專利名稱：一種核桃殼提取物及其抗艾滋病毒的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種核桃殼提取物及其醫(yī)藥用 途。該提取物表現(xiàn)出有效的體外抑制艾滋病毒功能，治療指數(shù)較高，可以預(yù)期發(fā)展成為防治 艾滋病的藥物。
背景技術(shù)：
艾滋病的醫(yī)學(xué)全名為“獲得性免疫缺陷綜合征”(Acquiredlmmune Deficiency Syndrome，即AIDS)，由人類免疫缺陷病毒(HIV，又稱艾滋病病毒)引起。HIV病毒是一種能 攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒，它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T4淋巴細(xì)胞作為攻擊目標(biāo)，大量 吞噬、破壞T4淋巴細(xì)胞，從而破壞人的免疫系統(tǒng)，最終使免疫系統(tǒng)崩潰，使人體因喪失對各 種疾病的抵抗能力而發(fā)病，從而發(fā)生多種感染或腫瘤，最后導(dǎo)致死亡。當(dāng)HIV感染者的免疫 功能受到病毒的嚴(yán)重破壞、以至不能維持最低的抗病能力時，感染者便發(fā)展為艾滋病病人。HIV在病毒分類學(xué)上屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)慢病毒屬(Ientivirus)，目 前已發(fā)現(xiàn)兩種HIV病毒株系，分別為HIV-I和HIV-2。兩者具有相似的病毒結(jié)構(gòu)和傳播途 徑。HIV-2主要分布于非洲西部，在歐洲和美洲的一些感染者中也被檢測到。其毒力和傳播 力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程較慢且較緩和。HIV-I廣泛分布于世界各地，是引起全 世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-I為主進(jìn)行的。艾滋病的危害席卷全球，蔓延之勢十分迅猛。1984年，全世界報告的艾滋病患者 不足3000人。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署發(fā)布的《2008艾滋病流行狀況報告》指出截至2007 年底，艾滋病已經(jīng)導(dǎo)致2500萬人死亡，另有3300萬人受感染，其中我國有70萬人。我國自 1985年首次發(fā)現(xiàn)HIV病毒感染者，至今已有60 80萬人發(fā)生了感染，專家估計，如果不迅 速采取有效的預(yù)防措施，按目前的年平均30%的增長速度，到2010年，我國的HIV感染者將 超過1000萬。在非洲的有些國家，HIV的感染率達(dá)總?cè)丝?30%以上。因此，預(yù)防和治療艾 滋病，已不僅僅是挽救個人生命的問題，而是關(guān)系到民族存亡的大事。艾滋病目前仍是不治之癥。歷史上許多曾嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，都因開發(fā)出 有效的疫苗而被控制甚至消滅，例如天花、小兒麻痹、麻疹等。但目前人類還沒有研制成功 艾滋病疫苗，科學(xué)家們?nèi)栽谂?。因此，研制抗HIV藥物迫在眉睫。目前，艾滋病的治療一 方面是抑制病毒，增強(qiáng)免疫功能，另一方面是防治機(jī)會性感染，緩解癥狀、延長生命。經(jīng)過幾 年的實(shí)踐證明，最行之有效的治療措施是增加使用有效的抗HIV藥物，通常使用聯(lián)合療法， 包括核苷類(如美國FDA推薦應(yīng)用的AZT (重氮脫氧胸苷))、非核苷類及蛋白酶抑制劑在內(nèi) 的兩種或多種藥物。這樣的聯(lián)合療法被認(rèn)為是高效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART，或稱“雞 尾酒療法”)。但HAART并不能根除體內(nèi)的病毒，而長期的藥物治療也會帶來一些副作用，且 價格較高(每人每年高達(dá)15000美金)。國內(nèi)的專家正將目光瞄準(zhǔn)中藥領(lǐng)域，發(fā)掘中國醫(yī)藥 學(xué)寶庫，力圖找到能有效抑制病毒、修復(fù)人體免疫力、低毒、廉價的抗HIV藥物，而我們的前 期研究已看到了希望。核桃殼為胡桃科植物泡核桃Juglans sigillata、胡桃Juglans reglia、核桃楸Juglans mandshurica、野核桃Juglans cathayensis等的成熟果實(shí)硬殼。核桃又名胡桃、羌 桃，是世界四大干果之一，食用具有豐富的營養(yǎng)價值。核桃入藥，通常用其種仁?！侗静菥V目》 記述，核桃仁有“補(bǔ)氣養(yǎng)血，潤燥化痰，益命門，處三焦，溫肺潤腸，治虛寒喘咳，腰腳重疼，心 腹疝痛，血痢腸風(fēng)”等功效。據(jù)現(xiàn)有報道，核桃仁具有防治心腦血管疾病、改善消化系統(tǒng)功 能、治療膽石癥、清除自由基、消炎殺菌、防癌抗癌等功效。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人類生活 水平的提高，人們對核桃資源的開發(fā)研究已不僅是以核桃仁為主，在核桃的樹皮、果(青) 皮、枝條、葉、花、堅果殼的應(yīng)用研究上也取得了新的進(jìn)展。然而，關(guān)于核桃的樹皮等部位的 應(yīng)用研究還局限于工藝品制作、飼料、活性炭原料等方面。關(guān)于核桃的堅果殼在制備藥物方 面的應(yīng)用研究除中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)?200710056996. 8)表明核桃殼的醇提取物具 有一定的強(qiáng)心及改善心肌供血的活性外，其余方面的應(yīng)用尚未見報道；且該技術(shù)方案僅涉 及核桃殼的乙醇提取部位，對于核桃殼的其他提取物的制藥用途也未見報道。世界上出產(chǎn)核桃的國家很多，除我國外，還有美國、法國、意大利、印度、土耳其等。 核桃在我國具有2000多年的栽培歷史，栽培面積為世界最大。2008年我國的核桃總產(chǎn)量達(dá) 到83萬噸，居世界前列。核桃在我國絕大部分省區(qū)均有栽培分布，其中云南是著名核桃產(chǎn) 區(qū)，年產(chǎn)量居全國之首。隨著近年來核桃加工工業(yè)的發(fā)展，大量的核桃殼下腳料得以收集利用。核桃加工 出仁率按45-50%計算，核桃出殼率達(dá)50-55%，折算起來現(xiàn)在每年可有41-45萬噸的核桃 殼資源可以利用。現(xiàn)在核桃殼主要直接作為生產(chǎn)活性炭的原料、制造環(huán)保濾料進(jìn)行污水處 理、以及在油田中應(yīng)用、研磨材料制造等。核桃殼作為藥物的應(yīng)用研發(fā)還很少?，F(xiàn)代研究表 明核桃殼具有抗氧化活性，能有效地清除羥基自由基，而對超氧陰離子無清除作用，可與同 濃度的茶多酚相媲美。但單純抗氧化活性，很難確定其在哪一類疾病中應(yīng)用能有較好的防 治效價。因核桃殼的藥理活性、功能主治的研究在國內(nèi)外開展尚少，影響了這一豐富天然 資源的有效開發(fā)和利用，長期以來造成這一藥用資源的巨大浪費(fèi)。以云南省為例，云南大理 漾濞縣為核桃之鄉(xiāng)，大量種植泡核桃Juglans Sigillata。大理漾濞核桃有限責(zé)任公司對核 桃的深加工、精加工已取得良好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益，成為省、州、縣的龍頭企業(yè)，被譽(yù)為 云南省的“企業(yè)之星”，為漾濞縣的“富民強(qiáng)縣”做出了積極貢獻(xiàn)。然而，被廢棄的核桃殼在 當(dāng)?shù)刂挥米鋈剂希⑽丛倮?。因此，將核桃殼按現(xiàn)代工藝進(jìn)行提取分離并尋找其有效抑制 艾滋病毒的有效部位既有巨大的社會效益又有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。在作了一系列相關(guān)研究后 我們發(fā)現(xiàn)了一種十分經(jīng)濟(jì)有效的核桃殼抗HIV病毒有效部位的制備方法，并據(jù)此完成了本 發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗HIV功能的核桃殼提取物，并公開了該提取物 用于制備防治艾滋病的藥物的用途。具體而言，本發(fā)明中核桃殼具抗艾滋病毒活性的有效部位提取物的制備方法如 下用堿溶液浸泡提取經(jīng)粉碎的核桃殼、醇沉、濃縮提取回收溶劑得到的抑制Hiv病毒生長 活性有效部位經(jīng)減壓濃縮至無醇味、干燥得產(chǎn)品。本發(fā)明中的核桃殼可以是泡核桃Juglans sigiIlata、胡桃Juglansreglia、核桃楸Juglans mandshurica、野核桃Juglans cathayensis或胡桃科胡桃屬其他植物中的一種 或多種。本發(fā)明所述的核桃殼提取物藥物組合物是由核桃殼堿溶液提取物和藥學(xué)上應(yīng)用 的各種制劑輔料，通過合理組合制成的用于醫(yī)療目的的制劑。本發(fā)明具有抗HIV病毒功能的核桃殼提取物可以與現(xiàn)已上市的抗艾滋病藥 物如重氮脫氧胸苷(AZT)、齊多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、地拉韋定 (delavirdine)、沙喹那韋、奈韋拉平(nevirapine)、利托那韋(ritonavir)和吲哚那韋等 聯(lián)合使用，制備得到具有艾滋病毒抑制活性的組合物，可用于治療艾滋病。該類藥物組合物 可以采用片劑、膠囊劑等劑型藥物，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型。這些 藥物組合物可以用于治療艾滋病、延長艾滋病人生存時間和/或質(zhì)量等用途。本發(fā)明的有益之處是核桃樹自然資源豐富，本發(fā)明提取物原料核桃殼資源豐富 易得，提取工藝簡單、成分及藥效穩(wěn)定，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。此外，該項研究完全有希望研發(fā)出 一種對核桃種植業(yè)，尤其是邊疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展有重大推動作用的抗艾滋新藥。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例給出 了代表性的部分核桃殼提取物的制備方法和抗HIV病毒活性數(shù)據(jù)的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明其 在抗艾滋病藥物研究領(lǐng)域中的用途。必須說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是 對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范 圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例1 核桃殼提取物A的制備核桃殼粗品1千克，粉碎，加800毫升的氫氧化鈉溶液(1摩爾/升)，常溫浸泡過 夜，過濾。再加入700毫升的氫氧化鈉溶液(1摩爾/升)，放置2小時，過濾，合并濾液。在 濾液中加入冰醋酸至PH = 5，放置1小時，過濾。濾液加入1倍量乙醇(95% )，放置1小 時，過濾。濾液再加入1倍量乙醇(95% )，放置1小時，過濾，得沉淀a。將a置40°C減壓， 烘干2小時，得干品1. 8克即得產(chǎn)品A。提取率0. 18%。實(shí)施例2 核桃殼提取物B的制備核桃殼粗品1千克，粉碎，加800毫升的氫氧化鈉溶液(1摩爾/升)，常溫浸泡過 夜，過濾。再加入700毫升的氫氧化鈉溶液(1摩爾/升)，放置2小時，過濾，合并濾液。在 濾液中加入冰醋酸至PH = 5，放置1小時，過濾。濾液加入1倍量乙醇(95% )，放置1小 時，過濾。濾液再加入1倍量乙醇(95%)，放置1小時，過濾。濾液繼續(xù)加入3倍量乙醇 (95% )，放置1小時，過濾，得沉淀b。將b置40°C減壓，烘干2小時，得干品1. 0克即得產(chǎn) 品B。提取率0. 1%0實(shí)施例3 核桃殼提取物A抑制HIV病毒的活性試驗(yàn)3. 1實(shí)驗(yàn)原理與依據(jù)根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)發(fā)布的“抗HIV藥物 非臨床藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(2006)”，采用國際通用實(shí)驗(yàn)方法對藥物的抗HIV-I活性 進(jìn)行檢測。3. 2材料與方法3. 2. 1測定藥物和化合物待測樣品為根據(jù)實(shí)施例1制備得到的核桃殼提取物A(以下簡稱“樣品1”)。待測樣品溶解于DMSO中，4°C保存，貯存濃度為25. 0毫克/毫升。3. 2. 2試劑和溶液生物緩沖劑HEPES (N-2-羥乙基哌嗪-N' _2_乙磺酸)、噻唑 M MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide)> DMF (N, N-二甲基甲酰胺)、青霉素(Penicillin)、硫酸鏈霉素(Str印tomycin sulfate)、谷氨酰胺 (Glutamine)均購自 Sigma 公司；2-巰基乙醇(2-ME，2-Mercaptoethanol)為 Bio-Rad 公司 產(chǎn)品。RPMI-1640和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。3. 2. 3細(xì)胞和病毒人T淋巴細(xì)胞系C8166細(xì)胞、MT-4細(xì)胞以及HIV-I實(shí)驗(yàn)株 HIV-Iiiib 均由英國 Medical Research Council, AIDS ReagentProject 惠贈。所有細(xì)胞和 病毒均以含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備HIV-Iiiib, 滴定并計算出病毒的TCID5tlt5病毒貯存液分裝后，置_70°C保存。細(xì)胞和病毒按常規(guī)方法凍 存和復(fù)蘇。3. 2. 4HIV-1 感染性滴定HIV_1IIIB 按 Johnson&Byington (1990)所述方法改良進(jìn) 行滴定，簡述如下將HIV-Iiiib貯存液在96孔板上作4倍稀釋，10個梯度，每梯度6個重復(fù) 孔，同時設(shè)置對照孔6孔。每孔加入C8166細(xì)胞50微升，每孔終體積為200微升。37°C，5 % CO2培養(yǎng)。第3 天補(bǔ)加新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基100微升，第7天在倒置顯微鏡下觀察每孔中HIV-Iiiib 誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CytopathicEffectCPE)，以每孔是否有合胞體(Syncytium)的形成 確定；按Reed&Muench方法計算病毒的TCID5tl (50%組織培養(yǎng)染毒濃度)。3. 2. 5對C8166細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)4X IO5/毫升C8166細(xì)胞懸液100微升與不同的 待測藥物溶液混合，設(shè)3個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含藥物的對照孔，37°C，5% CO2培養(yǎng)3天， 采用MTT比色法檢測細(xì)胞毒性。ELx800酶標(biāo)儀測定OD值，測定波長為595nm，參考波長為630nm。計算得到CC5tl值 (50%抑制細(xì)胞生長濃度)，即對50%的正常T淋巴細(xì)胞系C8166細(xì)胞產(chǎn)生毒性時的藥物濃度。3. 2. 6對HIV-Iiiib致細(xì)胞病變(CPE)的抑制實(shí)驗(yàn)將8 X IO5/毫升C8166細(xì)胞50 微升/孔接種到含有100微升/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，然后加入50 微升的HIV-Iiiib稀釋上清，1300TCID50/孔。設(shè)3個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含藥物的正常細(xì) 胞對照孔。AZT為陽性藥物對照。37°C，5%C02培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下(100X)計數(shù)合胞 體的形成。EC5tl(50%有效濃度)為抑制合胞體形成50%時的藥物濃度。3. 2. 7計算公式根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制劑量反應(yīng)曲線，按Reed&Muench法計算出化合 物抑制病毒的50%有效濃度(EC5tl), 50%抑制細(xì)胞生長濃度(CC5tl)及抗HIV-I活性的治療 指數(shù) TI 值(Therapeuticindex)。1、細(xì)胞生長存活率(％ )=實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值X 1002、HIV-I致細(xì)胞病變的抑制率(％) = (1-實(shí)驗(yàn)孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體 數(shù))X1003、TI = CC5。/EC503. 3結(jié)果樣品1的細(xì)胞毒性作用、對HIV-Iiiib誘導(dǎo)C8166細(xì)胞病變的抑制作用， 以及樣品1抗HIV-I病毒的治療指數(shù)如表1 表3所示。表IMTT法測試樣品對人T淋巴細(xì)胞系C8166細(xì)胞的毒性作用藥物cc5()(微克/毫升)(第一次) CC5Q(微克/毫升)(第二-次)
樣品1 AZT499.78 406.49 1010.35 —
表2. CPE法測試樣品對HIV-Iiiib誘導(dǎo)C8166細(xì)胞病變的抑制作用I藥物EC5Q(微克/毫升)(第一次) EC5Q(微克/毫升χ第二.次)
樣品1 AZT0.87 0.83 0.00082 —
表3.測試樣品的治療指數(shù)
樣品1 AZT治療指數(shù)(Tl) 489.75 574.46 1232134.153. 4 結(jié)論樣品1對人T淋巴細(xì)胞系C8166細(xì)胞毒性小，重復(fù)試驗(yàn)顯示其CC5tl均大于400微 克/毫升；對HIV-I誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體抑制活性較好，EC50為0. 83 0. 87微克 /毫升，治療指數(shù)(Tl值)為489. 75 574. 46。結(jié)論樣品1具有一定的體外抗HIV-1活 性，其治療指數(shù)為489. 75 574. 46，可以預(yù)期發(fā)展成為用于治療HIV病毒感染引起的艾滋 病的藥物。
權(quán)利要求
一種具有抗艾滋病毒功能的核桃殼提取物，其由包含下列步驟的方法制備得到a)粉碎粗品，加氫氧化鈉溶液至剛好浸沒樣品，常溫浸泡10 24小時，過濾得濾液A；b)在濾液A中加入500 1000毫升堿液，放置1 3小時，過濾，所得濾液與濾液A合并，得濾液B；c)在濾液B中加入冰醋酸，放置0.5 2小時，過濾得沉淀C，濾液加入1倍量乙醇，放置0.5 2小時，過濾得沉淀D，濾液再加入1倍量乙醇，放置0.5 2小時，過濾得沉淀E，濾液繼續(xù)加入3倍量乙醇，放置0.5 2小時，過濾得沉淀F；d)將沉淀C、D、E、F中的一個或多個部分置30 50℃減壓烘干1 3小時，得干品即為產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核桃殼提取物，其制備方法的步驟a)中的氫氧化鈉溶液是指濃度 為1摩爾/升的氫氧化鈉溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的核桃殼提取物，其制備方法的步驟b)中的堿液是指濃度為1摩爾 /升的氫氧化鈉溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的核桃殼提取物，其制備方法的步驟c)中的乙醇的濃度為 20-100%。
5.權(quán)利要求1-4之一的核桃殼提取物用于制備防治艾滋病的藥物的用途。
6.一種具有抑制艾滋病毒功能的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的權(quán) 利要求1-4之一的核桃殼提取物和可藥用載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其是片劑、膠囊劑、控釋劑或緩釋劑。
全文摘要
本發(fā)明“一種核桃殼提取物及其抗艾滋病毒的藥物用途”涉及一種核桃殼有效部位的提取分離方法及其醫(yī)藥用途。本發(fā)明的核桃殼提取物由經(jīng)粉碎的核桃殼以堿溶液浸泡提取、醇沉、溶劑回收、干燥而成。本發(fā)明得到的核桃殼提取物能有效抑制艾滋病毒(HIV)，可以預(yù)期發(fā)展成為防治艾滋病的藥物。藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示核桃殼具有體外抗HIV-1活性，治療指數(shù)大于400。
文檔編號A61K36/52GK101982187SQ201010521318
公開日2011年3月2日 申請日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者劉光明, 呂永俊, 周萍, 張?zhí)m勝, 張楨, 張海珠, 李冬梅, 李好枝, 李春艷, 楊敏, 羅建蓉, 董光平, 趙昱 申請人:大理學(xué)院