專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于鴨禽流感口服黏膜免疫的復(fù)合佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于鴨禽流感口服黏膜免疫的復(fù)合佐劑，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專(zhuān) 用于提高滅活疫苗的黏膜免疫效果。
背景技術(shù)：
1消化道黏膜免疫的特點(diǎn)黏膜免疫系統(tǒng)是指機(jī)體與外界相通的腔道(包括呼吸道、消化道及泌尿生殖道) 黏膜表面的免疫。該系統(tǒng)在體內(nèi)的覆蓋面積很大(超過(guò)400m2)，形成動(dòng)物體防御外界病原 物的第一道屏障，因此黏膜免疫系統(tǒng)在機(jī)體免疫系統(tǒng)中占有非常重要的地位。消化道淋巴 組織亦稱(chēng)腸相關(guān)淋巴組織(GALT)。分泌型IgA是黏膜免疫的主要效應(yīng)因子，它不僅具有中 和病毒、抑制微生物吸附的作用，還具有免疫排斥及促天然抗菌因子的功能。黏膜免疫系統(tǒng)的傳入誘導(dǎo)部位為派伊爾氏斑(Peyer’ s Patches，PP)和淋巴濾 泡，派伊爾氏斑位于回腸黏膜固有層并深入到黏膜下層，雞的派伊爾氏斑為一粉紅色橢圓 形斑，位于回盲交界處上方。派伊爾氏斑分為三個(gè)區(qū)①特化圓頂上皮區(qū)，②濾泡區(qū)或B細(xì) 胞區(qū)，③濾泡旁區(qū)或T細(xì)胞區(qū)。圓頂上皮區(qū)有特殊化的抗原識(shí)別細(xì)胞或稱(chēng)M細(xì)胞，它吞飲腸 腔內(nèi)多種抗原?？乖晦D(zhuǎn)運(yùn)到派伊爾氏斑，在濾泡區(qū)受到加工，引起抗原特異性B和T淋巴 細(xì)胞興奮。隨后它們離開(kāi)派伊爾氏斑，轉(zhuǎn)移到黏膜固有層和上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞。派伊爾氏 斑內(nèi)的T細(xì)胞可激活B細(xì)胞，產(chǎn)生IgA。黏膜免疫系統(tǒng)的傳出效應(yīng)部位為黏膜固有層和上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞。正常情況時(shí)， 腸黏膜固有層持續(xù)地含有大量漿細(xì)胞，其中70% 90%分泌IgA。固有層內(nèi)漿細(xì)胞的前體 來(lái)自派伊爾氏斑，通過(guò)腸系膜淋巴和胸導(dǎo)管而到黏膜固有層。巨噬細(xì)胞占固有層內(nèi)淋巴細(xì) 胞的10%。研究表明，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性和自然殺傷性淋巴細(xì)胞的活性，能分 泌多種細(xì)胞因子，參與腸道抗感染免疫和經(jīng)口免疫耐受的形成，并在調(diào)節(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞 功能方面起重要作用。微皺褶細(xì)胞(Microfold cell)簡(jiǎn)稱(chēng)M細(xì)胞，是一種特化的扁平上皮 細(xì)胞，與腸上皮細(xì)胞緊密排列在一起。微皺褶細(xì)胞漿具有豐富的吞飲小泡和線粒體。雞的 派伊爾氏斑處也存在微皺褶細(xì)胞，并具有很強(qiáng)的飲液活性。微皺褶細(xì)胞主要攝取和運(yùn)輸顆 粒性抗原，如某些病毒、細(xì)菌等抗原性物質(zhì)。黏膜免疫的效應(yīng)位點(diǎn)也是誘導(dǎo)位點(diǎn)，消化道派伊爾氏斑中B細(xì)胞受到抗原刺激后 形成致敏的淋巴細(xì)胞通過(guò)全身循環(huán)除再分布到消化道以外還可散布到其它黏膜效應(yīng)位點(diǎn) (如乳腺、支氣管黏膜、生殖道黏膜等)，B細(xì)胞在這些部位進(jìn)行克隆擴(kuò)增，一旦再接觸到相 同抗原，在Th細(xì)胞和其分泌的細(xì)胞因子的輔助下，分化為分泌IgA的漿細(xì)胞。2黏膜免疫佐劑的研究進(jìn)展目前，黏膜免疫佐劑已成為黏膜免疫的研究熱點(diǎn)之一，它能引起局部和全身的免 疫反應(yīng)。研究主要類(lèi)型有細(xì)菌佐劑、核酸佐劑、細(xì)胞因子佐劑、無(wú)機(jī)成分佐劑和投遞系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)卡介苗中含有特殊的核酸序列——CpG基序(寡脫氧核苷酸)，能特 異性的增加抗原的免疫原性。目前把含有未甲基化CpG基序的DNA、細(xì)菌的質(zhì)粒DNA以及人工合成的寡核甘酸統(tǒng)稱(chēng)為CpG DNA,即核酸佐劑或具有免疫刺激作用的DNA序列 (immunostimulatory sequences, ISS)，當(dāng)將它們與蛋白質(zhì)抗原的疫苗共同使用時(shí)，可誘導(dǎo) 以細(xì)胞免疫為主的免疫反應(yīng)。試驗(yàn)證實(shí)，CpG DNA作為黏膜佐劑能促進(jìn)機(jī)體對(duì)乙型肝炎表面 抗原(HBsAg)的系統(tǒng)和黏膜免疫應(yīng)答。CpG DNA可改進(jìn)其它佐劑誘導(dǎo)Th2類(lèi)型應(yīng)答的缺點(diǎn)， 如把CpG DNA與霍亂毒素或氫氧化鋁等佐劑聯(lián)用，先誘導(dǎo)出混合型的Thl和Th2類(lèi)應(yīng)答，然 后轉(zhuǎn)向Thl類(lèi)型的應(yīng)答。黃芪多糖(Astraglus Polysacchride, APS)是從植物黃芪中提取出的一種免疫 活性物質(zhì)，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、增強(qiáng)細(xì)胞代謝，還可以作為免疫佐劑，具有免疫增強(qiáng)的 功能。此外，黃芪多糖還具有符合安全、穩(wěn)定、低成本、可降解等黏膜免疫佐劑的優(yōu)點(diǎn)。黃芪 多糖與金黃色葡萄球菌滅活苗混合免疫家兔和奶牛，血清特異性抗體滴度增加快且明顯提 高，且抗體維持在一個(gè)較高水平。小鼠口服黃芪液能促進(jìn)免疫反應(yīng)早期階段的T細(xì)胞和B 細(xì)胞的前體細(xì)胞增生。目前黃芪多糖口服液也已用于提高人類(lèi)的免疫力。因此黃芪多糖是 一種有效的黏膜免疫佐劑。高濃度葡萄糖可使緊密連接相關(guān)蛋白Z0-I表達(dá)減少，細(xì)胞間連接松懈，增加黏膜 上皮細(xì)胞的通透性。本試驗(yàn)應(yīng)用高濃度葡萄糖主要是增加禽流感滅活抗原的吸收。從本試 驗(yàn)中可以看出應(yīng)用CpG DNA、黃芪多糖和高濃度葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫鴨，小 腸局部禽流感特異性抗體水平和IL-2和IL-6水平顯著或極顯著高于單獨(dú)應(yīng)用禽流感滅活 抗原和單獨(dú)應(yīng)用葡萄糖的水平，表明高濃度葡萄糖可能只促進(jìn)禽流感抗原或CpG DNA的吸 收而沒(méi)有免疫增強(qiáng)劑的作用，如果要提高滅活病毒抗原的黏膜免疫效果不僅需要高濃度葡 萄糖促進(jìn)吸收，還需要免疫佐劑的配合。3黏膜免疫佐劑在消化道黏膜免疫中的意義動(dòng)物傳染病的傳播大多都以消化道和呼吸道為主要途徑?？诜醵疽呙缈梢灾苯?刺激小腸黏膜內(nèi)的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量的IgA和多種細(xì)胞因子，在腸黏膜表面形成一層保護(hù) 膜，防御病原微生物的入侵。研究與實(shí)踐證明消化道黏膜免疫不僅在黏膜局部和其它黏膜 組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還可引起全身性的體液免疫應(yīng)答，因此黏膜免疫受到國(guó)內(nèi)外免疫學(xué)家 的關(guān)注。消化道免疫(口服免疫)方法簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，操作時(shí)不會(huì)引起動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)， 特別適用于大規(guī)模養(yǎng)殖的小型動(dòng)物的免疫接種。但是單獨(dú)應(yīng)用滅活抗原和滅活疫苗不能引 起有效的免疫應(yīng)答。免疫佐劑是摻入疫苗制劑后能促進(jìn)、延長(zhǎng)或增強(qiáng)對(duì)疫苗抗原特異性免 疫應(yīng)答的物質(zhì)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑配合滅活疫苗通過(guò)黏膜免疫動(dòng)物可以取得較好的 效果。本試驗(yàn)巧妙地運(yùn)用免疫增強(qiáng)劑CpG DNA和中藥免疫增強(qiáng)劑黃芪多糖，再配合黏膜促 進(jìn)吸收劑——高濃度葡萄糖作為鴨源禽流感抗原的復(fù)合佐劑，通過(guò)飲水免疫顯著提高了鴨 黏膜局部和系統(tǒng)的免疫水平。4飲水免疫預(yù)防鴨禽流感的意義目前禽流感的發(fā)生給我國(guó)乃至全球養(yǎng)禽業(yè)均帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。禽流感不僅 在家禽中廣泛傳播，近幾年水禽等其他動(dòng)物感染禽流感病毒(AIV)發(fā)病和死亡的報(bào)道也越 來(lái)越多。水禽在感染禽流感后不僅能發(fā)病死亡，而且病毒可經(jīng)宿主糞便排出體外，從而污染 環(huán)境，感染其他禽類(lèi)和哺乳動(dòng)物，因此控制水禽的禽流感對(duì)禽流感的防控具有重要的意義。預(yù)防禽流感有效的方法是注射禽流感疫苗。我國(guó)目前采取的主要方式是肌肉注 射油乳佐劑全病毒滅活苗，但此種免疫方式存在以下缺點(diǎn)浪費(fèi)人力物力、注射時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)影響動(dòng)物生長(zhǎng)、油乳佐劑的殘留影響肉質(zhì)等，另外水禽如鴨身體的特殊構(gòu)造(鴨羽 毛濕滑、鴨絨茂密)也給肌肉注射帶來(lái)更大的困難。消化道和呼吸道是諸多病原微生物感 染的主要途徑，如果通過(guò)飲水免疫直接切斷病原微生物的入侵和向外界釋放的途徑，將有 助于預(yù)防禽流感等傳染性疾病。研究表明飲水免疫是預(yù)防消化道感染的有效途徑。飲水免 疫與傳統(tǒng)肌肉注射相比簡(jiǎn)便安全，省時(shí)省力，減少家禽的應(yīng)激反應(yīng)，避免對(duì)增重和產(chǎn)蛋的影 響，適于大規(guī)模養(yǎng)鴨。同時(shí)，由于飲水免疫時(shí)疫苗只作用于家禽的消化道黏膜組織(這些部 位在家禽肉質(zhì)品加工中均被拋棄)，不會(huì)對(duì)禽類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，從而有利于我國(guó) 鴨肉產(chǎn)品的出口。能否將這一方法推廣應(yīng)用，有良好的免疫效果是基本前提。復(fù)合黏膜免 疫佐劑的應(yīng)用可以提高免疫效果，同時(shí)降低養(yǎng)殖業(yè)的免疫成本。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種滅活疫苗口服黏膜免疫的復(fù)合佐劑，用于增強(qiáng)鴨局部黏 膜抵抗禽流感的免疫力和全身免疫力。技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種用于鴨禽流感口服黏膜免疫的復(fù)合佐劑，其配方為20 50 μ gCpffl)NA、2 5mg黃芪多糖和70 IOOmg葡萄糖。有益效果1、本發(fā)明選取鴨源禽流感滅活抗原(由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所購(gòu)買(mǎi)，抗原標(biāo)準(zhǔn)毒 株為H9N2亞型病毒，代號(hào)為NJO1, HA為210，ELD50為I(T8 32A). Iml)配合CpG DNA、黃芪多 糖和高濃度葡萄糖飲水免疫雛鴨，檢測(cè)鴨小腸局部黏膜免疫反應(yīng)和全身免疫反應(yīng)。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)鴨消化道局部黏膜免疫反應(yīng)和全身免疫反應(yīng)都得到顯著提高。局部黏膜免疫反應(yīng)包括小 腸中肥大細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、IgA分泌細(xì)胞及IgG分泌細(xì)胞數(shù)量，小腸IL-2和IL-6水 平，小腸內(nèi)容物中特異性SIgA及IgG抗體水平；全身免疫反應(yīng)主要是血清中禽流感特異性 抗體。本發(fā)明的口服黏膜免疫的復(fù)合免疫佐劑顯著提高了鴨抵抗禽流感的免疫力。大腸桿 菌牦牛株，為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室保存菌種，公開(kāi)文 獻(xiàn)發(fā)表。(唐泰山.新型免疫佐劑細(xì)菌核酸動(dòng)物免疫增強(qiáng)試驗(yàn)[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論 文·2001)2、攻毒保護(hù)試驗(yàn)和橫向傳播試驗(yàn)證明口服黏膜免疫的復(fù)合佐劑配合禽流感滅活 抗原飲水免疫可以有效保護(hù)鴨群抵抗病毒感染，阻止病毒排出污染環(huán)境，進(jìn)而阻止敏感鴨 群感染。3、由于鴨是禽流感病毒的自然貯存庫(kù)，禽流感病毒感染鴨后主要是在大腸復(fù)制， 而且病毒能以很高的滴度通過(guò)糞便排出體外，污染環(huán)境，繼續(xù)感染其他禽類(lèi)和哺乳動(dòng)物。本 發(fā)明復(fù)合黏膜免疫佐劑的特點(diǎn)在于消滅了禽流感病毒散播的來(lái)源，大大減少禽流感病毒 的污染，為控制禽流感的發(fā)生具有重要的意義。4、可將此復(fù)合佐劑試用于其它滅活疫苗的飲水免疫，減少肌肉注射帶來(lái)的應(yīng)激和 對(duì)肉質(zhì)品的影響。5、現(xiàn)有技術(shù)中《用于禽流感滅活抗原的鼻腔免疫復(fù)合佐劑》(專(zhuān)利號(hào)ZL 2007 10024385. 5)只能用于禽流感滅活抗原鼻腔黏膜免疫。其中應(yīng)用的黏膜促進(jìn)吸收劑是膽酸鈉，但膽酸鈉在小腸中也存在，應(yīng)用膽酸鈉作為口服疫苗佐劑就不會(huì)發(fā)揮理想的效果。因此 本發(fā)明應(yīng)用的黏膜促進(jìn)吸收劑是高濃度葡萄糖?！犊诜呙绲膹?fù)合黏膜免疫佐劑》(專(zhuān)利號(hào) ZL 200610085419. 7)與《一種黏膜免疫的復(fù)合佐劑》(專(zhuān)利號(hào)=ZL 200610085420. X)均只能 用于活病毒(雞新城疫病毒)抗原的免疫。本發(fā)明是應(yīng)用于滅活抗原(禽流感)的免疫。 本專(zhuān)利增加了黏膜促進(jìn)吸收劑葡萄糖(可促進(jìn)滅活抗原在小腸的吸收)。這是目前唯一的 應(yīng)用于禽流感滅活抗原的口服黏膜免疫佐劑。
四

圖1高濃度葡萄糖對(duì)幾種熒光標(biāo)記分子在Caco-2細(xì)胞單層中轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響
圖2復(fù)合佐劑對(duì)血清中禽流感特異性HI抗體水平的影響
圖3復(fù)合佐劑對(duì)咽的IgA分泌細(xì)胞數(shù)量變化的影響
圖4復(fù)合佐劑對(duì)咽的IgG分泌細(xì)胞數(shù)量變化的影響
圖5復(fù)合佐劑對(duì)小腸的IgA分泌細(xì)胞數(shù)量變化的影響
圖6復(fù)合佐劑對(duì)小腸的IgG分泌細(xì)胞數(shù)量變化的影響
圖7復(fù)合佐劑對(duì)咽的特異性IgA水平變化的影響
圖8復(fù)合佐劑對(duì)咽的特異性IgG水平變化的影響
圖9復(fù)合佐劑對(duì)小腸的特異性IgA水平變化的影響
圖10復(fù)合佐劑對(duì)小腸的特異性IgG水平變化的影響
圖11復(fù)合佐劑對(duì)血清中特異性IgA水平變化的影響
圖12復(fù)合佐劑對(duì)血清中特異性IgG水平變化的影響
圖13復(fù)合佐劑對(duì)小腸的IEL細(xì)胞數(shù)量變化的影響
圖14復(fù)合佐劑對(duì)咽的肥大細(xì)胞數(shù)量變化的影響
圖15復(fù)合佐劑對(duì)小腸的肥大細(xì)胞數(shù)量變化的影響
圖16復(fù)合佐劑對(duì)小腸IL-2水平變化的影響
圖17復(fù)合佐劑對(duì)小腸IL-6水平變化的影響
五具體實(shí)施例方式第一部分前期試驗(yàn)1高濃度葡萄糖促進(jìn)熒光標(biāo)記分子的轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞單層(Caco-2細(xì)胞，購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù))和熒光滲 透性標(biāo)記分子(購(gòu)自 Sigma 公司)FITC (MW 389. 4)、FD20S (MW 70, 000)和 FD2000S (Mff 2，000, 000)作為細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，由于其親水特性，只能專(zhuān)一的從細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)，作為證 實(shí)高濃度葡萄糖促進(jìn)吸收的上的試驗(yàn)。加入葡萄糖(750mmol/L)2h后發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖 (750mmol/L)極顯著提高了 FD2000S 轉(zhuǎn)運(yùn)量(P < 0. 01)(圖 1)。2高濃度葡萄糖促進(jìn)膠原酶在小鼠小腸上皮的吸收應(yīng)用高濃度葡萄糖(1500mmOl/L)和FITC標(biāo)記的膠原酶(0. 25ml)進(jìn)行小鼠灌胃， 發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可顯著促進(jìn)膠原酶的轉(zhuǎn)運(yùn)效率(P < 0. 05)，在2h時(shí)，促吸收率可增加 29. 25士3. 43%。以上表明高濃度葡萄糖可能促進(jìn)禽流感滅活抗原在小腸的吸收。
第二部分后期工作首先進(jìn)行鴨IgA和IgG的提取及兔抗鴨IgA和IgG血清的制備然后進(jìn)行以下動(dòng)物試驗(yàn)7日齡雛鴨(江南家禽育種有限公司購(gòu)買(mǎi))100只隨機(jī)分成4組，每組25只。第1 組應(yīng)用生理鹽水飲水免疫雛鴨；第2組應(yīng)用鴨源禽流感滅活抗原(0. 3ml/只)飲水免疫雛 鴨；第3組應(yīng)用鴨源禽流感滅活抗原(0. 3ml/只)配合葡萄糖(72mg/只)飲水免疫雛鴨；第 4組應(yīng)用鴨源禽流感滅活抗原配合CpG DNA (20 50 μ g/只)、黃芪多糖(2 5mg/只)和 葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫雛鴨。10日齡首次免疫，用注射器從口腔滴注0. 30ml/ 只；14日齡二次免疫，20日齡時(shí)再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，方法劑量與首次免疫相同。其中應(yīng)用的材料1) CpG DNA提取方法參考崔義邦等文獻(xiàn)中介紹的方法。(《細(xì)菌CpG DNA對(duì)雞接 種禽流感病毒H9亞型滅活苗的免疫增強(qiáng)作用》中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，25(2) :135_137)大腸桿菌牦牛株液體培養(yǎng)基接種牦牛大腸桿菌，使菌液濃度至0D600 = 1. 5時(shí)，取 50ml菌液4000g離心lOmin，棄去上清，收集沉淀。沉淀用19ml TE緩沖液重懸后，加入Iml 的質(zhì)量濃度100g/L的SDS和60 μ 1 20mg/ml的蛋白酶K，37°C消解Ih ；加入3. 4ml 5mol/L NaCl溶液，振蕩混合；再加入2. 7ml CTAB/NaCl溶液(質(zhì)量濃度50g/L CTAB、5mol/LNaC 1) 混勻，65°C溫育30min，加等體積酚/氯仿/異戊醇(質(zhì)量比為25 24 1)抽提三次；吸 取上層澄清液體，加入0. 6倍體積的異丙醇，輕輕混勻_20°C靜置Ih沉淀CpG DNA, 12000g 離心lOmin，棄去上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫晾干后_20°C保存。檢測(cè)將提取的Cp⑶NA沉淀，加200 μ 1 TE溶解CpG DNA沉淀，于紫外分光光度 儀上測(cè)定其A26Q、A280的吸光值，若CpG DNA溶解液A26Q/A28Q比值在1. 8-2. 0之間，則提取的 CpG DNA沉淀為純品，若其A26tlA28tl比值不在1. 8-2. 0之間，則加等體積酚/氯仿/異戊醇 (質(zhì)量比為25 24 1)繼續(xù)抽提(提取方法同上)JiCpG DNA沉淀為純品。然后加適 量TE緩沖液使其終濃度為10 μ g/ μ 1的CpG DNA溶解液。飲水免疫時(shí)每1只鴨需CpG DNA 50 μ g，即 5 μ 1 CpG DNA 的 TE 溶解液。2)鴨源禽流感滅活抗原江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所購(gòu)買(mǎi)，毒株標(biāo)準(zhǔn)為Η9Ν2亞型病毒， 代號(hào)為NJ01，紅細(xì)胞凝集價(jià)(HA)為21(1，雞胚半數(shù)致死量(ELD5tl)為10_8 32/0. 1ml。3)葡萄糖購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司，為分析純。二次免疫后28小時(shí)每組隨機(jī)選5只，斷頭剖殺后均取相同部位小腸。首次免疫后 第2、3、4、5、6、7周每組隨機(jī)選取6只雛鴨翅靜脈采血，3000rpm離心15分鐘制備血清，用 PBS(0. 01mol/L, pH 7. 4)以1 8稀釋后_20°C保存；首次免疫后第3、5、7周每組隨機(jī)選 取6只試驗(yàn)鴨，進(jìn)行宰殺取材，取相同部位咽、小腸各兩段，一段于-20°C保存，樣品于液氮 磨碎，稱(chēng)重，然后用PBS按8④1/mg組織的比例溶解，充分混勻，3000rpm離心IOmin取上 清，-20°C保存，另一段于Bounis液固定。用SPA-HRP方法顯示咽和小腸中IgA和IgG分泌 細(xì)胞、用間接ELISA方法檢測(cè)咽、小腸和血清中禽流感特異性IgA和IgG抗體水平；用蘇木 精-伊紅(HE)方法顯示小腸中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞；用甲苯胺藍(lán)染色法顯示咽和小腸中肥大 細(xì)胞；用放免方法檢測(cè)小腸中IL-2和IL-6水平；用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)血清中禽流感 特異性HI抗體水平。最后，通過(guò)攻毒試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證禽流感滅活抗原配合佐飲水免疫后，鴨群 對(duì)H9N2病毒攻擊的抵抗力及免疫對(duì)鴨從糞便中排出病毒的影響；通過(guò)同居感染試驗(yàn)來(lái)探討禽流感滅活抗原配合佐劑飲水免疫對(duì)病毒擴(kuò)散的影響。1局部消化道細(xì)胞免疫水平檢測(cè)1)咽和小腸中肥大細(xì)胞數(shù)量的變化用甲苯胺藍(lán)法顯示肥大細(xì)胞常規(guī)制備石蠟切片，梯度酒精脫水，染色用中性紅染 液(中性紅0. 5g，500ml/L酒精100ml)染30min,甲苯胺藍(lán)染液(0. 5mol/L HCl配置5g/L 的甲苯胺藍(lán)，調(diào)PH為0. 5)染30min，丙酮脫色，中性樹(shù)膠封片，Olympus顯微鏡觀察、拍照。從圖14和15可以看出，在整個(gè)免疫期中各組肥大細(xì)胞數(shù)量呈上升趨勢(shì)。首免后 第3、5、7周，應(yīng)用禽流感滅活抗原配合CpG DNA(20 50yg/只)、黃芪多糖(2 5mg/只) 和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫雛鴨后咽和小腸中肥大細(xì)胞數(shù)量比單獨(dú)應(yīng)用禽流感 滅活抗原顯著或極顯著增加(P < 0. 05 ；P < 0. 01)。特別是咽中肥大細(xì)胞數(shù)量在首免后第 5周增幅達(dá)200%。在整個(gè)免疫期，單獨(dú)應(yīng)用滅活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感滅活抗 原飲水免疫后肥大細(xì)胞數(shù)量與口腔滴注生理鹽水相比均無(wú)明顯變化(P > 0. 05)。2)小腸中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的變化常規(guī)制備石蠟切片，常規(guī)HE染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。Olympus顯微 鏡觀察、拍照。從圖13可以看出。在整個(gè)免疫期，各組小腸中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量均呈上升趨 勢(shì)，首免后第3、5、7周，應(yīng)用禽流感滅活抗原配合CpG DNA (20 50 μ g/只)、黃芪多糖(2 5mg/只)和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫雛鴨后小腸中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量比單獨(dú) 應(yīng)用禽流感滅活抗原顯著增加(P <0.05)，數(shù)量增加幅度約為25%。在整個(gè)免疫期，單獨(dú) 應(yīng)用滅活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫后上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與 口腔滴注生理鹽水相比均無(wú)明顯變化(P > 0. 05)。3)小腸中細(xì)胞因子IL-2和IL-6水平變化應(yīng)用放免法檢測(cè)IL-2和IL-6水平將加強(qiáng)免疫后28h采得樣品在液氮中勻漿，用 NP-40裂解液(碧云天生物公司)處理，3000rpm離心15min取上清，進(jìn)行放免檢測(cè)，試劑盒 購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所。從圖16和17可以看出，應(yīng)用生理鹽水、單獨(dú)應(yīng)用禽流感滅活抗原和應(yīng)用葡萄糖配 合禽流感滅活抗原飲水免疫的鴨IL-2和IL-6水平均較低，而應(yīng)用禽流感滅活抗原配合CpG DNA (20 50 μ g/只)、黃芪多糖(2 5mg/只)和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫的 鴨在免疫后IL-2和IL-6水平均極顯著高于單獨(dú)應(yīng)用禽流感滅活抗原的水平(P < 0. 01)。 IL-2和IL-6水平分別增加132%和52%。4)咽和小腸中IgA和IgG分泌細(xì)胞數(shù)量的變化用SPA-HRP間接染色法檢測(cè)IgA和IgG分泌細(xì)胞=Bouins液固定，常規(guī)石蠟切 片，切片厚8 μ m。石蠟切片脫蠟后，放入0.8% H2O2處理30min，用含0. 4% Triton-IOO的 PBS(pH7. 6)洗滌3次，每次5min ；滴加5%正常山羊血清封閉30min ；棄羊血清后分別滴 加適當(dāng)稀釋比例的兔抗鴨IgA或兔抗鴨IgG高免血清，4°C過(guò)夜，0.4% Triton-IOOPBS(pH 7. 6)洗滌3次，每次5min ；滴加適當(dāng)稀釋的SPA-HRP (Sigma公司)，37 °C作用60min ； Tris-HCl緩沖液(0. 05mol/L，pH 7. 6)洗滌15min ；DAB顯色，晾干，中性樹(shù)膠封片。對(duì)照組 用PBS分別替代兔抗鴨IgA和兔抗鴨IgG。從圖3、4、5和6中可以看出，應(yīng)用禽流感滅活抗原配合CpG DNA(20 50 μ g/只)、
8黃芪多糖(2 5mg/只)和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫后雛鴨的咽和小腸中IgA和 IgG分泌細(xì)胞面積比單獨(dú)應(yīng)用禽流感滅活抗原顯著或極顯著增加(P < 0. 05 ；P < 0. 01)，特 別是小腸中IgA分泌細(xì)胞的面積在首免后第3和5周均成倍增加。2消化道黏膜局部抗原特異性IgA和IgG抗體的檢測(cè)用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)血清中消化道黏膜局部抗原特異性IgA和IgG抗體禽流感抗 原包被過(guò)夜，脫脂乳37°C封閉2h，洗滌后加待檢內(nèi)容物上清37°C作用lh，洗滌加兔抗鴨IgA 和IgG抗體，37°C lh，洗滌后加酶標(biāo)羊抗兔IgG 37°C作用lh，OPD顯色后酶標(biāo)儀檢測(cè)。從圖7、8、9和10中可以看出，應(yīng)用禽流感滅活抗原配合CpG DNA(20 50 μ g/ 只)、黃芪多糖(2 5mg/只)和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫的鴨IgA和IgG (除第 7周小腸外)抗體水平與應(yīng)用禽流感滅活抗原飲水免疫鴨相比均極顯著提高(P < 0. 01)。3全身體液免疫水平的檢測(cè)1)血清中禽流感特異性HI抗體水平的變化用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)血清中禽流感特異性HI抗體用禽流感滅活抗原配制 4單位病毒，在96孔反應(yīng)板上依次加入生理鹽水、血清倍比稀釋液、4單位病毒和1 %鴨紅細(xì) 胞。370C 15min后讀數(shù)。從圖2中可以看出，應(yīng)用禽流感滅活抗原配合CpG DNA (20 50 μ g/只)、黃芪多 糖(2 5mg/只)和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫后，血清中禽流感特異性HI抗體 可以在整個(gè)免疫期內(nèi)保持較高水平，首免后2 5周均顯著高于單獨(dú)應(yīng)用禽流感滅活抗原 飲水免疫組(P < 0. 05)。尤其是在首免后4周時(shí)達(dá)到高峰，HI抗體滴度達(dá)7. 81og2，遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18936-2003(《高致病性禽流感診斷技術(shù)》)中規(guī)定的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)51og2。
2)血清中禽流感特異性抗體IgA和IgG水平的變化應(yīng)用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)血清中禽流感特異性IgA和IgG抗體禽流感抗原包被過(guò)夜， 脫脂乳37°C封閉2h，洗滌后加待檢內(nèi)容物上清37°C作用lh，洗滌加兔抗鴨IgA和IgG抗體， 370C lh，洗滌后加適當(dāng)稀釋后的酶標(biāo)羊抗兔IgG 37°C作用lh，OPD顯色后酶標(biāo)儀檢測(cè)。從圖11和12中可以看出，應(yīng)用禽流感滅活抗原配合CpG DNA (20 50 μ g/只)、 黃芪多糖(2 5mg/只)和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫的鴨禽流感特異性IgA和 IgG抗體水平結(jié)果相似，IgA抗體水平均是在首免后第2、3、4、5、6周顯著提高(P < 0. 05)， IgG抗體水平在第3、4、5、6、7周顯著提高(P < 0. 05)，在整個(gè)免疫期IgA和IgG抗體水平 保持在較高水平且穩(wěn)定，分別于第4和3周時(shí)升高至最高點(diǎn)，以后逐漸下降，至首免后第7 周，IgA抗體水平雖仍高于單獨(dú)應(yīng)用禽流感滅活抗原的水平，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。4攻毒保護(hù)試驗(yàn)和橫向傳播試驗(yàn)1)攻毒保護(hù)試驗(yàn)-J日齡雛鴨30只隨機(jī)分成3組，每組10只。第1組應(yīng)用生理鹽 水(0. 3ml/只)飲水免疫雛鴨；第2組應(yīng)用鴨源禽流感滅活抗原(0. 3ml/只)飲水免疫雛 鴨；第3組應(yīng)用鴨源禽流感滅活抗原(0. 3ml/只)配合CpG DNA (20 50 μ g/只)、黃芪多 糖(2 5mg/只)和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫雛鴨，首免后第21天用禽流感病 毒(病毒為制備滅活抗原用毒株，標(biāo)準(zhǔn)同上)(2ml/只)攻擊，攻毒后3、6、9天分別采集泄 殖腔棉拭子、空腸和結(jié)腸樣品，采樣后泄殖腔棉拭子放入1. Oml的PBS(含有青霉素和卡那 霉素)中，4°C過(guò)夜后擠壓棉拭子并將其取出，樣品置-20°C ；小腸和大腸組織樣品稱(chēng)重，勻 漿，用含上述抗體的PBS配面10%混懸液。在病毒分離前置4°C過(guò)夜，按《禽流感病毒控制指導(dǎo)方針》用9 11日齡SPF雞胚分離病毒。而后測(cè)尿囊液HA，HA >4時(shí)判為感染，若無(wú)， 則進(jìn)行盲傳，盲傳至第三代。病毒分離結(jié)果(見(jiàn)表1)在病毒攻擊3天后未免疫鴨有2/3分離到病毒，單獨(dú)應(yīng) 用禽流感滅活抗原飲水免疫鴨也有1/3分離到病毒，而所有免疫鴨在病毒攻擊后均未分離 到病毒。結(jié)果表明，復(fù)合黏膜免疫佐劑配合禽流感滅活抗原飲水免疫鴨雖然沒(méi)有造成鴨的 死亡和明顯發(fā)病，但可以顯著減少禽流感病毒分離陽(yáng)性率及病毒排出。2)橫向傳播試驗(yàn)7日齡雛鴨24只，12只雛鴨應(yīng)用生理鹽水(0. 3ml/只)飲水免 疫雛鴨；12只雛鴨應(yīng)用鴨源禽流感滅活抗原(0. 3ml/只)配合CpG DNA (20 50 μ g/只)、 黃芪多糖(2 5mg/只)和葡萄糖(70 IOOmg/只)飲水免疫雛鴨?？乖懊庖叻椒ㄅc 前同。首免后第21日分別取6只用H9N2病毒攻擊，攻毒劑量和方法同前。攻毒后取3只 免疫未攻毒鴨(Cl)與3只免疫攻毒鴨；取3只免疫未攻毒鴨(C2)與3只未免疫攻毒鴨； 取3只未免疫未攻毒鴨(Dl)與3只免疫攻毒鴨；取3只未免疫未攻毒鴨(D2)與3只未免 疫攻毒鴨混合飼養(yǎng)，3天后分開(kāi)飼養(yǎng)?；旌巷曫B(yǎng)后第3、6、9天采集未攻毒鴨泄殖腔棉拭子。 按上述方法對(duì)泄殖腔棉拭子進(jìn)行病毒分離。結(jié)果從表2可以看出，混合飼養(yǎng)后第3天，分別與免疫攻毒和未免疫攻鴨混合飼 養(yǎng)的免疫鴨(即Cl和C2組)中，病毒分離陽(yáng)性鴨數(shù)分別為0和1 ；分別與免疫攻毒和未免 疫攻鴨混合飼養(yǎng)的未免疫鴨中，病毒分離陽(yáng)性鴨數(shù)(即Dl和D2)分別為1和2?；旌巷曫B(yǎng) 后第6天、9天，所有鴨均沒(méi)分離到禽流感病毒。結(jié)果提示禽流感滅活抗原配合復(fù)合佐劑 飲水免疫能夠在一定程度上減少病毒排出，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的抵抗力，防止禽流感的傳播。以上兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)合黏膜免疫佐劑配合禽流感滅活抗原飲水免疫可以有 效保護(hù)鴨群抵抗病毒感染，阻止病毒排出污染環(huán)境，進(jìn)而阻止敏感鴨群感染。應(yīng)用本發(fā)明所提供的一種口服黏膜免疫的復(fù)合佐劑可用于鴨禽流感滅活抗原口服疫 苗，免疫方式相比簡(jiǎn)單安全，省時(shí)省力，減少鴨的應(yīng)激反應(yīng)，適于大規(guī)模養(yǎng)鴨。顯著提高疫 苗的免疫效果和降低鴨禽流感病毒向外界的釋放。復(fù)合佐劑中葡萄糖、黃芪多糖有成品出 售，CpG DNA經(jīng)提取后即可使用。同時(shí)，復(fù)合佐劑成本較低，免疫時(shí)每只需葡萄糖的成本為 0. 1728分；黃芪多糖的成本為0. 018分；CpG DNA的成本為2. 1分。每只鴨需佐劑的成本約 為2. 3分。目前生產(chǎn)中預(yù)防禽流感通常都要用滅活油乳佐劑和禽流感抗原肌肉注射進(jìn)行免 疫，每只鴨應(yīng)用的油乳佐劑(包括白油和乳化劑)成本為1. 1分/只，另外還要增加乳化制 造過(guò)程(需要大型儀器和人員)，成本將為4分/只。因此，應(yīng)用本發(fā)明所提供的復(fù)合佐劑 預(yù)防鴨禽流感不僅方便易行，效果更好，從養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)上也得到實(shí)惠。表1復(fù)合佐劑免疫鴨用禽流感病毒H9N2攻擊后病毒分離結(jié)果攻毒后天數(shù)，病毒分離陽(yáng)性鴨數(shù)/總數(shù)
權(quán)利要求
1. 一種用于鴨禽流感口服黏膜免疫的復(fù)合佐劑，其配方為20 50 μ g CpG DNA、2 5mg黃芪多糖和70 IOOmg葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及口服滅活疫苗的一種黏膜免疫的復(fù)合佐劑，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，專(zhuān)用于口服滅活疫苗的應(yīng)用。其配方為20～50μg CpG DNA、2～5mg黃芪多糖和70～100mg葡萄糖。本發(fā)明(復(fù)合黏膜免疫佐劑)能夠有效提高黏膜局部免疫和全身體液免疫力。同時(shí)復(fù)合佐劑與禽流感滅活抗原配合，通過(guò)飲水免疫就可以激發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生有效的全身免疫應(yīng)答水平，避免肌肉注射引起的鴨群應(yīng)激反應(yīng)，也為提高鴨肉品質(zhì)提供了保證。
文檔編號(hào)A61K39/145GK102000332SQ20101054468
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者康海泓, 庾慶華, 楊倩, 王紅麗 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)