專利名稱：蘋果酸舒尼替尼脂質體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及蘋果酸舒尼替尼脂質體及其制備方法，具體涉及脂質體制備過程中乙醇含量的控制，確保制備過程中殘留的乙醇對脂質體性質無顯著性影響。
背景技術：
舒尼替尼及其蘋果酸鹽(Sunitinib malate, Sutent, SU11248, SU)為新型的多靶點酪酸激酶受體抑制劑，它對多種受體的酪氨酸激酶(TKIs)具有抑制作用，主要包括血小板衍生生長因子受體β (PDGFRii )、血管內(nèi)皮生長因子受體1，2，3 (VEGFRl, 2，3)和干細胞因子受體(c-Kit)。此藥對多種實體瘤有明顯的抗腫瘤活性，在對多種類型腫瘤(如晚期腎細胞癌、胃腸道間質瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤)進行的
II和(或)ΙΠ期臨床試驗中均取得很好的療效。2006年經(jīng)FDA批準上市的Pfizer公司
的產(chǎn)品Sutent用于治療晚期腎細胞癌和伊馬替尼耐受的胃腸道間質瘤。Sutent的主要毒性反應包括全身反應(乏力、虛弱)、胃腸道反應(惡心、消化不良、腹瀉、口腔黏膜炎)、血液學反應(中性粒細胞減少、血小板減少)以及皮膚反應(皮炎、毛發(fā)褪色)，臨床采用停藥手段以減少副反應，但由此引發(fā)的患者病情可能惡化的情況也令人擔憂，因此考慮將其制備成脂質體以期解決上述問題。一般而言，磷脂分散于水相時，分子的疏水尾部聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成了具有雙分子層結構的封閉囊泡，即脂質體。膽固醇的加入以及磷脂分子間存在較弱的相互作用力(如疏水相互作用、范德華力、氫鍵等)，碳氫鏈高度有序、磷脂分子排列緊密，使得脂質體以雙分子層的結構相對穩(wěn)定存在。但是由于溫度、PH值和含水量等因素能夠引發(fā)脂質體結構改變，可能引發(fā)被包封藥物的泄露，所以在脂質體研發(fā)過程中脂質體的穩(wěn)定性更會引起科研工作者的廣泛重視。制備脂質體的經(jīng)典方法中常常以氯仿、二氯甲烷等溶媒溶解膜材料，這存在有毒溶劑殘留的問題?；谝掖既芙饽げ亩⑵饋淼母牧家掖甲⑷敕ǎ哂胁僮骱唵?，所制得的脂質體粒子小且均勻，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但當制劑中含有較高濃度乙醇時，脂質體間可能會產(chǎn)生聚集、融合，導致被包封藥物的泄露，從而影響其穩(wěn)定性。研究人員對其機理進行了深入的考察，歸納機理如下當脂質體間存在一定距離，脂質體膜間具有較弱的范德華力和靜電排斥力；而當兩表面接觸很近(l-3nm)時，產(chǎn)生的水合力將引起強烈的排斥作用。水合力是由水分子與磷脂親水基團的相互作用引起的，它能夠阻止脂質體膜間的聚集，對脂質體的穩(wěn)定起著相當大的作用。Hiroaki等以大單室脂質體(直徑大約170 nm)為模型， 發(fā)現(xiàn)高濃度乙醇存在時，乙醇會干擾脂質體的水合層，減小脂質體間的水合力，引起交錯相 (Interdigitated membranes)形成，由于交錯相的膜較正常雙層的膜薄，交錯相的每個磷脂分子有較大的表面積，水合力較小，從而引發(fā)膜聚集，隨后水分子被進一步排擠，頭基在小范圍內(nèi)連接，且連接區(qū)域不斷延伸至形成連接區(qū)，導致脂質體融合。即在制備過程中所加入的乙醇會對脂質體膜結構產(chǎn)生影響，過多的乙醇易造成脂質體的聚集、雙分子層融合以及藥物的滲漏，從而影響脂質體的包封率，粒徑及穩(wěn)定性等。因此已有的阿霉素脂質體
3(D0XIL，凱萊)商品中乙醇殘留量要求小于0.01%。

發(fā)明內(nèi)容
至今，尚無針對載藥脂質體中乙醇含量允許上限的研究。我們考慮到乙醇毒性低、對脂質體膜材有良好溶解能力的特點，采用改良乙醇注入法制備空白脂質體，以離子梯度裝載技術制備舒尼替尼脂質體。鑒于此工藝中不可避免地會殘留乙醇的考慮，我們研究了不同乙醇含量對空白脂質體、梯度脂質體及載藥脂質體包封率、粒徑及抗腫瘤效率的影響，驚喜地發(fā)現(xiàn)最終脂質體制劑的乙醇殘留量可以控制在10% (ν/ν)以內(nèi)，極大地縮短簡化工業(yè)生產(chǎn)中的乙醇含量控制提供參考。由此建立改良乙醇注入法制備SU脂質體的制備工藝，具體方法如下配制水化介質于45 75 ！保溫待用；以制劑產(chǎn)品終體積百分比小于10%的乙醇，包括無水乙醇，于45 75 °C溶解脂質相；將脂質相按照一定速度加入至水化介質中，攪拌分散，降低粒徑，得空白脂質體按照梯度載藥法即可。脂質體藥物制劑可通過常規(guī)技術測定藥物在脂質體中的包封率。脂質體包封率測定的方法有超濾法、透析法、柱層析法、微柱離心法等，這些方法均存在一定問題。我們采用離子交換樹脂(纖維)進行包封率測定，具有耗時短、操作簡單、價格低廉、可重復使用、不需要昂貴的儀器設備等優(yōu)點。本發(fā)明的有益技術效果如下1、采用硫酸銨梯度、蔗糖八硫酸酯銨梯度、EDTA銨梯度、檸檬酸梯度與金屬離子梯度制備舒尼替尼脂質體的包封率大于90% ；2、首次明確采用改良乙醇注入法制備舒尼替尼脂質體時，乙醇無需全部除去，合理控制制備過程中殘留的乙醇量，脂質體理化性質與療效無顯著性變化。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。這些實施例只是舉例說明，它們不應當構成對本發(fā)明的限制。實施例1空白脂質體制備的一般方案 1一般方案1
空白脂質體處方氫化大豆磷脂(HSPC) 3g 膽固醇(CH)Ig
mPEG2000-DSPE0. 75g
稱取處方中各脂質化合物，用適量無水乙醇于65°C水浴攪拌溶解，揮除乙醇，加入一定濃度硫酸銨((NH4)2SO4)溶液，65°C水浴攪拌20 min，得空白脂質體初品。將初品探頭超聲 8 min (200 wX2 min,400 wX6 min)后，依次通過 0. 8、0. 45、0. 22 μ m 的微孔濾膜，即得空白脂質體混懸液，最終磷脂質量濃度為50 mg · mL—1。2 一般方案2 空白脂質體處方氫化大豆磷脂(HSPC) 3g 膽固醇(CH)Ig mPEG2000-DSPE 0. 75g
稱取處方中各脂質化合物，用適量無水乙醇于70°C水浴攪拌溶解，揮除乙醇，加入一定濃度乙二胺四乙酸銨(NH4EDTA)溶液，65°C水浴攪拌20 min，得空白脂質體初品。將初品探頭超聲 8 min (200 wX2 min、400 wX6 min)后，依次通過 0. 8、0. 45、0. 22 μ m 的微孔濾膜，即得空白脂質體混懸液，最終磷脂質量濃度為50 mg · mL—1。3 —般方案3 空白脂質體處方氫化大豆磷脂(HSPC) 3g 膽固醇(CH)Ig mPEG2000-DSPE 0. 75g
將HSPC、CH、mPE(i2_-DSPE以二氯甲烷溶解，按照薄膜法工藝除去二氯甲烷，得脂質薄膜。加入預熱至65°C的硫酸銨((NH4)2SO4)溶液，65°C水浴攪拌20 min，得空白脂質體初品。 將初品探頭超聲 8 min(200 wX2 min,400 wX6 min)，再依次通過 0. 8 μ m、0. 45 μπι、0. 22 μ m微孔濾膜，得空白脂質體混懸液。
實施例2梯度脂質體的制備及載藥
建立梯度的方法包括“透析法”、“超濾法”、“離子交換樹脂法”、“分子篩分離法”等。下面以離子交換樹脂法為例進行說明。取“實施例1”的空白脂質體混懸液0.3 mL，上樣于經(jīng)離心預處理的3 mL陰陽混合離子交換樹脂柱(濕法裝柱，陰離子樹脂與陽離子樹脂體積比為2: 1),2000 rpm離心4 min，得到具有(NH4)2SO4跨膜梯度的空白脂質體混懸液。取適量梯度脂質體與SU溶液(5. O mg · mL—1)混合，于一定溫度下孵育一定時間， 即得SU-L。SU-L包封率的測定
采用陽離子交換樹脂法測定SU-L包封率，具體操作如下精密移取0.1 mL SU-L 于10. O mL容量瓶中，加入1.6 mL蒸餾水，以體積分數(shù)為90%的異丙醇溶液(含0.75 mol · IZ1HCl)破乳并定容，搖勻，430 nm波長下測定吸光度Atl (藥物總吸收度)。另精密移取0.1 mL SU-L，置于陽離子交換樹脂柱頂端表面中央，2000 r · mirT1離心4 min，再于柱頂端加入400 μ 蒸餾水，2000 r ^irT1離心4 min,重復4次，合并洗脫液。洗脫液轉移至 10.0 mL量瓶中，用體積分數(shù)為90%的異丙醇溶液(含0. 75 mol .L-1HCl)破乳并定容，搖勻， 測定吸光度A1 (包封藥物吸收度)，計算包封率。1 SU-L的制備工藝優(yōu)化一般方案1
在預實驗的基礎上，以(NH4)2SO4濃度(A)、藥脂質量比(B)、載藥溫度(C)、載藥時間(D) 為主要考察因素，每個因素取3個水平(表1)，選用(34)正交設計表(表2)進行實驗， 按上述方法制備脂質體，測定包封率，以相應包封率(EE)為指標對結果進行分析。表1 4因素3水平表
mm
水乎-------
^(mmol'L"1)BC(O)D(miii)
1100Ti50Γθ
21501:85515
3_200_ 1:166020表2正交試驗Z9 (34)表
權利要求
1.蘋果酸舒尼替尼脂質體，其特征在于，其處方組成主要為藥物與構建脂質體雙分子膜的脂質類物質。
2.如權利要求1所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體，其特征在于，其中脂質體制劑的膜材是磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷月旨、心磷脂等天然或合成的磷脂或其衍生物、及上述物質通過常用方法氫化的物質；作為主要膜材可以只含一種磷脂，也可以含有多種磷脂；處方中尚可以加入其他成分，包括糖脂質、膽固醇、谷固醇類中任意一種或多種。
3.如權利要求2所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體，其特征在于，其中所述的脂質體制劑的膜材中磷脂優(yōu)選HSPC、HEPC、DSPC，更優(yōu)選HSPC ；“其他成分”優(yōu)選膽固醇。
4.如權利要求1所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體，其特征在于，還含有親水性高分子脂質衍生物，包括聚乙二醇與磷脂或膽固醇的脂質連接所得PEG脂質衍生物。
5.如權利要求4所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體，其特征在于，所述的親水性高分子脂質衍生物為聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及费苌铩?br> 6.如權利要求4所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體，其特征在于，聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中PEG的分子量通常為200-20000道爾頓，優(yōu)選1000-7000道爾頓，更優(yōu)選 2000-5000道爾頓；其用量相對于膜脂質的比率通常為0. 0-20md%，優(yōu)選0. 5_10%。
7.—種如權利要求1所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體的制備方法，其特征在于，通過改良乙醇注入法制備，其具體工藝如下配制水化介質于45 75 ！保溫待用；以制劑產(chǎn)品終體積百分比小于10%的乙醇，包括無水乙醇，于45 75 °C溶解脂質相；將水化介質加入至脂質相中，攪拌分散，降低粒徑，得空白脂質體；按照梯度載藥法即可。
8.如權利要求1所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體的制備方法，其特征在于，所述的梯度載藥法采用硫酸銨梯度、蔗糖八硫酸酯銨梯度、EDTA銨梯度、檸檬酸梯度、金屬離子梯度將藥物裝載進入脂質體，控制乙醇含量為0-15% (V/V)0
9.如權利要求8所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體的制備方法，其特征在于，控制乙醇含量小于10% (V/V)。
10.如權利要求7所述的蘋果酸舒尼替尼脂質體的制備方法，其特征在于，以硫酸銨梯度載藥條件為=(NH4)2SO4濃度15(T200mM，藥脂比1:6 1:8，載藥溫度55 60°C，載藥時間15 20min ；以EDTA銨梯度載藥條件為=NH4EDTA濃度200 300mmol · L—1，藥脂比1:8 1:6 (w/w)，60 65°C 載藥 10 15 min。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，公開了蘋果酸舒尼替尼脂質體及其制備方法，本發(fā)明的蘋果酸舒尼替尼脂質體的處方為藥物與構建脂質體雙分子膜的脂質類物質，通過改良乙醇注入法制備。本發(fā)明還考察了所制備處方中乙醇含量對其包封率、粒徑分布、穩(wěn)定性及抗腫瘤效果的影響。結果表明，梯度法載藥制備的脂質體包封率大于90%，當控制乙醇含量不大于10%時，脂質體相關參數(shù)幾乎沒有變化，為舒尼替尼脂質體制備及工業(yè)生產(chǎn)中的乙醇含量控制提供參考。
文檔編號A61P35/00GK102485212SQ20101056823
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權日2010年12月1日
發(fā)明者張艷晶, 鄧意輝 申請人:沈陽藥科大學