專利名稱：人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核仁(nucleolus)是一個高度致密、動態(tài)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。核仁的主要功能是為核 糖體生物發(fā)生提供場所，核糖體生物發(fā)生包括三個重要的步驟1)核糖體RNA轉(zhuǎn)錄；2) 核糖體RNA的加工；3)核糖體大、小亞基的組裝。哺乳動物細(xì)胞中，47S的rRNA前 體在核仁由RNA polymerase I轉(zhuǎn)錄生成。47S的rRNA前體含有三個轉(zhuǎn)錄區(qū)以及四個轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū)。三個轉(zhuǎn)錄區(qū)包括18S、5.8S、28S rRNA序列。四個轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)包括5，外 部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(5，external transcribe spacer, 5' ETS)，位于 I8S rRNA 序列的上游；兩 個內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribe spacer，ITS1，ITS2)，分別位于5.8S rRNA序列的 兩側(cè)；以及較短的3’外部轉(zhuǎn)錄間隔序列(3，external transcribe spacer, 3，ETS)位于 28S rRNA的下游。47S rRNA前體在核酸內(nèi)切酶作用下經(jīng)過剪切加工生成成熟的18S、 5.8S和28S rRNA。5S rRNA由RNA polymerase III轉(zhuǎn)錄，在核漿轉(zhuǎn)錄完成后被轉(zhuǎn)運(yùn)至核 仁。在真核生物中18S rRNA和34種核糖體小亞基蛋白組裝成40S小亞基，28SrRNA、 5S rRNA、5.8S rRNA和49種核糖體大亞基蛋白組成60S大亞基。rRNA的加工過程包括rRNA的修飾與剪切。rRNA的修飾與剪切主要由小核仁 核糖核蛋白體顆粒(small nucleolar ribonucleoprotein particals, snoRNPs)來完成。snoRNPs 由小核仁RNA (small nucleolar RNA, snoRNA)和相關(guān)蛋白結(jié)合而成，通過其snoRNA與 核糖體RNA前體堿基配對介導(dǎo)核糖體RNA前體的修飾和剪切。在18S rRNA的剪切加工過程中U3 snoRNA起重要作用。U3 snoRNA在真核細(xì) 胞中普遍存在，生化與基因分析顯示U3 snoRNA主要通過與核糖體RNA前體通過堿基 配對來介導(dǎo)核糖體RNA前體的剪切。U3 snoRNA和40余種蛋白組成核糖核蛋白體復(fù)合 物(U3snoRNPs，U3 snoRNA particle)發(fā)揮剪切加工作用。在酵母中U3 otoRNPs所含的 40余種蛋白包括四種與U3 snoRNA結(jié)合的核心蛋白fibrillarin，Nop58p, Nop56p, Snul3p(在哺乳動物中是15.5kDa蛋白)；六種與U3 snoRNA特異結(jié)合的蛋白Sofl， MpplO, Imp3, Imp4, Dhrl, Rrp9 ；五種核糖體蛋白 Rps4，Rps6, Rps7, Rpsl4 和 Rps28 ；還包括參與18S rRNA加工的蛋白Rrp5和一些與U3 snoRNA結(jié)合的蛋白。這些與 U3 snoRNA結(jié)合的蛋白命名為UTP (U three protein)。 目前在酵母中發(fā)現(xiàn)的有Utpl_17， 18，20-22。小亞基加工體(small subunit processome，SSU)是 U3 snoRNP 中的一組蛋 白，它們是與U3 snoRNA結(jié)合的核仁蛋白，參與18S rRNA加工。Bernstein等制定了鑒 定SSU組分的標(biāo)準(zhǔn)(1)定位于核仁；⑵與U3 snoRNA結(jié)合；(3)參與18S rRNA的 加工。在脊椎動物，參與5.8和28S rRNA前體的剪切生成過程的是U8 snoRNPs, U8 snoRNPs由U8 snoRNA與相關(guān)蛋白結(jié)合而成。核糖體生物發(fā)生是細(xì)胞的一個重要生命過程，與細(xì)胞生長和增殖等正常生命活動的維持密切相關(guān)，因此受到嚴(yán)密的調(diào)控。當(dāng)核糖體生物發(fā)生發(fā)生異常時(shí)，會引起p53 的改變。在正常細(xì)胞中p53以低水平無活性形式存在，p53的穩(wěn)定性與活性調(diào)控的主要機(jī) 制包括調(diào)控p53的亞細(xì)胞定位、p53的降解調(diào)控和p53的翻譯后修飾。在大多數(shù)應(yīng)激情況 下p53主要通過翻譯后修飾快速活化并維持其穩(wěn)定性。蛋白酶體-泛素系統(tǒng)是p53主要 的降解方式。Mdm2是p53的E3泛素連接酶，介導(dǎo)p53泛素依賴蛋白酶體依賴的降解。 Mdm2結(jié)合p53后，促進(jìn)p53蛋白在26S的蛋白酶體中降解。Mdm2也是p53下游的靶基 因產(chǎn)物，p53反饋調(diào)節(jié)Mdm2的轉(zhuǎn)錄。Mdm2結(jié)合p53的N端轉(zhuǎn)錄活性區(qū)后，p53的轉(zhuǎn) 錄活性被阻斷，Mdm2的表達(dá)水平也會隨之減少。p53與Mdm2的這種相互作用形成了 自身反饋環(huán)來維持Mdm2和p53的正常水平。當(dāng)核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄和加工受到干擾時(shí)， 核糖體蛋白如RPL11，RPL23, RPL5, RPS7等與Mdm2特異結(jié)合，使Mdm2對p53的 泛素連接酶活性受到抑制，p53的活性和穩(wěn)定性增加。這一通路又被稱為RP-Mdm2-p53 信號途徑。在這一通路中起中心作用的是p53蛋白。在應(yīng)激反應(yīng)中p53蛋白穩(wěn)定性增加、水平增高并通過翻譯后修飾及四聚化變成 能結(jié)合DNA的活性形式，聚集于細(xì)胞核。作為一種特異的轉(zhuǎn)錄因子p53在細(xì)胞核中激 活p2嚴(yán)“⑶115’ 16和其它一些生長停滯基因產(chǎn)物如GADD45 (growth arrest and DNA damage induction gene 45)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，p21和GADD45能夠引起細(xì)胞周期停滯并刺激DNA修 復(fù)。如果DNA損傷無法修復(fù)，由p53誘導(dǎo)促凋亡相關(guān)基因表達(dá)使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。 因此p53通過激活或抑制下游基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期停滯、DNA的損傷后修復(fù)和/ 或細(xì)胞凋亡等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人UTP14a(hUTP14a)蛋白表達(dá)抑制劑在制備細(xì)胞增殖抑制 劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑的如下應(yīng)用(1)在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用；(2)在制備促進(jìn)細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述p53蛋白如序列表的 序列3所示；所述人UTP14a蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。所述人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑可為序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序 列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種。所述細(xì)胞可為U20S細(xì)胞或HeLa細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)一種細(xì)胞增殖抑制劑，為序列表的序列5所示的siRNA、序列表的 序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種。所述細(xì)胞可為U20S細(xì)胞或HeLa細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)一種促進(jìn)細(xì)胞中p53蛋白水平升高的產(chǎn)品，為序列表的序列5所示 的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種。所述細(xì)胞可為U20S細(xì)胞或HeLa細(xì)胞。本發(fā)明在MCF-7細(xì)胞中干擾hUTP14a后通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)對細(xì)胞周期進(jìn)行了分 析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hUTP14a表達(dá)減少后S期細(xì)胞減少，而G2/M的細(xì)胞數(shù)無明顯變化。該結(jié)果提示hUTP14a干擾后引起的p53增多抑制了細(xì)胞周期從Gl期向S期轉(zhuǎn)變。小亞基加工體(SSU)參與rRNA前體在AO，Al，A2位點(diǎn)的剪切最后形成18S rRNA。在剪切加工過程中，U3 snoRNA與rRNA前體通過堿基配對介導(dǎo)U3 snoRNPs與 rRNA前體的相互作用。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)hUTP14a和1A6/DRIM(UTP20)在細(xì)胞核仁內(nèi)存 在共定位，hUTP14a與U3 snoRNA相互作用，是U3 snoRNPs的組分之一，阻斷hUTP14a 蛋白的表達(dá)可減少18S rRNA的生成，hUTP14a可與1A6/DRIM (UTP20)結(jié)合。以上結(jié) 果說明，hUTP14a是SSU加工體組成成分之一，參與18S rRNA的加工。rDNA的轉(zhuǎn)錄和rRNA前體的加工是核糖體生物發(fā)生的關(guān)鍵步驟。核糖體生物發(fā) 生包括三個重要的步驟①核糖體RNA和核糖體蛋白的協(xié)調(diào)表達(dá)；②核糖體RNA的加 工；③40S和60S核糖體亞基的組裝。40S和60S核糖體亞基從核仁被轉(zhuǎn)運(yùn)至核漿，最 終轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿并在胞漿中組裝成80S核糖體并為蛋白質(zhì)的合成提供場所。三個步驟中任 何一個受到干擾都會引起核仁應(yīng)激，觸發(fā)一些核糖體蛋白(如RPL11，RPL23, RPL5, RPS7等)與Mdm2特異結(jié)合，使Mdm2對p53的泛素連接酶活性受到抑制，p53的活性 和穩(wěn)定性增加。這一通路又被稱為RP_Mdm2-p53信號途徑。p53的半衰期很短，正常 情況下保持在低水平，在細(xì)胞內(nèi)外的應(yīng)急信號作用下p53能夠被誘導(dǎo)活化而穩(wěn)定在較高 的蛋白水平。應(yīng)急情況下p53蛋白水平增高并從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，在細(xì)胞核中主要作為 一種序列特異的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能，激活p21Wafl/ap115’ 16和其它一些生長停滯基因產(chǎn)物如 GADD45(GADD45, growth arrest and DNA damage induction gene 45)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，p21 禾口 GADD45能夠引起細(xì)胞周期停滯并刺激DNA修復(fù)。如果DNA損傷無法修復(fù)，由p53誘 導(dǎo)促凋亡相關(guān)基因表達(dá)啟動細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。因此p53通過激活或抑制下游基因的 表達(dá)，引起細(xì)胞周期停滯、DNA的損傷后修復(fù)和細(xì)胞凋亡等。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，hUTP14a的 表達(dá)下調(diào)可引起p53蛋白水平的升高，hUTP14a過表達(dá)能引起內(nèi)源p53水平的降低，在翻 譯途徑被阻斷后，hUTP14a過表達(dá)使p53的半衰期縮短。以上結(jié)果說明，hUTP14a可促 進(jìn)p53蛋白的降解。p53蛋白的降解分為蛋白酶體非依賴和蛋白酶體依賴兩種降解途徑。蛋白酶體 非依賴的降解途徑較少見主要指鈣離子依賴的calpain蛋白酶剪切途徑。蛋白酶體依賴的 p53蛋白降解可被蛋白酶體抑制劑阻斷，并且蛋白酶體依賴的p53蛋白降解途徑又根據(jù)是 否依賴于泛素分為泛素非依賴的蛋白媒體途徑和泛素依賴的蛋白媒體途徑。當(dāng)DNA損傷 應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞p53蛋白的水平主要通過泛素依賴的蛋白酶體降解途徑來調(diào)控。泛素 依賴的蛋白媒體途徑中E3泛素連接酶起著重要的作用。p53蛋白的E3泛素連接酶最常見 的是HECT-domain，RING-finger兩種類型。HECT-domain型的E3泛素連接酶較常見的 有ARF-bpl、E6AP (HPVE6相關(guān)蛋白)。RING-finger類型的E3泛素連接酶有Mdm2、 pirh2、COPU SCF等。Mdm2是p53最重要的特異內(nèi)源E3連接酶。并且Mdm2依賴 泛素依賴的蛋白酶體途徑是p53蛋白最主要的降解途徑。本發(fā)明中，在U20S細(xì)胞中轉(zhuǎn) 染hUTP14a后，用MG132阻斷蛋白酶體對蛋白質(zhì)降解后對p53蛋白水平進(jìn)行進(jìn)行分析。 結(jié)果顯示MG132處理后，hUTP14a不再降解p53蛋白，這一結(jié)果說明hUTP14a通過蛋 白酶體途徑降解p53蛋白。p53、Flag_hUTP14a質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染不表達(dá)p53蛋白的H1299細(xì) 胞，轉(zhuǎn)染后用抗p53蛋白單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，在p53蛋白的免疫沉淀中檢測到 hUTP14a,說明hUTP14a與p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。用大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的GST_p53
5融合蛋白與體外轉(zhuǎn)錄翻譯的Flag_hUTP14a蛋白進(jìn)行的GST pull-down實(shí)驗(yàn)說明hUTP14a
與p53蛋白直接結(jié)合。對p53蛋白進(jìn)行修飾的蛋白與p53存在直接結(jié)合。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)
hUTP14a通過242-267和646-771氨基酸序列與p53蛋白的C端和M段結(jié)合。 本發(fā)明有助于對于細(xì)胞增殖和凋亡的研究，對抗癌藥物的開發(fā)具有深遠(yuǎn)影響。


圖1為人類UTP14a與小鼠和酵母同源物的比較。圖2為Western blot對hUTP14a多克隆抗體的鑒定。圖3為用hUTP14a多克隆抗體檢測UTP14a在多種細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中的表達(dá)。圖4為人UTP14a在細(xì)胞內(nèi)的定位。圖5為人UTP14a siRNA通過抑制人UTP14a抑制p53蛋白的降解。圖6為人UTP14a與p53結(jié)合。圖7為人UTP14a siRNA抑制細(xì)胞增殖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí) 驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說 明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。Hela細(xì)胞購自ATCC ，CCL-2 。U20S細(xì)胞 購自ATCC ,HTB-96 。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。siRNA寡核苷酸片段由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，序列如下siRNA-NC 5，-ACUACCGUUGUUAUAGGUG-3，(序列表的序列 4)；siRNA-A-1 5' -AAUCCGCUAGUUCUUCCUG-3，(序列表的序列 5);siRNA-A-2 5，-UUAAUGAGAACCGGCGUC-3，(序列表的序列 6)；siRNA-A-3 5，-UGUGGAUCCGUUCAAUCU-3，(序列表的序列 7)。10XPBS(pH7.4) 80g NaCl, 14.4g Na2HPO4, 2g KCl, 2Ag KH2PO4,溶于 1000ml去離子水中；10XPBS(pH7.4)稀釋至10倍體積即為PBS。細(xì)胞總蛋白裂解液(EBC250) 0.5 % NP-40，250mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH7.4), ImM EDTA, ImM PMSF, ImMNaF, lmMNa3V04, 2yg/ml 亮肽素 (Ieupeptin)，2 μ g/ml 蛋白酶抑制劑(aprotinin)。細(xì)胞漿蛋白裂解液IOmMHEPES (pH7.9)，1.5mM MgCl2, IOmM KCl, 0.5mM DTT, 0.5mMPMSF, 0.2mMpefa。細(xì)胞核蛋白提取液50mMTris-HCl (pH7.4-8.0)，4 5 OmM NaCl，，
1 % NP-40, 20 % glycerol, 2mM DTT, ImM PMSF, 0.2mM Na3VO4, 5mM β -glycerophosphate。實(shí)施例1、hUTP14a蛋白的發(fā)現(xiàn)和生物信息學(xué)分析在對核仁蛋白1A6/DRIM (Xing X.，Du, X.，Lu, Z.，Ning, T.，Su, X.， Ke, Y.Characterization of the promoter of 1A6/DRIM, a novel cancer-related gene andidentification of its transcriptional activator.Gene 2005, 344 161—169)進(jìn) 亍研究時(shí)，發(fā) 明人以1A6/DRIM為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交得到了與1A6/DRIM相互作用的蛋白 hUTP14a (Human U three protein 14a)。hUTP14a蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其編碼基因的核苷酸序列如 序列表的序列2所示。hUTP14a蛋白定位于人類染色體Xq25，cDNA全長2316bp，編碼 長為771個氨基酸殘基的蛋白產(chǎn)物。利用Clustal X軟件將UTP14a蛋白與數(shù)據(jù)庫所有的 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示UTP14a蛋白與小鼠、酵母Utpl4a同源(比對見圖1)。實(shí)施例2、相關(guān)重組質(zhì)粒的制備一、重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag (含有Flag的重組質(zhì)粒)的制備1、合成 DNA 片段 pCI-Flag_pl3-F 和 DNA 片段 pCI-Flag_pl3-R，將 DNA 片段 pCI-Flag-pl3-F 和 DNA 片段 pCI_Flag-pl3-R 通過復(fù)性形成雙鏈 DNA。pCI-Flag-pl3-F 5，-CTAGACCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG GAATTCAAGCTTGG GCCCGGTACCGCTAGCGC-3 ‘；pCI-Flag-pl3-R 5' -GGCCGCGCTAGCGGTACCGGGCCCAAGCTTGAATTC CTTGTCATCGTCGTC CTTGTAGTCCATGGTGGT-3 ‘。2、用限制性內(nèi)切酶NheI和NotI雙酶切步驟1的雙鏈DNA，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶NheI和NotI雙酶切質(zhì)粒pCI-neo (Promega公司)，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pCI-neo-Flag。 二、重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag-UTP14a (含有Flag和hUTP14a的重組質(zhì)粒)的制備1、以HeLa細(xì)胞的總RNA為模板，用F-1和R-2316組成的引物對進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(UTP 14a全長cDNA)F-I 5，-ATCG GAATTC CTCGAG atg act gcg aac egg ctt-3，R-2316 5，-ATCG GGTACC-atc tac aga gca ttt ctt cag-3，2、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn) 物。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag，回收載體骨
^K O4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pCI-neo-Flag-UTP 14a。三、重組質(zhì)粒pCI-neo_UTP14a(含有hUTP14a的重組質(zhì)粒)的制備1、以HeLa細(xì)胞的總RNA為模板，用F-1和R-2316組成的引物對進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(UTP14a全長cDNA)F-I 5，-ATCG GAATTC CTCGAG atg act gcg aac egg ctt-3，
R-2316 5，-ATCG GGTACC-atc tac aga gca ttt ctt cag-3，2、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn) 物。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切質(zhì)粒pCI-neo，回收載體骨架。
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4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pCI-neo-UTP14a。實(shí)施例3、hUTP14a多克隆抗體的制備、純化和特異性鑒定一、hUTP14a多克隆抗體的制備、純化利用DNAstar軟件，對UTP14a蛋白的全長一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，選擇具有較高的 親水性和抗原性、同時(shí)表面暴露性較強(qiáng)的多肽作為抗原，三條抗原多肽的氨基酸序列如 下Pl DGKNRRKLAERSEASLK ；針對自氨基末端第54-70位氨基酸殘基；P2 QQSERTPNNRPDAPKEKKKKEQM ；針對自氨基末端第 536-558 位氨基酸
殘基；P3 QRNPKRITTRHKKQLKKC ；針對自氨基末端第751-768位氨基酸殘基。分別將上述三條多肽與血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，得到三種偶聯(lián)物；將三種偶聯(lián)物 等摩爾混合后免疫新西蘭兔(購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心)。三種偶聯(lián)物混合(均為lOOug)，用PBS稀釋至Iml后與等量的弗氏佐劑充 分混合，進(jìn)行初次免疫(于兩足踱部各0.25ml進(jìn)行皮下注射，其余0.5ml后背部多點(diǎn) 皮下注射)；之后每2周加強(qiáng)免疫1次，采用使用同等劑量的多肽與等體積的不完全 弗氏佐劑混合后全部后背皮下多點(diǎn)注射(Manabu Nakayama，Reiko Kikuno and Osamu Ohara.Protein-Protein Interactions Between Large Proteins Two-Hybrid Screening Using a Functionally Classified Library Composed of Long cDNAs.Genome Res.，2002, 12 1773-1784)。第2次加強(qiáng)免疫后14天取兔耳源靜脈血樣通過ELISA檢測效價(jià)，至效價(jià) 達(dá)1 105(體積比)以上后將免疫兔處死，心臟取血獲得血清。將血清用PBS稀釋后進(jìn)行親和層析，親和層析的具體參數(shù)親和層析柱是將三 條抗原多肽(PI、P2和P3)偶聯(lián)的Sepharose 4B親和層析柱上得到的；將血清上樣于親和 層析柱，4°C孵育過夜；PBS沖洗柱料后使用pH2.4、O.lmol/L甘氨酸緩沖液洗脫抗體， 收集洗脫液；將洗脫液用pH2.4的0.1mol/L的Tris-HCl (pH9.0)中和并透析至PBS中， 獲得抗體I(Abl)。抗體1作為hUTP14a多克隆抗體，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用BCA蛋白定 量試劑盒(美國Pierce公司)檢測抗體1的濃度。二、hUTP14a多克隆抗體的特異性鑒定為鑒定hUTP14a多克隆抗體的特異性，在Hela細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pCI-neo-UTP14a 和重組質(zhì)粒 pCI-neo_Flag-UTP14a，同時(shí)用重組質(zhì)粒 pCI-neo-Flag 作為 對照。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收取細(xì)胞核蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用抗 Flag抗體M2 (Sigma, F3165)和hUTP14a多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析。如圖2A所 示，F(xiàn)lag_hUTP14a蛋白由于Flag的存在比內(nèi)源的hUTP14a略大。hUTP14a的多克隆抗 體可以同時(shí)識別外源的hUTP14a蛋白、Flag_hUTP14a蛋白和內(nèi)源的hUTP14a蛋白?？?Flag抗體M2僅特異識別外源表達(dá)的Flag-hUTP14a(圖2B)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明制備 的hUTP14a多克隆抗體可以特異的識別hUTP14a蛋白，同時(shí)正確的克隆了編碼hUTP14a 的質(zhì)粒。實(shí)施例4、UTP14a在多種細(xì)胞系的表達(dá)及在細(xì)胞內(nèi)的定位為明確UTP14a在多種細(xì)胞系的表達(dá)情況，提取十二種細(xì)胞系的細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜后，分別用Topoimerase I多克隆抗體、Rho A單克隆抗體和hUTP14a多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析。如圖3所示細(xì)胞核蛋白 Topoimerase I僅在細(xì)胞核蛋白中檢測到，而細(xì)胞漿蛋白Rho A僅在細(xì)胞漿蛋白中檢測到， 說明細(xì)胞核和細(xì)胞漿之間沒有互相污染；hUTP14a在這十二種細(xì)胞都有表達(dá)且只存在于 細(xì)胞核蛋白中。這說明hUTP14a在各細(xì)胞系廣泛表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞核。利用抗hUTP14a多克隆抗體和抗1A6/DRIM單克隆抗體進(jìn)行雙色熒光免疫染 色，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。1A6/DRIM顯示為紅色，hUTP14a顯示為綠色， 同時(shí)用DAPI染核，為藍(lán)色。圖4A顯示hUTP14a與1A6/DRIM共同定位于細(xì)胞核仁內(nèi)。為進(jìn)一步驗(yàn)證hUTP14a在細(xì)胞內(nèi)的定位，將GFP-UTPHa轉(zhuǎn)染細(xì)胞，DAPI染核 后熒光顯微鏡下觀察，圖4B顯示GFP-UTPHa與內(nèi)源UTP14a呈現(xiàn)同樣的定位。為進(jìn)一 步確定正確克隆了編碼hUTP14a的質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag-UTP14a轉(zhuǎn)染Hela細(xì) 胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后固定，用兔抗核仁素(micleolin)抗體和鼠抗Flag抗體M2進(jìn)行雙色熒 光免疫染色，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。核仁素用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG檢測， 顯示為綠色，F(xiàn)lag_hUTP14a用TRITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG檢測，顯示為紅色；用DAPI染 核，為藍(lán)色。圖4C顯示，F(xiàn)lag-hUTP14a(紅色)與核仁素(綠色)在細(xì)胞核仁內(nèi)存在共 定位。實(shí)施例5、UTP14a的表達(dá)引起p53蛋白通過蛋白酶體降解一、抑制hUTP14a的表達(dá)引起細(xì)胞內(nèi)p53的水平升高( 一 ) siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞將siRNA (siRNA-A-1、siRNA-A-2、siRNA-A-3 或 siRNA-NC)轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)
胞，具體步驟如下1、將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至35cm2培養(yǎng)瓶中，至細(xì)胞密度達(dá)80%左右。2、將siRNA溶于140ul DEPC水中，使終濃度約為20uM ；然后95°C4min， 70 °C IOmin,室溫放置30min使其復(fù)性。3、在無血清培養(yǎng)基中，通過脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000，購自Invitrogen公 司)將siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、6h后，換上含有10% (體積百分含量)FCS的培養(yǎng)基。( 二)鑒定試驗(yàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞72小時(shí)后，通過Western blot分析hUTP14a的表達(dá)情況和p53蛋白水平。1、分析hUTP14a的表達(dá)情況(1)提取細(xì)胞核蛋白①細(xì)胞用冷的PBS洗兩次，再加Iml冷的PBS刮取細(xì)胞入1.5ml EP管， 12,OOOrpm離心15秒，取沉淀。②沉淀中加入約3倍體積的細(xì)胞漿蛋白裂解液重懸細(xì)胞，12,OOOrpm振蕩10秒 鐘，冰上放置10分鐘。③12,OOOrpm離心15秒，取沉淀(上清為細(xì)胞漿提取物)。④向沉淀中加入約3倍體積的細(xì)胞核蛋白提取液重懸細(xì)胞，2,OOOrpm振蕩10秒 鐘，冰上放置15分鐘。
⑤4°C、12,OOOrpm離心30分鐘，收集上清，即為細(xì)胞核提取物。(2)檢測細(xì)胞核蛋白中hUTP14a的表達(dá)情況將細(xì)胞核提取物進(jìn)行8 % SDS-PAGE凝膠電泳，然后進(jìn)行Western Blot (以Actin
為上樣量對照)，一抗為實(shí)施例3制備的hUTP14a多克隆抗體(抗體1)。結(jié)果見圖5A，在上樣量基本一致的情況下，轉(zhuǎn)染siRNA-A-1、siRNA_A_2和 siRNA-A-3的細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)hUTP14a表達(dá)被沉默。2、分析細(xì)胞中p53蛋白的水平(1)提取細(xì)胞總蛋白①細(xì)胞用冷的PBS洗兩次，再加Iml冷的PBS刮取細(xì)胞入1.5ml EP管， 12,OOOrpm離心15秒，取沉淀。②沉淀中加入Iml細(xì)胞總蛋白裂解液重懸細(xì)胞。③冰上間歇超聲，45HZ、每次15秒，重復(fù)三次。④4°C、12,OOOrpm離心30分鐘，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。(2)檢測細(xì)胞中p53的水平將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行8 % SDS-PAGE凝膠電泳，然后進(jìn)行Western Blot (以Actin為
上樣量對照)，一抗為鼠抗p53單克隆抗體(購自北京中杉金橋公司)。結(jié)果見圖5A，在上樣量基本一致的情況下，轉(zhuǎn)染siRNA-A-1、siRNA_A_2和 siRNA-A-3的細(xì)胞內(nèi)p53含量均高于轉(zhuǎn)染siRNA_NC的細(xì)胞。結(jié)果表明，干擾內(nèi)源hUTP14a的表達(dá)后，p53蛋白的水平升高。二、過表達(dá)hUTP14a引起內(nèi)源p53蛋白水平降低(一)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞用重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag_UTP14a轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，具體步驟如下①在5X7cm培養(yǎng)瓶中種上細(xì)胞(1父106個細(xì)胞/瓶)，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞達(dá)到
90%匯合。②將不同劑量的質(zhì)粒(0 μ g、lug, 2yg、41^或61^)溶于200^1無血清的培
養(yǎng)基中。③將10 μ 1脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)溶于200 μ 1無血清的培養(yǎng)基中。④將步驟②和步驟③的培養(yǎng)基混合，室溫放置20min。⑤將步驟①得到的待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換上4ml無血清的培養(yǎng)基。⑥將步驟④的混合物加入步驟⑤的培養(yǎng)基中，混勻，在37°C、5%032培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑦6h后，換上含有10% (體積百分含量)FCS的培養(yǎng)基。(二)鑒定試驗(yàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，通過Western blot分析hUTP14a的表達(dá)情況和p53蛋白水平。1、分析hUTP14a的表達(dá)情況方法同步驟一的(二)的1。結(jié)果見圖5B，在上樣量基本一致的情況下，隨著質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量的增加，細(xì)胞核 內(nèi)hUTP14a表達(dá)也增加。
2、分析細(xì)胞中p53蛋白的水平方法同步驟一的(二)的2。結(jié)果見圖5B，在上樣量基本一致的情況下，隨著質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量的增加，細(xì)胞 內(nèi)p53蛋白含量降低。結(jié)果表明，hUTP14a過表達(dá)導(dǎo)致p53蛋白水平的下降。三、細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的半衰期測定用重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag_UTP14a或重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞，具
體步驟同步驟二的(一)，轉(zhuǎn)染劑量為4 μ g。轉(zhuǎn)染細(xì)胞16h后，加入放線菌酮(cycloheximide)，使其濃度為10 μ g/ml，以 阻斷蛋白質(zhì)翻譯；分別在 Omin、5min、lOmin、15min、20min、30min、40min 收取細(xì)
胞，提取細(xì)胞總蛋白，對p53蛋白、hUTP14a蛋白和Flag_hUTP14a蛋白的表達(dá)量進(jìn)行 分析。p53蛋白表達(dá)量分析方法同步驟一的(二)的2。hUTP14a蛋白表達(dá)量分析和 Flag-hUTP14a蛋白表達(dá)量分析方法同步驟一的(二)的1。結(jié)果見圖5C，在上樣量基本一致的情況下，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag的細(xì)胞 中p53蛋白的半衰期為20分鐘，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag-UTP14a的細(xì)胞中p53蛋白 的半衰期為10分鐘。結(jié)果表明，hUTP14a可以促進(jìn)p53蛋白降解。四、機(jī)理分析p53的降解分為蛋白酶體非依賴和蛋白酶體依賴兩種降解途徑。很多原癌基因產(chǎn) 物與p53蛋白結(jié)合后通過蛋白酶體導(dǎo)致p53蛋白的降解，這種降解可被蛋白酶抑制劑所阻 斷。為探討hUTP14a引起的p53蛋白的降解是否通過蛋白酶體，在U20S細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染重 組質(zhì)粒pCI-neo-Flag-UTP14a，用重組質(zhì)粒pCI-neo-Flag作對照。轉(zhuǎn)染16h后，加蛋白 酶體阻斷劑MG132 (終濃度為10 μ Μ)后繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，同時(shí)溶劑DMSO作為對照， 收取細(xì)胞總蛋白對ρ53的水平進(jìn)行分析。結(jié)果見圖5D。結(jié)果表明，用溶劑DMSO處理 的細(xì)胞內(nèi)ρ53蛋白被hUTP14a降解，而MG132處理的細(xì)胞內(nèi)hUTP14a不能再降解p53蛋 白。說明MG132能阻斷UTP14a引起的p53蛋白降解，也就是說UTP14a引起的p53蛋 白降解是依賴于蛋白酶體的。實(shí)施例6、UTP14a在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)合p53蛋白為研究hUTP14a與p53之間是否直接結(jié)合，用大腸桿菌中表達(dá)的GST和 GST-p53融合蛋白與體外轉(zhuǎn)錄翻譯的Flag_hUTP14a蛋白進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)。用 hUTP14a多克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示(圖6A) hUTP14a與p53直接
結(jié)合p53蛋白含有393個氨基酸殘基、分為四個主要的功能結(jié)構(gòu)域，從N端到C 端它們依次是轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(氨基酸1-97，p53-N)、序列特異的DNA結(jié)合區(qū)(氨基酸 98-292，p53-M)、含有寡聚化功能域(氨基酸324-355)和負(fù)性調(diào)節(jié)區(qū)(氨基酸363-393) 的C末端(氨基酸293-393，p53-C)。為了明確p53與hUTP14a結(jié)合的氨基酸序列， 用大腸桿菌表達(dá)的GST_p53及3個截?cái)囿w(圖6B下面的示意圖所示)GST_p53_N， GST-p53-M, GST-P53-C 與體外轉(zhuǎn)錄翻譯的 Flag_hUTP14a 蛋白進(jìn)行 GST pull-down 實(shí) 驗(yàn)，然后用hUTP14a抗體進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示(圖6B)，p53通過其aa 98-292 (M 段)和 aa 293-393 (C 端)與 hUTP14a 結(jié)合，而 aa 1-97 (N 端)不與 hUTP14a？口口。為研究hUTP14a與p53結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了 GST_hUTP14a系列截?cái)嗤蛔凅w (圖 6C) Del-I aa 1-267，Del-2 aa 268-645，DeHB: aa 646-771，在大腸桿菌中表 達(dá)這些截?cái)囿w的GST融合蛋白，與體外翻譯的p53蛋白進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 (圖6C)顯示，aa 1-267和aa 646-771與p53結(jié)合，而aa268_645不與p53結(jié)合。提示 hUTP14a通過其N端和C端與p53結(jié)合。同時(shí)將3 個 hUTP14a 的 GFP_hUTP14a 截?cái)囿w DeHl、Del-2 和 De:i-3 轉(zhuǎn)染至 H1299細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP蛋白的定位，圖6D所示，與p53結(jié)合的 Del-I和Del-3是定位在細(xì)胞核內(nèi)。為驗(yàn)證hUTP14a與p53在細(xì)胞內(nèi)的相互作用，將p53、Flag_hUTP14a質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染H1299細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后提取細(xì)胞總蛋白，用抗p53單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀，經(jīng) SDS-PAGE分離，用抗p53抗體和抗UTP14a多克隆抗體對沉淀下來的蛋白復(fù)合物進(jìn)行 Western blot檢測，結(jié)果顯示(圖6E)用抗hUTP14a多克隆抗體可以從p53抗體沉淀下來 的蛋白復(fù)合物物中檢測出hUTP14a和Flag_hUTP14a。結(jié)果說明，hUTP14a在細(xì)胞內(nèi)與 p53結(jié)合。實(shí)施例7、hUTP14a表達(dá)水平降低后抑制細(xì)胞增殖將siRNA(siRNA-A_l、siRNA_A_2、siRNA_A_3 或 siRNA-NC)轉(zhuǎn)染 U20S 細(xì)
胞，方法同實(shí)施例5的步驟一的(一)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞72小時(shí)后分別進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 和增殖曲線制作。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，步驟如下將500個細(xì)胞種于6孔板中，培養(yǎng)10天后，通 過乙醇/冰醋酸(3體積份乙醇和1體積份冰醋酸混合)固定細(xì)胞后，經(jīng)蘇木素染色并拍 照，結(jié)果見圖7A。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siRNA-A-1、siRNA_A_2和siRNA_A_3后，細(xì)胞增 殖明顯受到抑制。制作增殖曲線制作方法如下將IX IO4個細(xì)胞/孔種于96孔板，分別在不同時(shí) 間(24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí))加入CCK-8 (購自Dojindo公司)10 μ 1，繼續(xù) 培養(yǎng)4小時(shí)，測450nm的吸光值，每次實(shí)驗(yàn)各測2個孔，將3次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用 每點(diǎn)的平均值作增殖曲線，結(jié)果見圖7B。轉(zhuǎn)染了 siRNA-A-1、siRNA_A_2和siRNA_A_3 后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制。
權(quán)利要求
1.人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述人UTP14a蛋白的氨基酸序列如序列 表的序列1所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑為 序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的 siRNA中的至少一種；所述細(xì)胞為U20S細(xì)胞或HeLa細(xì)胞。
4.人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑在制備促進(jìn)細(xì)胞中p53蛋白水平升高的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述p53蛋白如序列表的序列3所示。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述人UTP14a蛋白的氨基酸序列如序列 表的序列1所示。
6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑為 序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的 siRNA中的至少一種；所述細(xì)胞為U20S細(xì)胞或HeLa細(xì)胞。
7.—種細(xì)胞增殖抑制劑，為序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的 siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞增殖抑制劑，其特征在于所述細(xì)胞為U20S細(xì)胞或 HeLa細(xì)胞。
9.一種促進(jìn)細(xì)胞中p53蛋白水平升高的產(chǎn)品，為序列表的序列5所示的siRNA、序列 表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種；所述p53蛋白 如序列表的序列3所示。
10.如權(quán)利要求9所述的促進(jìn)細(xì)胞中p53蛋白水平升高的產(chǎn)品，其特征在于所述細(xì) 胞為U20S細(xì)胞或HeLa細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。p53蛋白通過激活或抑制下游基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期停滯、DNA的損傷后修復(fù)和細(xì)胞凋亡等。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)人UTP14a蛋白的表達(dá)下調(diào)可引起p53蛋白水平的升高，即人UTP14a蛋白表達(dá)抑制劑可以促進(jìn)細(xì)胞中p53蛋白水平升高，從而抑制細(xì)胞增殖。本發(fā)明有助于對于細(xì)胞增殖和凋亡的研究，對抗癌藥物的開發(fā)具有深遠(yuǎn)影響。
文檔編號A61K31/713GK102008725SQ20101053992
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者杜曉娟, 柯楊, 胡樂林 申請人:北京大學(xué)