實驗操作可以拿到超凈工作臺外進行；4. 2 每孔用 2OOul wash buffer I 洗 3 遍，棄 wash buffer I (最后一遍后拍干)4. 3 稀釋 Detection 抗體，用稀釋 buffer (1 XPBS+10 % FBS) 250 倍稀釋，終濃度 2ug/ml。每孔加入 IOOul ；4. 4蓋上蓋子，室溫培養(yǎng)2小時。5.加入酶連抗體5. 1棄Detection抗體溶液，每孔用200ul wash buffer I洗3遍。(最后一遍拍 干)；5. 2 用稀釋 buffer 稀釋 Str印tavidin-HRP(用稀釋 buffer(lXPBS+10% FBS)稀 釋100倍。現(xiàn)用現(xiàn)配，用完多余的棄之)每孔加IOOul ；5. 3蓋上蓋子，室溫培養(yǎng)1小時。6.結(jié)果檢測6. 1 棄 Streptavidin-HRP 溶液，每孑L用 200ul wash buffer I 洗 4 遍；6. 2 每孔用 200ul wash buffer II洗 2 遍(最后一遍拍干)；6.3加入底物AEC，每孔加IOOul (注意避光)?？刂瓢唿c形成約需要15min ；6. 4用去離子水(洗2遍)終止底物反應；6.5室溫避光空氣吹干板子2小時-過夜，至板子全干，避光保存板子待檢測。注 不要將板子放到烤箱中，防止膜發(fā)脆、破裂。)結(jié)果ELISP0T的結(jié)果是通過最后的板子出斑的數(shù)目來確定，通過肉眼看到 vAd-E2E3免疫組出斑數(shù)目明顯增加，說明經(jīng)東部馬腦炎病毒的刺激后，vAd-E2E3免疫組小 鼠脾細胞分泌IFN- γ活性明顯增高，抗原刺激后vAd-QE免疫組小鼠脾細胞分泌IFN- γ活 性是對照vAd-GFP組的4倍，是PBS對照組的11倍(根據(jù)出斑數(shù)目來統(tǒng)計倍數(shù))。三、攻毒實驗1、發(fā)病和存活狀況加強免疫4周后，vAd-GFP對照組、vAd_E2E3免疫組和PBS對照組的每組處死后剩 余的小鼠在BSL-3實驗室進行攻毒實驗，再將8只小鼠為一組，分為兩組vAd-GFP對照組A 腹腔注射215個LD5tl (半數(shù)致死劑量)東部馬腦炎病毒vAd-GFP對照組B 腹腔注射21個LD5tl東部馬腦炎病毒vAd-E2E3免疫組A 腹腔注射215個LD5tl (半數(shù)致死劑量)東部馬腦炎病毒vAd-E2E3免疫組B 腹腔注射21個LD5tl東部馬腦炎病毒PBS對照組A 腹腔注射215個LD5tl (半數(shù)致死劑量)東部馬腦炎病毒PBS對照組B 腹腔注射21個LD5tl東部馬腦炎病毒持續(xù)4周觀察小鼠發(fā)病和存活狀況。結(jié)果為加強免疫4周后，215個LD50的東部馬腦炎病毒攻擊后，vAd_E2E3免疫組 A的保護效率為0 (8只小鼠都死亡)；21個LD50東部馬腦炎病毒攻擊時，vAd-E2E3免疫組B的保護率僅為25% (8只小鼠死亡6只)；對照組(vAd-GFP對照組A、vAd-GFP對照組B、 PBS對照組A、PBS對照組B)均無保護作用(8只小鼠都死亡)。保護率是最后存活小鼠的 數(shù)量與其攻毒前小鼠的數(shù)量比值。2、利用BHK細胞單層測定小鼠血清中和抗體收集上述攻毒后的各組小鼠的血清，利用BHK細胞(Invitrogen公司產(chǎn)品，Cat. No. R760-07)單層測定小鼠血清中和抗體。先將免疫小鼠血清適當稀釋后，置56°C水浴中 處理30min，破壞其中的補體和其他不耐熱的非特異性毒性因子，然后以維持液(含有2% (體積百分比)胎牛血清的細胞維持液的配置方法向500ml DMEM液體中加入IOml胎牛血 清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAAUOOul HEPES，之后用實驗室配置的經(jīng)過過 濾除菌的7. 5% NaHCO3(質(zhì)量百分比)調(diào)節(jié)溶液的pH值為7. 0-7. 2 ；上述DMEM、胎牛血清、 100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA、HEPES 均為 GIBCO 公司產(chǎn)品)在無菌離心管中 進行2倍連續(xù)稀釋。取100個TCID5tl東部馬腦炎病毒病毒液和等體積不同稀釋度的血清， 充分混勻后置37°C孵育lh，中間上下顛倒離心管混勻液體1-2次，1小時后取出96孔板，其 內(nèi)的BHK細胞已鋪滿單層，吸去細胞單層上的培養(yǎng)基，加入作用過的病毒-抗體混合液(即 上述孵育過的混勻液體，請核實)，培養(yǎng)板上同時設(shè)陽性和陰性對照孔(陽性對照為用細胞 維持液稀釋為100個TCID5tl的東部馬腦炎病毒病毒液，陰性對照為用細胞維持液稀釋的不 同濃度的血清，空白對照為細胞維持液)。放入含有5% C02的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀 察和記錄細胞病變的情況。中和實驗檢測血清效價，具體方法為通過顯微鏡觀察細胞的病變情況(病變時 細胞膨大變圓聚集)，當孔內(nèi)細胞病變達到90%以上記為++++，細胞病變達到75%以上記 為+++，細胞病變達到50%以上記為++，細胞病變達到25%以上記為+，無細胞病變記為一， 最后用Reed-Muench法計算血清的中和指數(shù)。結(jié)果接種病毒前vAd_E2E3免疫組A和vAd_E2E3免疫組B小鼠血清效價均為 1 80，攻毒4周后，接種21個LD50的東部馬腦炎病毒攻擊后的vAd-E2E3免疫組B存活 小鼠的血清效價為1 300，215個LD50東部馬腦炎病毒攻擊后的vAd_E2E3免疫組A的存 活小鼠血清效價則為1 30。而對照組(vAd-GFP對照組A、vAd-GFP對照組B、PBS對照組 A、PBS對照組B)均無特異性抗體的產(chǎn)生。結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組腺病毒vAd_E2E3產(chǎn)生了較好體液免疫反應，為進一步開 展免疫保護實驗提供了重要的數(shù)據(jù)支持。
權(quán)利要求
一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)或3) 或4)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第1-1589位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌、表達盒或重組病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pAdeasy-Ι和 重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)過同源重組得到的；所述重組穿梭質(zhì)粒是將所述編碼基因插入到載體 pShuttle-CMV的多克隆位點間得到的質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組病毒，其特征在于所述重組病毒為重組腺病毒；所述重組腺病毒為將所述重組載體轉(zhuǎn)入宿主細胞后，得 到的重組腺病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的重組病毒，其特征在于所述宿主細胞為真核細胞，優(yōu)選 為離體的哺乳動物細胞，尤其優(yōu)選為HEK-293細胞。
8.一種疫苗，它的活性成分為如下任意一種1)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)；2)權(quán)利要求2或3所述編碼基因；3)權(quán)利要求4或6或 7所述重組腺病毒。
9.權(quán)利要求4或6或7所述重組腺病毒在制備疫苗中的應用，所述疫苗為腦炎病毒疫田ο
10.權(quán)利要求4或6或7所述重組腺病毒在制備提高IFN-Y活性的增強劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腦炎病毒蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明獲得的重組腺病毒vAd-E2E3有希望成為腦炎基因工程疫苗的候選疫苗。
文檔編號A61P31/14GK101967185SQ20101050616
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者吳曉燕, 孫偉, 常國輝, 康曉平, 張雨, 戶義, 李靖, 楊銀輝, 林磊, 柳洪濤, 祝慶余, 羅彥軍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所