專利名稱：流行性感冒原代地鼠腎細胞多價疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備流行性感冒原代地鼠腎細胞疫苗的 方法以及制備的疫苗。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡稱流感，是一種嚴重的呼吸道傳染病。在1918-1919年的流感大流 行中，由于感染了流感病毒而死亡的人數(shù)比持續(xù)4年的第二次世界大戰(zhàn)中死亡人數(shù)還要 多。流感的特征往往是反復流行，突然發(fā)生，迅速傳播，小則局部流行，大則遍及全球。嬰兒 和老人病死率高，每年數(shù)以萬計。目前流感仍是影響世界公眾健康的重要問題，而最近高致 病的禽流感又大有侵襲人類的危險，所以接種疫苗仍是當前預(yù)防流感和禽流感傳播感染的 重要手段之一。作為流感的病原體，流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)型流感病毒。甲型流感病 毒常以流行形式出現(xiàn)，能引起世界性流感大流行，它在動物中廣泛分布，也能在動物中引起 流感流行和造成大量動物死亡。乙型流感病毒常常引起流感局部暴發(fā)，不會引起世界性流 感大流行，至今尚未找到它存在于人之外的其它動物中的確鑿證據(jù)。丙型流感病毒主要以 散在形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。過去一直認為人是丙型流感病毒唯 一的天然宿主，但近年來這種看法已得到了徹底糾正，郭元吉等人于1981 1982年從我國 豬群中分離出多株丙型流感病毒，并已得到了世界公認。所有流感病毒均為正粘病毒，分三 個型別，即甲、乙和丙型流感病毒。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的差異又可 分為不同亞型，迄今甲型流感病毒HA有15個亞型(H1-H15)，NA有9個亞型(N1_N9)，H和 N均為糖蛋白，H、N的變異是獨立的。根據(jù)1980年世界衛(wèi)生組織公布的流感病毒的命名如下甲型流感病毒命名法可 用下列公式表示之型別/宿主/分離地點/毒株序號(指采樣時標本號)/分離年代(血 凝素亞型、神經(jīng)氨酸酶亞型)，其中宿主為人的可以忽略不寫。乙型和丙型流感病毒的命名 法和甲型相同，但無亞型劃分。流感是一種古老性疾病，至今在防治方面尚未找到真正的突破口。由于流感病毒 的抗原性，尤其HA蛋白的抗原性，能經(jīng)常不斷地發(fā)生變異，這不僅給疫苗制備增加了難度， 更主要的是能很快使疫苗免疫接種效果下降，甚至無效，所以人類一直不斷地在開發(fā)新的 疫苗，以應(yīng)對新一輪次流感的襲擊。本世紀30年代初，流感病毒滅活疫苗就開始進行動物實驗。當時用受染的小鼠肺 所制成勻液中的流感病毒，經(jīng)甲醛滅活接種動物，然后用流感野毒株皮下和腹腔內(nèi)攻擊，以 了解是否有免疫保護。顯然這種疫苗不能用于人體。1937年，雞胚培養(yǎng)流感病毒獲得成功，使大量生產(chǎn)疫苗成為可能。流感病毒滅活 疫苗于1941年在美國首次被批準使用。1943年美國開始在軍隊中使用，并證實有效；1945年在美國開始廣泛應(yīng)用。這種早期粗制的疫苗，是用含流感病毒粒的雞胚尿囊液，經(jīng)紅細胞 吸附和釋放有限的純化，然后甲醛滅活。接種疫苗后，局部和全身反應(yīng)都很強。本世紀60年代，超速離心機和層析色譜技術(shù)的應(yīng)用，使毒粒純化操作能力大大提 高，制成了全毒粒疫苗。然而，兒童使用時仍可出現(xiàn)不良反應(yīng)。后來經(jīng)過進一步用裂解劑 裂解病毒并進行純化制備出流感裂解疫苗，使用時不良反應(yīng)就大為減少。前后研制出多種 裂解劑，如乙醚，3-N- 丁基磷酸鹽(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80 (Polysorbate 80)，脫氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)，三硝基甲苯X-IOO (Triton X-100)等。流感裂解 疫苗1968年在美國首次被批準使用。本世紀70和80年代，在裂解疫苗的基礎(chǔ)上，又研制出了毒粒亞單位和表面抗原 (HA和NA)疫苗。英國在臨床疫苗試用中，證實了免疫效果與裂解疫苗相同，并可用于兒童。 1980年英國首次批準使用，而后擴展到其它國家。在我國，以朱既明教授為首的一批科研工 作者的辛勤工作下，建立了我國流感研究中心，并組織開發(fā)了超速離心提純的甲型流感單 價滅活疫苗。隨著流感流行病學研究的深入，發(fā)現(xiàn)在流感流行中，常常有甲、乙型流感同時 流行，特別是1976年以來，又形成了甲JH1N1)及甲3(Η#2)同時流行的局面。因此，為了有 效的預(yù)防流感，對流感滅活疫苗抗原的組成，不僅要求含有當前流行株的同類抗原，而且必 須含有同時流行的各種型或亞型的抗原成份。所以，我國先是研究生產(chǎn)了雙價及三價(甲 i、甲3、乙型)流感滅活疫苗，并在長春生物制品研究所投入生產(chǎn)。在預(yù)防和控制流感的流 行中取得了比較滿意的防病效果。最初的流感滅活全病毒疫苗是從感染的雞胚尿囊液中分離流感病毒顆粒制成的。 其工藝中單純的超速離心雖然收集了大部分的流感病毒，但有大量的宿主蛋白，這是流感 滅活疫苗引起副反應(yīng)的主要原因之一。為了提高流感滅活疫苗的免疫原性，降低其副反應(yīng)， 許多工作者致力于疫苗生產(chǎn)工藝的研究。目前，國內(nèi)外許多制造流感全病毒滅活疫苗的廠 家，通常使用離心法和柱層析法從感染的雞胚尿液中分離流感病毒，用此種技術(shù)生產(chǎn)的病 毒制品，純度是比較高的，疫苗接種后的副反應(yīng)性也有減弱。隨著人們對流感疫苗免疫研究的深入，發(fā)現(xiàn)流感病毒的表面抗原，即血凝素和神 經(jīng)氨酸酶所產(chǎn)生的抗體，對同型的流感病毒攻擊具有保護作用，而兩種表面抗原中產(chǎn)生抵 抗力的主要是血凝素抗原。血凝素抗原和神經(jīng)氨酸酶的抗原所賦予的免疫性在機制上是不同的。血凝素抗體 中和病毒的感染性，并抑制最初的感染，而神經(jīng)氨酸酶抗體則限制病毒在感染個體中的散 播，因而，限制了病毒自呼吸道擴散并減少了疾病的嚴重性。目前，沒有證據(jù)表明流感病毒 顆粒的主要內(nèi)部抗原，即核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)具有免疫性。由于以上的基礎(chǔ)研究工 作的進展，使人們在考慮疫苗的安全性和有效性的基礎(chǔ)上，進一步對工藝進行了改進，開發(fā) 出了流感裂解疫苗和流感亞單位疫苗。在開發(fā)過程中，很多科學工作者對裂解工藝進行了 改進，如裂解劑的種類、濃度、裂解時間、裂解的時段等等，并且純化方法也有所提高。而不 同的工藝使得最終病毒原液的性能也有所區(qū)別。這些研究成果，不僅為流感裂解疫苗明確 了質(zhì)控指標，而且為流感病毒滅活疫苗的新劑型和新技術(shù)打下了一定基礎(chǔ)。由于在雞胚上流感病毒具有即強又快的適應(yīng)性，使得目前人們一直沿用雞胚來作 為流感疫苗生產(chǎn)過程中病毒培養(yǎng)和增殖的基質(zhì)，這也使得在流感疫苗生產(chǎn)過程中，一直要 嚴格控制生產(chǎn)用雞胚的質(zhì)量，使之不能受到各種病毒(尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒)污染。而與此
4同時，由于雞胚的擴大生產(chǎn)受到多方面的影響，諸如禽流感、禽白血病等等，使得近年來國 內(nèi)外加速研究用細胞作為流感病毒傳代增殖的基質(zhì)。目前美國使用一種傳代細胞，即MDCK 細胞(一種狗腎細胞)進行流感病毒的傳代取得突破，該細胞制備的疫苗正在進行臨床試 驗；而加拿大和我國的一些公司也在進行傳代細胞為基質(zhì)的流感疫苗的研究。他們是在 Vero細胞中培養(yǎng)流感病毒，并且取得了一些進展，其中進展快一些的加拿大公司已經(jīng)進入 臨床實驗階段。然而，用這兩種傳代細胞作為培養(yǎng)基質(zhì)，都存在的共同問題是適應(yīng)期長，收 獲的病毒滴度偏低等不足，而且傳代細胞DNA很難通過純化的方法去除，因此利用傳代細 胞制備的疫苗具有致瘤性的潛在危險。而原代細胞作為流感病毒增殖傳代的基質(zhì)細胞來制 備流感疫苗，不僅解決了雞胚來源不足和疫苗易受逆轉(zhuǎn)錄病毒污染的問題，還解決了流感 病毒在傳代細胞適應(yīng)慢和病毒滴度弱的不足的問題，同時由于原代地鼠腎細胞不具有傳代 性，即細胞DNA不具有復制性，所以制備出來的疫苗不具有致瘤性的危險。自80年代，我國 的一些單位已經(jīng)將原代地鼠腎細胞應(yīng)用于狂犬疫苗制備，也有利用原代地鼠腎細胞來制備 出血熱疫苗，如中國專利申請第99107985. X號公開的技術(shù)。這說明原代地鼠腎細胞可以應(yīng) 用于疫苗的生產(chǎn)。然而，不同的病毒在原代細胞上的適應(yīng)性也不同，對原代細胞的不同培養(yǎng) 方式以及病毒適應(yīng)時期都需要做大量的試驗摸索，以促進病毒的適應(yīng)性和病毒在原代細胞 上的穩(wěn)定增殖性。國內(nèi)外還沒人有報道過利用原代地鼠腎細胞制備流感疫苗的先例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的流行性感冒疫苗的制備方法。該方法采用原代地 鼠腎細胞作為流感病毒的增殖基質(zhì)，解決了雞胚來源不足和疫苗易受逆轉(zhuǎn)錄病毒污染的問 題，還解決了流感病毒在傳代細胞適應(yīng)慢和病毒滴度弱的不足的問題。由此制備的疫苗中 不含有可復制的DNA成分，簡化了疫苗工藝，并且提高了疫苗的安全性。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種制備流行性感冒疫苗的方法，包括如下步驟a)將流行性感冒病毒原始毒種通過無特定病原雞胚進行適應(yīng)性傳代，制備主代種 子；b)制備原代地鼠腎細胞，利用培養(yǎng)瓶或細胞生物反應(yīng)器進行細胞擴增；c)用主代種子感染原代地鼠腎細胞，并進行適應(yīng)性傳代，制備工作種子；d)用工作種子感染原代地鼠腎細胞，進行病毒擴增，制備疫苗原液。e)將疫苗原液經(jīng)濃縮、滅活、純化后，獲得流行性感冒病毒疫苗。上述步驟a)中的流行性感冒病毒原始毒種可以是世界衛(wèi)生組織(WHO)每年推薦 的或國家相關(guān)部門批準的人流行性感冒病毒毒種或禽流行性感冒病毒毒種；所述流行性感 冒病毒原始毒種優(yōu)選通過1 3代SPF雞胚適應(yīng)性傳代，取血凝效價(HA)達到1 320以 上的雞胚尿囊液作為主代種子。步驟b)中的原代地鼠腎細胞可以是新制備的原代地鼠腎細胞，也可以是經(jīng)過培 養(yǎng)的原代地鼠腎細胞；優(yōu)選為經(jīng)過培養(yǎng)的原代地鼠腎細胞，以增加細胞的量，有利于在病毒 感染后提高病毒收獲液的血凝滴度，并且與傳代細胞制備流感疫苗工藝相比，在制備過程 中沒有去除DNA的純化工序。按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優(yōu)選方案，原代地鼠腎細胞優(yōu)選取自10 14日齡的地鼠，將地鼠進行消毒處理后，無菌取腎、剪碎、用胰蛋白酶和EDTA 組成的消化液將組織小塊消化分散成為單個細胞懸液，其細胞濃度優(yōu)選為約1. OX IO7 5. OX IO8 個/ml。步驟c)中的主代種子到工作種子在原代地鼠腎細胞適應(yīng)性傳代的次數(shù)為1 10 代，優(yōu)選為3 8代，更優(yōu)選為3 6代。原代地鼠腎細胞進行擴增培養(yǎng)或者用工作種子感染原代地鼠腎細胞，進行病毒擴 增時，培養(yǎng)方式選自玻璃瓶貼壁培養(yǎng)、生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)或生物反應(yīng)器片狀載體 籃式培養(yǎng)。按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優(yōu)選方案，步驟b)中原代地鼠腎 細胞培養(yǎng)時，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中另外加入一定濃度的促生長劑作為生長液；步驟c)中用工 作種子感染原代地鼠腎細胞，進行病毒擴增時，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中另外加入一定濃度促生 長劑作為細胞維持液(包括I和II)。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自M199、MEM、DMEM、IMDM、IPM1640和Ham F12培養(yǎng)基中的一種 或多種的組合，其配方根據(jù)培養(yǎng)的不同階段采取不同濃度配比。所述促生長劑能促細胞生 長和促病毒增殖，其成分為小牛或胎牛血清、人血白蛋白、胰蛋白酶、胰島素、半胱氨酸和多 聚賴氨酸中的一種或多種的組合。當使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為液體時，所述促生長劑的加量與 基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量與體積(g/ml)比為1 1000到1 10，當培養(yǎng)基為干粉時，取相當量， 余量為水。按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的另一個優(yōu)選方案，不論是在毒種制備還 是在疫苗生產(chǎn)時，原代地鼠腎細胞的培養(yǎng)階段，所用生長液中促生長劑的量與液體基礎(chǔ)培 養(yǎng)基按重量與體積(g/ml)比為1 50到1 10;原代地鼠腎細胞感染流感病毒后采用的 維持液中促生長劑的量與液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量與體積(g/ml)比為1 1000到1 50 ； 當培養(yǎng)基為干粉時，取相當量，余量為水。按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優(yōu)選方案，原代地鼠腎細胞培養(yǎng)時 加入的促生長劑優(yōu)選為小牛血清、胰島素和多聚賴氨酸，每IOOml生長液中含有基礎(chǔ)培養(yǎng) 基IMDM或者DMEM為90 95ml (或相當量的干粉培養(yǎng)基，余量為水)、小?；蛱ヅＱ鍨?5 10克(相當于5 IOml)、胰島素為0. 005 0. 05克、多聚賴氨酸為0. 001 0. 05克， 更優(yōu)選小牛血清、胰島素和多聚賴氨酸的重量份之比為80 0.2 0.1;原代地鼠腎細胞 感染流感病毒后所用維持液I中加入的促生長劑優(yōu)選為人血白蛋白、半胱氨酸和胰島素， 每IOOml的維持液I含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM為75 97. 5ml (或相當量的干粉培 養(yǎng)基，余量為水)、人血白蛋白0.5 5克(相當于20% (質(zhì)量/體積)的人血白蛋白為 2. 5 25ml)、半胱氨酸0. 05 0. 5克以及胰島素為0. 005 0. 05克，更優(yōu)選人血白蛋白、 半胱氨酸和胰島素的重量份之比為20 1 0.1;所用維持液II中加入的促生長劑優(yōu)選 為人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶，IOOml的維持液II含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基為90 99ml (或 相當量的干粉培養(yǎng)基，余量為水)、人血白蛋白0.2 2克(相當于20% (質(zhì)量/體積)的 人血白蛋白為1 IOml)、半胱氨酸為0. 05 0. 5克以及胰蛋白酶0. 01 0. 1克，更優(yōu)選 人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶的重量份之比為10 1 0.5。按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優(yōu)選方案，將腎組織消化下來的細 胞接種于培養(yǎng)瓶或細胞生物反應(yīng)器中，接種后培養(yǎng)容器中的細胞初始濃度為約1.0 X IO5 1.0X106個/ml，采用生長液培養(yǎng)60 80小時，換成維持液進行病毒感染。按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優(yōu)選方案，原代地鼠腎細胞培養(yǎng)達 到細胞濃度為約1. OX IO7 1.0X IO8個/ml時，或者原代地鼠腎細胞在培養(yǎng)瓶(包括細胞 培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶等可用于細胞培養(yǎng)的器皿)中培養(yǎng)達到占據(jù)培養(yǎng)面的約60% 80%或生物反 應(yīng)器培養(yǎng)中細胞在載體上的貼壁率達到約70% 90%時，進行流感病毒的感染。按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優(yōu)選方案，在用工作種子感染原代 地鼠腎細胞時，原代地鼠腎細胞適應(yīng)的流感病毒工作種子用維持液I稀釋IO2 IO4倍，然 后感染原代地鼠腎細胞，并在37°c適應(yīng)吸附于細胞1 6小時，改變成32 35°C維持培養(yǎng)， 感染后的1 2天，更換成維持液II，繼續(xù)維持培養(yǎng)1 3天，收獲細胞感染液及細胞。按照本發(fā)明流行性感冒疫苗的制備方法的一個優(yōu)選方案，單價病毒液經(jīng)檢定合格 后進行離心、超濾濃縮、滅活、超速離心、凝膠層析以及不同型別的單價病毒液的混合后，分 裝成成品。本發(fā)明的另一個目的是提供根據(jù)上述方法制備的流行性感冒疫苗。所述制備的疫苗可以是人、禽或其它動物的流感全病毒疫苗、流感裂解疫苗或流 感亞單位疫苗，優(yōu)選為流感裂解疫苗。本發(fā)明的流感疫苗的制備藝方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢1)原代地鼠腎細胞能夠很好地應(yīng)用于流感疫苗毒種的適應(yīng)傳代，并能使該適應(yīng)株 很好地保持原病毒株的毒力，且該病毒株可以在培養(yǎng)瓶或生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的原代地鼠腎 細胞上增殖，解決了流感病毒在傳代細胞適應(yīng)慢和病毒滴度弱的問題；2)地鼠繁殖能力強，生長快，其腎臟來源充足，原代地鼠腎細胞作為流感病毒培養(yǎng) 和增殖的基質(zhì)細胞，解決了雞胚來源受限的問題，并且與雞胚相比，不易受到其他病毒，尤 其是逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染；尤其在禽流感爆發(fā)，由于雞的禽流感病毒感染的可能性使雞胚的 來源中斷時，本發(fā)明為流感疫苗的生產(chǎn)提供了一種有效的培養(yǎng)基質(zhì)和可以產(chǎn)業(yè)化的工藝；3)本發(fā)明采用的原代地鼠腎細胞直接來自地鼠的腎臟組織，這種細胞傳代能力很 弱，即細胞中DNA復制很差，細胞個體分生2 3次后，其DNA就不具有復制能力了，因此制 備的疫苗中不含可復制的DNA成分，不具有致瘤性的危險，而且可以簡化了疫苗的純化步 驟，降低流感疫苗的生產(chǎn)成本，有利于大規(guī)模生產(chǎn)；而傳代細胞在體外培養(yǎng)時能夠傳5代以 上，在1次傳代過程中，細胞個體一般分生2 4次，例如現(xiàn)行開發(fā)的Vero細胞或MDCK細 胞制備的流感疫苗，Vero細胞可以傳代150次以上，MDCK細胞可以傳代80次以上，這兩種 細胞的DNA在體外培養(yǎng)過程中復制能力是非常強的，制備的流感疫苗具有致腫瘤的危險；4)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的流感疫苗不含有對人體或其他動物具有致瘤性的可 復制的DNA，消除了逆轉(zhuǎn)錄病毒進入機體導致腫瘤的危險，提高了疫苗的安全性，消除使用 者的恐懼心理。
具體實施例方式一、流行性感冒病毒原代地鼠腎細胞適應(yīng)的毒種制備1.流行性感冒病毒毒種的獲取原始毒種甲JH1N1)型為IVR-116，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；甲3(H3N2) 型為NYMC X-15F，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；乙型為B/Jiangsu/10/2003，系雞胚6代尿囊液凍干保存毒種。上述三種毒種均購自英國國家生物制品及標準化控制研究所 (NIBSC)，為WHO推薦的流感疫苗株。2.主代病毒種子庫的建立將上述三種毒種分別在專用的無菌室內(nèi)啟封，在SPF雞胚上進行1 3次適應(yīng)性 傳代。將收獲的病毒尿囊液分別進行無菌試驗、血凝效價的測定。無菌試驗合格，選擇血凝 效價(HA效價)達到1 320以上的作為生產(chǎn)用主代種子。并對其進行EID50、HI及中和 試驗等指標進行檢定，建立主代病毒種子庫。3.原代地鼠腎細胞的培養(yǎng)選10 14日齡健康的金黃地鼠(Mesocricetus auratus，簡稱地鼠)，用飲用水殺 死并清洗1 2次，用1%。新潔爾滅消毒1 3次，每次3 8分鐘。在無菌環(huán)境下，用無菌 剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入含0. 1 % 0. 5 %的胰蛋白酶和0. 01 % 0. 05 %的 EDTA組成的消化液，置于2-8°C冷消化15 20小時，棄掉消化液，加入生長液分散細胞，并 制備成1. 0 X IO7 1. 0 X IO8個/ml的懸液。取1 2ml細胞懸液接種于玻璃方瓶中，用生 長液加至10ml，放置于37°C的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M 48小時，培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)達到占據(jù)培 養(yǎng)面的60% 80%時棄掉生長液，用生理鹽水輕輕地漂洗1 3次細胞面，然后換成病毒 感染液。生長液由基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM加入小牛(胎牛)血清、胰島素、多聚賴氨酸 制成，其中每IOOml生長液中含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM為90 95ml、小牛(胎牛) 血清為5 10ml、胰島素為0. 005 0. 05克、多聚賴氨酸為0. 001 0. 05克。4.用主代流感病毒種子感染原代地鼠腎細胞用維持液I將主代流感病毒種子液稀釋IO2 IO4倍作為病毒感染液感染制備好 了的細胞。維持液I是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM加入人血白蛋白、半胱氨酸和胰島素 組成。其中每IOOml的維持液I含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM或者DMEM為75 97. 5ml,20% (質(zhì) 量/體積)的人血白蛋白為2. 5 25ml、半胱氨酸0. 05 0. 5克以及胰島素為0. 005 0. 05 克。5.原代地鼠腎細胞感染后培養(yǎng)(工作種子庫的建立)將感染后的培養(yǎng)瓶放于37°C的(X)2培養(yǎng)箱中，使病毒吸附1 5小時，然后改變溫 度為32 35°C維持培養(yǎng)1 2天，更換一次維持液I。繼續(xù)維持培養(yǎng)1 2天，收獲病毒 液。然后分別進行無菌試驗、血凝效價的測定。如無菌試驗合格，血凝效價在1 640以下， 則用病毒液繼續(xù)感染培養(yǎng)好了的地鼠腎細胞，同樣在32 35°C維持培養(yǎng)2 4天，收獲病 毒液，再進行無菌試驗、血凝效價(HA效價)的測定。當無菌試驗合格，血凝效價(HA效價) 達到1 640或以上時，將病毒液作為流行性感冒原代地鼠腎細胞純化疫苗生產(chǎn)用的工作 種子。對其進行EID5(i、HI及中和試驗等指標的檢定。如收獲的病毒液無菌試驗不合格，則重新利用主代病毒種子在原代地鼠腎細胞上 適應(yīng)傳代。主代種子到工作種子，在地鼠腎細胞上適應(yīng)性傳代為8代以內(nèi)，一般為3 8代， 更優(yōu)選3 6代，其毒株的抗原性、毒力、毒性與原始毒株應(yīng)當保持一致。二、疫苗原液的生產(chǎn)1.地鼠腎細胞的制備選10 14日齡健康的金黃地鼠，飲用水殺死并清洗1 2次，用1%。新潔爾滅消 毒1 3次，每次3 8分鐘。在無菌環(huán)境下，用無菌剪子解剖地鼠并取出腎臟，剪碎后加入由0. 1 % 0. 5%的胰蛋白酶和0. 01 % 0. 05%的EDTA組成的消化液，置于2 8°C冷 消化15 20小時，棄掉消化液，加入生長液分散細胞，制備成1. OX IO7 1. OX IO8個/ ml的細胞懸液。取該原代細胞懸液，按照細胞懸液生長液為1 20 1 100的比例 接種于3L、10L轉(zhuǎn)瓶中或者接種于細胞生物反應(yīng)器中，再加入生長液，使細胞的初始濃度為 1.0X105 5. OX IO6個/ml。轉(zhuǎn)瓶在37°C有(X)2的環(huán)境下進行細胞培養(yǎng)，而細胞生物反應(yīng) 器則設(shè)定好培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速為50 80rpm，溫度為36°C 38°C，pH 為6. 5 7. 5，溶氧為15% 85%。2.種子病毒的接種和疫苗原液的收獲當細胞培養(yǎng)濃度達到1.0X IO7 1.0X IO8個/ml時；或者原代地鼠腎細胞在轉(zhuǎn) 瓶中培養(yǎng)達到占據(jù)培養(yǎng)面的60% 80%或生物反應(yīng)器培養(yǎng)中細胞在載體上的貼壁率達到 70% 90%時，用生理鹽水漂洗1 3次，換成維持液I。將原代地鼠腎細胞適應(yīng)的流感 病毒工作種子用維持液I稀釋IO3 IO5倍，然后進行感染，并在37°C適應(yīng)吸附于細胞1 6小時，改變成32 35°C維持培養(yǎng)，感染后的1 2天，更換成維持液II。繼續(xù)維持培養(yǎng) 1 3天，收獲細胞感染液及細胞，置于_60°C凍溶融2 3次后，取樣做無菌試驗和血凝效 價(HA效價)測定。其中，維持液II是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基M199或者MEM加入人血白蛋白、半胱 氨酸和胰蛋白酶組成。IOOml的維持液II含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基為90 99ml、20% (質(zhì)量/體 積)的人血白蛋白為1 10ml、半胱氨酸為0. 05 0. 5克以及胰蛋白酶0. 01 0. 1克。三.疫苗原液的處理純化及疫苗的配制當無菌試驗合格，血凝效價達到1 320以上時，則將單價病毒液，離心后進行超 濾濃縮，然后按滅活劑和單價病毒液的體積比1 4000加入滅活劑進行滅活，滅活劑為甲 醛溶液或者β-丙內(nèi)酯溶液。然后進行1000 2000rpm低速離心，取上清，經(jīng)過超濾，可使 樣品濃縮20倍以上，同時去除相當?shù)碾s質(zhì)。經(jīng)超速離心和kpharose 4FF凝膠過濾層析純 化，經(jīng)平衡、上樣、清洗和洗脫后，總回收可達80-90%，純化后的單價病毒液過濾除菌，并抽 樣進行單價病毒液檢定。然后根據(jù)不同單價原液血凝素抗原含量的相應(yīng)比例進行混合(合 并)，即為疫苗半成品。檢定合格后分裝成為成品。實施例一流行性感冒病毒原代地鼠腎細胞適應(yīng)的毒種制備原始毒種甲i (H1N1)型為IVR-116，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；甲3 (H3N2)型 為NYMC X-15F，系雞胚8代尿囊液凍干保存毒種；乙型為B/Jiangsu/10/2003，系雞胚6代 尿囊液凍干保存毒種。將上述三種毒種在專用的無菌室內(nèi)啟封，分別在SPF雞胚上進行2次適應(yīng)性傳代。 最終收獲的病毒尿囊液，分別進行無菌試驗、血凝效價(HA效價)的測定。無菌試驗合格， 甲1和甲3的血凝效價均為1 640，乙型的血凝效價為1 320，從而建立生產(chǎn)用主種子 庫。并對其進行EID5(I、HI及中和試驗等指標的檢定。其結(jié)果見表1。表1.流感主代毒種的檢定結(jié)果
單價主代毒種EID50HI效價中和指數(shù)甲 1(IVR-116)10_901 6409. OlogEID50A). 2ml
權(quán)利要求
1.一種制備流行性感冒疫苗的方法，包括以下步驟a)將流行性感冒病毒原始毒種通過無特定病原雞胚進行適應(yīng)性傳代，制備主代種子；b)制備原代地鼠腎細胞，利用培養(yǎng)瓶或細胞生物反應(yīng)器進行細胞擴增；c)用主代種子感染原代地鼠腎細胞，并進行適應(yīng)性傳代，制備工作種子；d)用工作種子感染原代地鼠腎細胞，進行病毒擴增，制備疫苗原液；e)將疫苗原液經(jīng)濃縮、滅活、純化后，獲得流行性感冒病毒疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟d)后進一步包括將制備得到的 針對不同型別的流行性感冒病毒的疫苗原液進行混合，制備流行行感冒多價病毒疫苗的步 驟；和/或步驟e)后進一步包括制備流行性感冒裂解疫苗或流行性感冒亞單位疫苗的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)中所述的流行性感冒病毒原始毒 種是世界衛(wèi)生組織每年推薦的或國家相關(guān)部門批準的人流行性感冒病毒或禽流行性感冒病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)中是將流行性感冒病毒原始毒種 通過無特定病原雞胚進行1 3次適應(yīng)性傳代，病毒血凝效價達到1 320以上的雞胚尿 囊液作為主代種子；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中的原代地鼠腎細胞由10 14 日齡的地鼠的腎細胞制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c)中所述主代種子感染原代地鼠腎 細胞進行適應(yīng)性傳代的次數(shù)為1 10代。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中進行細胞擴增時，采用基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中另外加入促生長劑作為生長液；步驟c)中進行病毒擴增時，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中另外加 入促生長劑作為細胞維持液；所述促生長劑選自小?；蛱ヅＱ?、人血白蛋白、胰蛋白酶、 胰島素、半胱氨酸和多聚賴氨酸中的一種或多種的組合；當使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為液體時，所 述促生長劑的加量的重量與所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積之比為1 1000 1 10，當培養(yǎng)基為 干粉時，取相當量，余量為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在原代地鼠腎細胞的培養(yǎng)階段，所用生長 液中促生長劑的加量的重量與所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的量的體積之比為1 50 1 10; 原代地鼠腎細胞感染流感病毒后采用的維持液中促生長劑的量與液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基按重量 與體積比為1 1000 1 50。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)和步驟c)中，當原代地鼠腎細胞 培養(yǎng)達到細胞濃度為1. OX IO7 1.0X IO8個/ml時，或者原代地鼠腎細胞在培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)達到占據(jù)培養(yǎng)面的60% 80%或生物反應(yīng)器培養(yǎng)中細胞在載體上的貼壁率達到70% 90 %時，進行流感病毒的感染。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的流行性感冒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備流感疫苗的方法，包括步驟a)將流感病毒原始毒種通過無特定病原雞胚適應(yīng)性傳代，作為主代種子；b)原代地鼠腎細胞的制備及利用培養(yǎng)瓶或細胞生物反應(yīng)器進行培養(yǎng)；c)用主代種子感染原代地鼠腎細胞，并進行適應(yīng)性傳代，直至得到病毒血凝效價不低于1∶640的毒種作為疫苗的工作種子；d)用工作種子感染原代地鼠腎細胞，進行病毒擴增，直至病毒血凝效價不低于1∶320為疫苗單價原液；e)疫苗單價原液經(jīng)濃縮、滅活、純化后，將不同型別的單價病毒液進行混合，分裝成成品。原代地鼠腎細胞來源充足，易于大規(guī)模生產(chǎn)，制備的疫苗中不含對人或動物體具有致瘤性的可復制的DNA，安全性高。
文檔編號A61K39/145GK102114243SQ20101053203
公開日2011年7月6日 申請日期2006年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日
發(fā)明者吳歧, 李云英, 王玉清 申請人:深圳市孚沃德生物技術(shù)有限公司