專(zhuān)利名稱(chēng)：高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、嗜肝細(xì)胞性丙型肝炎擬似病毒及其包膜蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種含高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、高肝細(xì)胞嗜性丙型肝炎包膜蛋白的擬似病毒顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒Q^patitis C virus, HCV)是一種嗜肝單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒屬成員，該病毒嗜肝特性的機(jī)制目前尚不十分清楚。目前鑒定出人四次跨膜素家族成員⑶81、清道夫受體SR-BI和緊密連接蛋白claudin 1、occludin是HCV感染必須依賴(lài)的受體，但這四種分子也同時(shí)表達(dá)于其他組織細(xì)胞，因此不能以此完美解釋HCV的嗜肝特性。 HCV的體外細(xì)胞培養(yǎng)非常困難，目前尚不能用感染者血清在體外感染靶細(xì)胞從而達(dá)到分離培養(yǎng)的目的，這給研究HCV帶來(lái)了很大困難。2003年法國(guó)和美國(guó)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別報(bào)道，用編碼小鼠白血病病毒(MMLV)或人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)包裝信號(hào)RNA序列及報(bào)告基因序列的質(zhì)粒與衣殼蛋白-逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)質(zhì)粒以及HCV包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎成纖維細(xì)胞，可以獲得可感染性與HCV相似的嵌合病毒，該病毒表面的雙層脂質(zhì)膜中鑲嵌有生物活性的HCV包膜糖蛋白，內(nèi)部含有MLV或HIV的衣殼蛋白-逆轉(zhuǎn)錄酶。嵌合病毒表面的HCV包膜蛋白是該嵌合病毒具有與HCV相似生物特性(肝細(xì)胞嗜性、能被HCV中和抗體中和等)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。由于該嵌合病毒能模擬HCV的感染，但內(nèi)部并非HCV的結(jié)構(gòu)，因此被稱(chēng)為 HCV 擬似病毒(HCV pseudo-particle, HCVpp)。大量研究顯示，HCVpp的細(xì)胞嗜性與天然HCV完全一致，只能感染人類(lèi)肝組織來(lái)源的某些細(xì)胞系，感染性也嚴(yán)格依賴(lài)四種受體的表達(dá)，HCV包膜蛋白中和抗體能有效中和 HCVpp的感染性。HCVpp的這些特點(diǎn)使其成為研究HCV感染機(jī)制的重要模型，同時(shí)，也為開(kāi)發(fā)靶向感染肝細(xì)胞的病毒載體提供了一種有效途徑。然而，目前所有實(shí)驗(yàn)室建立的HCVpp 制備方法均存在一個(gè)共同的問(wèn)題，就是病毒產(chǎn)量及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很低，293T細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度均低于105FFU(fOcus forming unit)/ml，這在很大程度上限制了 HCVpp的應(yīng)用， 因此高滴度、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、高肝細(xì)胞嗜性的丙型肝炎擬似病毒顆粒的研制在HCV研究及生物技術(shù)運(yùn)用上意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種能制備高滴度、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、高肝細(xì)胞嗜性HCVpp的方法，高滴度、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、高肝細(xì)胞嗜性的HCVpp不僅可用于研究HCV的感染機(jī)制，評(píng)價(jià) HCV疫苗誘導(dǎo)抗體的保護(hù)作用，還能用作肝組織靶向感染的基因治療載體。HCV擬似病毒顆粒的主要包括三個(gè)基本成分1)慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒衣殼蛋白-逆轉(zhuǎn)錄酶，在細(xì)胞漿中主要負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合病毒核酸、構(gòu)成病毒樣結(jié)構(gòu)及分泌出牙新的病毒顆粒，是病毒滴度的主要決定元件；在感染靶細(xì)胞后，該蛋白元件負(fù)責(zé)將病毒核酸RNA變成雙鏈DNA，在其它蛋白的參與下將該DNA插入到核內(nèi)染色體中完成病毒核酸插入宿主染色體以達(dá)到復(fù)制繁殖的目的?；脠?bào)告基因，是將報(bào)告基因綠色熒光蛋白/熒光素酶等編碼序列與衣殼蛋白-逆轉(zhuǎn)錄酶識(shí)別序列合理拼接起來(lái)的一段RNA，在擬似病毒感染靶細(xì)胞后，該RNA能按照逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒在感染細(xì)胞內(nèi)部的生活史，完成從RNA變成雙鏈DNA的過(guò)程，并插入宿主染色體內(nèi)，依靠宿主信使RNA的生理代謝特點(diǎn)，完成報(bào)告基因的表達(dá)，從而為人工制作的擬似病毒提供方便可靠的評(píng)測(cè)手段。幻HCV包膜蛋白，該蛋白元件在擬似病毒顆粒中的主要職能是負(fù)責(zé)模擬相關(guān)病毒的靶細(xì)胞嗜性，能很好地代表病毒感染早期階段病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞發(fā)生的一切生物學(xué)現(xiàn)象。大量研究顯示，含艾滋病毒包膜蛋白的擬似病毒顆粒能很好的呈現(xiàn)艾滋病毒包膜蛋白的生物學(xué)特性，含流感病毒包膜蛋白的擬似病毒顆粒也能很好地代表流感病毒感染早期包膜蛋白的生物學(xué)特性。HCV包膜蛋白能有效、高靶向地將HCVpp導(dǎo)入某些肝癌細(xì)胞株或者原代肝細(xì)胞、該特性能有效地被HCV 感染病人血清中和說(shuō)明該包膜蛋白能很好地代表HCV感染特性，是區(qū)別不同擬似病毒顆粒的最關(guān)鍵元件。HCV主要分成1-6個(gè)主要基因型別，近百種基因亞型，每種型別具備不同的生物學(xué)特性，如1型占世界流行株的一半以上，也是干擾素加利巴韋林治療不敏感的一個(gè)基因型。這些特性暗示著這個(gè)型別的HCV在宿主和病毒漫長(zhǎng)的自然選擇中具備比較強(qiáng)的生存能力。擬似病毒技術(shù)出現(xiàn)之前，人們沒(méi)有辦法來(lái)研究各個(gè)型別HCV包膜蛋白的生物學(xué)特性的差異，如，感染能力等，因此，研究不同基因型別HCV包膜蛋白的感染能力，篩選出具備高感染力的HCV包膜蛋白意義重大。本發(fā)明主要體現(xiàn)在篩選、優(yōu)化了一株HCV包膜蛋白全長(zhǎng)基因(lb亞型)，含有該序列編碼的包膜蛋白的擬似病毒感染滴度可達(dá)到107FFU/ml。具體內(nèi)容如下一，HCV包膜蛋白全長(zhǎng)基因的克隆從50名HCV RNA陽(yáng)性感染者血清中抽提病毒核酸RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出HCV包膜蛋白全長(zhǎng)基因，將擴(kuò)增的基因插入高效表達(dá)載體，然后對(duì)擴(kuò)增的基因進(jìn)行測(cè)序鑒定。二，功能性HCV包膜蛋白編碼序列的篩選運(yùn)用50株HCV包膜蛋白全長(zhǎng)基因插入表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)合衣殼蛋白-逆轉(zhuǎn)錄酶、報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)，共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別制作成50種HCVpp，50種HCVpp同時(shí)分別感染人肝癌Huh7細(xì)胞，72小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Huh7細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因綠色熒光蛋白(慢病毒質(zhì)粒表達(dá))的表達(dá)，以此判斷50種HCVpp將報(bào)告基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞的效率。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)篩選出一株可制備出5X105FFU/ml HCVpp的HCV包膜蛋白編碼基因。三、HCV包膜蛋白基因的優(yōu)化HCV包膜蛋白E2氨基末端的27個(gè)氨基酸高度變異，被成為高變區(qū) 1 (hypervariable region 1，HVR1)，HVRl 是介導(dǎo) HCV 包膜蛋白與 HCV 受體 SR-BI 結(jié)合的關(guān)鍵功能肽段，該肽段序列的變異不僅可使得HCV逃避免疫應(yīng)答，還能通過(guò)調(diào)節(jié)HCV包膜蛋白與SR-BI的親和力而影響HCV的感染性。我們將HVRl的第8和第12位氨基酸殘基同時(shí)突變?yōu)榻M氨酸，并缺失第16 M位氨基酸殘基，構(gòu)成優(yōu)化的HCV包膜蛋白表達(dá)序列，運(yùn)用該序列編碼的HCV包膜蛋白構(gòu)建新的HCVpp，比較該擬似病毒與未優(yōu)化的擬似病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，結(jié)果顯示該HCVpp感染性滴度能達(dá)到1 X 107FFU/mlo四，HCVpp細(xì)胞嗜性的鑒定
我們進(jìn)一步將HCVpp感染9種細(xì)胞系，結(jié)果表明，HCVpp僅能感染人肝組織來(lái)源的 Huh7細(xì)胞和HepIBB細(xì)胞系。集合國(guó)際同行的結(jié)果，含該包膜蛋白顯示很好的肝細(xì)胞嗜性。本發(fā)明中用于制備HCVpp的HCV包膜蛋白基因序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。


圖1 :50株HCVpp的感染性檢測(cè)圖2 =HVRl突變對(duì)HCVpp感染性的影響圖3 =HCVpp對(duì)不同細(xì)胞系的易感性
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :HCV包膜蛋白全長(zhǎng)基因的克隆1、HCV核酸的抽提分別從50名HCV RNA陽(yáng)性感染者血清中抽提病毒核酸RNA，采用QIAGEN公司 QIAamp Ultraseus virus 試齊[|盒。具體方法取Iml血清至2ml EP管并平衡溫度至15°C _25°C，加800ul Buffer AC, 加5. 6ulcarrier RNA到EP管蓋子里，然后漩渦振蕩IOs混勻；室溫培育10分鐘，3200rpm 3min離心，棄去全部上清；加300ul Buffer AR(60°C預(yù)熱)加20ul蛋白酶K，漩渦振蕩使沉淀全部溶解；40°C水浴10分鐘期間漩渦振蕩一次5秒鐘，將其全部移入QIAamp Spin Column 6000rpm Imin 離心棄去廢液；加 500ul Buffer Affl 7500rpm Imin 離心棄去廢液， 加 500ul Buffer AW2 15000rpm;3min 離心棄去廢液，加 30ul Buffer AVE 7500rpm Imin 離心，收集含HCV RNA洗脫液，-20°C保存。2、逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增HCV包膜蛋白全長(zhǎng)基因用hvitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Super Script II)對(duì)抽提的病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 引物采用隨機(jī)引物。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體方法取1. 5ml離心管，加去離子水5ul、隨機(jī)引物(IOuM) Iul、樣品RNA 5ul、 dNTP 11^1(101111)1111，651孵育51^11后置于冰上，加5\卩化8{-8^^11(1 Buffer 4ul、0. 1M、 DTT 2ul、RNase0UT Iul，25°C孵育 2min，加 Superscript IIRT lul，25°C孵育 lOmin，42°C 孵育50min，70°C孵育15min，取2ul進(jìn)行PCR擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用Roche的高保真耐熱DNA聚合酶(Pwo SuperYield DNA Polymerase)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，分兩輪進(jìn)行。第一輪PCR擴(kuò)增，引物5'引物660"^601^￥01^1666614化=00
3'引物GATGCAGCCATCTCYCGGTC(Y = CT)退火溫度58°C，延伸時(shí)間2分鐘，35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物取4微升進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。第二輪PCR擴(kuò)增，引物5' :GTTGCTCTTTYTCTATCTTC(Y = CT)3'引物GCTATCAGCAGCATCATCCA
退火溫度58 V，延伸時(shí)間2分鐘，；35個(gè)循環(huán)。3、PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序?qū)⒌诙啍U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收擴(kuò)增的分子量約1900bp的DNA片段，與pMDlS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，獲得抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化子接種LB，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定有相應(yīng)的DNA片段插入后，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序。獲得了來(lái)源于50例HCV感染者的HCV包膜基因全長(zhǎng)克隆。具體方法取50ul PCR 產(chǎn)物加 IOXloading buffer 5ul, 1% agarose, TBE 電泳液，IOOmv 40min電泳，回收1900bp的DNA片段。將電泳所得到的E1E2條帶(1900bp)分別切下回收至以稱(chēng)重的1. 5ml EP管中，用QIAEX II Gel Extraction Kit純化加入3倍體積的 Buffer QXl(100mg 加 300ul QXl)。加 30ul Buffer QIAEX II 然后 50°C水浴 10 分鐘，期間每?jī)煞昼婁鰷u振蕩一次。13000rpm 30s離心，棄去上清，加500ul QIAEX I洗一次， 加Buffer PE 500ul洗兩次棄去上清，空氣干燥15min直至沉淀變白。加入20ulTE漩渦振蕩30秒培育5min，13000rpm, 30s離心將上清移入1. 5mlEP管。取純化后的PCR產(chǎn)物2ul， PMD18-T vector lul，去離子水 2ul 加入 5ul 的 solution I，16°C反應(yīng) 30min。全量加入至 100ulDH5a，冰中放置30min，42°C加熱45秒鐘后，再冰中放置Imin。加入LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min。取IOOul涂含有氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落，挑出單菌落至含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時(shí)，將培養(yǎng)8小時(shí)的菌液用QIApr印 Spin Miniprep Kit小提質(zhì)粒將菌液倒入標(biāo)記好的1. 5ml離心管中，13000rpm，4°C，3min， 離心棄去上清；加250ul Buffer P1，混勻(不留塊狀沉淀)，加250ul Buffer P2，迅速輕輕顛倒4-6次；加入350ul Buffer N3，顛倒4-6次混勻，有白色絮狀物析出，13000rpm, 4°C，IOmin ；把QIApr印spin column放于一 1. 5ml EP管中(收集廢液)然后將上清移入 QIAprep spin column 中，8000rpm 4°C Imin ；棄去廢液，加 750ul Buffer ΡΕ, 13000rpm, 4°C, lmin，棄去廢液，13000rpm，4°C, Imin離心，將QIApr印 spin column移入新的 1. 5ml 離心管中，豎直加30ul Buffer EB于膜上，放置Imin后，4°C，13000rpm, Imin離心獲得液體單克隆的質(zhì)粒。然后酶切鑒定，用限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I和EcoRI對(duì)上步所得質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系為10XNEBuffer (3) 2ul、BSA lul.Nhe I 0.5ul、EcoRI 0.5ul、DNA 0. 8ug、 雙蒸水補(bǔ)足20ul，37°C溫育1小時(shí)，瓊脂糖電泳。挑選酶切正確的克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)施例2 功能性HCV包膜蛋白編碼序列的篩選1、HCV包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將經(jīng)過(guò)酶切、測(cè)序鑒定正確的HCV包膜蛋白基因用PCR擴(kuò)增，引物序列根據(jù)測(cè)序獲得的5'和3'端序列設(shè)計(jì)、合成，在5'和3'端分別加入酶切位點(diǎn)Nhe I和EcoRI。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用Nhe I和EcoRI酶切，插入質(zhì)粒表達(dá)載體pCI-neo (Promega產(chǎn)品)，酶切鑒定后再測(cè)序鑒定。正確的質(zhì)粒用于制備HCVpp。具體方法A限制性?xún)?nèi)切酶消化將鑒定正確的帶有HCV包膜蛋白編碼序列的克隆和pCI-neo 表達(dá)質(zhì)粒分別用Nhe I和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶消化，酶切體系為=IOXNEBuffer (3) IOul、 Nhe I 5ul、EcoRI 5ul、BSA lul、質(zhì)粒 DNA 5ug、雙蒸水補(bǔ)足至 lOOul，37°C溫育 2 小時(shí)。1% 瓊脂糖電泳，回收1900bp的DNA片段和pCI-neo載體片段。將電泳所得到的E1E2條帶和 pCI-neo條帶分別切下回收至以稱(chēng)重的1. 5ml EP管中，用QIAEX II Gel Extraction Kit純化加入 3 倍體積的Buffer QXl (IOOmg加 300ul QX1)。加 30ul Buffer QIAEX II 然后 50°C 水浴10分鐘，期間每?jī)煞昼婁鰷u振蕩一次。13000rpm 30s離心，棄去上清，加500ul QIAEXI 洗一次，加Buffer PE 500ul洗兩次棄去上清，空氣干燥15min直至沉淀變白。加入20ulTE 漩渦振蕩30秒培育5min，13000rpm, 30s離心將上清移入1. 5mlEP管。按E1E2基因片段與 pCI-neo載體基因片段3 1比例用T4連接酶Gnvirtogen公司)分別進(jìn)行定向連接，連接體系5X Ligase Reaction Buffer 4ul、pCI-neo 載體 30fmol、E1E2 基因片段 90fmol、 T4DNA Ligase 1U、去離子水補(bǔ)足至20ul，混勻后室溫靜止1小時(shí)。取2ul轉(zhuǎn)化至DH5 α，涂布 L-瓊脂平板培養(yǎng)基(氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。挑取單克隆至LB (含氨芐青霉素)， 370C 200rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。提取質(zhì)粒；酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系10 XNEBuffer (3) 2ul、 Nhe I 0. 5ul、EcoRI 0. 5ul、BSA 2ul、質(zhì)粒 DNA 0. 5ug、雙蒸水補(bǔ)足 lOOul，37°C溫育 40min， 瓊脂糖電泳。測(cè)序鑒定。2、HCVpp 制備將HCV包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒與基于HIV的慢病毒包裝質(zhì)粒Gnvitrogen產(chǎn)品)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。全部質(zhì)粒包括HCV包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒，pLPl質(zhì)粒anvitrogen產(chǎn)品)， PLP2質(zhì)粒(Invitrogen產(chǎn)品)，pLenti-EGFP質(zhì)粒(Invitrogen產(chǎn)品)。各質(zhì)粒用量比例 2:5:3:3。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，過(guò)濾45 μ m濾器，用于感染Huh7細(xì)胞。具體方法A. Huh7和293T細(xì)胞株的培養(yǎng)Huh7和細(xì)胞株培養(yǎng)用DMEMlO % FBSU % HEPES, 1 % PS (Invirtogen公司)，傳代倒掉原有培養(yǎng)基，用0. OlM PBS清洗兩次，加 0. 25% Trypsin-EDTA Iml將細(xì)胞消化下來(lái)后，加入完全培養(yǎng)基吹打兩次使細(xì)胞分散開(kāi)，取適量細(xì)胞懸液到新的培養(yǎng)瓶37°C 5% C02培養(yǎng)。B.擬似病毒顆粒制作將HCV包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒，pLPl質(zhì)粒，pLP2質(zhì)粒， pLenti-EGFP 質(zhì)粒使用 PolyFect Transfection Kit 共同轉(zhuǎn)染 37 °C 5 % C02 二氧化碳培養(yǎng)箱72小時(shí)，收集上清用0. 45umPVDF膜過(guò)濾，4 °C保存。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)按PoIyi^ect Transfection kit說(shuō)明操作方法如下1. 5ml EP管取HCV包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒(0. Iug/ ul)2ul pLPl 質(zhì)粒(0. lug/ul)5ul pLP2 質(zhì)粒(0. lug/ul)3ul pLenti-EGFP 質(zhì)粒(0. lug/ ul) 3ul加DMEM87ul充分混勻，加Polyfect 20ul混勻，室溫靜止5-10分鐘。取一瓶293T 細(xì)胞(培養(yǎng)瓶75cm2)用0. OlM PBS洗兩遍，0. 25% Trypsin EDTA消化后，加完全培養(yǎng)基吹打分散，計(jì)數(shù)，6孔板每孔種150萬(wàn)個(gè)細(xì)胞補(bǔ)足每孔培養(yǎng)基終體積1. 5ml，將準(zhǔn)備好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑混合液加600ul完全培養(yǎng)基吹打兩次加入6孔板，輕拍使細(xì)胞均勻分布，37°C 5% C02 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)。收集上清，用0. 45umPVDF膜過(guò)濾，4°C保存。3、HCVpp感染人肝癌Huh7細(xì)胞系分別取上述過(guò)濾處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清100 μ 1，加入預(yù)先接種有8000個(gè)Huh7細(xì)胞的96孔板(先吸除原培養(yǎng)上清)，5小時(shí)后換液，然后繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。具體方法將Huh7細(xì)胞用0. OlM PBS洗兩遍，用0. 25% Trypsin EDTA消化后加完全培養(yǎng)基，吹打幾次，使細(xì)胞充分分散，計(jì)數(shù)，96孔板，每孔8000個(gè)細(xì)胞，37°C 5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小時(shí)。將上面準(zhǔn)備的96孔板培養(yǎng)基吸出，用將過(guò)濾處理的細(xì)胞上清與完全培養(yǎng)基1 1混合每孔加IOOul病毒混合液。37°C 5%二氧化碳培養(yǎng)箱5小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。
7
4、用流式細(xì)胞檢測(cè)表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的細(xì)胞陽(yáng)性率，根據(jù)檢測(cè)的細(xì)胞總數(shù)、EGFP陽(yáng)性率以及投入的HCVpp上清體積(100 μ 1)，計(jì)算HCVpp的滴度FFU。結(jié)果如圖所示，50株HCVpp的感染性差異顯著，41株低于1 X 104FFU/ml,8株介于1 X IO4-I X IO5FFU/ ml，一株為5 X 105FFU/ml，將該株命名為C50。實(shí)施例3 =HCV包膜蛋白基因的優(yōu)化1、我們前期的研究表明，HCV包膜蛋白HVRl中的堿性氨基酸殘基對(duì)于HCVpp的感染性有重要影響，尤其是第8和第12位氨基酸殘基如果是堿性氨基酸，能明顯增強(qiáng)HCVpp 的感染性。根據(jù)這些研究結(jié)果，我們將C50株HCV包膜蛋白基因中編碼HVRl的第8位纈氨酸殘基(V)和第12位蘇氨酸殘基(T)單獨(dú)或同時(shí)突變?yōu)榻M氨酸殘基，采用Mratagene 試劑盒(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)進(jìn)行突變。突變體分別命名為 C50-V8H、C50-T12H、C50-VT-2H。2、我們前期的研究還表明，HCV包膜蛋白HVRl中的第16- 位氨基酸殘基在空間上阻礙HCV包膜蛋白與SR-BI受體的結(jié)合，刪除該肽段能明顯增強(qiáng)HCVpp的感染性。因此， 我們將C50⑶C株HCV包膜蛋白基因中編碼第16-M位氨基酸殘基刪除，采用Mratagene 試劑盒進(jìn)行突變，突變體命名為C50-D9。3、同時(shí)將HVRl的第8位纈氨酸殘基和第12位蘇氨酸殘基突變?yōu)榻M氨酸殘基，并缺失第16- 位氨基酸殘基，突變體命名為C50-2HD9。4、分別以上述包膜蛋白突變體制作HCVpp (實(shí)施例2. 2)，感染Huh7細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)報(bào)告基因EGFP的表達(dá)，獲得HCVpp的感染性滴度(圖幻，上述突變體包裝的 HCVpp 感染性滴度分別為:C50-V8H :9. 2X 105FFU/ml、C50-T12H :8. 4X 105FFU/ml、 C50-VT-2H :3. 3X106FFU/ml、C50-D9 :5. 8X 106FFU/ml、C50-2HD9 :1 X 107FFU/ml。與原型 C50的5X 105FFU/ml滴度相比，這些突變均能增加HCVpp的感染性滴度，尤其是突變具有協(xié)同效應(yīng)，使得C50-2HD9突變體HCVpp滴度能高達(dá)1 X 107FFU/ml,目前沒(méi)有任何相關(guān)技術(shù)報(bào)道。實(shí)施例4 =HCVpp細(xì)胞嗜性的鑒定將C50-HCVpp和突變體C50_2HD9HCVpp感染不同組織來(lái)源的細(xì)胞，包括細(xì)胞 (人胚腎成纖維細(xì)胞)、Huh7細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)、Η印;3Β細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)、Raji細(xì)胞(人 B淋巴瘤細(xì)胞)、Molt4細(xì)胞(人T淋巴瘤細(xì)胞)、Hela細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)、NIH3T3細(xì)胞 (小鼠成纖維細(xì)胞)、CHO細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)。將上述細(xì)胞接種96孔板，每孔8000個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后，吸除原培養(yǎng)液，每孔加入C50-HCVpp 或突變體C50-2HD9HCVpp上清100 μ 1，5小時(shí)候換液，繼續(xù)培養(yǎng)72h，檢測(cè)EGFP的表達(dá)。結(jié)果C50-HCVpp和突變體C50-2HD9HCVpp僅感染Huh7細(xì)胞和HepIBB細(xì)胞，不感染其他任何細(xì)胞，表明制備的HCVpp具有嗜肝細(xì)胞的特征(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種高滴度特異性感染肝細(xì)胞的丙型肝炎擬似病毒的制備方法，其特征在可獲得感染性達(dá)到lX107FFU/ml的丙型肝炎擬似病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高滴度特異性感染肝細(xì)胞的丙型肝炎擬似病毒的制備方法，其特征在于丙型肝炎擬似病毒具有人肝細(xì)胞靶向感染的特性，專(zhuān)一感染人肝組織來(lái)源的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高滴度特異性感染肝細(xì)胞的丙型肝炎擬似病毒的制備方法，其特征在于HCV包膜蛋白序列是從HCV感染者血清中克隆并篩選而獲得，并對(duì)高變區(qū) 1進(jìn)行了突變，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高滴度特異性感染肝細(xì)胞的丙型肝炎擬似病毒的制備方法，制備的丙型肝炎擬似病毒可用于研究HCV的感染機(jī)制，評(píng)價(jià)抗體以及小分子藥物對(duì) HCV感染的阻斷作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高滴度特異性感染肝細(xì)胞的丙型肝炎擬似病毒的制備方法，制備的丙型肝炎擬似病毒可用做肝組織靶向性基因治療載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明篩選并通過(guò)基因突變的方法獲得一株高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、高肝細(xì)胞嗜性的丙型肝炎病毒包膜蛋白基因，將該基因的表達(dá)質(zhì)粒與基于HIV的慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染可獲得感染性滴度達(dá)到1×107FFU/ml的丙型肝炎病毒擬似病毒，該方法獲得丙型肝炎病毒擬似病毒的感染滴度比其他方法高100倍，由于丙型肝炎病毒擬似病毒為肝細(xì)胞特異性感染，因此除了用于研究丙型肝炎的感染機(jī)制、評(píng)價(jià)中和抗體、篩選小分子藥物以外，還可能作為肝細(xì)胞靶向性基因治療載體，具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102234634SQ20101056731
公開(kāi)日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者王岳, 譚文杰, 趙平 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所