專利名稱：磁性載基因脂質(zhì)超聲微泡造影劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種作為既可影像增強(qiáng)又可對(duì)腫瘤進(jìn)行治療的磁性載基因脂質(zhì)超聲 微泡造影劑的制備方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所涉及的是新型脂質(zhì)超聲微泡及其制備方法，將納米技術(shù)引入超聲微泡的 制備中，通過(guò)納米技術(shù)制備出Fe3O4磁性納米粒并進(jìn)行PEI的表面修飾，經(jīng)修飾后的Fe3O4磁 性納米?？捎行У呐c真核表達(dá)質(zhì)粒相結(jié)合，進(jìn)而將DNA/PEI/ Fe3O4復(fù)合物包裹入脂質(zhì)微泡 中，形成載基因磁性脂質(zhì)微泡。從而使其不僅具有影像增強(qiáng)功能而且具有基因治療和熱療 的雙重抗腫瘤細(xì)胞效能。腫瘤熱療是利用物理方法使組織加熱，達(dá)到殺滅癌細(xì)胞的特定溫度以治療惡性 腫瘤的一種治療手段。目前腫瘤熱療技術(shù)在臨床上已得到了廣泛的應(yīng)用，如射頻、微波、激 光等。但因?qū)δ[瘤的靶向能力差，易導(dǎo)致周圍正常組織產(chǎn)生可逆性損傷而使其應(yīng)用受到 限制。同時(shí)對(duì)深層部位腫瘤熱療，由于人體組織的不均勻性，使得熱分布不均勻，療效較 差。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的突飛猛進(jìn)，將磁性納米材料應(yīng)用于腫瘤熱療能夠克服目前 加熱技術(shù)的不足。在納米顆粒用于治療腫瘤時(shí)，理想的是納米顆粒只存在于腫瘤組織中， 而不出現(xiàn)在其他組織中，從而將治療局限于病灶，不致?lián)p傷正常組織。1997年德國(guó)學(xué)者 Jordan等利用磁性納米粒在交變磁場(chǎng)(alternating magneticfield, AMF)作用下能夠?qū)?吸收的磁能轉(zhuǎn)化為熱能的特點(diǎn)來(lái)治療腫瘤，這種新方法稱為磁流體熱療(magnetic fluid hyperthermia, MFH)。處于交變磁場(chǎng)中的磁性納米顆粒主要是通過(guò)磁滯損耗來(lái)大量吸收磁 場(chǎng)能量產(chǎn)生熱量的。磁流體更易被腫瘤細(xì)胞攝取，在腫瘤中分散均勻，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)加熱的目 的，并且能夠隨著腫瘤分裂進(jìn)入子細(xì)胞中，具有更強(qiáng)的殺傷力。有學(xué)者將脂質(zhì)膜包裹納米磁 性微粒，制成磁性脂質(zhì)體(magnetic liposomes，MLs)，由于脂質(zhì)膜和細(xì)胞膜的成份相似，這 種磁性脂質(zhì)體通過(guò)細(xì)胞的融合或吞噬作用就可以更快更多的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而進(jìn)一步增 強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)熱療的療效。肝癌是目前常見(jiàn)且病死率較高的惡性腫瘤之一，且常伴有肝硬化腹水和肝內(nèi)轉(zhuǎn) 移，故手術(shù)切除的可能性小。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，為腫瘤 的治療開(kāi)辟了新的途徑，肝癌的基因治療已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。國(guó)內(nèi)多項(xiàng)臨床研究證 實(shí)P53基因?qū)Ω伟┲委煹挠行浴Ｄ壳盎蛑委煹难芯亢团R床應(yīng)用中常用的病毒載體和非 病毒載體都存在無(wú)法克服的免疫反應(yīng)、細(xì)胞毒性與安全性的問(wèn)題，限制基因治療的發(fā)展。研 究證實(shí)，納米粒與DNA的連接多通過(guò)靜電吸引作用來(lái)完成。DNA的磷酸骨架所帶的負(fù)電荷 只能與表面帶正電性的載體結(jié)合。因此，需要利用生物活性分子對(duì)納米顆粒的表面進(jìn)行改 性，使其表面攜帶陽(yáng)離子物質(zhì)，以起到防止納米顆粒團(tuán)聚，并有利于結(jié)合DNA分子的作用。 PEI是目前應(yīng)用較有效的陽(yáng)離子聚合物基因載體。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是分子中每隔2個(gè)碳原子 就有一個(gè)活性氮原子(一NH2)，這些氮原子在生理?xiàng)l件下可以發(fā)生質(zhì)子化而帶上正電荷(一 H3+),從而與DNA上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)通過(guò)靜電吸附作用而形成復(fù)合物。本研究中的結(jié)果顯示，以聚乙烯亞氨(PEI)修飾的Fe3O4納米顆粒作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可有效的與DNA結(jié)合 形成Fe3O4納米粒/DNA復(fù)合物。目前關(guān)于超聲造影劑的研究已有30余年的歷史。經(jīng)國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者的研究，已經(jīng) 產(chǎn)生了多種包膜微泡造影劑，它可顯著增強(qiáng)實(shí)質(zhì)器官的灰階顯像，是很好的聲學(xué)對(duì)比劑。超 聲造影技術(shù)可以提高超聲多普勒對(duì)血流信號(hào)的敏感性，可以使組織和血流的聲像圖質(zhì)量大 加改善，提高腫瘤的分辨率，對(duì)腫瘤良惡性的鑒別診斷有很大的幫助。肝臟腫瘤的超聲造影 增強(qiáng)特征取決于該腫瘤的供血特征和血流灌注特征，也是其對(duì)病變性質(zhì)診斷的重要依據(jù)。 肝細(xì)胞癌以肝動(dòng)脈供血為主，血流速度較快，在動(dòng)脈期病灶迅速增強(qiáng)，表現(xiàn)為快進(jìn)快出。肝 轉(zhuǎn)移癌受原發(fā)癌病理類型及血供的影響，其增強(qiáng)表現(xiàn)也各不相同，可環(huán)狀強(qiáng)化，也可快速團(tuán) 狀灌注強(qiáng)化，但多在門脈期增強(qiáng)影像立即消退，其影像低于肝實(shí)質(zhì)。肝血管瘤是由血竇構(gòu)成 的良性腫瘤，因血流速度緩慢，致造影劑進(jìn)出緩慢，表現(xiàn)為從邊緣向中心的逐漸增強(qiáng)，典型 的血管瘤在肝實(shí)質(zhì)相時(shí)其增強(qiáng)影像高于周邊肝實(shí)質(zhì)。最近，JUrgen等制作了定位于血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子受體22和α V β 3整合素的雙靶點(diǎn)靶向微泡，并在荷人卵巢癌的小鼠上進(jìn)行 B超顯影，證明雙靶點(diǎn)的靶向微泡能更多地聚集于靶腫瘤，達(dá)到更理想的腫瘤顯影效果。
大量研究已經(jīng)表明，超聲造影劑不僅僅可以提高圖象的分辨率和對(duì)比度，其在體內(nèi)亦 可作為安全性和高效性的攜帶藥物和基因的載體，在超聲作用下能顯著提高靶部位藥物的 傳輸效率而減少全身的毒副作用和明顯提高局部細(xì)胞和組織的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)。隨著超聲 造影劑與超聲造影設(shè)備的迅速發(fā)展，使得超聲造影成為當(dāng)前超聲醫(yī)學(xué)的熱門研究課題。超 聲微泡聯(lián)合超聲技術(shù)介導(dǎo)基因和藥物靶向治療是利用超聲空化效應(yīng)，將帶有藥物或基因的 微泡載體經(jīng)外周靜脈或局部注入體內(nèi)，待其到達(dá)靶區(qū)后，用超聲照射而使靶區(qū)產(chǎn)生空化效 應(yīng)，微泡內(nèi)爆后將藥物和基因釋放入靶區(qū)。所釋放的藥物和基因可通過(guò)擴(kuò)大的毛細(xì)血管內(nèi) 皮細(xì)胞進(jìn)入組織間隙，最后由細(xì)胞膜上的小孔會(huì)集在細(xì)胞內(nèi)，增強(qiáng)了外源基因的攝取、轉(zhuǎn)染 與表達(dá)，提高了藥物的局部濃度，實(shí)現(xiàn)了靶向治療的作用。Hayashida等將無(wú)水酒精混合在 常用于肝臟顯像的C02微泡中，經(jīng)皮穿刺治療后發(fā)現(xiàn)只需一次就可達(dá)到直徑小于3cm的 腫瘤壞死，并且注射的無(wú)水酒精量也大大減少，無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生，治療后無(wú)肝內(nèi)及腹膜 轉(zhuǎn)移。Aoi等以超聲微泡為載體，將單純皰疹胸腺激酶基因成功導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，證明超聲 微泡作為一種新的基因遞送方法用于腫瘤的基因治療具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。綜上所述，如果將磁性材料與超聲脂質(zhì)微泡相融合，形成載基因磁性超聲脂質(zhì)微 泡，集兩者優(yōu)勢(shì)于一體，在增強(qiáng)腫瘤影像的同時(shí)既能發(fā)揮靶向熱化療，基因治療的功效，又 可對(duì)腫瘤進(jìn)行體外示蹤，這將不失為超聲造影領(lǐng)域的又一創(chuàng)舉。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種磁性載基因脂質(zhì)超聲微泡造影劑的制備方法，利用本發(fā)明可獲得 影像
增強(qiáng)效果好、磁響應(yīng)性強(qiáng)、分散性較好、粒徑小的磁性載基因脂質(zhì)超聲微泡造影劑。 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案來(lái)解決其技術(shù)問(wèn)題
(1)用分析純的FeCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20分別配制成0. lmol/L的FeCl3溶液和FeCl2 溶液，按 Fe3+Fe2+=5 3 分別加入 IOOml 0. lmol/L 的 FeCl3 和 60ml 0. lmol/L 的 FeCl2 溶液于 燒瓶中，在N2保護(hù)和磁力攪拌下滴加1. 5mol/L的NH4OH,溶液中迅速出現(xiàn)沉淀物，繼續(xù)滴加NH4OH至反應(yīng)液的PH=9，沉淀物由紅褐色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏^續(xù)攪拌30min后停止。于80°C 水浴恒溫30min進(jìn)行熟化，然后用強(qiáng)磁鐵吸住燒瓶底部，傾去上層廢液，用去離子水反復(fù)沖 洗生成物，至其溶液PH=7，將生成物真空干燥得Fe3O4磁性納米粒。(2)將Fe3O4干粉溶于5g/L草酸溶液中配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的磁流體，超聲分散后 高速離心棄上清。沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液中，邊超聲邊緩慢加入適量PEI充分混勻，超聲 1 h，磁力攪拌2 h，使反應(yīng)充分形成穩(wěn)定的PEI/ Fe3O4納米粒子。用蒸餾水、乙醇反復(fù)洗滌， 干燥后將PEI/ Fe3O4納米粒子與pEGFP-Cl質(zhì)粒DNA按15 :1的質(zhì)量比充分混合，室溫靜置 30 min，得載基因Fe3O4磁性納米粒子。(3)將DSPC ( 二硬脂酰磷脂酰膽堿)、DPPE ( 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺)、DPPA (二 苯基磷?；B氮化物)按1 :1 1的比例溶于氯仿和異丙醇為2 1的有機(jī)溶劑中，超聲20min 使其充分溶解，于85° C水浴中加熱30min使有機(jī)溶劑蒸發(fā)完全，在西林瓶底部形成一脂質(zhì) 薄膜，以葡萄糖和丙二醇按4 1比例配置的水合液加入此西林瓶中，超聲分散30min后使其 形成充分的脂質(zhì)懸液。在此懸液里加入40mg的PEG4000，60° C加熱使其完全溶解。將一 定量DNA/ PEI/ Fe3O4和明膠按2:1比例加入到脂質(zhì)懸液中，后加吐溫80 0.01ml,使總體 積為西林瓶的1/3。用5ml注射器充入Iml的SF6氣體后置換西林瓶上方的空氣。將此西 林瓶放入頻率4500HZ的機(jī)械振蕩器中振蕩60s，即得載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得了如下有益效果
1.化學(xué)共沉淀法成功制備的Fe3O4磁性納米粒為黑色粉末狀，用掃描電鏡觀察，F(xiàn)e3O4 磁性納米粒呈細(xì)顆粒狀外觀，大小較一致，平均粒徑為15nm，呈散在分布或聚集成片。用能 譜儀對(duì)Fe3O4磁性納米粒成份進(jìn)行分析，可見(jiàn)其中僅含有鐵和氧兩種成分，質(zhì)量百分含量與 Fe3O4中鐵氧質(zhì)量百分含量吻合。Fe3O4磁性納米粒經(jīng)用PEI修飾后掃描電鏡示分散性良好。 實(shí)驗(yàn)表明PEI/Fe304磁性納米粒具有良好的DNA結(jié)合能力，且具有良好的超順磁性和磁感應(yīng) 升溫特性。在頻率為230kHz、功率為4kW，輸出加熱電流為20A的交變磁場(chǎng)照射下，一定濃度 的PEI/Fe304磁性納米粒在50min后溫度幾乎不再上升而恒定保持在42° C_62° C之間， 此溫度為腫瘤熱療的有效溫度。因此，我們可以利用特定濃度的PEI/ Fe3O4在一定磁場(chǎng)下 的升溫而后保持恒溫的性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的熱療。2.采用機(jī)械振蕩法制備的磁性脂質(zhì)微泡光鏡下呈圓球形外觀，外包被一層脂質(zhì) 膜，內(nèi)充有透亮的3&氣體，分散度好，馬爾文粒徑測(cè)量?jī)x示平均粒徑為1127nm。掃描電鏡圖 示磁性脂質(zhì)微泡近似圓球形，表面能譜分析結(jié)果示磁性脂質(zhì)微泡中含有P 0 Fe等元素， 其中P為脂質(zhì)成分，F(xiàn)e 0為磁性材料的成分，證實(shí)磁性脂質(zhì)微泡已制備成功。研究表明， PEGFP-C1/PEI/ Fe3O4磁性脂質(zhì)微泡轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白 的表達(dá)。3.采用20%的烏拉坦5ml/kg經(jīng)耳緣靜脈將兔子麻醉后，經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注0. Iml/ kg的濃度為3X IO9 /ml的磁性脂質(zhì)微泡溶液，即刻追注Iml的生理鹽水。采用Philips彩 超診斷儀，用高頻探頭對(duì)兔肝進(jìn)行造影，與造影前相比兔肝實(shí)質(zhì)有明顯的影像增強(qiáng)。4.在頻率為230kHz、功率為4kW，輸出加熱電流為20A的交變磁場(chǎng)照射下，磁性脂 質(zhì)微泡的升溫能力與包被Fe3O4磁性納米粒子的濃度成正相關(guān)，濃度越大升溫能力越強(qiáng)、溫 度上升越高，溫度升高到某一定點(diǎn)后保持恒定，最終溫度可保持在42°C 45°C之間的腫瘤 有效熱療溫度范圍。
5. 一定量的載WtP53磁性脂質(zhì)超聲微泡體外作用于人肝癌細(xì)胞，不但可以通過(guò) 磁感應(yīng)靶向加熱、還可以通過(guò)WtP53的轉(zhuǎn)染和表達(dá)來(lái)共同抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)其凋 亡。它與單一的磁性脂質(zhì)微泡磁感應(yīng)熱療或單一的載WtP53基因磁性脂質(zhì)超聲微泡基因治 療相比，效果更加顯著(P<0. 05)。6.作為一種新型的超聲造影劑，載WtP53磁性脂質(zhì)超聲微泡既可保證影像增強(qiáng)， 在超聲引導(dǎo)下的同時(shí)又可對(duì)腫瘤進(jìn)行基因治療和熱療的聯(lián)合治療。具有靶向性好，安全性 高的特點(diǎn)，有望為臨床肝癌的治療開(kāi)辟新的路徑。


圖1是本發(fā)明制得的磁性脂質(zhì)微泡光鏡圖(400X )。圖2是熒光顯微鏡下磁性脂質(zhì)微泡對(duì)IfepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率圖。圖3是不同濃度磁性脂質(zhì)微泡體外升溫曲線圖。圖4是兔肝實(shí)質(zhì)超聲造影增強(qiáng)圖(左圖造影前右圖造影后)。圖5是磁性脂質(zhì)微泡的掃描電鏡圖。圖6是磁性脂質(zhì)微泡的表面能譜分析。
具體實(shí)施例方式(1)用分析純的FeCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20分別配制成0. lmol/L的FeCl3溶液和 FeCl2:^液，按 Fe3+:Fe2+=5:3 分別加入 IOOml 0. lmol/L 的 FeCl3 和 60ml 0. lmol/L 的 FeCl2 溶液于燒瓶中，在N2保護(hù)和磁力攪拌下滴加1. 5mol/L的NH4OH,溶液中迅速出現(xiàn)沉淀物，繼 續(xù)滴加NH4OH至反應(yīng)液的PH=9，沉淀物由紅褐色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏^續(xù)攪拌30min后停止。 于80°C水浴恒溫30min進(jìn)行熟化，然后用強(qiáng)磁鐵吸住燒瓶底部，傾去上層廢液，用去離子水 反復(fù)沖洗生成物，至其溶液PH=7，將生成物真空干燥得Fe3O4磁性納米粒。(2)將Fe3O4干粉溶于5g/L草酸溶液中配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的磁流體，超聲分散后 高速離心棄上清。沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液中，邊超聲邊緩慢加入適量PEI充分混勻，超聲 1 h，磁力攪拌2 h，使反應(yīng)充分形成穩(wěn)定的PEI/ Fe3O4納米粒子。用蒸餾水、乙醇反復(fù)洗滌， 干燥后將PEI/ Fe3O4納米粒子與pEGFP-Cl質(zhì)粒DNA按15 :1的質(zhì)量比充分混合，室溫靜置 30 min，得載基因Fe3O4磁性納米粒子。(3)將DSPC ( 二硬脂酰磷脂酰膽堿)、DPPE ( 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺)、DPPA (二 苯基磷?；B氮化物)按1 :1 1的比例溶于氯仿和異丙醇為2 1的有機(jī)溶劑中，超聲20min 使其充分溶解，于85° C水浴中加熱30min使有機(jī)溶劑蒸發(fā)完全，在西林瓶底部形成一脂質(zhì) 薄膜，以葡萄糖和丙二醇按4 1比例配置的水合液加入此西林瓶中，超聲分散30min后使其 形成充分的脂質(zhì)懸液。在此懸液里加入40mg的PEG4000，60° C加熱使其完全溶解。將一 定量DNA/ PEI/ Fe3O4和明膠按2 :1比例加入到脂質(zhì)懸液中，后加吐溫80 0.01ml使總體積 為西林瓶的1/3。用5ml注射器充入Iml的SF6氣體后置換西林瓶上方的空氣。將此西林 瓶放入頻率4500HZ的機(jī)械振蕩器中振蕩60s，即得載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡。
權(quán)利要求
一種作為既可影像增強(qiáng)又可對(duì)腫瘤進(jìn)行治療的磁性脂質(zhì)超聲微泡造影劑的制備方法，其特征在于(1)用分析純的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O分別配制成0.1mol/L的FeCl3溶液和FeCl2溶液，按Fe3+:Fe2+=5:3分別加入100ml 0.1mol/L的FeCl3和60ml 0.1mol/L的FeCl2溶液于燒瓶中，在N2保護(hù)和磁力攪拌下滴加1.5mol/L的NH4OH，溶液中迅速出現(xiàn)沉淀物，繼續(xù)滴加NH4OH至反應(yīng)液的PH=9，沉淀物由紅褐色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?，繼續(xù)攪拌30min后停止，于80℃水浴恒溫30min進(jìn)行熟化，然后用強(qiáng)磁鐵吸住燒瓶底部，傾去上層廢液，用去離子水反復(fù)沖洗生成物，至其溶液PH=7，將生成物真空干燥得Fe3O4磁性納米粒，(2)將Fe3O4干粉溶于5g/L草酸溶液中配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的磁流體，超聲分散后高速離心棄上清，沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液中，邊超聲邊緩慢加入適量PEI充分混勻，超聲1 h，磁力攪拌2 h，使反應(yīng)充分形成穩(wěn)定的PEI/ Fe3O4納米粒子，用蒸餾水、乙醇反復(fù)洗滌，干燥后將PEI/ Fe3O4納米粒子與pEGFP C1 質(zhì)粒DNA按151的質(zhì)量比充分混合，室溫靜置30 min，得載基因Fe3O4磁性納米粒子，(3)將DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)、DPPE(二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺) 、DPPA(二苯基磷酰基疊氮化物)按111的比例溶于氯仿和異丙醇為21的有機(jī)溶劑中，超聲20min使其充分溶解，于85°C水浴中加熱30min使有機(jī)溶劑蒸發(fā)完全，在西林瓶底部形成一脂質(zhì)薄膜，以葡萄糖和丙二醇按41比例配置的水合液加入此西林瓶中，超聲分散30min后使其形成充分的脂質(zhì)懸液，在此懸液里加入40mg的PEG4000，60°C加熱使其完全溶解，將一定量DNA/ PEI/ Fe3O4、和明膠按21比例加入到脂質(zhì)懸液中，后加吐溫80 0.01ml,使總體積為西林瓶的1/3，用5ml注射器充入1ml的SF6氣體后置換西林瓶上方的空氣，將此西林瓶放入頻率4500HZ的機(jī)械振蕩器中振蕩60s，即得載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡。
全文摘要
一種磁性脂質(zhì)超聲微泡造影劑的制備方法配FeCl3和FeCl2溶液并加入燒瓶中，攪拌下滴加NH4OH，出現(xiàn)沉淀，熟化，取出生成物并沖洗，至其溶液pH=7，干燥后得Fe3O4磁性納米粒；將Fe3O4干粉配成磁流體，棄上清，沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液，加PEI形成PEI/Fe3O4納米粒子，將其與pEGFP-C1質(zhì)粒DNA混合靜置，得載基因Fe3O4磁性納米粒子；將DSPC、DPPE、DPPA溶于氯仿和異丙醇為21的有機(jī)溶劑中，蒸發(fā)溶劑，剩脂質(zhì)薄膜，以葡萄糖和丙二醇按41配置水合液加入瓶中，分散后形成脂質(zhì)懸液，加入40mg的PEG4000，加熱溶解，將DNA/PEI/Fe3O4和明膠加到脂質(zhì)懸液中，加吐溫800.01ml,置換西林瓶上方的空氣，振蕩后得載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101987203SQ20101053146
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者張東生, 李華梅 申請(qǐng)人:東南大學(xué)