專利名稱：槲皮素在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是槲皮素在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
正常人每IOOg肝濕重約含4 5g脂類，其中磷脂占50%以上，甘油三酯(TG)占 20%，游離脂肪酸占20%，膽固醇約7%，余為膽固醇酯等。當肝細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積超過肝濕重的5%，或組織學上每單位面積見1/3以上肝細胞脂變時，即稱為脂肪肝。臨床上常根據(jù)飲酒與否，將其分為酒精性和非酒精性。非酒精性脂肪性肝病(non alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種病變主體在肝小葉，以肝細胞脂肪變性和脂肪貯積為病理特征但無過量飲酒史的臨床綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化三種主要類型。 NAFLD雖通常被認為是一種良性及靜止的病變，但可在較短期內(nèi)發(fā)展為不可逆的肝損害，其肝纖維化的發(fā)生率高達25%，且約1. 5% 8%的患者可進展為肝硬化。因此積極防治脂肪肝對阻止慢性肝病進展和改善預(yù)后有著十分重要的意義。目前治療NAFLD的藥物主要有增加胰島素敏感性、改善胰島素抵抗的噻唑烷二酮類和雙胍類，降血脂的煙酸類和他汀類、抗氧化劑等，都不同程度具有一定的副作用。一、噻唑烷二酮類藥物(TZDs) :TZDs是人工合成的過氧化物體增殖物激活受體 (PPARy)的高親合性配體。PPARy分布于胰島素作用的關(guān)鍵靶組織，包括脂肪、骨骼肌和肝臟等，具有調(diào)解胰島素效應(yīng)、基因轉(zhuǎn)錄及控制葡萄糖產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運和利用的作用。許多臨床研究已顯示，TZDs具有控制血糖、保護β細胞功能、改善胰島素抵抗的作用。最新的研究表明，TZDs藥羅格列酮能夠改善NAFLD的組織學水平和肝功能。同類藥物中還有曲格列酮、 匹格列酮等，目前尚無足夠的證據(jù)證明哪種藥物更有效。但TZDs類藥物有肝毒性、體重增加、液體潴留和導(dǎo)致骨質(zhì)丟失等毒副作用。因此， 目前并未被推薦為治療NAFLD的治療藥物。二、雙胍類藥物代表藥物為二甲雙胍，此藥可促進脂肪組織攝取葡萄糖，減少葡萄糖在腸道的吸收，能明顯增強外周組織對胰島素的敏感性，并有一定的減輕體重、降低高胰島素血癥、TNF-α、瘦素和游離脂肪酸水平，改善肝臟胰島素抵抗的作用。很多研究表明二甲雙胍可以明顯改善NAFLD的肝損害，并由于二甲雙胍的應(yīng)用，使與之合并存在的代謝綜合癥明顯的改善。目前比較認可的是二甲雙胍在不增加體重的情況下，可以明顯地改善谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血脂、胰島素抵抗、瘦素等生化學指標及肝臟細胞炎癥、纖維化、脂肪變性等病理學指標。但雙胍類易引起乳酸性酸中毒的危險，特別是對年齡雖不太大，但心血管、肺、肝、 腎有問題的糖尿病病人，由于體內(nèi)缺氧，乳酸的生成增多，而其代謝、清除發(fā)生障礙，更容易發(fā)生乳酸性酸中毒。此外，二甲雙胍還易引起食欲下降、惡心、嘔吐、口干、口苦、腹脹、腹瀉等消化道反應(yīng)。目前該類藥也未被推薦為治療NAFLD的有效藥物。三、降低血脂的藥物NAFLD脂代謝紊亂，肝細胞甘油三酯(TG)的合成與分泌之間失去平衡最終導(dǎo)致脂質(zhì)在肝細胞內(nèi)過度沉積，患者常伴有高脂血癥，故降脂藥物一直是治療脂肪肝的研究熱點之一。臨床具有降低血脂的代表藥物為羥甲基戊二酸單酰輔酶 (HMG-CoA)還原酶抑制劑，包括普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀等。它們通過抑制膽固醇合成的限速酶HMG-CoA還原酶的活性而發(fā)揮作用，臨床證實具有肯定的降血脂療效。大多數(shù)降脂藥物本身具有一定的肝損傷作用，且停藥可反彈，并且不能有效改善肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，臨床上是否用降脂藥物來治療脂肪肝，尚有爭議。四、中藥治療隨著世界回歸天然熱潮的逐步形成，植物提取類藥物也有較好的發(fā)展前景。許多單味藥或復(fù)方制劑都顯示了降脂，緩解轉(zhuǎn)氨酶升高、脂肪變性、炎癥和肝纖維化程度方面等都顯示出一定的治療作用。但是，從目前的研究表明，沒有哪種確切的藥物對NAFLD是有效的，在NAFLD的發(fā)病率不斷增加、缺乏理想的西藥的情況下，在中藥中探索新的治療藥物顯得尤為重要，對防治NAFLD將有著積極的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對不足，提出一種槲皮素在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用，能有效改善具有胰島素抵抗的非酒精性脂肪肝細胞模型的脂質(zhì)堆積程度、有效降低甘油三酯水平，對肝細胞膜具有保護作用。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案槲皮素在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用。槲皮素可從胡頹子科沙棘屬植物沙棘、殼斗科植物伊比利亞櫟的皮和葉、小檗科植物紅八角蓮、金絲桃科植物紅旱蓮(湖南連翹)全草和夾竹桃科植物紅麻葉中提取。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中槲皮素能有效改善具有胰島素抵抗的非酒精性脂肪肝細胞模型的脂質(zhì)堆積、有效降低甘油三酯水平，對肝細胞膜具有保護作用。


圖1是本發(fā)明的槲皮素對脂質(zhì)堆積模型的影響；圖2是槲皮素不同劑量對肝細胞脂質(zhì)堆積模型的影響；圖3是槲皮素的量效關(guān)系；附圖標記說明Con-正常對照組細胞；Model-模型對照組細胞；Ber-黃連素處理過的細胞；Que-槲皮素處理過的細胞。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。一、槲皮素改善NAFLD的作用1.脂質(zhì)堆積細胞模型的建立用含有10%新生小牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng) HepG2細胞，將生長至80% 90%匯合的H印( 細胞按照IX IO4個細胞/毫升的密度接種至48孔板中，約M小時后，待孔中IfePh細胞生長至80 90%匯合時，吸棄舊培養(yǎng)基，再用無菌PBS洗滌1 2次。每孔加入500 μ 1脂質(zhì)堆積誘導(dǎo)溶液(脂質(zhì)堆積誘導(dǎo)溶液5mM 的油酸鈉溶液、5% BSA的DMEM培養(yǎng)液、無血清DMEM培養(yǎng)基以及5000nM的長效胰島素溶液配制成胰島素抵抗誘導(dǎo)培養(yǎng)液，使其終濃度為長效胰島素ΙΟΟηΜ、油酸鈉lmM、l % BSA)，誘導(dǎo)48小時。2.藥物處理研究分為正常對照組、模型組、陽性藥小檗堿組和槲皮素組。正常對照組細胞在吸棄舊培養(yǎng)基后，換上含有0. DMSO以及BSA的無血清低糖DMEM培養(yǎng)基；模型對照組細胞在吸棄舊培基后，換上脂質(zhì)堆積誘導(dǎo)溶液；陽性藥物小檗堿處理組細胞換上脂質(zhì)堆積誘導(dǎo)溶液后，再加入小檗堿至培養(yǎng)基中的藥物終濃度為10- ；槲皮素處理組細胞換上脂質(zhì)堆積誘導(dǎo)溶液后，再加入槲皮素至培養(yǎng)基中的藥物終濃度為分別為io_4M、I(^M、 KTfiM各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時。另外，為研究槲皮素的量效關(guān)系，分別給以5Χ1(ΤΜ、 2. 5 X 10_5M、1 X 10_5M、5 X 10_6Μ、1 X 1(Γ6Μ和5 X 1(Γ7Μ劑量的槲皮素作用于脂質(zhì)堆積模型，研究其對脂質(zhì)堆積模型細胞改善作用。3. MTT法測定藥物安全性將細胞種至48孔板上(1*10Ε4/板)24小時，給以 10exp-4、5*10exp-5、10exp-5、5*10exp-6、10exp-6、5*10exp-7 劑量的槲皮素。給藥 48h 后， 加入MTT20ul，池，棄其上清，加入lOOulDMSO，充分溶解，在540nm處測OD值。檢測對正常 HepG2細胞生長的細胞毒性。以正常對照組(Con)細胞存活率作為100%，當細胞存活率低于80%則認為樣品具有明顯的細胞毒性。4.油紅0實驗取油紅0貯存液15ml，加入IOml純水，室溫下靜置10分鐘，用濾器過濾后即為油紅0工作液。吸棄48孔板各孔中的舊誘導(dǎo)液，每孔用ImlPBS洗滌1 2次后，每孔加500 μ 1油紅0工作液，于室溫下染色15分鐘，然后每孔用Iml純水洗3次至背景透明。在顯微鏡下觀察，可見胞質(zhì)中脂滴呈亮紅色，照相記錄。然后每孔加入200μ1異丙醇，室溫搖晃孵育15分鐘進行抽提，取抽提液200 μ 1放入96孔板，于510nm讀吸光度。5.細胞內(nèi)的甘油三酯測定吸棄48孔板各孔中的舊誘導(dǎo)液后，用37°C溫育的PBS 沖洗2 3遍，加入適量的冰預(yù)冷的RIPA裂解液后，置于冰上10 20min。用細胞刮刮下細胞后，收集在EP管中后，用超聲裂解儀裂解(100 200w)3s，共2次。低溫高速離心G°C， 12000g，2min)。取50 μ 1上清液，使用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。其余上清液加入2倍體積的甲醇氯仿混合萃取液(V/V = 2 1)，充分混勻進行萃取，靜置30min后，然后進行離心，12000g, 2min)，棄去上層溶液，在70°C條件下?lián)]干下層溶液，然后加入20 μ 1PBS， 溶解脂質(zhì)，最后按照試劑盒說明書，使用甘油三酯試劑盒測定細胞內(nèi)甘油三酯。 根據(jù)上述試驗結(jié)果討論如下一、槲皮素對脂質(zhì)堆積模型的油紅染色的影響如圖1所示，正常對照組細胞(Con)的胞質(zhì)中沒有明顯的著色。而模型對照組細胞 (Model)的胞質(zhì)中被油紅0染成的亮紅色脂滴多而大，脂肪變性明顯，說明形成脂質(zhì)堆積模型。在給予了陽性藥物小檗堿和化合物槲皮素處理后，可見細胞內(nèi)紅色脂滴較Model的數(shù)量減少、體積減小。用油紅0定量的方法測定細胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積程度，結(jié)果與鏡下照片的結(jié)果一致。相比Con，M0del脂質(zhì)堆積嚴重，油紅0著色量明顯增加(P < 0. 001)；相比Model， 槲皮素高、中劑量處理后，其細胞的脂質(zhì)堆積程度得到顯著性的改善，其油紅0著色量明顯降低(P < 0. 01)；此作用與陽性藥小檗堿(P < 0. 001)類似。
二、槲皮素不同劑量對脂質(zhì)堆積模型的影響由圖2可以看出，模型組與對照組比較，具有顯著性差異(P < 0. 001)；陽性藥小檗堿與模型組比較具有顯著性差異(P <0.001)，抑制脂肪細胞形成達55. 2% ；高、中劑量組與模型組比較具有顯著性差異(P < 0. 001)，抑制率分別為60. 7 %和58. 3 %，抑制程度與陽性藥相當。而低劑量組抑制率為13. 5%，與模型組比較沒有顯著性差異(P > 0. 05)。由此說明，槲皮素高、中劑量對脂質(zhì)代謝的影響。三、槲皮素的量效關(guān)系槲皮素分別為10^1、5\10^\1、10^\1、5\10^1、10^1、5\10^1、10^\1，從圖 3 可以看出，槲皮素對脂質(zhì)代謝的影響可呈現(xiàn)劑量依賴性。IC50為6.91E-6。四、槲皮素對甘油三酯的影響從表1可以看出，槲皮素能降低肝細胞脂質(zhì)堆積模型細胞中甘油三酯的水平表1槲皮素對肝細胞脂質(zhì)堆積模型細胞中甘油三酯含量的影響
權(quán)利要求
1.槲皮素在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種槲皮素在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中槲皮素能有效改善具有胰島素抵抗的非酒精性脂肪肝細胞模型的脂質(zhì)堆積程度、有效降低甘油三酯水平，對肝細胞膜具有保護作用。
文檔編號A61P1/16GK102327260SQ20101051957
公開日2012年1月25日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者劉青妍, 李秀麗 申請人:李秀麗