專利名稱：一種靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向乙型肝炎病毒基因的SiRNA分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝炎，即肝臟炎癥，有多種致病因素-如病毒、細(xì)菌、寄生蟲、化學(xué)毒物、藥物和毒 物、酒精等，侵害肝臟，使得肝臟的細(xì)胞受到破壞，肝臟的功能受到損害，它可以引起身體的 一系列不適癥狀，以及肝功能指標(biāo)的異常。肝炎多數(shù)情況下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、 戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)感染導(dǎo)致的乙型肝炎，是一種嚴(yán)重威脅 全球人類健康的的傳染性疾病，也是最嚴(yán)重類型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死 于肝硬化和肝癌的風(fēng)險極高。HBV屬嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)，全基因組長約3. 2kb，為部分雙鏈環(huán)狀 DNA。其基因組共有四個開放閱讀框(Open Reading Frame，0RF)，編碼蛋白包括表面抗原 (S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全世界估計有20億人感染HBV，其中有3. 5億以上的人為慢 性乙肝感染者，估計每年有60萬人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，癥狀可 持續(xù)數(shù)周，包括皮膚和眼睛發(fā)黃(黃疸)，尿色深，極度疲勞，惡心，嘔吐和腹痛。患者可能需 要數(shù)月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也會造成慢性肝臟感染，以后可能發(fā)展成肝硬化 或肝癌。乙型肝炎病毒通過與受感染者的血液或其他體液(比如，精液和陰道分泌物)接 觸而在人與人之間傳播，傳播途徑與人類免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒 的傳染性比艾滋病毒強50-100倍，乙型肝炎病毒在體外可存活至少7天以上。在此期間， 如果病毒進(jìn)入未感染者的身體，它依然可造成感染。病毒潛伏期平均達(dá)90天，但也可能為 大約30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可發(fā)現(xiàn)，持續(xù)時間差別很大。目前主要是通過嬰兒接種乙型肝炎疫苗來預(yù)防乙型肝炎的發(fā)生，但盡管如此，人 群HBV流行率仍然很高。目前主要治療慢性乙型肝炎的方法僅局限于抑制患者體內(nèi)病毒基 因的表達(dá)和復(fù)制。如口服核苷類抗病毒藥-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的復(fù)制，但是停 藥后復(fù)發(fā)率高，長期應(yīng)用則可導(dǎo)致病毒變異，在用藥6個月后發(fā)生由病毒聚合酶基因發(fā)生 變異引起的耐藥性，使得臨床抗病毒治療面臨極大的挑戰(zhàn)。近幾年來，隨著RNA干擾(RNAi)技術(shù)的迅猛發(fā)展，為疾病尤其是癌癥開辟了 全新的治療途徑，為科研工作者提供了一個全新的基因治療方法。該技術(shù)通過用小 干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾特定靶基因的表達(dá)，來達(dá)到治療疾病 的目的，是基因治療的重要組成部分。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。其作用機制是核糖核 酸酶III家族的Dicer酶，與dsRNA結(jié)合，將其剪切成21_23nt及3’端突出的siRNA，隨后 siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合到靶信使RNA(mRNA)上并將其切 斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)。RNAi已作為一種簡單有效的基因 敲除的技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。本發(fā)明提供了一種用RNAi技術(shù)來抗HBV的方法。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，用靶向至 HBV基因的siRNA作為靶向藥物，在基因的轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行干擾，從而有效抑制HBV的蛋白表達(dá) 和病毒復(fù)制，具有特異性強、高效、副作用小、可持續(xù)用藥的優(yōu)勢，且能彌補目前治療乙型肝 炎藥物的不足，在不久的將來可能成為一種新的治療乙型肝炎的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過siRNA全位點分子庫技術(shù)篩選出的高效靶向HBV 基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成正義鏈5，-CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGCNN-3，(SEQID NO 3)反義鏈5，-GCAAUUUCC⑶CCGAAG⑶UUGGNN-3，(SEQID NO 4)其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。換言之，該雙鏈siRNA分子的主干序列為正義鏈5，-CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGC-3，(SEQID NO 5)反義鏈5，-GCAAUUUCC⑶CCGAAGGUUUGG-3，(SEQID NO 6)在一個優(yōu)選的實施方式中，上述序列中3，端的“NN”是兩個脫氧胸腺嘧啶dTdT。本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備抗HBV藥物中的應(yīng)用。體外實驗證明，本發(fā)明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的 mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，抑制HBV蛋白質(zhì)翻譯和病毒復(fù)制，達(dá)到抗 HBV的治療目的。


圖1是抽提的HBV基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。M為Ikb plus DNA Ladder (標(biāo) 準(zhǔn)參照)。圖2A HBV聚合酶片段1瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，制備得到的DNA片段大小為 1625bp。圖2B是HBV聚合酶片段2瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，制備得到的DNA片段大小為 874bp。M 為 Ikb plus DNA Ladder (標(biāo)準(zhǔn)參照)。圖3是siRNA分子庫構(gòu)建流程示意圖。圖4是TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl表達(dá)框結(jié)構(gòu)示意圖。圖5是PCR制備的TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl表達(dá)框純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。 圖中，M 為 Ikb plus DNA Ladder (標(biāo)準(zhǔn)參照)；1 為 HBV-22 ；2 為 HBV-676 ；3 為 HBV-877 ；4 為 HBV-638 ；5 為 HBV-1003 ；6 為 HBV-748 ；7 為 HBV-182 ；8 為 HBV-261 ；9 為陰性對照。圖6是表達(dá)框轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA表達(dá)量柱形圖， 縱坐標(biāo)表示HBV聚合酶基因mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示處理實驗組，"Negative Control” 為陰性對照組。圖7是化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA表達(dá) 量柱形圖，縱坐標(biāo)表示HBV聚合酶基因mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示處理實驗組，"NegativeControl”為陰性對照組。
具體實施例方式本發(fā)明中諸如“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”等術(shù)語可以互換，其表示的 意思和范圍相同。其中，siRNA序列可以是單鏈結(jié)構(gòu)，也可以是雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的siRNA分子來源于針對HBV聚合酶基因的功能保守區(qū)而制備的siRNA分 子庫，本發(fā)明所用siRNA全位點分子庫技術(shù)是百奧邁科生物技術(shù)有限公司的專利技術(shù)(中 國發(fā)明專利號為ZL 200710024217. 6，專利名稱PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子庫制備 方法)，其優(yōu)點在于所制備得到的siRNA隨機分布于HBV聚合酶基因區(qū)段，長度可控性分布 于 18-25bp，可以提高有效靶位點的命中率。siRNA的制備可采用多種方法，比如化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄、酶切長鏈dsRNA、載 體表達(dá)siRNA、PCR合成siRNA表達(dá)元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間， 可以更好地獲得基因沉默效率。本發(fā)明的siRNA分子可以作為抗HBV藥物的有效成分。作為該siRNA分子的另一種表達(dá)形式，可將其制備成DNA表達(dá)框形式，比如:U6啟 動子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl啟動子。簡言之，在下文中將“TO啟動子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl啟動子”簡寫為“TO_siRNA 轉(zhuǎn)錄模板-Hl ”或“U6-siRNA-Hl ”，它們表示的意思和范圍相同。出于應(yīng)用目的，可將siRNA分子、表達(dá)siRNA分子的DNA表達(dá)框、或者包含siRNA 分子表達(dá)框的質(zhì)粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如病灶組織。本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)?保持siRNA分子的活性。比如，對于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng) 的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３謘iRNA分子的活性。為了實現(xiàn)本發(fā)明的設(shè)計思想并驗證篩選得到的siRNA的抗HBV效果，設(shè)計了如下
實驗方案(1)構(gòu)建HBV聚合酶基因的siRNA分子庫，該分子庫中包含靶向至HBV聚合酶基因 的siRNA效應(yīng)分子，長度分布于18-25bp。(2)制備具有相應(yīng)效應(yīng)的siRNA表達(dá)框，其結(jié)構(gòu)為U6啟動子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl 啟動子，使其更易于體外篩選。(3)運用實時定量PCR技術(shù)，檢測上述siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出的效應(yīng)siRNA 分子對HBV聚合酶基因的抑制作用。(4)化學(xué)合成上述方法篩選得到的最優(yōu)靶點siRNA，在體外細(xì)胞實驗中進(jìn)一步運 用實時定量PCR技術(shù)檢測HBV聚合酶基因的mRNA表達(dá)水平。下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對本發(fā)明進(jìn)行限制。實施例1siRNA全位點分子庫的制備
1.主要儀器、試劑和材料1. 1儀器PCR儀(ABI公司)；電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司)；離心機(Eppendorf公司)， 長波長紫外燈等。1. 2材料和試劑!fepG22· 2. 15細(xì)胞(百奧邁科公司保存)；Ikb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；DNase I (Roche 公司)；MnCl2 (BBI 公司)；磷酸接頭 (Sigma-aldrich 公司)；ATP (BBI 公司)；BSA (NEB 公司)；BmsbI (NEB 公司)；T4DNA 連 接酶(NEB公司)；Tag DNA聚合酶(百奧邁科公司)；瓊脂糖(BBI公司)；dNTP(上海生 工)；酚氯仿抽提試劑(上海生工)；低分子量DNA Ladder(NEB公司)；EcoP15I (NEB公 司)；T4DNA聚合酶(NEB公司)；FokI酶(NEB公司)；SfiI酶(NEB公司)；感受態(tài)細(xì)胞 (invitrogen公司)；pU6Hl_GFP表達(dá)載體(NT Oimcs公司)。凝膠抽提試劑盒=QIAEX II Gel Extration Kit (QIAGEN公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(百奧邁科公司)。其他生化試劑均 購于 Sigma-aldrich 公司。2. siRNA全位點分子庫的構(gòu)建2. IHBV聚合酶基因的獲得從細(xì)胞H印G22. 2. 15的基因組DNA(如圖1所示)中 PCR擴增HBV聚合酶片段。HepG22. 2. 15細(xì)胞含2個拷貝的HBV基因組，能穩(wěn)定分泌HBsAg、 HBeAg, HBcAg及Dane顆粒，并可檢測到細(xì)胞內(nèi)HBV的DNA和RNA等中間復(fù)制體(Sells et al. Proc Natl Acad Sci，1987 ;84 :1005_1009)，其含有 HBV 的血清亞型為 ayw(GenBank Accession number :U95551)，根據(jù)GenBank報道的核酸序列設(shè)計PCR擴增引物，分成兩個 片段為HBV聚合酶片段1和HBV聚合酶片段2，長度分別為1625bp (如圖2A所示)和 874bp (如圖2B所示)。引物序列如下HBV聚合酶片段1上游引物5，-AATTCCACAACCTTTCACCAA-3’ ；
HBV聚合酶片段1下游引物5，-TCACGGTGGTCTCCATGCGA-3 ^ ；
HBV聚合酶片段2上游引物5，-ATGCCCCTATCCTATCAACAC-3，；
HBV聚合酶片段2下游引物5，-CCACTGCATGGCCTGAGGAT-3，。
1)HBV聚合酶片段1序列
1aattccacaacctttcaccaaactctgcaagatcccagagtgagaggcctgtatttccct
61gctggtggctccagttcaggagcagtaaaccctgttccgactactgcctctcccttatcg
121tcaatcttctcgaggattggggaccctgcgctgaacatggagaacatcacatcaggattc
181ctaggaccccttctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaata
241ccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggaactaccgtgtgt
301cttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcctgtcctccaact
361tgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctcttcatcctgctg
421ctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcct
481ctaattccaggatcctcaaccaccagcacgggaccatgccgaacctgcatgactactgct
541caaggaacctctatgtatccctcctgttgctgtaccaaaccttcggacggaaattgcacc
601tgtattcccatcccatcatcctgggctttcggaaaattcctatgggagtgggcctcagcc
661cgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttccccc
721actgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacagcatc
781ttgagtccctttttaccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaacc
1. 1儀器PCR儀(ABI公司)；實時定量PCR儀(Bio-Rad公司)；凝膠電泳設(shè)備 (北京六一)；長波長紫外燈；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)等。1. 2 材料和試劑lkb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；Pfu DNA 聚合酶(百 奧邁科公司)；瓊脂糖(BBI公司)；dNTP (上海生工)；瓊脂糖凝膠純化試劑盒(百奧邁科 公司)，Lipofectamin 2000 (invitrogen 公司)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，TurboCapture mRNA kit(QIAGEN 公司)，SensiMix One-Step Kit (Quantace 公司)等。其他生化試劑均 購于上海生工。1 3PCR引物(百奧邁科合成)5，U6 啟動子引物5，-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3，3，HI 啟動子引物5，-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3，HBV 聚合酶正向引物5，-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3，HBV 聚合酶反向引物5，-GCGTCAGCAAACACTTGG-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，2. siRNA表達(dá)框的制備2. 1PCR擴增制備TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1表達(dá)框選取8例HBV聚合酶siRNA陽 性克隆質(zhì)粒為模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通過PCR的方法擴增制備TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模 板-HI表達(dá)框(圖3為表達(dá)框示意圖)。各PCR反應(yīng)體系為50 u 1反應(yīng)體系0. 5 ill模板DNA(10-50ng) 1 5，U6啟動 子引物(10uM),lu 1 3，HI 啟動子引物(10u M), 1 U 1 dNTP (10mM), 0. 5 u 1 Pfu DNA 聚合 酶，用ddH20補足到50iil。反應(yīng)條件為:95°C lmin預(yù)變性，95°C 15sec變性，58°C 30sec退 火，72°C 30sec延伸，20個循環(huán)。1. 0%瓊脂凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物條帶單一，片段大小符
合實驗要求。2. 2表達(dá)框PCR產(chǎn)物純化1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增得到的表達(dá)框，并 用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化凝膠產(chǎn)物。純化后的DNA再次進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測，純化后的TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-HI表達(dá)框純度和濃度符合要求，如圖4所示。同時用紫 外分光光度計測得制備后的表達(dá)框濃度約為200ng/ia。3.靶位點篩選3. 1細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞IfepG22. 2. 15在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3. 2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染將細(xì)胞按IX 105/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在無抗含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染按照LipofectaminTM2000的說明書轉(zhuǎn)染，U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-HI表達(dá)框DNA 量按0. 2iig/孔加入。3. 3實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA水平用mRNA提取純化試劑盒 TurboCapture mRNA kit提取純化細(xì)胞RNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，用80 yl無RNase 水/孔溶解RNA，取4 ill RNA為模板進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。用基因特異性引物檢測樣本中HBV聚合酶基因mRNA表達(dá)水平，同時擴增看家基因 GAPDH作為內(nèi)參對照。每個反應(yīng)做3個平行實驗。建立如下25 u 1的反應(yīng)體系4 u 1模板
8RNA, 12. 5u 1 2XSensiMix One-Step, 1 u 1 5，正向引物(6 ii M)，1 ii 1 3，反向引物(6 ii M)， 0. 5u 1 50XSYBR Green I，用無RNase水補足體系至25 yl。反應(yīng)條件42°C反轉(zhuǎn)錄30min， 95°C預(yù)變性 7min，95°C變性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環(huán) 45 次。3. 4結(jié)果分析用實時定量PCR 2_AAet法分析實驗結(jié)果，并作出柱狀圖，如圖5 所示，結(jié)果顯示對應(yīng)于HBV聚合酶基因多個位點的siRNA均呈現(xiàn)較好的沉默效果，尤其是 HBV-22，相對于未轉(zhuǎn)染組其沉默效果達(dá)到66%。尤其需要說明的是，HBV-22正義鏈序列與HBV聚合酶基因的第575-597位(下劃 ccaaaccttcggacggaaattgc) t目實施例3化學(xué)合成siRNA驗證沉默效果1.主要儀器、試劑和材料1. 1儀器核酸合成儀(GE公司)、PCR儀(ABI公司)；實時定量PCR儀(Bio-Rad 公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)等。1. 2 材料和試劑Lipofectamin 2000 (invitrogen 公司)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公 司)，TurboCapture mRNA kit(QIAGEN 公司)，SensiMix One-Step Kit(Quantace 公司) 等。其他生化試劑均購于上海生工。1 3PCR引物(百奧邁科合成)HBV 聚合酶正向引物5，-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3，HBV 聚合酶反向引物5，-GCGTCAGCAAACACTTGG-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，2.化學(xué)合成制備siRNA利用百奧邁科生物技術(shù)有限公司擁有的核酸合成儀(美國GE公司)分別合成 siRNAl的正義鏈(sense strand)和反義鏈(antisense strand)的RNA。并進(jìn)行純化，將 正義鏈和對應(yīng)的反義鏈退火成siRNA雙鏈(duplex)，分裝10D/管，最后冷凍干燥，轉(zhuǎn)染前用 無RNase水溶解至20 u M。3.沉默效率驗證3. 1細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞IfepG22. 2. 15在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3. 2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染將細(xì)胞按IX 105/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在無抗含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染按照LipOfeCtaminTM2000的說明書轉(zhuǎn)染，RNA按lOnM/孔加入。3. 3實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA水平用mRNA提取純化試劑盒 TurboCapture mRNA kit提取純化細(xì)胞RNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，用80 yl無RNase 水/孔溶解RNA，取4 ill RNA為模板進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。用基因特異性引物檢測樣本中HBV聚合酶mRNA表達(dá)水平，同時擴增看家基因 GAPDH作為內(nèi)參對照。每個反應(yīng)做3個平行。建立如下25 ill反應(yīng)體系4 ill模板RNA， 12. 5 ii 12X SensiMix One-Step, 1 u 1 5，正向引物(6 ii M)，1 ii 1 3，反向引物(6 ii M)， 0. 5u 150XSYBR Green I，用無RNase水補足體系至25 yl。反應(yīng)條件42°C反轉(zhuǎn)錄30min，95°C預(yù)變性 7min，95°C變性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環(huán)估次。
3. 4結(jié)果分析用實時定量PCR 2_AAet法分析實驗結(jié)果，并作出柱狀圖，如圖6所 示，結(jié)果顯示靶向至HBV聚合酶基因的HBV-22的沉默效果達(dá)到90%。
權(quán)利要求
一種靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子，其特征在于，具有如下序列結(jié)構(gòu)正義鏈5’ CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGCNN 3’SEQ ID NO3，反義鏈5’ GCAAUUUCCGUCCGAAGGUUUGGNN 3’SEQ ID NO4，其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子，其特征在于，所述N為
3.權(quán)利要求1 2中任一項所述的siRNA分子在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的病毒為乙型肝炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向乙型肝炎病毒聚合酶基因的雙鏈siRNA分子及其應(yīng)用。該siRNA分子正義鏈為SEQ ID NO3，反義鏈為SEQ ID NO4，其中，反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，達(dá)到抗乙型肝炎病毒的目的。
文檔編號A61P31/20GK101979558SQ20101052200
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者M·格拉漢姆, 付博峻, 唐小軍, 孫云成, 朱遠(yuǎn)源, 李鐵軍, 王晉康, 陸毅祥 申請人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司