專利名稱：miRNA-34c化合物作為腦膠質(zhì)瘤標(biāo)志物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小分子RNA，即miR-34c的用途，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
自從1993年Lee等采用經(jīng)典克隆方法在線蟲中首次克隆了 lin_4基因，通過點(diǎn)突 變的方法證實(shí)小分子RNA的存在以來，目前在Sanger miRNA數(shù)據(jù)庫注釋的miRNA共計(jì)有 14197條。根據(jù)生物信息學(xué)方法的預(yù)測(cè)，脊椎動(dòng)物體內(nèi)約1/3的基因受到miRNA的調(diào)控。尋 找miRNA靶基因、揭示其作用機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)，也是后基因組時(shí)代需要解決的問題之一。
miRNA基因首先被II類聚合酶轉(zhuǎn)錄形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pri_miRNA)，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成 pi-mi RNA, pi-mi RNA最長(zhǎng)有幾kb，會(huì)有許多莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)。pri_miRNA在核內(nèi)被Drosha以 及共同作用因子DGCR8識(shí)別并切割形成長(zhǎng)約70nt的miRNA前體(pre-miRNA)。前體miRNA 會(huì)被核轉(zhuǎn)運(yùn)因子Exportin-5以Ran-GTP依賴型的方式運(yùn)送到胞質(zhì)中。Dicer是一種III 類RNA內(nèi)切酶，會(huì)在胞質(zhì)中識(shí)別pre-miRNA的莖環(huán)，切割形成長(zhǎng)約22nt的雙鏈RNA，其中一 條鏈被降解，而另一條鏈則成為成熟體，成熟的miRNA會(huì)同Ago2形成沉默復(fù)合體導(dǎo)向到基 因的特定區(qū)域進(jìn)行調(diào)控。已有的研究表明miRNAs參與了生物體的許多重要的過程，包括 細(xì)胞增殖、凋亡、生長(zhǎng)、分化和代謝等。此外，大量研究證實(shí)miRNA突變或者異位表達(dá)與多種 人類癌癥相關(guān)，一些miRNA可以起到腫瘤抑制基因或者癌基因的功能，因而有望用于癌癥 的診斷和治療。
miR-34 家族包括 miR-34a、miR-34b、miR-34c。研究發(fā)現(xiàn) miR-34a 會(huì)受到 p53 的調(diào) 控，而P53在許多腫瘤中是缺失或被突變的，這也就使得mil^Ma表達(dá)異常。同時(shí)也有研 究發(fā)現(xiàn)miR-34a的CpG也出現(xiàn)了甲基化的情況。miR_34b/c在人類中是共同轉(zhuǎn)錄，此前已 有研究表明miR-3k在喉癌及前列腺癌中呈低表達(dá)。同時(shí)，miR-34c也受到p53基因的調(diào) 控在卵巢癌中抑制細(xì)胞的增殖和分化，繼而發(fā)現(xiàn)miR-3k在多種癌癥中呈低表達(dá)，包括結(jié) 腸癌和肺癌等。盡管不少研究都表明mil^Mc是抑癌基因，但亦有研究指出在早期胃癌中 miR-34c過表達(dá)。因此人們對(duì)miR-3k的真正角色仍然有爭(zhēng)議。
腦膠質(zhì)瘤是浸潤(rùn)性的惡性腫瘤，在成人腦腫瘤中發(fā)病率最高?；颊咴诖_診后的平 均生存時(shí)間少于1年。最近有研究表明多個(gè)miRNA在腦膠質(zhì)瘤表達(dá)異常，包括miR-21， miR-10b, miR-221/222, miR-26a, and miR_34a。miR_34a 受到 p53 基因的調(diào)控，同時(shí)又 靶向多個(gè)p53信號(hào)通路下游基因，說明其在p53信號(hào)通路中起著十分關(guān)鍵的作用。有關(guān) miR-34c在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能研究目前尚未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供miRNA_3k作為腦膠質(zhì)瘤臨床診斷標(biāo)志物的應(yīng)用。
本發(fā)明旨在提供miRNA_3k作為制備治療腦腫瘤藥物的應(yīng)用。
首先在腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中檢測(cè)了 miR-34c的表達(dá)情況。如圖IA所示，mir-34c在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著降低，而在6個(gè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(SW1783，U138, U251, U87, U373, TJ905)和1個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SK-N-SH)中，也同樣顯著低表達(dá)。 為了探索引起miR-3k低表達(dá)的機(jī)制，我們采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化測(cè)序的方法研究了人腦膠 質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中CpG島的甲基化狀態(tài)。如圖IB腦膠質(zhì)瘤組織GlO和G17及細(xì)胞系U251 和U87在此區(qū)域有很多CpG島被甲基化，而在正常的腦DNA中，只有很少一部分散在的甲基 化位點(diǎn)。此外，甲基化抑制劑AZA處理腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系miR-34c的表達(dá)水平更高。因此甲 基化可能是導(dǎo)致miR-3k在腦膠質(zhì)瘤中低表達(dá)的主要原因。
進(jìn)一步研究了 miR-3k對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)和浸潤(rùn)的影響。細(xì)胞周期分布分析 表明在miR-3k轉(zhuǎn)染后48小時(shí)發(fā)生了顯著的Gl延滯(圖2A)。此外，轉(zhuǎn)染了 miR-3k的U87 和U251細(xì)胞同對(duì)照組相比基質(zhì)膠侵襲更弱(圖2B)。因此，miR-3k扮演著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì) 胞生長(zhǎng)和浸潤(rùn)的角色。
為了探討miR-3k在腦膠質(zhì)瘤形成中的作用機(jī)制，我們研究了其可能的作用靶基 因。如圖3A所示為miR-3k對(duì)Rafl可能的作用位點(diǎn)及其保守性。我們構(gòu)建了 miR-3k過 表達(dá)的U251穩(wěn)定細(xì)胞株(圖2B)。miR-3k的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以顯著抑制Raf-I和磷酸化Erkl/2 的表達(dá)(圖3C)。最后，我們構(gòu)建了 miR-3k對(duì)Rafl作用位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告載體，其熒光表 達(dá)在miR-3k過表達(dá)U251穩(wěn)定細(xì)胞株中顯著下調(diào)(圖3D)。上述數(shù)據(jù)提示Raf-I是miR-34c 的直接靶標(biāo)。
進(jìn)一步研究了 miR-3k和Raf-I在腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況。圖4A病 理切片所示腦膠質(zhì)瘤組織組織學(xué)特征，Raf-I和磷酸化Erkl/2表達(dá)上調(diào)，具有相似的表達(dá) 模式(圖4B)。此外，miR-3k的過表達(dá)會(huì)在U251和U87細(xì)胞系抑制Raf-I和磷酸化Erkl/2 的表達(dá)(圖4C)。因此，在腦膠質(zhì)瘤中Raf-I同miR-3k表達(dá)負(fù)相關(guān)。
最后，在37個(gè)臨床樣品中檢測(cè)了 miR_34c的表達(dá)情況，包括正常組8例，II期7 例，III期7例，IV期8例。圖5A表明，與正常組比較miR-3k在腦膠質(zhì)瘤的不同臨床時(shí) 期的表達(dá)水平均顯著下調(diào)。而Rafl在腦膠質(zhì)瘤臨床樣品中則顯著上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了 Rafl 同miRj9a的相互關(guān)系。
本發(fā)明首次證明miR-3k在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)均顯著下調(diào)，原因是其啟動(dòng)子上游 CpG島的甲基化所致。結(jié)合靶基因的預(yù)測(cè)方法我們發(fā)現(xiàn)miR-3k在RAFl gene中有作用 位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)及免疫印跡證實(shí)了 RAFl是miR-34c的可能靶標(biāo)。為進(jìn)一步研究 miR-34c在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中的分子機(jī)制，我們構(gòu)建了能分別穩(wěn)定表達(dá)miR-3k的腦膠 質(zhì)瘤細(xì)胞株。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證實(shí)了 RAFl是miR-3k的直接靶標(biāo)，而RAFl的激活則可 促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞惡化。為探討miR-3k在腦膠質(zhì)瘤早期診斷中的意 義，對(duì)腦膠質(zhì)瘤臨床各期標(biāo)本進(jìn)行了定量研究。結(jié)果證實(shí)miR-34c的表達(dá)水平各個(gè)時(shí)期的 表達(dá)均顯著下調(diào)，故它們都有作為腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)志物用于臨床診斷等。迄今，尚無miR-34c 作為腦膠質(zhì)瘤一種抑癌基因和一種潛在生物標(biāo)志物的文獻(xiàn)報(bào)道。


圖1，甲基化導(dǎo)致miR-3k在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)。
A)實(shí)時(shí)定量PCR分析miR-3k在人腦膠質(zhì)瘤組織樣品以及細(xì)胞系SW1783、U138、 U251、U87、U373、TJ905、SK-N-SH 中的表達(dá)情況。
B)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化測(cè)序分析miR-3k上游18個(gè)CpG島在腦膠質(zhì)瘤及細(xì)胞系中的 甲基化狀態(tài)。■甲基化CpG島；□未甲基化CpG島。
C)實(shí)時(shí)定量PCR分析miR-3k在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(AZA，5-氮雜-2 ‘-脫氧 胞嘧啶核)處理前后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)差異。
圖2，miR-34c抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。
A)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251轉(zhuǎn)染mil^Mc后的細(xì)胞周期分布，在轉(zhuǎn)染48小時(shí) 后Gl期細(xì)胞數(shù)目比對(duì)照組顯著增加(mean士S. E，n=3)。
B)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251轉(zhuǎn)染mil^Mc及miR_C的基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)分析 (X200)。
圖3，miR-34c直接靶向作用RAF-1。
A)圖示miR-3k對(duì)RAFl的預(yù)測(cè)位點(diǎn)及其在不同物種中的保守情況。首先通過 MiRanda vl. Ob (Enright et al. 2003)預(yù)測(cè)軟件針對(duì)miR_34c可能作用靴基因的3，UTR 和CDS區(qū)域進(jìn)行搜索，然后在UCSC的基因組窗口瀏覽器中分析預(yù)測(cè)位點(diǎn)的保守型情況 (NCBI36/hgl8, http://genome, ucsc. edu/,紅色框標(biāo)示相應(yīng)預(yù)測(cè)位點(diǎn))。
B)慢病毒miR-3k及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染U251后的表達(dá)情況。紅色熒光標(biāo)示慢病毒成 功轉(zhuǎn)染(上圖)。半定量RT-PCR表明轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞顯著表達(dá)miR-34c，2%DNA瓊脂糖電泳結(jié) 果見下圖。
C) RAF-I及其下游基因在U87和U251中的蛋白印跡結(jié)果。
miR-34c轉(zhuǎn)染48h后RAF-I呈顯著下調(diào)，磷酸化的ERK1/2受到間接抑制。
D)RAF-1的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。過表達(dá)mil^Mc顯著抑制了 RAF-I載體的熒光表 達(dá)。(n=3, *p < 0.05)。
圖4，在腦膠質(zhì)瘤組織中miR_34c同Raf-I的表達(dá)相關(guān)A)HE染色腦膠質(zhì)瘤組織的病理檢測(cè)。晚期腫瘤組織的組織學(xué)特征包含退行性病灶，微 血管增值以及壞疽。
B) Rafl, Erkl/2和磷酸化Erkl/2在腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中的免疫印跡分析。 Rafl和磷酸化的Erkl/2在腦膠質(zhì)瘤組織中都呈上調(diào)表達(dá)。C1-6代表SW1783，U138, U351, U87, U373, and SK-N-SH0 Beta-actin 作為對(duì)照。
ORafl, Erkl/2，磷酸化Erkl/2在mil^Mc過表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表 達(dá)情況。miR-34c的過表達(dá)會(huì)同時(shí)抑制Rafl和磷酸化Erkl/2在U251和U87中的表達(dá)， Beta-actin作為對(duì)照。
圖5，mir-34c在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)同惡性程度負(fù)相關(guān)。
A)實(shí)時(shí)定量PCR分析mir-3k在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。正常組織(n=7) ；II期 (n=7) ；III期(n=5) ；IV期(n=8)。U6 rRNA作為對(duì)照。Cl和C2分別為淋巴瘤和肺癌腦轉(zhuǎn)移癌癥樣品。
B)A)實(shí)時(shí)定量PCR分析mir-34b在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。正常組織(n=7) ；II 期(n=5) ；III期(n=6) ；IV期(n=8)。U6 rRNA作為對(duì)照。Cl和C2分別為淋巴瘤和肺癌腦轉(zhuǎn)移癌癥樣品。
具體實(shí)施方式
1.腦膠質(zhì)瘤臨床樣品采集正常腦組織樣品及腦膠質(zhì)瘤組織樣品從復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院取得。手術(shù)取出后，組 織塊以PBS或生理鹽水清洗干凈，迅速將組織切成小塊，部分樣品放入2ml凍存管中于液氮 中保存?zhèn)溆?。其他用多聚甲醛固定后用于組織切片分析。用于分子分析的樣本在液氮中研 磨為粉末后分別提取RNA或蛋白質(zhì)。
2. RNA抽提每100 mg組織加入1 mL Trizol，用液氮研磨充分研碎組織塊。加 入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。4°C，12，000 rpm 離心15分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清液入新的1. 5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻， 室溫靜置10分鐘。4°C，12000 rpm離心10分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70% 乙醇，4°C，12000 rpm離心洗滌沉淀5分鐘。去上清，將沉淀室溫晾干后加入適量無RNA酶 的水充分溶解，測(cè)定0D260和0D280值。采用無RNA酶的DNA酶I處理，QIAGEN RNeasy試 劑盒純化總RNA，詳細(xì)操作原理和方法見試劑盒說明書。瓊脂糖膠電泳評(píng)價(jià)總RNA質(zhì)量，在 凝膠成像儀上觀測(cè)、拍照，保存圖像，一般認(rèn)為> 2可以初步判定總RNA質(zhì)量較好。
3. QR-PCR檢測(cè)方法miRNA 的 qPCR檢測(cè)使用 invitrogen 的 Trizol 抽提總 RNA，定 量并質(zhì)檢。取50-100ng總RNA為模板，使用針對(duì)特定miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物及invitrogen的 superscript III First-Strand Synthesis System 試劑盒合成 cDNA。以 cDNA 為模板，使 用針對(duì)目標(biāo)miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R) Premix Ex TaqTM熒光定量PCR體系， 在stratagen MX3000P定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)得樣品的Ct值。將所得Ct值通過代入 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的公式，采用絕對(duì)定量的計(jì)算方法得出樣品中的目標(biāo)miRNA的含量。U6 基因作為內(nèi)照對(duì)miRNA qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。對(duì)于預(yù)測(cè)中的目標(biāo)基因的qPCR檢 測(cè)使用invitrogen的Trizol抽提總RNA，定量并質(zhì)檢。取3 μ g總RNA為模板，以隨機(jī)寡核 苷酸為弓I物，使用 invitrogen 的 SuperScript III First-Strand Synthesis System試劑 盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用針對(duì)目標(biāo)基因的特異引物及Takara的STOR(R) Premix Ex TaqTM熒光定量PCR體系，在stratagen MX3000P定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)得樣品 的Ct值。同時(shí)測(cè)定待測(cè)樣品中的看家基因(如β -肌動(dòng)蛋白、GAPDH)的Ct值，以此來校正 各組樣品之間上樣量差別。
4.細(xì)胞培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SW1783、U138、U251、U87、U373和人源神經(jīng)母 細(xì)胞株SK-N-SH購自ATCC (Manassas, VA)，人源胎兒腎細(xì)胞株購自hvitrogen (Carlsbad, CA) SW1783、U138、U87、U373 和 SK-N-SH 細(xì)胞培養(yǎng)在 MEM 培養(yǎng)基(Gibco, CA) 中，U251細(xì)胞培養(yǎng)在RPIM 1640培養(yǎng)基(Gibco)中，上述培養(yǎng)基都含有10%的FBS (PAA Laboratories, Linz, Austria)、青霉素(100 單位/mL)和鏈霉素(100 ng/mL)。細(xì)胞 培養(yǎng)在含有10% FBS,2 mM L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)和青霉素/鏈霉素 的DMEM培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞置37°C培養(yǎng)箱、5%C02，每天傳代一次。
5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染甲氧基寡核苷酸由上海吉瑪公司化學(xué)合成，microRNA前體購自美 國 Ambion 公司(Ambion Pre-mir miRNA precursor CaU No. 17100)，轉(zhuǎn)染另設(shè)正常對(duì)照 組，miRNA前體組和miRNA前體通用陰性對(duì)照組。細(xì)胞于鋪板18_24h后至70%_80%融合開 始轉(zhuǎn)染，所用試劑為L(zhǎng)ipofectamine 2000 (Invitrogen) 0轉(zhuǎn)染按本室常規(guī)方法并參照說 明書進(jìn)行。細(xì)胞于鋪板18_24h后約有70%-80%融合開始轉(zhuǎn)染，所用試劑為L(zhǎng)ipofectamine2000 (Invitrogen).具體轉(zhuǎn)染方法參照說明書進(jìn)行，寡核苷酸及siRNA的工作濃度均為 1OOnmol/L。
6.體外侵潤(rùn)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞U87分別用miRNA_3k和R-Ras siRNA轉(zhuǎn)染48 h，用寡居 核苷酸設(shè)陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞(5X104個(gè))懸浮于含5% BSA的MEM培養(yǎng)基中，接種于 鋪有膠原膜的M孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱上層培養(yǎng)M h，未吸附的細(xì)胞用棉簽小心移除。 侵入膠原膜下表面的細(xì)胞用細(xì)胞染色劑染色，繼而計(jì)數(shù)，最終用微孔板讀取器于560 nm處定量測(cè)定。
7.流式細(xì)胞周期分析細(xì)胞U87以30%密度接種于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)M h。分 別與miRNA-3k及其前體(100 nM)轉(zhuǎn)染M h后，用諾考達(dá)唑(nocodazole)處理18 h。接 著收集所得細(xì)胞并用70%的乙醇于4°C下固定M h。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌后再分散于 含有10 mg/mL碘化丙錠和50 mg/mL RNase的PBS溶液中(500 mL)，室溫下培養(yǎng)30 min。 所得細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析測(cè)定(BD FACSaria cell sorter, BD Bioscences, San Jose, CA, USA)。
8.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)將miRNA-3k (100 nM)與U87和SK-N-SH細(xì)胞、陰性對(duì)照細(xì)胞 接種于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，利用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)抽取(25μ g)，所 得產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜。多克隆抗體 R-RAS (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) 和 CCNDl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)按照使用說明進(jìn)行稀釋并于 4° C下培養(yǎng)過夜。接著與AP-標(biāo)記的兔抗山羊IgG 二級(jí)抗體室溫下培養(yǎng)2 h。β-肌動(dòng)蛋 白表達(dá)水平用兔源多克隆抗肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行測(cè)定。色帶用BCIP/NBT (Ameresco)顯色并 用 Labworks Instrument software (UVP LLC, Upland, CA)進(jìn)行定量分析。
9.熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)人源Rafl基因3’ UTR用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 RAF1-3UTR-F: 5' - GGTACCGTCCCAGCACTACCTTCTT -3，，RAF1-3UTR-R: 5' - TCTAGACCATTCCCTGAGCCGTCTG -3，，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pmd-19t載體(TaKaRa)，繼而克隆到pGL3_Control vector (Promega)熒光素下游。核苷酸替換突變基于PCR的方法(KOD-Plus-Mutagenesis Kit, T0Y0B0) ο 引物為Mut 3' UTR of RAFl 5' - GGACGGTGTGGACAGCAGGATGATT -3'禾口 5' - GTGGTGCTGACCATGTGGACATTAG -3，。
上述質(zhì)粒載體采用Lipofectamine 2000 Qnvitrogen)分別與mil^Mc前體共轉(zhuǎn) 染U87細(xì)胞，48小時(shí)后按Promega提供的方法處理細(xì)胞，在多功能酶標(biāo)儀(BioTek)讀取熒 光值。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次。
10.組合亞硫酸氫鈉限制分析實(shí)驗(yàn)(COBRA)和亞硫酸氫鈉測(cè)序?qū)嶒?yàn)采用 California Santa Cruz (UCSC)大學(xué)數(shù)據(jù)庫測(cè)定 CpG 島(CGI)跨越 miRNA_34c 基因。用 于CGI的組合亞硫酸氫鈉限制分析(COBRA)采用Methprimer 6軟件設(shè)計(jì)。亞硫酸鈉轉(zhuǎn)換 的基因組(只能將非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為脲嘧啶)用引物的特定鏈進(jìn)行擴(kuò)增，繼而用甲基 化敏感酶進(jìn)行消化。PCR測(cè)序所用引物序列為miR-34c -CG-BSFl 5‘ -AGTTGATTGTATTGTGGTGGTTATAATTAT-3‘禾Π miR-34c -CG-BSRl 5， -CCTCCAAAAATTTTACTTTCCTAAC-3，。
11.慢病毒制備和滴度測(cè)定在10厘米的組織培養(yǎng)板，QygWpLemir - 3 質(zhì)粒(Openbiosystems)及包裝混合物 26ul(Openbiosystems)共轉(zhuǎn)染的 187. 5 微升 Arrest-In transfection reagent (Openbiosystems)感染 6 X IO6 HEI^93T。轉(zhuǎn)染 48 和 72 小時(shí)后 收集含有該病毒培養(yǎng)上清，用0.45微米的過濾器filted和病毒儲(chǔ)存分裝。病毒滴定于轉(zhuǎn) 染前一天在M孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞(5 X 104)，稀釋后的病毒液分別用于感染 細(xì)胞，感染后48小時(shí)后，統(tǒng)計(jì)每毫升RFP表達(dá)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算病毒滴度。
12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有tag取平均值t S. Ε.禾Ij用Microsoft Excel中的Durnett，s法進(jìn)行 觀分析。取雙尾P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
權(quán)利要求
1.miRNA-34c化合物作為腦膠質(zhì)瘤臨床診斷標(biāo)志物的應(yīng)用。
2.miRNA-34c化合物作為制備治療腦腫瘤藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種人腦膠質(zhì)瘤新的標(biāo)志物miR-34c的用途。首次證實(shí)了miR-34c在人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)均顯著下調(diào)，究其原因是miR-34c基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化所致。同時(shí)，也首次證實(shí)了腦膠質(zhì)瘤中RAF致癌因子1是miR-34c的直接作用靶標(biāo)，過表達(dá)miR-34c能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)。進(jìn)一步對(duì)不同級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本進(jìn)行定量分析表明miR-34c能作為腦膠質(zhì)瘤檢測(cè)的標(biāo)志物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102031309SQ20101056479
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者劉順英, 戚艷婷, 李丹, 賴立輝, 趙宇嵐, 鄒超 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)