專利名稱：缺失型人成纖維細(xì)胞生長因子21變異體及其偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和藥物領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種N末端截短的人成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF-21)的變異體，相應(yīng)的DNA分子、表達(dá)載體、該變異體與聚乙二醇的共價連接及用途。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast Growth Factor, FGF)是一類由FGF基因家族成員編碼的結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，對內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞有促進DNA合成和細(xì)胞分裂作用，主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞、多形細(xì)胞分泌，相對分子量一般在17 34kD。FGF家族成員的中心區(qū)域氨基酸具有 30%-70%的同源性。FGF-21是最新被發(fā)現(xiàn)的一個FGFs成員，屬于FGF-19亞科。FGF-19 亞科包括FGF-15、FGF-19, FGF-21和FGF-23，與其他FGF成員不同的是，他們以內(nèi)分泌的形式對代謝起調(diào)控作用，且不具有與肝素結(jié)合的功能。FGF-21主要在成熟肝臟和胸腺中表達(dá)，最早由 Nishimura 等(Nishimura T 等，Biochim Biophys Acta，2000，1492 :203-206) 于2000年首次在小鼠胚胎中分離得到，其氨基酸序列與FGF-19和FGF-23的同源性分別為 35 %和M %。隨后在胰臟、脂肪組織和肌肉組織同樣發(fā)現(xiàn)了 FGF-21的mRNA (Inagaki T等， Cell Metab，2007，5(6) :415-425)。人源 FGF-21 基因位于 19 號染色體，全長 FGF-21 蛋白由181個氨基酸的成熟FGF-21蛋白和位于N端的28個氨基酸的信號肽組成，其氨基酸序列與鼠源FGF-21約有75%相同。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-21對血糖、血脂的代謝和體重控制起非常重要的作用。在這些作用過程中，其N端區(qū)域和C端區(qū)域發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，即N端氨基酸參與與 FGF受體的相互作用，C端氨基酸參與與一種叫做β -Klotho的蛋白的相互作用(Micanovic R 等，J CellPhys, 2009, 219 (2) :227-234)。Kharitonenkov A 等在 2005 年首次報道了重組人FGF-21蛋白可以刺激分化的小鼠3T3-L1細(xì)胞和人前脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取 (Kharitonenkov A 等，J ClinInvest, 2005,115(6) :1627-1635)。隨后的研究進一步表明， FGF-21是通過增加3T3-L1細(xì)胞和人前脂肪細(xì)胞中葡萄糖載體_1 (GLUT-I)的表達(dá)來增加非胰島素依賴的葡萄糖攝取的(Amer P等，F(xiàn)EBS Lett, 2008, 582 (12) :1725-1730)。與胰島素介導(dǎo)的快速利用葡萄糖不同，F(xiàn)GF-21在葡萄糖攝取方面的效應(yīng)可持續(xù)幾個小時。更重要的是，F(xiàn)GF-21作用下的葡萄糖攝取是非胰島素依賴性的，而且在與胰島素共同存在時可以增加攝取葡萄糖的效應(yīng)(Alexei Kharitonenkov 等，Biodrugs，2008，22 (1) :37-44)。FGF-21 可以改善胰島β細(xì)胞的功能。FGF-21持續(xù)處理8周的db/db小鼠餐后血糖正常，葡萄糖清除率得到明顯改善，胰島素的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和分泌增加，但胰島細(xì)胞數(shù)量沒有變化。另外， 在分離的小鼠胰島和INS-IE細(xì)胞中，F(xiàn)GF-21可以阻止糖脂毒性和細(xì)胞因子介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡，保護胰島β細(xì)胞的數(shù)量和功能，抑制葡萄糖介導(dǎo)的胰高血糖素的釋放(Wente W等，Diabetes, 2006, 55 =2470-2478) 0在非人類靈長類糖尿病動物模型方面，注射重組人FGF-21可以降低LDL膽固醇含量，增加HDL膽固醇含量，降低患心血管方面疾病的風(fēng)險 (Kharitonenkov A 等，Endocrinology，2007，148 :774-781)。在目前進行的重組人 FGF-21動物體內(nèi)藥效學(xué)實驗中，未發(fā)現(xiàn)有低血糖、水腫和肥胖增多等其他糖尿病經(jīng)常出現(xiàn)的副反應(yīng)出現(xiàn)，顯示出了良好的應(yīng)用前景和安全性。Li 1 Iy公司公開了人FGF-21的氨基酸序列和重組制備、用途(US7259248， W0/2009/020802)，人FGF-21蛋白與IgG4或HSA的融合蛋白專利(US20070237768)，同時公布了一種人FGF21的N端的缺失4個氨基酸的突變體以及153位Leu，167位Ala和118位及 134位Cys的突變體。但生物效應(yīng)不同程度降低，其中單純N端缺失4位氨基酸變異體活性保留90% (US 7622445) 0本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)，重組人野生型FGF-21的穩(wěn)定性差，表現(xiàn)為 N末端斷裂。將人FGF21蛋白分子的N末端9個氨基酸序列缺失后(代號為AN9FGF-21)， 具有更高的穩(wěn)定性和生物活性。通過采用基因工程重組蛋白技術(shù)制備缺失型AN9FGF21，包括大腸桿菌(E. coli)、酵母(Pichia Pastoris)和哺乳動物細(xì)胞(CHO)的三大表達(dá)體系，均證明了重組缺失型人FGF21的以上特性。同時，本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)，通過對該缺失型變異體的聚乙二醇修飾后所得的偶聯(lián)物，保持了該缺失型變異體在體內(nèi)的活性，改善了該缺失型變異體在體內(nèi)的的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)。該缺失型變異體及其偶聯(lián)物更適合作為一種藥物組合用于治療或預(yù)防肥胖、 糖尿病、高糖或高脂血癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種缺失型人成纖維細(xì)胞生長因子21 (AN9FGF-21)變異體。它具有seq ID No 1的氨基酸序列特征，該特征序列與野生型人成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF-21)的序列比較，在N末端截短了 HPIPDSSPL共9個氨基酸，由172個氨基酸組成。在原核生物如大腸桿菌中重組表達(dá)時，其N末端可帶有甲硫氨酸(Met)殘基，表述為 Met- Δ N9FGF-21。本發(fā)明所述涉及的N末端缺失9位氨基酸人成纖維細(xì)胞21 ( Δ N9FGF-21) 其N端帶有Met與否，不影響其生物特性。人AN9FGF-21 的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp151015Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu lie Arg Glu Asp Gly Thr Val202530Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala354045Leu Lys Pro Gly Val lie Gln lie Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe505560Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp65707580Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn859095Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn100105110Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
4
115120125Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly lie Leu130135140Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val145150155160Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser165170本發(fā)明的另一目的是提供編碼缺失型人成纖維細(xì)胞生長因子21變異體的序列 (SEQ IDNO=I)的DNA分子，以及含有此DNA分子的重組表達(dá)載體。其表達(dá)載體可以是源于原核生物或真核生物體系，除含有編碼AN9FGF-21的基因序列外，還包含目的蛋白表達(dá)的調(diào)控序列如啟動子和篩選標(biāo)記如氨芐青霉素、四環(huán)素、新霉素、G418、Zeocin, DHFR等。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌，酵母或哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種通過培養(yǎng)上述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)液中分離和純化重組缺失型人FGF-21變異體的方法。本發(fā)明的另一目的是提供了一種穩(wěn)定性和生物活性均獲得提高的人成纖維細(xì)胞生長因子21的類似物，即人AN9FGF-21。本發(fā)明的另一個目的是提供人成纖維細(xì)胞生長因子21的N末端缺失型變異體及其偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物是通過活化的聚乙二醇分子與人AN9FGF-21的N末端氨基或Lys氨基的共價連接而成，其中聚乙二醇主要與SEQ ID NO :1序列中第47位，第50位，第60位和第113位Lys的氨基共價連接，其中聚乙二醇分子可以為直鏈或分支鏈或星型狀，其分子量為 ^D-40KD。該人成纖維細(xì)胞生長因子21的N末端缺失型變異體及其偶聯(lián)物蛋白更具有用于治療或預(yù)防肥胖、糖尿病、高脂和高糖血癥的應(yīng)用價值。為實現(xiàn)其藥物應(yīng)用價值，在有效劑量范圍下，通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)可制備成相應(yīng)治療或預(yù)防用的藥物或藥物組合。根據(jù)藥物的給藥方式或途徑的不同，用已知的公開制劑方法可制成注射液、凍干劑、緩釋劑、片劑或膠囊。


附圖1重組人AN9FGF-21蛋白表達(dá)和純化SDS-PAGE電泳圖譜。其中，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，1為未誘導(dǎo)，2為誘導(dǎo)表達(dá)后，3為經(jīng)Wienyl純化后，4為反相純化后。附圖2重組人AN9FGF-21的PEG修飾及其純化SDS-PAGE電泳圖譜。其中，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，1為修飾前樣品，2為修飾后樣品，3為純化后PEG- Δ N9FGF21。附圖3重組人ΔN9FGF21和PEG-ΔN9FGF21對3T3-L1細(xì)胞葡萄糖攝取率的作用(縱坐標(biāo)為葡萄糖含量(mMol/L)，橫坐標(biāo)為時間(小時)，其中▲為對照組， 為 Δ N9FGF21，■為 PEG- Δ N9FGF21。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，用優(yōu)選的表達(dá)載體pET_3c和宿主細(xì)胞BL21(DE3)PlysS進行重組缺失型人成纖維細(xì)胞生長因子21變異體的表達(dá)和分離制備，采用分子量為20KD的直鏈由醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子(mPEG-ButylALD-20KD)修飾缺失型人成纖維細(xì)胞生長因子21變異體。所述實例僅為說明目的，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1 重組人AN9FGF-21蛋白表達(dá)工程菌的構(gòu)建根據(jù)野生型人FGF-21的氨基酸序列(來源于Genebank)，將N末端9位His Pro lie ProAsp Ser Ser Pro Leu 序列缺失后，作為 Δ N9FGF-21 的氨基酸序列(SEQ ID No: 1)，并按照大腸桿菌偏愛的密碼子，優(yōu)化設(shè)計編碼相對應(yīng)的人AN9FGF-21的eDNA(SEQ ID NO :2)。委托寶生物(大連)有限公司進行全基因合成，其中在cDNA 5，端引入Nde I酶切位點(CATATG)，3，端引入終止密碼子(TCA)和BamH I酶切位點(GGATCC)，插入pMD-19-T simplevector后，轉(zhuǎn)入宿主菌DH5 α，陽性克隆經(jīng)cDNA測序驗證與設(shè)計序列完全一致后，命名為 pMD-AN9FGF21。人AN9FGF-21 的 cDNA 序列(SEQ ID NO 2)5' -CTG CAG TTT GGC GGC CAG GTG CGT CAG CGT TAT CTG TAT ACC GAT GATGCG CAG CAG ACC GAA GCG CAT CTG GAA ATT CGT GAA GAT GGC ACC GTGGGC GGC GCG GCG GAT CAG AGC CCG GAA AGC CTG CTG CAG CTG AAA GCGCTG AAA CCG GGC GTG ATT CAG ATT CTG GGC GTG AAA ACC AGC CGT TTTCTG TGC CAG CGT CCG GAT GGC GCG CTG TAT GGC AGC CTG CAT TTT GATCCG GAA GCG TGC AGC TTT CGT GAA CTG CTG CTG GAA GAT GGC TAT AATGTG TAT CAG AGC GAA GCG CAT GGC CTG CCG CTG CAT CTG CCG GGC AATAAA AGC CCG CAT CGT GAT CCG GCG CCG CGT GGC CCG GCG CGT TTT CTGCCG CTG CCG GGC CTG CCG CCG GCG CTG CCG GAA CCG CCG GGC ATT CTGGCG CCG CAG CCG CCG GAT GTG GGC AGC AGC GAT CCG CTG AGC ATG GTGGGC CCG AGC CAG GGC CGT AGC CCG AGC TAT GCG AGC-3'提取pMD_AN9FGF21重組質(zhì)粒，用Nde I和BamH I雙酶切后，回收MObp左右目的片段，用iMDNA連接酶與同樣經(jīng)Nde I和BamH I酶切回收的表達(dá)質(zhì)粒pET_3c (Invitrogen) 連接。采用CaC12方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌DH5 α，挑選陽性克隆，用酶切和PCR驗證正確的重組質(zhì)粒命名為PET-3C-AN9FGF21。該質(zhì)粒經(jīng)CaC12方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌 BL21(DE3) PlysS (Novagen)感受態(tài)，篩選并克隆高效表達(dá)重組人Δ N9TOF-21蛋白的菌株， 并于-80°C保存。實施例2 重組人AN9FGF-21在大腸桿菌中的重組表達(dá)及制備。將表達(dá)最佳工程菌株劃線接種于LA (LB培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml Amp)瓊脂平板， 37°C培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)的LA平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g， 酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定溶至1000mL，121°C，高壓滅菌30min即可)試管中，37°C 活化12小時，然后按1 %的比例轉(zhuǎn)接到含200mL LB培養(yǎng)液的IOOOmL三角瓶中，37°C培養(yǎng)過夜即成為上罐種子液。將上罐種子液按5%的比例接種于含20L M9+YT培養(yǎng)液的30L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)，整過發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通空氣量、通純氧量來保持溶氧>30%， 用的氨水調(diào)節(jié)PH并保持在7.0。培養(yǎng)菌液0D600 = 4.0 6.0時，將培養(yǎng)溫度降至 280C，至菌液OD600 = 8 . 0 10. 0時，加入終濃度為0. 5mmol/L IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)6小時后停止發(fā)酵，收集菌液，SOOOrpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體放入_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。發(fā)酵液用冷凍高速離心機在4°C下8000rpm離心lOmin，收集菌體，置_20°C凍存 24 小時。每 Ig 菌體加入 IOml 破菌緩沖液(50mmol/LTris,5mmol/L EDTA，pH10. 3)，30°C水浴攪拌1小時后，用ATS公司的壓力勻漿機(型號AH-BASIC) 500Pa勻漿兩次，用顯微鏡觀察，菌體完全破碎，呈絮狀。然后4°C下IOOOOrpm離心lOmin，收集上清。上清中補入10 %的飽和硫酸銨溶液，4 °C放置30min后，4 °C下8000rpm離心 lOmin，除去沉淀物。隨后Phenyl Sepharose (FF)柱層析方法；溶液A為lOmmol/L PB, 15% 飽和硫酸銨溶液(PH8. 0)；溶液B為lOmmol/L PB (pH8. 0)。上清上樣后，用A液復(fù)平衡，再用B液洗脫收集含AN9FGF-21洗脫峰。Q-Srpharose(FF)柱層析方法溶液A為IOmmol/ L/L PB (PH8. 0)，溶液B為10mmol/L/L(PH8. 0)和0. 5M NaCl。將巰水層析洗脫峰上樣后，用溶液A至溶液B的離子梯度洗脫，收集含AN9FGF-21的目的蛋白峰(約50%梯度)。C18 反相層析方法分離介質(zhì)為WelchXB-CIS，溶液A為5%乙腈和0. 1% TFA，溶液B為75%乙腈(含0. 1 % TFA)。Q柱洗脫峰用TFA調(diào)PH至2. 0 3. 0后上樣，用溶液A至溶液B的梯度進行洗脫(10個柱體積)，收集AN9FGF-21洗脫峰(約35%梯度)。再經(jīng)冷凍干燥后成重組人AN9FGF-21的樣品。樣品經(jīng)過上述步驟純化，即鹽析、疏水層析、離子交換層析、反相層析后，純度達(dá)到 95%以上。經(jīng)工藝研究，重組人AN9FGF-21為可溶性表達(dá)，每IOOg菌體可純化制備重組人 AN9FGF-21 蛋白 IOOmg 左右實施例3 :mPEG-ButylALD-20KD 對 AN9FGF-21 的修飾和純化AN9FGF-21 溶液由實例 2 制備，mPEG-ButylALD_20KD (相對分子質(zhì)量為 20 X IO3)， 氰基硼氫化鈉(OKBNNa)溶液作為α -NH2的活化劑。Δ N9FGF-21溶液經(jīng)對IOOmM PB pH5. O 透析后，加入 OKBNNa 終濃度為 20mM。取 Δ N9FGF-21 與 mPEG-ButylALD_20KD 質(zhì)量比 1:2， 4°C條件下，100r/min攪拌，反應(yīng)Mhr，取樣進行SDS-PAGE電泳(圖3)，確定PEG- Δ N9FGF21 的修飾比例，其修飾率達(dá)到75%。修飾后樣品PEG-20- Δ N9FGF21，用DDW稀釋5_10倍后，調(diào) PH至8. O。采用Source 15-Q進一步分離純化。用平衡液(50mM Tris-HClpH8. 0)平衡后，上樣再平衡。用0-500mM的NaCl線性洗脫，收集不含未修飾的Δ N9FGF-21的PEG- Δ N9FGF21 洗脫峰。實施例4 重組人Δ N9FGF-21生物學(xué)特性檢測1、N末端氨基酸序列檢測重組制備的AN9FGF-21蛋白經(jīng)N端氨基酸序列自動分析(Edman降解法)，N末端 15 個氨基酸序列為=Met-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-T hr，為 Met-AN9FGF-212、分子量和純度15% SDS-PAGE還原電泳顯示制備的重組人AN9FGF-21為分子量19，000道爾頓的單一電泳帶，高效液相色譜(HPLC)ClS反相柱檢測結(jié)果顯示，其純度大于98. 0%。實施例5 體外活性測定細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化在37°C、5% CO2的條件下，3T3-L1前脂肪細(xì)胞(上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫)在含10% FBS的高糖DMEM中培養(yǎng)，2天后加入含0. 5mm0l/L0l/L IBMX、 1 μ mol/L地塞米松、10mg/L人胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)48hr，再換含10mg/L人胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)48hr，誘導(dǎo)分化8 12天的3T3-L1細(xì)胞90%左右呈脂肪細(xì)胞表型，用于以下實驗。1)葡萄糖轉(zhuǎn)運分析 孔板中3T3-L1脂肪細(xì)胞，同時分別加入含重組人 ΔN9FGF-21、PEG-ΔN9FGF21和重組人FGF-21 (rhFGF-21)(北京愛迪博生物科技公司)的培養(yǎng)基(0. 2% BSA 的高糖 DMEM)，使終濃度分別為 0、0. 032,0. 16,0. 8、4、20 和 100nM，37°C下培養(yǎng)M小時。葡萄糖被攝取檢測用加熱(37°C)的KRP緩沖液(NaCl 131. 2mmol/Lol/L, KCl 4. 7mmol/Lol/L, MgSO4 1. 2mmol/Lol/L, CaCl2 2. 5mmol/Lol/L, NaH2PO4 2. 5mmol/Lol/ L，pH 7.4)洗滌兩次后；用含有BSA、0. 2μ( /孔2-脫氧-〔14C〕-葡萄糖(北京原子能研究所)(100 μ 1)的KRP緩沖液孵育lhr，加入lOumol/1細(xì)胞松弛素B終止葡萄糖的攝取。另設(shè)一組加lOymol/L細(xì)胞松弛素Wcytochalasin B)作為2-脫氧-(14C)-葡萄糖的非特異攝取率，所有數(shù)據(jù)減去此值，作為各組細(xì)胞的葡萄糖攝取率(CPM，每分鐘液閃儀計數(shù)值)。結(jié)果顯示重組人AN9FGF-21比人FGF-21在相同實驗條件下測定的體外促進脂肪細(xì)胞提取葡萄糖的活性高45%左右，PEG-AN9FGF21在相同實驗條件下測定的體外促進脂肪細(xì)胞提取葡萄糖的活性保留70%左右。葡萄糖利用分析取3T3-L1誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞后(方法同上)，分別加入 PEG- Δ N9FGF21和人Δ N9FGF-21樣品(用低糖的DMEM+5 % FCS)配制成終濃度4ηΜ，于 37°C,5% CO2中培養(yǎng)ia!r、Mhr和48hr時間點分別取培養(yǎng)上清，用葡萄糖測定試劑盒測定上清中葡萄糖的含量并作圖(圖3)，由圖可知，重組人AN9FGF-21和PEG-AN9FGF21可顯著促進3T3-L1細(xì)胞利用葡萄糖。實例6 重組人Δ N9FGF-21和PEG- Δ N9FGF21在⑶_1小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)取CD-I小鼠M只，隨機分成兩組(Δ N9FGF-21組和PEG- Δ N9FGF21組)。每組按 0. 4mg/kg皮下注射，于注射后0到144hr間，間隔多次取血。采用FGF-21ELISA Kit (康肽生物公司)測定血中FGF-21的血藥濃度，計算半衰期。
權(quán)利要求
1.一種人成纖維細(xì)胞生長因子21的N末端缺失型變異體及其偶聯(lián)物。
2.權(quán)利要求1中人成纖維細(xì)胞生長因子21的N末端缺失型變異體，其特征為野生型人成纖維細(xì)胞生長因子21的N末端缺失9個氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1中缺失型人成纖維細(xì)胞生長因子21變異體具有kqID No. 1的序列特征。
4.權(quán)利要求1中缺失的N末端9個氨基酸序列是HisPro lie Pro Asp Ser Ser ProLeu。
5.缺失型人成纖維細(xì)胞因子21變異體的相應(yīng)DNA分子，該DNA分子含有偏碼權(quán)利要求 1、2、3的核苷酸序列。
6.一種重組表達(dá)權(quán)利要求1的缺失型人成纖維細(xì)胞生長因子21的表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求5的DNA分子和用于該DNA分子表達(dá)的調(diào)控序列。
7.權(quán)利要求1中的偶聯(lián)物，其特征為它是以聚乙二醇化學(xué)修飾缺失型變異體人成纖維細(xì)胞生長因子21而形成的Δ N9FGF-21偶聯(lián)物。
8.權(quán)利要求1、7中的偶聯(lián)物，其特征是聚乙二醇與該缺失型變異體的N末端氨基或 Lys氨基的共價連接。
9.權(quán)利要求7、8中的聚乙二醇，其特征為直鏈或分支鏈或星型狀，分子量為5KD-40KD。
10.權(quán)利要求1，2，4，5,7,8中所述缺失型人成纖維細(xì)胞生長因子21變異體具有更強的體外穩(wěn)定性和更高的生物活性。
11.權(quán)利要求1所具備的生物學(xué)特征，更適合作為一種藥物組合用于治療或預(yù)防肥胖、 糖尿病、高糖或高脂血癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天然野生型的N末端缺失型變異體人成纖維細(xì)胞生長因子21(FibroblastGrowth Factor 21，F(xiàn)GF-21)，特征為在N末端缺失掉9個氨基酸序列(△N9FGF21)。該缺失型變異體具有更強的體外穩(wěn)定性和更高的生物活性。同時，本發(fā)明還提供了該缺失型變異體的偶聯(lián)物，其特征為，它是以分子量為5KD-40KD的聚乙二醇化學(xué)修飾缺失型變異體人成纖維細(xì)胞生長因子21而形成的△N9FGF-21偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物保持了△N9FGF21在體內(nèi)的活性，改善了△N9FGF21在體內(nèi)的的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)。該缺失型變異體及其偶聯(lián)物更適合作為一種藥物組合用于治療或預(yù)防肥胖、糖尿病、高糖或高脂血癥。
文檔編號A61P3/06GK102464712SQ20101053967
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月11日
發(fā)明者張淳, 張益 , 梅翔, 范開, 陳勇, 陳海容 申請人:重慶富進生物醫(yī)藥有限公司