專利名稱：小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗阿霉素性心功能障礙或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小檗堿和阿霉素，具體涉及小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗阿霉 素性心功能障礙或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿霉素是臨床上應(yīng)用十分廣泛的抗腫瘤藥物，它對于白血病、淋巴瘤、乳腺 癌、肺癌等都有著非常顯著的療效，是目前臨床上最常用的抗腫瘤藥物之一。阿霉素主 要的毒副作用為心肌毒性，它不僅可引起心律失常，且隨著劑量的累積，還能誘發(fā)進(jìn)行 性心肌病、充血性心力衰竭。80年代以來，阿霉素心肌毒性分子機(jī)制的研究已取得了許 多新的進(jìn)展，目前大多數(shù)的研究認(rèn)為可能和阿霉素可通過氧化應(yīng)激途徑，或非依賴于氧 化應(yīng)激途徑，啟動(dòng)內(nèi)、外源性的凋亡信號通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡有關(guān)。因此出現(xiàn)一系 列抗氧化劑、鐵離子螯合劑和自由基清除劑、鈣離子抑制劑、神經(jīng)酰胺抑制劑、凋亡一 些相關(guān)基因的抑制劑等等。如右丙亞胺、卡地洛爾、黃酮類、他汀類、維生素E等。 但迄今為止，臨床研究發(fā)現(xiàn)，還沒有一種制劑能夠在不影響阿霉素抗腫瘤作用的前提下 同時(shí)又可以顯著降低阿霉素心肌毒性反應(yīng)。因此，如何開發(fā)新的抗阿霉素心肌毒性的心 臟保護(hù)藥物一直是醫(yī)學(xué)面臨的重要課題。近年來國內(nèi)不斷有文獻(xiàn)報(bào)道小檗堿對控制心力衰竭、心律失常、高血壓等危險(xiǎn) 因素的患者有顯著療效且無明顯毒副作用。研究還發(fā)現(xiàn)小檗堿可明顯改善心力衰竭患者 的心功能，增加運(yùn)動(dòng)耐量，它可能是通過正性肌力、降低外周阻力以及抑制炎性介質(zhì)的 釋放等多個(gè)方面發(fā)揮其治療心衰的作用。在以往的實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)小檗堿能有效防治脂多 糖性心功能障礙，其作用機(jī)制可能與其糾正心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)異常，抑制心肌細(xì)胞 釋放腫瘤壞死因子α有關(guān)。同時(shí)前期的實(shí)驗(yàn)表明小檗堿能減輕去甲腎上腺素引起的心肌 細(xì)胞損傷，可能是通過阻斷ROS-TNF α-Caspase信號通路抑制去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌 細(xì)胞凋亡。綜上所述，小檗堿與阿霉素混合制劑可作為腫瘤治療、防治阿霉素心肌毒性 的新制劑。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)小檗堿(berberine，Ber)與阿霉素(Doxorabicine，DOX)聯(lián)合應(yīng)用
時(shí)，能有效地防治阿霉素性心肌毒性，同時(shí)又不會(huì)影響甚至增加阿霉素的抗腫瘤療效。 為臨床上治療阿霉素的心肌毒性提供新的措施，從而改善阿霉素化療后病人的生存質(zhì) 量，使阿霉素能更好的廣泛應(yīng)用于抗腫瘤的臨床治療中。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗 阿霉素性心功能障礙或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗阿霉素性心功 能障礙或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述藥物中小檗堿和阿霉素的摩爾濃度比為(0.625 4) 1，最佳比例為1 1。所述藥物為口服制劑或注射制劑。通過體外原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞48小時(shí)后，分別設(shè)立對照組；DOX(l μ mol/ L)組；Ber(0.625y mol/L)+DOX 組；Ber (0.25 μ mol/L)+DOX 組；Ber (1.00 μ mol/ L) +DOX 組；Ber (4.00 μ mol/L) +DOX 組；Ber (4.00 μ mol/L)單用組。藥物處理 24 小時(shí) 后用CCK-8檢測各組細(xì)胞的活力。結(jié)果證明給予小檗堿和阿霉素混合制劑組的細(xì)胞存活 率均高于阿霉素單用組，并顯現(xiàn)出一定的劑量依賴性。同時(shí)通過檢測細(xì)胞上清中乳酸脫 氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量發(fā)現(xiàn)小檗堿能顯著減輕阿霉素引起的心肌損傷。 ELISA法檢測各組的組蛋白含量，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)小檗堿和阿霉素混合制劑組的細(xì)胞凋亡率 均較阿霉素單用組明顯降低。另一方面選用腫瘤細(xì)胞MCF-7細(xì)胞，培養(yǎng)24h后加藥處理 24和48h后CCK-8檢測細(xì)胞活力，并計(jì)算細(xì)胞的抑制率，觀察小檗堿對阿霉素抗腫瘤作 用的影響。結(jié)果顯示小檗堿和阿霉素混合制劑組對MCF-7細(xì)胞的抑制率高于阿霉素單用 組?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，小檗堿不僅可以減輕阿霉素引起的心肌損傷，還能對阿霉素引 起的心肌凋亡起到抑制作用，同時(shí)又不會(huì)減弱、甚至增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤效用。


圖1為各處理組細(xì)胞上清中LDH含量測定結(jié)果圖。η = 4.#Ρ < 0.05與對照組比 較，><0.05 與 DOX(IyM)組比較。圖2為各處理組心肌細(xì)胞裂解液OD值測定結(jié)果圖。η = 4.#Ρ < 0.05與對照組 比較，><0.05與DOX(IyM)組比較。圖3-1為不同劑量的小檗堿/阿霉素處理24h后對MCF-7細(xì)胞的抑制率結(jié)果 圖，η = 3。圖3-2為不同劑量的小檗堿/阿霉素處理48h后對MCF-7細(xì)胞的抑制率結(jié)果圖， η = 4。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不 限于此。實(shí)施例1小檗堿對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的影響取1天新生的SD乳鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，取其心尖部分，采 取胰酶(美國Sigma公司)常規(guī)消化，按現(xiàn)有的方法獲得心肌細(xì)胞。用含10%胎牛血清(購于Hyclone公司)的DMEM(購于Gibico公司)懸浮細(xì) 胞，置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中，孵育2小時(shí)，純化所得的心肌細(xì)胞。按照IXlO5個(gè) ZmL細(xì)胞密度接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。用5mL生理鹽水溶解IOmg阿霉素 (DOX)(美國Sigma公司)，再用DMEM (購于Gibico公司)培養(yǎng)基稀釋為10 μ mol/L的 阿霉素工作液。小檗堿(Ber)(美國Sigma公司)用雙蒸水溶解至4.00 μ mol/L工作液， 再 DMEM 分別稀釋成 1.00 μ mol/L、0.25 μ mol/L、0.625 μ mol/L 工作液。對培養(yǎng) 48 小 時(shí)后的心肌細(xì)胞分別做如下加藥處理①對照組(control)組200μ L DMEM
②阿霉素(1μ mol/L)組180 μ L DMEM+20 μ L DOX③小檗堿(0.625μ mol/L)+ 阿霉素(1 μ mol/L)組160 μ L DMEM+20 μ LDOX+20 μ L Ber④小檗堿(0.25μ mol/L)+ 阿霉素(1 μ mol/L)組160 μ L DMEM+20 μ LDOX+20 μ L Ber⑤小檗堿(1.00μ mol/L)+ 阿霉素(1 μ mol/L)組160 μ L DMEM+20 μ LDOX+20 μ L Ber⑥小檗堿(4.00μ mol/L) + 阿霉素(1 μ mol/L)組160 μ L DMEM+20 μ L DOX+20 μ L Ber⑦小檗堿(4.00μ mol/L)組180 μ L DMEM+20 μ L Ber于加藥處理24小時(shí)后，分別提取各處理組細(xì)胞上清液，用全自動(dòng)生化分析儀檢 測各組的乳酸脫氫酶(LDH)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示心肌細(xì)胞分組處理24h后，1 μ mol/L DOX組細(xì)胞上清中的LDH 含量為 34.94士 2.17U/mL，高于對照組(7.12 士0.43U/mL，P < 0.05)；而 0.25 μ mol/L、 1.00 μ mol/L以及4.00 μ mol/L的小檗堿+阿霉素組中LDH活性均低于DOX單用組(P <0.05)，并且各不同濃度的小檗堿+阿霉素組之間呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系；0.625， 0.25，1.00 和 4.00 μ mol/L 小檗堿單用組的 LDH 活性(分別為 6.37士0.69，7.94士0.26， 7.93士0.26，8.37士0.43U/mL，圖中未顯示)和對照組 LDH 活性(7.12士0.43U/mL)相接 近。經(jīng)過SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的統(tǒng)計(jì)處理，無顯著性差異(P > 0.05)。實(shí)施例2小檗堿對阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞活力的影響取1天新生的SD乳鼠，取其心尖部分，采取胰酶消化法，獲得心肌細(xì)胞。用 含10%胎牛血清的DMEM懸浮細(xì)胞，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育2小時(shí)，純化 所得的心肌細(xì)胞。按照1 X IO5個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。用 5mL生理鹽水溶解阿霉素注射液(DOX)，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋為10 μ mol/L的阿霉素 工作液。小檗堿(Ber)用雙蒸水溶解至4.00 μ mol/L工作液，再分別稀釋成1.00 μ mol/ L、0.25 μ mol/L、0.625 μ mol/L工作液。對純化所得的心肌細(xì)胞分別做如下加藥處理①對照組(control)組200μ L DMEM②阿霉素(1μ mol/L)組180 μ L DMEM+20 μ L DOX③小檗堿(0.625μ mol/L)+ 阿霉素(1 μ mol/L)組160 μ L DMEM+20 μ LDOX+20 μ L Ber④小檗堿(0.25μ mol/L)+ 阿霉素(1 μ mol/L)組160 μ L DMEM+20 μ LDOX+20 μ L Ber⑤小檗堿(1.00μ mol/L)+ 阿霉素(1 μ mol/L)組160 μ L DMEM+20 μ LDOX+20 μ L Ber⑥小檗堿(4.00μ mol/L) + 阿霉素(1 μ mol/L)組160 μ L DMEM+20 μ L DOX+20 μ L Ber⑦小檗堿(4.00μ mol/L)組180 μ L DMEM+20 μ L Ber然后置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育24h后，我們進(jìn)一步觀察各處理組中心肌細(xì)胞活力的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示心肌細(xì)胞分組處理24h后，CCK-8檢測出的OD值中，1 μ mol/ LDOX組的OD值低于對照組(P < 0.05)；而除了 0.625，0.25 μ mol/L小檗堿+阿霉素 組的OD值和阿霉素單用組沒有差別外，1.00 μ mol/L以及4 μ mol/L的小檗堿+阿霉素組 中OD值均高于DOX單用組(P < 0.05)，并且各不同濃度的小檗堿干預(yù)組之間呈現(xiàn)出一 定的劑量依賴關(guān)系；0.625、0.25、1.0和4.0 μ mol/L小檗堿單用組的OD值和對照組OD 值相接近(0.625、0.25和1.0 μ mol/L小檗堿單用組未列表中)。經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的 統(tǒng)計(jì)處理，無顯著性差異(P > 0.05)。表1.小檗堿/阿霉素處理心肌細(xì)胞24h后，各處理組中心肌細(xì)胞活力變化
權(quán)利要求
1.小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗阿霉素性心功能障礙或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗阿霉素性心功能障礙或抗 腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中小檗堿和阿霉素的摩爾濃度比為(0.625 4) 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗阿霉素性心功能障礙或抗腫 瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中小檗堿和阿霉素的摩爾濃度比為1 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗阿霉素性心功能障礙或抗腫 瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為口服制劑或注射制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了小檗堿和阿霉素混合制劑在制備抗阿霉素性心功能障礙或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述藥物中小檗堿和阿霉素的摩爾濃度比為(0.625～4)∶1，最佳比例為1∶1，所述藥物為口服制劑或注射制劑，小檗堿和阿霉素聯(lián)用不僅可以減輕阿霉素引起的心肌損傷，還能對阿霉素引起的心肌凋亡起到抑制作用，同時(shí)又不會(huì)減弱、甚至增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤效用。
文檔編號A61P9/00GK102008495SQ201010558160
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者呂秀秀, 戚仁斌, 王華東, 王媛, 陸大祥 申請人:暨南大學(xué)