專利名稱：人結腸癌移植瘤小鼠模型的建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腫瘤模型的建立方法，特別涉及人結腸癌移植瘤小鼠模型的建立方 法。
背景技術：
結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國僅次于肺癌、胃癌、肝癌、 食管癌，據(jù)2004-2005年全國城鄉(xiāng)主要惡性腫瘤估計分析，結腸癌新發(fā)病例數(shù)達20萬，死 亡人數(shù)達10萬，在美國結腸癌是第三大常見的腫瘤，2008年估計有149000新發(fā)病例，近 50000人死于結腸癌。目前我國結、直腸癌的發(fā)病率與大部分惡性發(fā)病率逐年下降相反，每 年新發(fā)病病例約增加2 %。結腸癌的標化發(fā)病率迅速上升，與1972年比，2000年標化發(fā)病 率男性增加134%，女性增加135%。腫瘤模型是研究腫瘤的重要手段，腫瘤模型一般可分為自發(fā)性腫瘤模型、誘發(fā)性 腫瘤模型、移植性腫瘤模型和轉移性腫瘤模型。腫瘤實驗研究中選用自發(fā)性腫瘤模型為對 象進行研究有一定優(yōu)點首先是自發(fā)性腫瘤通常比用實驗方法誘發(fā)的腫瘤與人類所患的腫 瘤更為相似，有利于將動物實驗結果推用到人；其次是這一類腫瘤發(fā)生的條件比較自然，有 可能通過細致觀察和統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)原來沒有發(fā)現(xiàn)的環(huán)境的或其它的致癌因素，可以著重觀 察遺傳因素在腫瘤發(fā)生上的作用。但應用自發(fā)性腫瘤模型也存在一些缺點腫瘤的發(fā)生情 況可能參差不齊，不可能在短時間內(nèi)獲得大量腫瘤學材料，觀察時間可能較長，實驗耗費較 大。Miwa等報道在三年觀察3000例雄性Wistar大鼠中僅發(fā)現(xiàn)28例結腸癌。誘發(fā)性腫瘤 大多采用致癌劑誘發(fā)腫瘤，常用二甲基胼(DMH)和氧化偶氮甲烷(AOM)，選擇合適的致癌劑 及適當?shù)膭游锟梢栽诙虝r間內(nèi)獲得一批合適的模型，適用于病因學的研究，但是模型所患 腫瘤來源于動物，在基因上與人體存在一定的差異；誘發(fā)性腫瘤實驗因環(huán)保問題需要防護 設施，實驗條件要求高。而移植性腫瘤一般由相應的細胞株建立起來，可供選擇的細胞系或 細胞株較多，這些細胞的生物學特性比較明確，背景資料比較清楚，動物接種一定數(shù)量的腫 瘤細胞后，可以使一群動物帶有同樣的腫瘤，生長速率比較一致，個體差異較小，接種成活 率較高，甚至可達100%，宿主的荷瘤壽命比較接近，易于客觀地判斷療效，而且移植瘤可進 行連續(xù)傳代，模型重復性好，同自發(fā)性腫瘤和誘發(fā)性腫瘤相比，它的試驗周期一般比較短。 所以移植性腫瘤模型目前被廣泛應用于腫瘤研究。轉移性動物模型大多由移植性模型發(fā)展 而來，再現(xiàn)了腫瘤的轉移等生物學特性，用于腫瘤侵襲以及轉移機理的研究。近年來，由于 基因打靶技術和基因剔除技術的興起，各種轉基因動物得到廣泛應用，但并未能建立單純 的自發(fā)和轉移結腸癌模型。自1969年Rygaard和Povlsen等首次將人類結腸癌移植于裸小鼠體內(nèi)，成功地 建立了人類腫瘤裸小鼠皮下移植模型后，由裸小鼠等免疫缺陷動物來建立結腸癌模型的方 法得以迅速地推廣和應用。D，GUenot等用手術后的臨床各期人結腸癌組織塊移植至裸鼠， 建立移植瘤模型并傳代研究，共傳代14代，檢測移植瘤的基因突變位點，發(fā)現(xiàn)腫瘤的遺傳 特性和組織學特性得到完整保存。皮下種植瘤模型具有成功率高，操作簡單，便于觀察，腫瘤生長速度快等優(yōu)點，是研究實體瘤生長、相關腫瘤因子檢測、藥物療效評定等較好的病理 模型。然而，腫瘤在皮下生長時受微環(huán)境的影響，腫瘤轉移率極低，不能充分顯示結腸癌的 生長特點。1986年Mofikawa等成功將人結腸癌細胞種植到裸鼠盲腸漿膜下，建立結腸癌 的原位模型。Hoffman等于1991年創(chuàng)立了外科原位移植方法，即采用的移植物直接來自 新鮮外科標本或移植性人腫瘤組織，通過手術原位移植于裸鼠盲腸漿膜下建立腫瘤模型。 Dvory-Sobol等應用此方法從漿膜下注射0. Iml的活性癌細胞(lX106/ml)到盲腸壁，注 射14d后可以明顯觀察到盲腸腫瘤。CSspedes等采取此法將HCT-116、SW-620、DLD-I細 胞懸液在顯微鏡引導下用微量器注射到盲腸壁黏膜和肌層之間，結果觀察到腫瘤生成率為 75% -88% ；不同程度的腸系膜和腸系膜后淋巴結轉移癌發(fā)生率為57% -100%，血行播散 到肝臟發(fā)生率為29% -67%、肺29% -100%、腹膜播散為29% -100%。結腸癌原位種植模 型的腫瘤既可在原位生長，又可出現(xiàn)肝臟轉移，不但擁有較高的移植生長率，而且依據(jù)患者 的情況在宿主體內(nèi)展示其腫瘤生物學行為及轉移，比結腸癌皮下種植瘤模型更能代表臨床 結腸癌的生長特點，是一種更接近人體腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的模型。同時也是結腸癌肝轉移 的理想模型，適合結腸癌晚期和遠處肝轉移的研究。利用現(xiàn)有的結腸癌細胞株建立各種模 型，我國學者已做了較多相關方面的研究，周琪等利用人結腸癌細胞株Lovo建立原位移植 瘤模型，并形成了廣泛轉移；牛洪欣等用人結腸癌細胞株SW480建立原位模型，獲得肝轉移 及腹腔廣泛轉移的動物模型。張杰等利用人結腸癌細胞株HCT116建立皮下移植瘤，并反復 切瘤建立結腸癌肺轉移模型。涂經(jīng)楷等利用HCT116建立結腸癌單純淋巴結轉移的模型[。 利用已有結腸癌細胞株建立模型，遺傳學背景清晰，實驗資料豐富，成瘤率高而且穩(wěn)定，實 驗時間短，優(yōu)勢明顯。但目前應用于廣泛研究的結腸癌細胞株相當有限，而且大多來源于國 外。我國作為一個人口大國，地域遼闊，多民族，多種族，與國外人群在基因和表型上有較大 差異，采用國外的細胞株并不能完全代表我國人群結腸癌生物學特性。而且每一例結腸癌 在發(fā)病機理，基因表型以及生物學特性有較大差異，在強調腫瘤個體化治療的今天，細胞株 模型更不能滿足結腸癌的進一步研究。利用人結腸癌組織建立皮下移植瘤模型，我國學者 也做過一些探索，早在上個世紀八十年代吳秉銓等用乙結腸粘液腺癌標本建立皮下移植瘤 模型，共傳代18代，并建立腹水腫瘤模型；傅紅等利用右半結腸高分化管狀腺癌標本建立 皮下移植瘤模型，觀察其生物學特性；賀子彪等用人結腸癌組織塊貼壁培養(yǎng)后利用培養(yǎng)的 細胞建立了皮下移植瘤模型[；但均未建立原位模型作進一步研究。雖然利用低，中，高分化 的結腸癌組織建立移植瘤均有報道，但近年來由于利用腫瘤組織建立移植瘤模型時間長， 國內(nèi)學者利用人結腸癌組織建立原位移植瘤模型相當少。本實驗利用人新鮮結腸癌標本建 立皮下移植瘤模型，再利用皮下移植瘤組織分別移植于兩種不同免疫缺陷小鼠，進行病理 形態(tài)學觀察，免疫組化實驗，觀察其生長情況；建立原位模型，觀察腫瘤生長及轉移情況，為 建立新的細胞系作基礎工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于針對現(xiàn)有人結腸癌模型的建立方法所存在的問 題而提供一種人結腸癌移植瘤小鼠模型的建立方法，該方法利用人結腸癌組織成功建立結 腸癌皮下及原位移植瘤模型，該模型生物學穩(wěn)定，保持了原代腫瘤的特點。本發(fā)明所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現(xiàn)
—種人結腸癌移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟(1)小鼠皮下移植瘤模型的建立(2. 1)將腫瘤組織放置在含慶大霉素的生理鹽水中浸泡2min，取出組織，反復用 生理鹽水沖洗三分鐘，沖洗后標本組織無血液，將腫瘤組織用無菌眼科剪分割成直徑1. 5mm 大小，放在無菌培養(yǎng)皿中；(2. 2)用20號套管針把剪好的腫瘤組織分別移植到裸小鼠及BNX小鼠右側背部近 腋部皮下，壓迫傷口，無出血。每次套管針在電熱真空滅菌器中滅菌； (2. 3)將小鼠放入小鼠IVC系統(tǒng)飼養(yǎng)；(2.4)等待腫瘤形成約15mm左右，無菌切除皮下腫瘤，選擇實性腫塊，取材剪成 1. 5mm3小塊，移植于另外小鼠，傳三代；(3)結腸癌原位模型的建立(3. 1)利用實驗二所獲得的第四代裸小鼠皮下移植瘤作為瘤源，將腫瘤組織放置 在含慶大霉素的生理鹽水中浸泡2min，取出組織，反復用生理鹽水沖洗3min，沖洗后標本 組織無血液，將腫瘤組織用無菌眼科剪分割成直徑1. 5mm大小，放在無菌培養(yǎng)皿中備用；(3. 2)裸小鼠8只，禁食12h，3 %戊巴比妥溶液麻醉裸小鼠；(3. 3)將小鼠仰臥固定于操作臺上，75%酒精消毒皮膚；(3. 4)取腹部正中切口，尋找到盲腸，鉗出盲腸，于盲腸末端用手術刀背輕輕劃破 漿膜面，用無齒鑷將盲腸末端向內(nèi)推壓，使局部形成壁龕，將直徑1. 5mm的腫瘤組織塞入壁 龕內(nèi)，表面滴生物蛋白膠，使膠覆蓋瘤體表面，與盲腸粘合好，將盲腸回納入腹腔，3-0可吸 收線連續(xù)縫合關腹；(3. 5)傷口再次消毒后進入IVC系統(tǒng)飼養(yǎng)；(4).觀察項目(4. 1)分別記錄每一次皮下移植瘤小鼠腫瘤生長情況及成瘤率，皮下移植瘤等待 腫瘤生長到1.5mm時，取第四代裸小鼠皮下移植瘤標本，將腫瘤組織10%甲醛固定，石蠟包 埋，切片HE染色。(4. 2)觀察原位模型的腫瘤生長情況，人結腸癌組織原位移植后，定時觀察裸小鼠 的全身狀況，運動情況，腹部體征。當荷瘤小鼠出現(xiàn)明顯消瘦，弓背，精神萎靡等衰竭體征時 將裸鼠處死，解剖原位移植模型，觀察原位腫瘤生長情況，腹腔臟器轉移情況及淋巴結轉移 情況。本發(fā)明用人結腸癌組織直接移植至裸小鼠皮下及BNX小鼠皮下，通過反復傳代建 立大腸癌皮下移植瘤裸鼠模型，最終成瘤率100%，移植瘤病理切片光鏡下與原人體標本基
本一致。本發(fā)明實驗中發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過反復傳代后，雖然成瘤已經(jīng)穩(wěn)定，但未發(fā)現(xiàn)明顯的轉移， 這跟傳統(tǒng)實驗相比類似，但生長周期長，與傳統(tǒng)的人結腸癌細胞株模型相比有明顯差異，這 主要與選取的結腸癌組織塊惡性程度不高，分化較好，細胞侵襲力較低有關。皮下移植瘤未 見明顯轉移，這與大多數(shù)文獻報道一致，皮下移植瘤不易發(fā)生轉移主要與移植瘤在皮下生 長易被纖維包膜(假包膜)包裹，干擾腫瘤的新生血管形成，而新生血管的形成是腫瘤轉移 的必要基礎。而在光鏡下觀察，皮下移植瘤的細胞雖然與原代細胞差異不大，但與直接用已 有的結腸癌細胞株建立的皮下瘤比較，細胞株建立的皮下瘤模型間質細胞少，壞死少，整個
5視野可見密布的腫瘤細胞，而本組實驗中可見腫瘤細胞仍可見少量結腸癌腺管結構，從病 理學結構上更接近人類結腸癌的特點。本發(fā)明中原瘤細胞取材于結腸癌組織，并非取材于轉移淋巴結及轉移灶，僅僅通 過五代小鼠簡單篩選，并不容易得到侵襲能力強的腫瘤細胞。本發(fā)明采用為中等分化的結腸癌(惡性度低)建立模型，惡性度不高則腫瘤建模 困難，為提高腫瘤移植的成功率，前三代受體動物選用價格較高的深度免疫缺陷BNX小鼠 (T細胞、B細胞、NK細胞聯(lián)合缺陷)，待生長穩(wěn)定后，第三代起選用常用的裸小鼠(T細胞缺 陷)，至第五代移植成功率達100%。該方法能有效提高腫瘤建模的成功性(BNX小鼠本科 室從美國獨家引進)。本發(fā)明中利用人結腸癌組織建立了結腸癌移植瘤模型及原位模型，保存了原代人 體腫瘤組織的細胞和基因，可以作為藥物篩選的工具，為進一步研究和治療打下了基礎。


圖1為本發(fā)明BNX小鼠及BALB/c裸小鼠皮下移植瘤大體觀察的示意圖。圖2為本發(fā)明裸小鼠原位移植瘤模型示意圖。圖3為本發(fā)明皮下瘤和原位瘤切片組織示意圖。圖4為本發(fā)明兩種小鼠皮下移植腫瘤生長曲線示意圖。圖5為本發(fā)明人腸癌移植瘤模型體重變化示意圖。圖6分別為本發(fā)明ESA，CEA, P53，C-erbB-2在皮下移植瘤的表達示意圖。圖7為本發(fā)明BNX小鼠皮下瘤細胞流式分析示意圖。
具體實施例方式一、人結腸癌移植瘤模型的建立結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，腫瘤移植瘤模型是研究腫瘤轉移、藥物篩選、放 射治療和免疫治療的重要工具，目前實驗中應用的結腸癌模型大多用細胞株建立，具有遺 傳背景清晰，成瘤率穩(wěn)定，生物學特性詳細等優(yōu)點，但大多數(shù)細胞株來源于國外，在基因和 表型上與我國人群有較大差異，而我國幅員遼闊，民族眾多，因此建立盡可能多的腫瘤模型 以及細胞系對結腸癌的治療有著重要意義。本實驗利用人結腸癌組織初步建立結腸癌模 型，為結腸癌的發(fā)病機理及腫瘤防治提供實用模型。材料與方法1.材料1. 1腫瘤組織人結腸癌組織來源于2008年6月仁濟醫(yī)院一手術患者，男性，漢族，45歲，術前未 作化療和放療。術前CEA17y g，AFP, Cal9_9，CA242，CA724均在正常范圍內(nèi)。術后病理切 片提示為乳頭狀管狀腺癌I-II級，侵及肌層，淋巴結(0/15)病理分期=T3NtlMtl，免疫組化 ESA (++)，CEA (++)，P53 (+)，C-erbB-2 (+)。1. 2實驗動物 SPF級BALB/c-nu/nu裸小鼠6只一批，共計31只，BNX小鼠18只，由上海市腫瘤 研究所提供，實驗裸小鼠生產(chǎn)許可證號為[SCXK (滬)2002-0001]。BNX小鼠生產(chǎn)許可證號為[SCXK (滬)2007-0001]，鼠齡6-7周，體重18_20g，雌雄皆用，用墊料、飲水、全價顆粒飼 料及其他與動物接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理。實驗和飼養(yǎng)條件嚴格按照SPF級規(guī)范要求 [SYXK (滬)2007-0001]。1. 3試劑及抗體生理鹽水250ml*5袋(百特醫(yī)藥有限公司)，慶大霉素8萬*10支(上海中西制藥 有限公司)，3%戊巴比妥溶液，OB生物膠(廣州白云山制藥有限公司)，10%甲醛。1. 4儀器與器材(1) SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，(2)眼科剪，無菌培養(yǎng)皿，手術刀，顯微外科用持針鉗，3-0可吸收縫線，20號套管 針，電熱真空滅菌器。(3) IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)(蘇州安達凈化工程有限公司)，(4)數(shù)碼相機(NIKON)。2.小鼠皮下移植瘤模型的建立2. 1將腫瘤組織放置在含慶大霉素的生理鹽水中浸泡2min，取出組織，反復用生 理鹽水沖洗三分鐘，沖洗后標本組織無血液，將腫瘤組織用無菌眼科剪分割成直徑1. 5mm 大小，放在無菌培養(yǎng)皿中。2. 2用20號套管針把剪好的腫瘤組織分別移植到裸小鼠及BNX小鼠右側背部近腋 部皮下，壓迫傷口，無出血。每次套管針在電熱真空滅菌器中滅菌。2. 3將小鼠放入小鼠IVC系統(tǒng)飼養(yǎng)。2. 4等待腫瘤形成約15mm左右，無菌切除皮下腫瘤，選擇實性腫塊，取材剪成 1. 5mm3小塊，移植于另外小鼠。(1)頸椎脫臼處死小鼠，腫瘤周圍皮膚用75%酒精消毒，(2)用眼科剪剪開皮膚取出腫瘤放到盛有慶大霉素的生理鹽水的培養(yǎng)皿中，(3)剔除腫瘤包膜，選取生長良好的腫瘤組織剪成1. 5mm3小塊，(4)用20號套管針把剪好的腫瘤組織移植到BNX小鼠右側背部近腋部皮下，(5)用步驟四的方法進行腫瘤傳代，至第三代BNX小鼠，每代5-7只。BNX鼠皮下 移植瘤均出現(xiàn)，且腫瘤大小差異不大。再移植至裸小鼠皮下，傳三代。3.結腸癌原位模型的建立3. 1利用實驗二所獲得的第四代裸小鼠皮下移植瘤作為瘤源，將腫瘤組織放置在 含慶大霉素的生理鹽水中浸泡2min，取出組織，反復用生理鹽水沖洗3min，沖洗后標本組 織無血液，將腫瘤組織用無菌眼科剪分割成直徑1. 5mm大小，放在無菌培養(yǎng)皿中備用。
3. 2裸小鼠8只，禁食12h，3 %戊巴比妥溶液麻醉裸小鼠。3. 3將小鼠仰臥固定于操作臺上，75%酒精消毒皮膚。3. 4取腹部正中切口，尋找到盲腸，鉗出盲腸，于盲腸末端用手術刀背輕輕劃破漿 膜面，用無齒鑷將盲腸末端向內(nèi)推壓，使局部形成壁龕，將直徑1. 5mm的腫瘤組織塞入壁龕 內(nèi)，表面滴生物蛋白膠，使膠覆蓋瘤體表面，與盲腸粘合好，將盲腸回納入腹腔，3-0可吸收 線連續(xù)縫合關腹。3. 5傷口再次消毒后進入IVC系統(tǒng)飼養(yǎng)。4.觀察項目
4. 1分別記錄每一次皮下移植瘤小鼠腫瘤生長情況及成瘤率，皮下移植瘤等待腫 瘤生長到1.5mm時，取第四代裸小鼠皮下移植瘤標本，將腫瘤組織10%甲醛固定，石蠟包 埋，切片HE染色。4. 2觀察原位模型的腫瘤生長情況，人結腸癌組織原位移植后，定時觀察裸小鼠的 全身狀況，運動情況，腹部體征。當荷瘤小鼠出現(xiàn)明顯消瘦，弓背，精神萎靡等衰竭體征時將 裸鼠處死，解剖原位移植模型，觀察原位腫瘤生長情況，腹腔臟器轉移情況及淋巴結轉移情 況。實驗結果1.移植傳代情況2008年6月-2010年2月共進行人結腸癌外科切除標本BNX小鼠及裸小鼠移植 和傳代，共傳代5代，每次傳代5-7只，首次傳代裸小鼠未能形成皮下瘤，BNX小鼠形成皮下 瘤，繼續(xù)在BNX小鼠傳代，至第三代起每只移植小鼠腫瘤均呈實質性腫塊，從第三代起腫瘤 生長穩(wěn)定，移植至裸小鼠，生長穩(wěn)定，形成皮下瘤，平均潛伏期26天(潛伏期指種植后至肉 眼看到皮下瘤的時間)，從第4w左右肉眼可見腫瘤隆起于皮下，第13w腫瘤呈半球形，瘤體 直徑達15mm大小，解剖皮下移植瘤，小鼠肝臟、肺以及淋巴結未見明顯轉移。(見圖1)表1 各代裸小鼠移植瘤生長情況及潛伏期情況
種植小鼠 (只)腫瘤生長數(shù) (只)潛伏期 (天)傳代間隔 (天)(BNX小鼠)74 (4/7)37原代(裸小鼠)50 (0/5)第一代(BNX小鼠)65 (5/6)29145第二代(BNX小鼠)66 (5/6)26110第三代(BNX小鼠)55 (5/5)2692第三代(裸小鼠)65 (5/6)2595第四代(裸小鼠)66 (6/6)2595第五代(裸小鼠)66 (6/6)25952.原位移植模型的觀察8只裸小鼠盲腸腫瘤原位移植后約5w，右下腹觸及質地較硬的腫塊，7w時腫塊明 顯增大，IOw后出現(xiàn)動物消瘦，活動明顯減少，Ilw—只小鼠死亡后，停止實驗，處死所有小 鼠。解剖小鼠，5只裸小鼠盲腸處腫瘤浸潤性生長，其中2只小鼠腫瘤侵及整個腸壁，輕度 阻塞腸腔，導致腸梗阻。大體腫瘤組織見腫瘤呈白色魚肉樣，中央可見壞死。未見有明顯腹
8水，未見肝臟、腹腔轉移。(見圖2)3.病理檢查3. 1皮下移植瘤標本腫瘤細胞呈中等分化，異型明顯，核大深染，可見核分裂相，呈柱狀或立方形，呈腺 管狀排列，癌細胞排列成多層，細胞排列紊亂，極性消失，腺管大小不一，形狀不規(guī)則，管腔 內(nèi)及管腔外見癌性壞死物，為管狀腺癌I-II級，部分為乳頭狀癌。與原結腸癌標本鏡下類 似。(見圖3)3. 2原位腫瘤標本腫瘤細胞呈中分化，異性明顯，可見核分裂相，為管狀腺癌，部分為乳頭狀癌。(見 圖3)結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，美國結、直腸癌的發(fā)病率1975年就已開始上 升，到1989年達到最高峰，近年來，雖然結、直腸癌仍然為第三大惡性腫瘤，其發(fā)病率有緩 慢下降的趨勢，但我國隨著居民飲食習慣的改變，結、直腸癌的發(fā)病率逐年上升。腫瘤模型是研究腫瘤發(fā)病機制以及腫瘤防治的重要工具，結腸癌的腫瘤模型可分 為自發(fā)性腫瘤模型、誘發(fā)性腫瘤模型、移植性腫瘤模型和轉移性腫瘤模型。自發(fā)性腫瘤模型 生長緩慢，發(fā)病率低，不適合大規(guī)模的實驗研究；誘發(fā)性腫瘤模型發(fā)病時間較短，易于復制， 但由于腫瘤來源于動物，在基因和表型上與人類有較大差異，在藥物篩選以及轉移研究中 存在明顯缺陷[23]。自1969年丹麥學者Ryggard將人結腸癌組織移植于裸小鼠皮下獲得 成功，為腫瘤模型的建立開辟了新的途徑。利用免疫缺陷小鼠建立移植性腫瘤模型，模型相 對易于建立，尤其在結腸癌中，移植瘤模型建立已相對較為成熟，而且能夠保留原發(fā)腫瘤的 生物學和遺傳學特性。目前國內(nèi)建立動物移植瘤模型大多選用已有的細胞系，其優(yōu)點是遺傳背景清晰， 成瘤率高，但細胞株品種有限，而且大多來源于國外。我國是一個多民族國家，人口眾多，遺 傳背景相對較為復雜，利用國外已有的細胞株建立結腸癌模型進行實驗研究并不能代表我 國結腸癌特點，因此需要建立我國特有的結腸癌細胞系，來滿足藥物篩選和免疫學腫瘤學 等研究的要求。而建立細胞系首先需要利用人癌手術標本建立移植瘤的模型，為進一步研 究提供瘤源打下基礎。利用人癌手術標本移植成功率較低，平均僅為30 %左右，但結腸癌移 植成功率高達70 %。本實驗通過動物體內(nèi)反復傳代建立皮下移植瘤模型，并利用生長趨于 穩(wěn)定的皮下移植瘤建立結腸癌原位移植瘤模型，為細胞系的建立作基礎性工作。結腸癌在病理上主要以管狀腺癌為主，大約占65% -88%，CEA增高的結腸癌大約 為45% -80%，我國學者已有將結腸粘液腺癌建成模型以及建立細胞株，但利用中高分化 的結腸癌標本建成移植瘤模型報道較少，而我國主要人群主要是漢族，因此選取的患者標 本具有較強的代表性。本實驗用人結腸癌組織直接移植至裸小鼠皮下及BNX小鼠皮下，通過反復傳代建 立大腸癌皮下移植瘤裸鼠模型，最終成瘤率100%，移植瘤病理切片光鏡下與原人體標本基
本一致。BNX小鼠是上個世紀八十年代美國國立衛(wèi)生研究院培育的新一代免疫缺陷小鼠， 其主要特點是T，B, NK細胞聯(lián)合缺陷，已廣泛應用于乳腺病，肝癌，腸癌，胃癌的研究。應用 BNX小鼠建立腫瘤移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，⑴成瘤率高，一般可以達到100%;(2)成瘤時間早，一致性好，幾乎同時成瘤；(3)腫瘤大小個體差異小，便于實驗分組；(4)成瘤實驗重復性好。 發(fā)明人等用低分化的胃癌細胞株在BNX小鼠建立胃癌的原位模型，發(fā)現(xiàn)建立的模型與裸小 鼠比較，BNX小鼠模型成瘤率達100%，轉移早，而且出現(xiàn)了很少見的轉移。在初次傳代中， BNX小鼠皮下移植瘤成功，而在裸鼠皮下未能建立移植瘤，由于裸小鼠僅為T細胞缺陷，但 NK細胞以及B細胞，非依賴性T細胞免疫代償對移植腫瘤有重要抑制作用，免疫學認為NK 細胞在腫瘤免疫中有著重要的作用，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與NK細胞密切相關。在本實驗中發(fā)現(xiàn) 初次在裸小鼠皮下移植結腸癌組織均未能形成腫瘤，而在BNX小鼠中，由于T，B, NK細胞聯(lián) 合缺陷，對異體腫瘤組織的免疫攻擊更少，因此腫瘤移植獲得成功，而腫瘤細胞在BNX小鼠 體內(nèi)經(jīng)過篩選后，生長趨于穩(wěn)定，而且BNX小鼠移植瘤是均一性較高的腫瘤細胞，因此在實 驗中再將移植瘤移植于裸鼠皮下獲得了穩(wěn)定的皮下瘤。本實驗中發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過反復傳代后， 雖然成瘤已經(jīng)穩(wěn)定，但未發(fā)現(xiàn)明顯的轉移，這跟傳統(tǒng)實驗相比類似，但生長周期長，與傳統(tǒng) 的人結腸癌細胞株模型相比有明顯差異，這主要與選取的結腸癌組織塊惡性程度不高，分 化較好，細胞侵襲力較低有關。皮下移植瘤未見明顯轉移，這與大多數(shù)文獻報道一致，皮下 移植瘤不易發(fā)生轉移主要與移植瘤在皮下生長易被纖維包膜(假包膜)包裹，干擾腫瘤的 新生血管形成，而新生血管的形成是腫瘤轉移的必要基礎。而在光鏡下觀察，皮下移植瘤的 細胞雖然與原代細胞差異不大，但與直接用已有的結腸癌細胞株建立的皮下瘤比較，細胞 株建立的皮下瘤模型間質細胞少，壞死少，整個視野可見密布的腫瘤細胞，而本組實驗中可 見腫瘤細胞仍可見少量結腸癌腺管結構，從病理學結構上更接近人類結腸癌的特點。1986年Morikawa首次將人結腸癌細胞移植到裸小鼠盲腸漿膜下建立結腸癌原位 移植模型，該模型展示的腫瘤生物學行為與臨床患者相似，出現(xiàn)腫瘤的局部生長，廣泛腹腔 種植，淋巴結轉移、肝轉移等。比較而言，原位模型較皮下移植瘤更能代表臨床結腸癌的發(fā) 病特點。原位移植可分為利用細胞懸液接種法和組織塊接種法，細胞懸液接種由于腸壁較 薄，可能穿透腸壁導致接種失敗，還可能污染腹腔，引起腹腔播散。而組織塊法移植成功率 較高，本實驗采用組織塊法建立原位移植模型，成瘤率62. 5% (5/8)，在整個腫瘤生長過程 中，生長速率與皮下瘤差異不大，均在三周左右出現(xiàn)。病理組織切片光鏡下可見到腫瘤表現(xiàn) 與原皮下瘤保持一致。該模型未見腹腔淋巴結，肝臟無明顯轉移。分析其原因可能，第一，人 類結腸癌大多發(fā)生轉移較為緩慢，大多以局部發(fā)生浸潤性生長為主，而且發(fā)生轉移的大多 為惡性程度較高的腫瘤如粘液腺癌，而本實驗證實即使小鼠發(fā)生腸梗阻，也未發(fā)生肝轉移。 由于選取的為結腸中高分化腺癌。因此轉移較為緩慢，而隨著腫瘤生長，引起荷瘤小鼠負擔 過重而引起死亡。第二，大多數(shù)腫瘤細胞雖然屬于單克隆起源，但在演化過程中由于瘤細胞 遺傳學不穩(wěn)定加上宿主環(huán)境的選擇性壓力，使細胞不斷變異，產(chǎn)生分化及表型的多樣性，諸 如瘤細胞的侵襲性、生長速率、侵襲性、核型乃至激素的反應性和抗腫瘤藥物的敏感性等， 本實驗中原瘤細胞取材于結腸癌組織，并非取材于轉移淋巴結及轉移灶，所獲得的腫瘤細 胞則侵襲性、轉移能力可能較差，根據(jù)腫瘤轉移異質性理論，在一個原發(fā)性惡性腫瘤細胞群 中，并不是所有瘤細胞均具有侵襲和轉移能力，僅某些特殊亞群才具有轉移潛能，產(chǎn)生轉移 表型。而要獲得侵襲力強的腫瘤細胞則需在腫瘤模型體內(nèi)反復進行傳代篩選，而在體外則 需要通過劃痕，電泳等實驗。本實驗僅僅通過五代小鼠簡單篩選，并不容易得到侵襲能力強 的腫瘤細胞。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展既有共同的原因，也有個體的差異。在腫瘤治療中強調個體化治療，尤其近年來藥物遺傳學及藥物基因組學的發(fā)展，使腫瘤化療進入了一個新的時代 _。本實驗中利用人結腸癌組織建立了結腸癌移植瘤模型及原位模型，保存了原代人體腫 瘤組織的細胞和基因，可以作為藥物篩選的工具，為進一步研究和治療打下了基礎。二、人結腸癌組織移植瘤生物學特性的研究結腸癌皮下移植瘤模型能完整保存原發(fā)腫瘤的遺傳學特點，既保持原腫瘤的基因 突變的染色體位點以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，因此皮下移植瘤在腫瘤模型中意義重大；既為進 一步研究提供瘤源，又為建立細胞系提供基礎，同時皮下移植瘤易于觀察，而不同的免疫缺 陷小鼠對皮下移植瘤的生長有著不同的影響。本實驗擬選擇不同免疫缺陷小鼠，觀察皮下 移植瘤的生長情況，將皮下移植瘤切片進行免疫組化檢查。將皮下瘤粉碎后行流式細胞儀 檢查，觀察細胞周期及倍體，進一步了解該模型的生物學特性。材料與方法1.材料1. 1腫瘤組織取自來源于BNX小鼠的第三代皮下移植瘤1. 2實驗動物SPF級BALB/c-nu/nu裸小鼠6只，BNX小鼠6只，均由上海市腫瘤研究所提供， 實驗小鼠生產(chǎn)許可證號為SCXK (滬)2002-0001。鼠齡6_7周，體重18 20g，雌性，用墊 料、飲水、全價顆粒飼料及其他與動物接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理，試驗及飼養(yǎng)嚴格遵守 SPF (specific pathogen freecondition)級標準要求。1. 3試劑及抗體生理鹽水250ml*2袋(百特醫(yī)藥有限公司)，慶大霉素8萬*10支(上海中西藥業(yè) 有限公司)，3 %戊巴比妥溶液，10 %的甲醛，75 %醫(yī)用酒精，二甲苯，95 %無水酒精，DAB顯 色劑(福州邁新生物技術有限公司)，一抗兔抗人CEA (福州邁新生物技術有限公司)，人抗 ESA (福州邁新生物技術有限公司)，P53抗體(福州邁新生物技術有限公司)，C-erbB-2(美 國 immunotech)，二抗 EnViSion System(鼠兔通用型二抗)，PBS 緩沖液(8g NaCl,0. 2g KCl、1. 44gNa2HP04和0. 24g KH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調節(jié)溶液的pH值至7. 4， 最后加蒸餾水定容至IL即可。在151bf/in2(1034X105Pa)高壓下蒸氣滅菌25分鐘配制 而成)，3%的H2O2的溶液，檸檬酸緩沖液，胰蛋白酶(GIBC0公司)。1. 4儀器與器材(1) SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)(2)眼科剪，眼科鑷，培養(yǎng)皿，顯微外科用持針鉗，3-0可吸收縫線，20號套管針，電 熱真空滅菌器，(3) IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)(蘇州安達凈化工程有限公司)(4)蒸汽鍋，濕盒，切片機，恒溫箱，(5) Epics Altra 流式細胞儀(美國 Beckman Coulter 公司)2.方法2. 1兩種免疫缺陷小鼠皮下移植瘤的建立2. 1. 1取皮下移植的人腸癌荷瘤BNX小鼠頸椎脫臼法處死，75%酒精消毒皮膚，剝 取出移植瘤，將腫瘤組織放置在含慶大霉素的生理鹽水中浸泡二分鐘，取出組織，反復用生理鹽水沖洗三分鐘，沖洗后標本組織無血液，切取生長良好、淡紅色、魚肉狀的瘤組織將腫 瘤組織用無菌眼科剪分割成直徑1. 5mm大小，放在無菌培養(yǎng)皿中。2. 1. 2用20號套管針把剪好的腫瘤組織移植到小鼠右側背部近腋部皮下，壓迫傷 口，無出血。每次移植后套管針電熱真空滅菌儀消毒。2. 1. 3將動物放入IVC系統(tǒng)中分籠飼養(yǎng)。2. 2皮下移植瘤的免疫組化2. 2. 1皮下瘤切除后常規(guī)石蠟包埋，用切片機常規(guī)石蠟切片2_3um，2. 2. 2石蠟切片放置在60°C恒溫箱中烘烤120min，2. 2. 3脫蠟和水化二甲苯(20min) — 二甲苯(20min)—無水酒精(5minX2 次)一95% 酒精(5minX2) — 90% 酒精(5min) — 80% 酒精(5min)，2. 2. 4.在專用塑料染色缸中裝250mlPH7. 4的PBS緩沖液煮沸，放入切片再煮5分
鐘，冷卻至室溫，2. 2. 5抗原修復壓力鍋開始噴氣時，蓋上氣閥2min，冷卻，取下氣閥，冷卻至室
ilm 2. 2. 6 蒸餾水洗 1 次 5min，PBS 洗 2 次各 5min，2. 2. 7 加 3 % H2O2 孵育 30min (室溫)，2. 2. 8取出切片，用PBS沖洗，每次3min，3次，將切片上組織周圍擦干，2. 2. 9 滴加一抗 50μ 1，37°C孵育 lh,2.2. 10取出切片，用PBS沖洗，每次3min，3次，將切片上組織周圍擦干，2. 2. 11將切片置于濕盒中，滴加二抗EnViSion System 50 μ 1，室溫孵育25min，2.2. 12取出切片，用PBS沖洗，每次3min，3次，將切片上組織周圍擦干，2. 2. 13DAB顯色15min，自來水充分沖洗，2. 2. 14蘇木素復染3min，自來水充分沖洗，2. 2. 15鹽酸酒精分化2s，自來水充分沖洗，2. 2. 16 脫水、透明80%酒精(5min) — 95%酒精(5min) — 95%酒精(5min)— 無水酒精(5min)—無水酒精(5min) — 二甲苯(IOmin) — 二甲苯(IOmin)，2. 2. 17封片中性樹脂，加蓋玻片(組織部位切勿殘留小氣泡)，自然晾干，2.2. 18蘇木素復染，脫水，透明封片。3.觀察內(nèi)容3. 1裸小鼠、BNX小鼠皮下移植瘤生長情況結腸癌組織塊皮下移植后定時觀察，了解移植瘤的形成時間及生長情況，觀察小 鼠一般活動及營養(yǎng)狀態(tài)等改變，并觀察小鼠荷瘤壽命。每兩天用游標卡尺測量皮下瘤長徑 (a)和短徑(b)，根據(jù)腫瘤體積公式V= 1/2 (ab2)計算腫瘤體積并作出腫瘤生長曲線以及 荷瘤小鼠體重變化。3. 2裸小鼠、BNX小鼠解剖學和病理組織學觀察小鼠瀕臨死亡之前處死動物進行詳細的解剖學檢查。肉眼觀察臟器轉移情況(包 括肝、脾、腎、局部及遠處淋巴結)等。皮下瘤10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，經(jīng)蘇 木精-伊紅染色，光鏡觀察。3. 3免疫組化結果觀察
根據(jù)陽性細胞的著色程度，ESA為膜上著色棕黃色顆粒，CEA為細胞漿著色的棕黃 色顆粒，P53蛋白陽性表達定位于細胞核呈棕褐色。C-erbB-2蛋白陽性表達定位于細胞膜 或細胞漿呈棕褐色，陽性細胞總數(shù)在25%以下為弱陽性，中等陽性25% -49%，強陽性為陽 性細胞在50%以上。3. 4細胞增值周期和異倍體分析3. 4. 1將BNX小鼠皮下瘤切下，用機械法將新鮮的實體瘤組織剪碎，3. 4. 2用200目尼龍網(wǎng)過濾成單細胞懸液，置于檸檬酸緩沖液 (Citratebuffer)2h。3. 4. 3調整細胞濃度到1 X IO6個/ml左右，離心后棄去上清液，加入1800 μ 1胰酶 消化液充分作用。3. 4. 4加入1500 μ 1胰酶抑制酶液3min，加入1500 μ 1溶液PI-碘化丙錠作用 20mino3. 4. 5用200目尼龍網(wǎng)再次過濾，上機(FAM)作細胞DNA含量采樣及細胞周期分 析。5.實驗結果5. 1.皮下移植瘤的生長情況皮下移植瘤潛伏期都在四周左右，7w內(nèi)皮下瘤大小無差異，自第8w起裸鼠皮下移 植瘤較BNX小鼠生長略快，至1 Iw裸鼠皮下瘤略大于BNX小鼠皮下移植瘤，裸鼠皮下移植瘤 可見壞死，實驗結束。兩種小鼠皮下移植腫瘤生長曲線見圖4。兩組小鼠皮下瘤大體的差異 結果見表2表25. 2.解剖學和病理組織學觀察大體觀察裸小鼠皮下瘤及BNX小鼠皮下瘤均生長良好，生長差異不大。BNX小鼠 皮下瘤光鏡下觀察腫瘤細胞呈柱狀排列，核深染，極性消失，腫瘤細胞大小較為一致。腺管 樣結構消失，可見癌巢及壞死組織。裸小鼠皮下瘤光鏡下觀察腫瘤細胞呈中等分化，異型 明顯，核大深染，可見核分裂相，呈柱狀或立方形，呈腺管狀排列，癌細胞排列成多層，細胞 排列紊亂，極性消失，腺管大小不一，形狀不規(guī)則。兩者光鏡下組織學結構與原結腸癌標本相似。5. 3.免疫組化結果(表4)參見圖5和表3，ESA在皮下瘤中表達為陽性至強陽性，CEA強陽性，C_erB2為陽 性，P53表達為陽性。表3
小鼠類型 瘤體體積均值(mm)
瘤體重量均值(克) 裸小鼠2763.53±3398.8
BNX 小鼠2187. 17±2138. 52
1.6±1.6 1. 51±1. 57
1權利要求
一種人結腸癌移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟(1)小鼠皮下移植瘤模型的建立(2.1)將腫瘤組織放置在含慶大霉素的生理鹽水中浸泡2min，取出組織，反復用生理鹽水沖洗三分鐘，沖洗后標本組織無血液，將腫瘤組織用無菌眼科剪分割成直徑1.5mm大小，放在無菌培養(yǎng)皿中；(2.2)用20號套管針把剪好的腫瘤組織分別移植到裸小鼠及BNX小鼠右側背部近腋部皮下，壓迫傷口，無出血。每次套管針在電熱真空滅菌器中滅菌；(2.3)將小鼠放入小鼠IVC系統(tǒng)飼養(yǎng)；(2.4)等待腫瘤形成約15mm左右，無菌切除皮下腫瘤，選擇實性腫塊，取材剪成1.5mm3小塊，移植于另外小鼠，傳三代；(3)結腸癌原位模型的建立(3.1)利用實驗二所獲得的第四代裸小鼠皮下移植瘤作為瘤源，將腫瘤組織放置在含慶大霉素的生理鹽水中浸泡2min，取出組織，反復用生理鹽水沖洗3min，沖洗后標本組織無血液，將腫瘤組織用無菌眼科剪分割成直徑1.5mm大小，放在無菌培養(yǎng)皿中備用；(3.2)裸小鼠8只，禁食12h，3％戊巴比妥溶液麻醉裸小鼠；(3.3)將小鼠仰臥固定于操作臺上，75％酒精消毒皮膚；(3.4)取腹部正中切口，尋找到盲腸，鉗出盲腸，于盲腸末端用手術刀背輕輕劃破漿膜面，用無齒鑷將盲腸末端向內(nèi)推壓，使局部形成壁龕，將直徑1.5mm的腫瘤組織塞入壁龕內(nèi)，表面滴生物蛋白膠，使膠覆蓋瘤體表面，與盲腸粘合好，將盲腸回納入腹腔，3 0可吸收線連續(xù)縫合關腹；(3.5)傷口再次消毒后進入IVC系統(tǒng)飼養(yǎng)；(4).觀察項目(4.1)分別記錄每一次皮下移植瘤小鼠腫瘤生長情況及成瘤率，皮下移植瘤等待腫瘤生長到1.5mm時，取第四代裸小鼠皮下移植瘤標本，將腫瘤組織10％甲醛固定，石蠟包埋，切片HE染色。(4.2)觀察原位模型的腫瘤生長情況，人結腸癌組織原位移植后，定時觀察裸小鼠的全身狀況，運動情況，腹部體征。當荷瘤小鼠出現(xiàn)明顯消瘦，弓背，精神萎靡等衰竭體征時將裸鼠處死，解剖原位移植模型，觀察原位腫瘤生長情況，腹腔臟器轉移情況及淋巴結轉移情況。
全文摘要
本發(fā)明公開的人結腸癌移植瘤小鼠模型的建立方法，其將人新鮮結腸癌標本接種于BALB/c-nu/nu裸小鼠及BNX小鼠皮下，反復傳代5代。分別建立BNX小鼠及裸鼠皮下移植瘤，觀察生長情況，繪制生長曲線。利用皮下移植瘤組織建立原位移植瘤結腸癌模型，觀察成瘤情況及轉移情況。移植瘤組織石蠟包埋切片，比較光鏡下與原結腸癌組織有無組織學差異，免疫組織化學檢測石蠟切片ESA，CEA，C-erbB-2，P53在皮下瘤的表達，流式細胞技術檢測該腫瘤的細胞周期及倍體。本發(fā)明利用人結腸癌組織成功建立結腸癌皮下及原位移植瘤模型，該模型生物學穩(wěn)定，保持了原代腫瘤的特點。
文檔編號A61K35/12GK101982178SQ20101052405
公開日2011年3月2日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權日2010年10月28日
發(fā)明者萬伯順, 劉蕾, 姚明, 施中凱, 朱淼鑫, 李靜, 胡曉麗, 薩冰清, 趙方瑜, 閆明霞 申請人:上海市腫瘤研究所