專利名稱：脂質(zhì)體包裹重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)脂質(zhì)體的制備方法，脂質(zhì)體配方和用途。
背景技術(shù)：
睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary Neurotrophic Factor, CNTF)最初從雞胚的眼組織睫狀節(jié)中提取出來，因?qū)逘钌窠?jīng)元有營養(yǎng)作用并可維持雞副交感神經(jīng)節(jié)的存活而得名。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，CNTF具有多種功能，在神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉系統(tǒng)，肥胖癥及其相關(guān)疾病的治療中具有重要意義，有廣闊的臨床開發(fā)前景。但由于血腦屏障的阻隔，CNTF到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)受限，妨礙了 CNTF用于帕金森氏癥、老年癡呆癥等疾病的治療，通過脂質(zhì)體復(fù)合制劑可以幫助藥物分子穿越血腦屏障，為CNTF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中用藥提供了可行的途徑。因天然序列的CNTF蛋白毒副作用較大，其臨床應(yīng)用受到影響。為尋找安全有效的CNTF，人們已研究出多種CNTF的突變體。Regeneron制藥公司發(fā)表了用于治療肥胖癥的CNTF的人工合成類似物Axokine(AXM)。AX15是人CNTF的一個三重突變體17位的Cys被Ala替換，63位的 Gln被Arg替換，并缺失了 C末端的15個氨基酸。與天然人CNTF相比，AX15具有更高的生物學活性，更好的穩(wěn)定性和可溶性。中國藥品生物制品檢定所發(fā)明了一種重組睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體(中國專利，200510097985. 5，
公開日2006年4月19日)，突變體的第17位 Cys突變?yōu)镾er,并去掉C端的16個氨基酸，該突變體在治療肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)的疾病及神經(jīng)損傷相關(guān)疾病方面有較好效果。蘭州生物制品研究所發(fā)明了一種重組睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體(中國專利，200710112387. X，
公開日2008年3月19日)，將天然人CNTF基因的17位Cys突變?yōu)锳la，63位Gln突變?yōu)锳rg，在治療普通肥胖癥或糖尿病型肥胖癥方面有較好效果。已知CNTF能微量進入血腦屏障，作用于下丘腦食欲調(diào)節(jié)中樞，激活度素樣通路， 起到降低體重的作用。另外，有研究表明，玻璃體腔內(nèi)直接注射CNTF能促進損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglinecells，RGC) RGC存活和視神經(jīng)再生。Weise (Neurobiol Dis, 2000，7 =212-223)等利用基因治療的手段，用腺病毒(adenoviral vector, Ad)作為CNTF 基因載體注入鼠玻璃體內(nèi)，可使CNTF mRNA和蛋白穩(wěn)定表達，至少持續(xù)18天，起到有效治療神經(jīng)萎縮等病變的作用。然而天然或重組的人CNTF經(jīng)皮下或靜脈給藥后不能由血液循環(huán)有效穿越血腦屏障，實現(xiàn)治療中樞神經(jīng)相關(guān)病變的功效。本發(fā)明提供了 rhCNTF(A17R6315) 脂質(zhì)體的制備工藝及其進入腦組織中的情況，可實現(xiàn)人CNTF有效穿越血腦屏障。本發(fā)明以Axokine (AX15)的cDNA為基礎(chǔ)，在基因序列上設(shè)計了帶有Nde I酶切位點和ATG翻譯起始密碼子，下游引物則帶有BamHI酶切位點和TAA終止密碼子，全部使用大腸桿菌偏愛密碼子,命名為 rhCNTF (A17R6315) (Recombinant Human CNTF, rhCNTF)。采用表達載體質(zhì)粒 pET-3c，重組表達并經(jīng)高效純化工藝獲得具有生物活性的rhCNTF，將其成功地用于含CNTF 的脂質(zhì)體制備研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能穿越血腦屏障的含rhCNTF的脂質(zhì)體，從而改善神經(jīng)元損傷和退行性病變相關(guān)的疾病，如帕金森氏癥、老年癡呆癥、脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等的治療效果。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以Axokine (AX15)的cDNA為基礎(chǔ)(將野生型人CNTF的 cDNA C端去掉15個氨基酸，增加其生物活性，同時將17位Cys突變?yōu)锳la，63位Gln突變?yōu)锳rg)，在基因序列上設(shè)計了帶有酶切位點和ATG翻譯起始密碼子，下游引物則帶有酶切位點和TAA終止密碼子，全部使用大腸桿菌偏愛密碼子，命名為rhCNTF (A17R6315)。經(jīng)人工全基因合成后用Nde I和BamHI雙酶切后，與Nde I和BamHI雙酶切的pET_3c大片段在 T4連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。將鑒定后含AX15的外源基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)PlysS,誘導篩選高效表達的工程菌。rhCNTF (A17R6315)的純化工藝包括包涵體處理、復(fù)性及重組蛋白純化過程。本發(fā)明提供了一種含rhCNTF脂質(zhì)體的制備方法。本發(fā)明制備的脂質(zhì)體的粒徑為20-200nm，rhCNTF的包封率不低于70%。脂質(zhì)體是由磷脂分散在水中形成的多層微囊。微囊每層均為脂質(zhì)雙分子層，各層之間被水相隔開。脂質(zhì)體首先于1971年由英國萊門 (Rymen)等人用作藥物載體。脂質(zhì)體作為藥物或其它物質(zhì)的載體，具有生物降解性和生物相容性，通過延緩藥物代謝和清除、降低藥物分布體積，有利于藥物向病變組織分布，提供可持續(xù)的藥物釋放。一個IOOnm的脂質(zhì)體分子可以包裹上萬個藥物分子，脂質(zhì)體可以顯著地增加藥物在腦部的轉(zhuǎn)運量。脂質(zhì)體技術(shù)作為一種藥物的新型制劑，已廣泛應(yīng)用于小分子藥物和生物大分子藥物的載藥中。脂質(zhì)體包裹可改善藥物分子在血液中的代謝和組織分布行為，達到緩釋和靶向性的目的。脂質(zhì)體的配方和制備方法已具有一定的成熟度，常規(guī)的配方主要含不同比例的磷脂和膽固醇，制備方法包括薄膜超聲法、反相蒸發(fā)法、旋渦分散法等。本專利為實現(xiàn)含CNTF 脂質(zhì)體的腦靶向給藥，以單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)做為脂質(zhì)體的配方中的主要成分，再與一定的磷脂和膽固醇組合，經(jīng)薄膜超聲法和擠壓法制備含CNTF的獨特脂質(zhì)體。已知磷脂有多種形式，如天然磷脂和合成磷脂。天然磷脂具有組分不均一性，而合成磷脂以單一成分為主。本專利采用的磷脂主要指合成磷脂，包括DSPE、DSPC、DPPC、DMPG、DSPA、DPPG寸。


圖1 :rhCNTF(A17R6315)的堿基和氨基酸序列對比示意2 :pET-rhCNTF工程菌測序結(jié)果。其中rhCNTF的cDNA為50-617位正向序列， 與設(shè)計序列測定結(jié)果完全吻合。圖3 :rhCNTF表達和純化的SDS-PAGE分析圖譜。㈧1 表達對照；2 誘導表達的目的蛋白rhCNTF。(B) 1 =Q柱純化后rhCNTF ；2 復(fù)性后rhCNTF ；3 蛋白質(zhì)分子量標準。
圖4rhCNTF脂質(zhì)體的粒徑測定分析圖。
具體實施例方式
下文通過具體實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受實施例的限制。實施例IrhCNTF (A17R6315)基因的獲得根據(jù)Gene Bank獲得CNTF cDNA序列，將野生型人CNTF的cDNA C端去掉15個氨基酸，增加其生物活性，同時將17位Cys突變?yōu)锳la，63位Gln突變?yōu)锳rg，在基因序列上設(shè)計了帶有NdeI酶切位點和ATG翻譯起始密碼子，下游引物則帶有BamHI酶切位點和TAA 終止密碼子，全部使用大腸桿菌偏愛密碼子，全基因人工合成，并嵌入PUC18載體且命名為 PUC-CNTF0相應(yīng)的堿基及氨基酸序列分析如圖1實施例2質(zhì)粒PET-CNTF的構(gòu)建和表達用Nde I和BamHI雙酶切后，與Nde I和BamHI雙酶切的pET_3c大片段在！"4連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α涂布LB-Ampicillin平板，提取陽性克隆質(zhì)粒，用Nde I和BamHI雙酶切鑒定正確后，命名為pET_CNTF。該重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) plyss，獲得重組表達CNTF的工程菌。IPTG誘導表達篩選高表達菌株并保存。工程菌測序結(jié)果如圖 2。工程菌誘導表達如圖3A。實施例3rhCNTF的分離純化經(jīng)實驗證明rhCNTF重組蛋白為包涵體表達。1.將冰箱保存的菌體以1 10放入細菌裂解液中，37°C下攪拌4h后超聲，4°C冷卻后，按功率P < 400W工作時間5秒，間歇5秒超聲40次，12000r/min離心lOmin，取上清電泳，包涵體進一步處理。2.將包涵體放入洗滌液 M20mmol/L Tris-HCl pH 8. 0,5mmol/L EDTA，2mol/L Urea, 1% TritonX-100)中，超聲功率P < !MOW工作時間5秒，間歇5秒超聲40次。攪拌 30min 后，12000r/min 離心 15min，取上清 A 60 μ L 進行 SDS-PAGE。3.將包涵體放入洗滌液 BQOmmol/L Tris-HCl pH 8. 0,4mol/L Urea, 1. Omo 1/L NaCl)中，超聲功率P < 340W工作時間5秒，間歇5秒超聲40次(使尿素與菌液充分作用)，攪拌 30min 后，12000r/min 離心 15min，取上清 B 60 進行 SDS-PAGE。4.溶解包涵體以原菌液體積的10%加包涵體溶解液05mmol/L Tris-HCl pH 8. 0，8mol/L Urea, 2mmo 1/L EDTA, 1/2000B-ME)，37°C溫育 3h，4°C 8 IOh 使包涵體充分溶解，離心12000r/min 15min，棄不溶物。5.稀釋復(fù)性包涵體溶解液中逐步加入10倍體積的復(fù)性液05mmol/L Tris-HCl pH 8. 0)，置于4°C、100r/min攪拌，進行稀釋復(fù)性。6. Q-Sepharose 柱層析純化:25mmol/L Tris-HCl pH 8. O 的緩沖液平衡，含 0. 5mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫，收集rhCNTF洗脫液。7.純化后rhCNTF經(jīng)SDS-PAGE和HPLC分析純度達到98. O % (圖3B)。經(jīng)TF-I體外細胞生物測活ED50為1. 2ng/mL。實施例4rhCNTF脂質(zhì)體的制備取GM1250mg、磷脂酰乙醇胺(DSPE) 500mg和膽固醇lOOOmg，溶解于50mL有機溶劑中。充分溶解后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待殘留的有機溶劑完全揮發(fā)后，用2. 5mg/mL的rhCNTF(lOmmol/ LpH 7. 4磷酸鹽溶液)100mL溶解脂質(zhì)體膜，制得水性混懸液。探頭超聲(功率20-50W，超聲時間5s，間隔時間4s，超聲次數(shù)10-40次)、高壓均質(zhì)機均質(zhì)后過0. 22 μ m濾膜，即得rhCNTF 脂質(zhì)體。采用激光粒子測定儀測定rhCNTF脂質(zhì)體粒徑。粒徑分布范圍為20-200nm，平均粒徑為 85. Onm (圖 4)。實施例5包封率的測定取ImL rhCNTF 脂質(zhì)體，加入 1 10DDW 后，100000r/min 離心 2h (日立 CP100MX 超速冷凍離心機)。取上清和脂質(zhì)體沉淀，脂質(zhì)體沉淀用IOmL破乳液(1% SDS，10% TritonX-100)徹底破乳。根據(jù)rhCNTF的HPLC標準峰面積，計算沉淀和上清中rhCNTF的總含量，以脂質(zhì)體包封率公式計算包封率(包封率％ = 1_上￡二直量Χ·%)。制備的rhCNTF 脂質(zhì)體包封率為82.5%。實施例6rhCNTF標準曲線取 rhCNTF 原液 10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、 750ng/mL、1000ng/mL加入酶標板進行測定，同時取Human CNTF ELISA(R&D公司)試劑盒樣品稀釋液作為空白對照。450nm測定OD值后，根據(jù)OD值和樣品濃度得出公式Y(jié) = 66. 011Χ-1. 6658 (Y 為濃度，X 為 OD 值)，R = 0. 999，線性范圍為 lO-lOOOng/mL。實施例7精密度實驗HPLC測定rhCNTF濃度精密度實驗精密量取rhCNTF儲備液適量，用流動相A稀釋成質(zhì)量濃度為100，250，500 μ g/mL溶液。于Id和1周內(nèi)重復(fù)進樣5次，進樣量20 μ L， 計算日內(nèi)和日間精密度見表1。ELISA測定rhCNTF含量精密度實驗精密量取rhCNTF儲備液適量，用Human CNTF ELISA試劑盒樣品稀釋液稀釋成100，250，500ng/mL溶液。于Id和1周內(nèi)重復(fù)測定5次，計算日內(nèi)和日間精密度見表2。表IHPLC測定rhCNTF濃度的日內(nèi)和日間精密度
權(quán)利要求
1.一種將重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)進行脂質(zhì)體包裹的制備方法及配方和用途。其特征在于，脂質(zhì)體形式的rhCNTF，能更有效地穿越血腦屏障。
2.權(quán)利要求1中的脂質(zhì)體配方特征在于含有單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)、磷脂和膽固醇，其比例為1 4 8至1 2 4。
3.權(quán)利要求2中單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂在脂質(zhì)體中的含量為0.25% 1. 0%。
4.權(quán)利要求2中磷脂為合成磷脂DSPE、DSPC、DPPC,DMPG, DSPA, DPPG中的任何一種。
5.權(quán)利要求1中的rhCNTF指具有天然CNTF生物活性70%以上的CNTF類似物或突變體的重組蛋白。
6.權(quán)利要求3中rhCNTF優(yōu)選CNTF的17位Cys突變?yōu)锳la，63位Gln突變?yōu)锳rg，并缺失了 C末端的15個氨基酸的rh-CNTF (A17R6315)。
7.權(quán)利要求1中脂質(zhì)體包裹CNTF的制備方法包括以下步驟a)取一定量單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)、合成磷脂和膽固醇按相應(yīng)比例溶解于甲醇氯仿(70 30, V/V)的溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制成單層或多層脂質(zhì)膜。b)含0.02-1.0% rhCNTF磷酸鹽溶液(pH5. 5-8. 0)加入脂質(zhì)膜中，超聲處理制備包裹 rhCNTF的脂質(zhì)體。c)rhCNTF脂質(zhì)體經(jīng)高壓擠出器，制備20-200nm粒徑的脂質(zhì)體懸液。d)經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾，制成無菌脂質(zhì)體溶液。e)加入相應(yīng)輔料制成注射液、凍干粉、微球、微囊等制劑。
8.權(quán)利要求1和7所述的含rhCNTF脂質(zhì)體，可用于制備成神經(jīng)元損傷或神經(jīng)退行性病變相關(guān)的疾病等方面的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)的脂質(zhì)體包裹重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)及其制備方法。本發(fā)明制備的rhCNTF脂質(zhì)體粒徑在20-200nm范圍內(nèi)分布均勻，藥物包封率不低于70％。經(jīng)動物實驗證明該rhCNTF脂質(zhì)體能實現(xiàn)rhCNTF通過血腦屏障，具有治療神經(jīng)元損傷和退行性病變相關(guān)的疾病的應(yīng)用價值。
文檔編號A61K38/18GK102462662SQ20101055286
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者張繼蘭, 楊黎, 胡春蘭, 范開, 陳海容, 高劍坤 申請人:重慶富進生物醫(yī)藥有限公司