專利名稱：由復(fù)合msc的plga/tcp和msc組成的制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由復(fù)合MSC的PLGA/TCP和MSC組成的制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由疾病、創(chuàng)傷所致的骨、軟骨缺損是臨床常見且較難醫(yī)治的病癥，而各種原因造成 的關(guān)節(jié)軟骨缺損以及因自身缺乏有效的修復(fù)能力，造成損傷后常引起疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙 等。間充質(zhì)干細(xì)胞為骨缺損的治療提供了廣闊的前景。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來源廣泛，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，具有自 我更新和增殖能力，在適宜的微環(huán)境中具有多潛能分化特性。基于MSC具有易獲得、易培 養(yǎng)、方便運輸、低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)特性、能在宿主體內(nèi)長期存活、易于外源基因轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn) 染后外源基因可以穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點，其已成為組織工程、細(xì)胞移植、基因治療及器官移植等 領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞。將MSC作為種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合之后移植到創(chuàng)傷部位，被認(rèn)為 是現(xiàn)今最好的修復(fù)骨缺損的方法之一。支架材料不僅要具有臨床使用時所需要的理化性能，還必須具有生物安全性，組 織相容性等基本特性，以保證其使用的安全性，聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物(PLGA/ TCP)為常用的生物材料。有大量研究報道表明，MSC與生物材料相復(fù)合，在體內(nèi)可以向成 骨、軟骨組織分化。但是仍然存在一些不足，目前利用MSC來促進(jìn)組織工程骨的研究，基本 上是自體細(xì)胞移植，從而產(chǎn)生了許多局限性自體MSC來源有限；增加機(jī)體創(chuàng)傷；體外擴(kuò)增 需要一定時間而難于應(yīng)用于急診手術(shù)等。MSC具有低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)能力，提示MSC可 用于異體移植，而異體MSC移植是否存在安全問題，其在體內(nèi)引起怎樣的免疫反應(yīng)變化等 目前還沒有明確的結(jié)論。國內(nèi)郝偉等應(yīng)用兔脂肪干細(xì)胞與PLGA/TCP復(fù)合，從而構(gòu)建成骨組織工程復(fù)合體， 體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨分化成功。但是關(guān)于生物工程骨在體內(nèi)引起的免疫 反應(yīng)還沒有報道，生物工程骨移植后成功率也是潛在的問題。并且，組織工程骨要在臨床推 廣應(yīng)用也必須實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、降低移植物成本，也要考慮異體細(xì)胞的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于減輕生物材料復(fù)合骨片異體移植免疫反應(yīng)的制 劑。本發(fā)明提供的用于減輕生物材料復(fù)合骨片異體移植免疫反應(yīng)的制劑的活性成分 是如下單獨包裝的物質(zhì)1)和2)1)由間充質(zhì)干細(xì)胞和聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物復(fù)合成的生物材料復(fù)合 骨片；2)離體的間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地是物質(zhì)1)和2)中的間充質(zhì)干細(xì)胞是相同來源的。物質(zhì)1)中，所述生物材料復(fù)合骨片的制備方法包括如下步驟將所述間充質(zhì)干細(xì)
3胞滴加到所述聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物上，在35°C -40°C和4-6% CO2培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)1. 5-3小時。進(jìn)一步，上述培養(yǎng)條件是37°C和5% CO2 ；培養(yǎng)時間為2小時。上述間充質(zhì)干細(xì)胞與所述聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物的配比是長5mm、寬 5mm、厚l-2mm的聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物上復(fù)合105_5 X IO5 +間充質(zhì)干細(xì)胞。進(jìn)一步講，上述間充質(zhì)干細(xì)胞與所述PLGA/TCP的配比是長5mm、寬5mm、厚l_2mm 的聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物上復(fù)合2 X IO5間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的在于提供另一種用于減輕生物材料移植免疫反應(yīng)的制劑。本發(fā)明提供的另一種用于減輕生物材料移植免疫反應(yīng)的制劑的活性成分是如下 單獨包裝的物質(zhì)a)和b)a)聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物；b)離體的間充質(zhì)干細(xì)胞。物質(zhì)a)中，所述聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物是長5mm、寬5mm、厚l_2mm。實驗證明材料生物材料復(fù)合骨片異體皮下移植1周后，可以看到生物材料復(fù)合 骨片移植體區(qū)域(M+T)與相應(yīng)的單純材料移植組(T)相比，并沒有減少炎性細(xì)胞浸潤，主要 為淋巴細(xì)胞浸潤，而輸注MSC(M+T-C，T-C)后，發(fā)現(xiàn)降低了炎性細(xì)胞的浸潤；取移植后1周各 組小鼠脾臟，做病理切片，HE染色分析，觀察到生物材料復(fù)合骨片移植體區(qū)域(M+T)以及單 純材料移植組(T)的脾小結(jié)較大，較多，而輸注MSC(M+T-C，Τ-C；)后脾小結(jié)相應(yīng)減小和減 少，MSC輸注降低了⑶3+T淋巴細(xì)胞早期活化指標(biāo)⑶69的比例。。由此可見，我們建立了一 種間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注來減輕生物材料或生物材料復(fù)合骨片異體移植所引起的免疫反 應(yīng)的方法。


圖1為PLGA/TCP材料細(xì)胞接種率。圖2為檢測成骨誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞和PLGA/TCP材料生物材料復(fù)合骨片ALP活性。圖3為MSC輸注降低了移植體區(qū)域炎性反應(yīng)的圖片，從左到右依次為T，T_C，M+T， M+T-C ；材料移植和生物材料復(fù)合骨片移植后輸注MSC(T-C，M+T-C)降低了材料移植和生物 材料復(fù)合骨片移植(T，M+T)引起的炎性細(xì)胞浸潤；放大倍數(shù)100X。圖4為MSC輸注減輕了脾臟病理改變的圖片，A 正常對照(Control) ；B 從左到右 依次為T，T-C, M+T, M+T-C ；材料移植和生物材料復(fù)合骨片移植后輸注MSC (T_C，M+T-C)，脾 小結(jié)相對材料移植和生物材料復(fù)合骨片移植(T，M+T)減小，減少；放大倍數(shù)100X。圖5為MSC輸注降低了⑶3+T淋巴細(xì)胞早期活化指標(biāo)⑶69的比例。在不同的時 間點收集材料PLGA/TCP的各個處理組(T，T-C，M+T，M+T-C)脾淋巴細(xì)胞，標(biāo)記抗體，流式細(xì) 胞儀檢測，輸注MSC(T-C，M+T-C)后與單純材料和生物材料復(fù)合骨片移植(T，M+T)相比，降 低了 CD69+CD3.與CD3.的比例。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1一、制備生物材料復(fù)合骨片1、生物材料無菌處理將生物材料聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物(PLGA/TCP，數(shù)均分子量為3萬， 中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司)均切成的小塊(每塊規(guī)格長5mm、寬5mm、厚l_2mm)， 用70%乙醇浸泡半小時使材料具有親水性，再用PBS多次沖洗后，紫外消毒半小時，最后在 α -MEM(Gibco)+10% FCS (Hyclone)充分浸泡。2、小鼠骨實質(zhì)MSC的分離和培養(yǎng)將2-3周齡C57BL/6小鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)，斷頸處死小鼠，75% 酒精浸泡消毒小鼠一無菌條件下分離小鼠脛骨和股骨，置于平皿中一用無菌紗布搓去附著 肌肉，去除干骺端一用PBS+10% FCS(Hyclone)反復(fù)沖洗骨髓腔，沖出骨髓細(xì)胞一將骨組織 剪成約ImmX Imm大小一用0. 2 %膠原酶(Invitrogen)，37 V消化2小時一消化后吸出消 化液，用Ci-MEM(Gibco)洗骨片3遍一接種于培養(yǎng)瓶中，使骨片均勻分布瓶底，培養(yǎng)體系含 α -MEM(Gibco)+10% FCS (Hyclone)+100U/ml 青霉素 +100U/ml 鏈霉素，37°C、5% C02 的飽 和濕度條件下培養(yǎng)一每3天換液1次一細(xì)胞接近70-80%匯合時，0. 25%胰酶(Hyclone)消 化傳代，傳代細(xì)胞接種密度為4000個細(xì)胞/cm2。3.生物材料復(fù)合骨片的制備將不同含量(IO4個、5X104個、IO5個、2X105個、5X105個)的小鼠骨片來源的 MSC懸于10 μ 1含血清的培養(yǎng)基(a -MEM+10% FCS)中，得到各個細(xì)胞濃度的懸液，然后滴 加到材料一塊PLGA/TCP材料表面上，并在材料中央反復(fù)輕輕吹吸，使細(xì)胞盡量多的與材料 接觸。將上述滴加有細(xì)胞懸液的材料放入24孔板中，37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)2小時，得 到復(fù)合有各個細(xì)胞濃度的生物材料復(fù)合骨片。4、細(xì)胞接種率測定往步驟2得到的復(fù)合有各個細(xì)胞濃度的生物材料復(fù)合骨片中加入Iml培養(yǎng) 液(a-MEM(Gibco)+10% FCS(Hycl0ne),放入孵箱中培育過夜。同時設(shè)相應(yīng)細(xì)胞濃度 的對照組，即將各個細(xì)胞濃度的懸液直接種入24孔板中，然后同樣加入Iml培養(yǎng)液 (a -MEM(Gibco)+10% FCS(Hyclone)，放入孵箱中培育過夜。然后每孔中加入5mg/ml MTT 100 μ 1，37°C孵育4小時。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液， 用PBS沖洗一次，將材料分別置于1. 5ml EP管中，然后加入200 μ 1異丙醇，將材料夾碎， 2000g,離心10分鐘，取上清150 μ 1到96孔板中。培養(yǎng)板中直接加入異丙醇，溶解10分鐘。 選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。將各處理組與相應(yīng)對 照組做比值(即圖1縱坐標(biāo)值)，繪制生物材料細(xì)胞接種率曲線圖。結(jié)果如圖1所示，將不同的細(xì)胞濃度接種兩種材料上，測定細(xì)胞接種率，發(fā)現(xiàn)隨著 細(xì)胞接種濃度的升高而相對增加，當(dāng)細(xì)胞濃度為105-5X 105時兩種材料的細(xì)胞接種率較 高；當(dāng)細(xì)胞濃度為2 X IO5時兩種材料的細(xì)胞接種率最高。5、成骨分化能力測定往步驟2得到的復(fù)合有各個細(xì)胞濃度的生物材料復(fù)合骨片中加入Iml培養(yǎng)液 (Gibco)+10% FCS(Hyclone),放入孵箱中培育過夜。然后換入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成分如下
權(quán)利要求
一種用于減輕生物材料復(fù)合骨片異體移植免疫反應(yīng)的制劑，其活性成分是如下單獨包裝的物質(zhì)1)和2)1)由間充質(zhì)干細(xì)胞和聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物復(fù)合成的生物材料復(fù)合骨片；2)離體的間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于物質(zhì)1)中，所述生物材料復(fù)合骨片的制備 方法包括如下步驟將所述間充質(zhì)干細(xì)胞滴加到所述聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物 上，在35°C -40°C禾口 4-6% C02培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1. 5-3小時。
3.如權(quán)利要求2所述的制劑，其特征在于所述培養(yǎng)條件是37°C和5%C02 ；培養(yǎng)時間 為2小時。
4.如權(quán)利要求2或3所述的制劑，其特征在于所述間充質(zhì)干細(xì)胞與所述聚乳酸聚乙 醇酸/磷酸三鈣聚合物的配比是長5mm、寬5mm、厚l_2mm的聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚 合物上復(fù)合105-5X 105個間充質(zhì)干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的制劑，其特征在于所述間充質(zhì)干細(xì)胞與所述PLGA/TCP的配比 是長5mm、寬5mm、厚l_2mm的聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物上復(fù)合2X 105個間充質(zhì) 干細(xì)胞。
6.一種用于減輕生物材料移植免疫反應(yīng)的制劑，其活性成分是如下單獨包裝的物質(zhì) a)和 b)a)聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物；b)離體的間充質(zhì)干細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的制劑，其特征在于物質(zhì)a)中，所述聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三 鈣聚合物是長5mm、寬5mm、厚l_2mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由復(fù)合MSC的PLGA/TCP和MSC組成的制劑及其應(yīng)用。該制劑的活性成分是如下單獨包裝的物質(zhì)1)和2)1)由間充質(zhì)干細(xì)胞和聚乳酸聚乙醇酸/磷酸三鈣聚合物復(fù)合成的生物材料復(fù)合骨片；2)離體的間充質(zhì)干細(xì)胞。實驗證實利用物質(zhì)2)間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注可以減輕材料生物材料復(fù)合骨片異體移植所引起的免疫反應(yīng)。
文檔編號A61K35/12GK101991880SQ201010541010
公開日2011年3月30日 申請日期2010年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月8日
發(fā)明者劉元林, 吳英, 孔維霞, 張毅, 朱恒, 李紅, 毛寧, 江小霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所