專利名稱：阿魏酸在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥提取物領(lǐng)域，具體涉及用于制備防治骨質(zhì)疏松的藥物的中藥提取 物阿魏酸。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松是以骨量低下、骨骼微結(jié)構(gòu)破壞為特征，容易導(dǎo)致骨折的全身性疾病，是 一種常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響老年人健康和生活質(zhì)量，是一世界范圍的、主要的、不斷增長(zhǎng) 的衛(wèi)生和健康問題。隨著全球人口的老齡化，骨質(zhì)疏松已上升至常見病、多發(fā)病的第7位， 目前全球患病人數(shù)超過兩億，我國(guó)患者約9000萬。目前防治OP癥西藥有很多種，根據(jù)作用 機(jī)制可分為兩類，一是抑制骨吸收藥物，主要有雌激素(estrogen)、降鈣素(calcitonin)、 二膦酸鹽類(bisphosphonates)、異丙氧黃酮(ipriflavone)等；二是促骨形成藥物，主要 有骨礦化物(鈣鹽、維生素D及其衍生物)、雄激素類(androgen)、生長(zhǎng)激素(GH)、氟化物 (fluoride)、蛋白同化激素(anabolic steroids)等。雌激素一直作為防止婦女絕經(jīng)后骨丟失的首選藥物，具有降低骨吸收和促進(jìn)骨 形成兩方面的作用，主要通過抑制骨吸收，再建骨代謝平衡，對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)有 良好的治療效果。盡管長(zhǎng)期服用雌激素的絕經(jīng)后婦女骨折發(fā)生率、冠心病發(fā)生率及老年性 癡呆發(fā)生率均降低，對(duì)更年期綜合征也有良好的預(yù)防作用，能防止泌尿生殖器官萎縮，但 HRT的副作用是一個(gè)不容忽視的問題。美國(guó)經(jīng)過3年對(duì)16600例婦女的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)， 雌激素替代療法能使患者患中風(fēng)和心臟病的概率增加60、5%，使乳腺癌的發(fā)病危險(xiǎn)增加 沈％，并有可能導(dǎo)致卵巢癌。因此，2002年7月9日美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)在美國(guó)果斷 叫停了激素替代療法。其他類西藥，比如鈣劑及維生素D類藥物，臨床常用的分為普通維 生素D和活化骨三醇(羅鈣全，rocaltrol)兩種，兩類制劑均可引起高鈣血癥和高鈣尿癥， 且發(fā)生率較高。西藥存在的副作用等局限性，限制了它們臨床上的應(yīng)用。因此，選用毒副作用小、價(jià)格合理、標(biāo)本兼治并可長(zhǎng)期服用的中草藥治療成為國(guó)內(nèi) 醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。OP屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”、“骨痹”、“腰背痛”范疇。早在《內(nèi)經(jīng)》時(shí)代就已 經(jīng)將腎與骨病緊密結(jié)合起來。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精，主生長(zhǎng)、發(fā)育與生殖，在體為骨，主骨 生髓。骨的生長(zhǎng)發(fā)育，有賴于骨髓的充盈及其所提供的營(yíng)養(yǎng)。腎中精氣充盈，才能充養(yǎng)骨 髓，正如《素問 四時(shí)刺逆從論》中說“腎主身之骨髓”。小兒骨軟無力，以及老年人的骨質(zhì) 脆弱，易于骨折等，都與腎中精氣不足、骨髓空虛、骨失充養(yǎng)有關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，腎對(duì) 鈣、磷代謝具有調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)機(jī)制是通過腎小管加強(qiáng)對(duì)鈣的重吸收，并從尿內(nèi)排出大量 的磷，以維持血漿內(nèi)鈣、磷的動(dòng)態(tài)平衡。這種排磷保鈣的生理調(diào)節(jié)功能，可適應(yīng)骨骼的生長(zhǎng) 發(fā)育和骨損傷修復(fù)的需要。當(dāng)這種調(diào)節(jié)功能發(fā)生障礙時(shí)，可因體內(nèi)鈣的大量丟失、骨骼鈣的 不斷減少，而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。故腎對(duì)鈣、磷代謝的調(diào)節(jié)功能直接影響著骨代謝，從而體現(xiàn)了 與中醫(yī)“腎主骨”理論的一致性。中醫(yī)“腎主骨”理論一直有力地指導(dǎo)著中醫(yī)的臨床實(shí)踐。當(dāng)前中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏 松癥多采用補(bǔ)腎填精為主，輔以健脾養(yǎng)血、活血化淤、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋壯骨諸法，已取得一定
3臨床療效，對(duì)由腎虛引起的一系列衰老癥狀也有一定程度的改善作用。當(dāng)前應(yīng)用的復(fù)方有 護(hù)骨膠囊、骨愈靈膠囊、仙靈骨葆膠囊等，已經(jīng)用于治療的單味藥有淫羊藿、黃芪、蛇床子、 刺五加等。目前的研究中，骨礦含量(BMC)的微觀測(cè)定，為研究中醫(yī)“腎主骨”理論提供了 客觀指標(biāo)；對(duì)腎虛實(shí)質(zhì)的探討，又充分說明了腎主骨功能與老年性骨病的關(guān)系，隨著醫(yī)學(xué)科 學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)“腎主骨”的認(rèn)識(shí)也在不斷地深化目前研究報(bào)導(dǎo)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的病機(jī) 是“多虛多瘀“，這與明代張景岳在《景岳全書》中認(rèn)為“元?dú)鈹?，則精虛不能灌溉，血虛 不能營(yíng)養(yǎng)者，亦不少矣。痿由內(nèi)臟不足之所致，但不任用，亦無痛楚，此血?dú)庵撘病钡挠^點(diǎn) 一致?？紤]到老年病多虛多瘀的特點(diǎn)，腎虛是骨質(zhì)疏松癥的主要病機(jī)，脾為后天之本，氣血 生化之源，腎精依賴脾精的滋養(yǎng)才源源不斷得以補(bǔ)充。若脾不運(yùn)化，脾精不足，腎精乏源或 腎精虧虛，骨骼失養(yǎng)，則骨骼脆弱無力，必致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。脾虛是本病的重要病機(jī)，同 時(shí)腎虛與血瘀互相促進(jìn)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的進(jìn)一步產(chǎn)生。因此在中醫(yī)中藥中尋找有效安全的 藥物，從健脾益氣、活血通絡(luò)的角度，發(fā)揮中藥防治骨質(zhì)疏松的作用，具有重要的臨床意義 和廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)歸Angelica sinensis (Olivl) Diels是傘形科當(dāng)歸屬的一種多年生草本植 物。其干燥的貯藏根是我國(guó)一味常用的中藥材，藥用歷史悠久，歷代本草均有記載，始記于 《神農(nóng)本草經(jīng)》謂之“當(dāng)歸味溫，主呃逆上氣”被列為中品，有補(bǔ)血、和血、調(diào)經(jīng)止血、潤(rùn)腸滑腸 之功效，為醫(yī)家常用，素有“十方九歸”之稱。阿魏酸作為當(dāng)歸等中藥所含的一種水溶性單 提成分，是其主要活性物質(zhì)之一，具有鎮(zhèn)靜，增加冠脈血流量，保護(hù)缺血心肌，抗血小板凝集 等功能。目前阿魏酸及其鈉鹽對(duì)肌細(xì)胞、血細(xì)胞、視神經(jīng)細(xì)胞活性影響的研究已有報(bào)道，但 是尚沒有關(guān)于阿魏酸作用于成骨細(xì)胞的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的阿魏酸用途的局限性，提供一種阿魏酸的新用途。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
當(dāng)歸具有補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)、潤(rùn)腸的功能，作為一種常用的補(bǔ)血活血中藥，阿魏酸是其水 溶性單提成分，具有藥材來源充足、方便的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明研究不同濃度阿魏酸對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化功能的影 響，以及對(duì)成骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響，為阿魏酸在防治骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用提供依 據(jù)，可得出阿魏酸能用于制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化或礦化的藥物或防治骨質(zhì)疏松的藥 物。當(dāng)用阿魏酸能用于制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化或礦化的藥物或防治骨質(zhì)疏松的 藥物時(shí)，所述阿魏酸的用量為7. 8 500 mg/L，優(yōu)選31. 2mg/L0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)得知，阿魏酸7.纊500 mg/L四個(gè)濃度組與對(duì)照組比，均具有刺激成骨 細(xì)胞增殖的作用，組間比較，只有500mg/L濃度組與其他組比較存在顯著性增加(p<0. 001)； 同時(shí)在7.8 500 mg/L濃度內(nèi)，阿魏酸可以提高ALP活性，四個(gè)濃度組中，除了 31. 2與 125mg/L濃度之間沒有差異外，其他各組間都存在顯著性差異(p<0. 001)，隨著濃度的增 加，ALP增加；另外，茜素紅染色顯示，7.8 250 mg/L的阿魏酸可以增加鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量 (p<0. 05)，其中7. 8組的數(shù)量最多；而到500 mg/L濃度時(shí)，阿魏酸則不促進(jìn)鈣化結(jié)節(jié)的
4形成。RT-PCR的結(jié)果表明，阿魏酸在7. 8 500 mg/L內(nèi)還促進(jìn)成骨相關(guān)指標(biāo)Collagen- I、 AKP、Osteocalcin等基因的表達(dá)(p<0. 05)，但未見劑量依賴關(guān)系。


圖1為阿魏酸對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，其中，與對(duì)照組比較，*，/X0.05，**， /XO. 001 ；組間比較，a /XO. 05，A /XO. 001 VS 7.8; b ^<0. 05, B ^<0. 001 VS 31. 2;C P<0. 001 VS 125; D -JKQ. 001 VS 500 ；
圖2為阿魏酸對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，其中，與對(duì)照組比較，*，/X0. 05，**， /XO. 001 ；組間比較，A /XO. 001，VS 7.8; B /XO. 001 VS 31. 2;C ^<0. 001 VS 125; D P<0. 001 VS 500 ；
圖3為阿魏酸對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響，其中，從左到右阿魏酸濃度依次為0 mg/L,7. 8 mg/L、3L2 mg/L、125 mg/L,500 mg/L ；與對(duì)照組比較，7. 8 250 mg/L的阿魏酸可以增加鈣 化結(jié)節(jié)的數(shù)量，其中7. 8組的數(shù)量最多；而到500 mg/L濃度時(shí)，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量未見明顯增 加；
圖4為阿魏酸對(duì)成骨分化標(biāo)記的基因表達(dá)的影響；從上至下依次為AKP組、 Osteopontin組、Collagen I組和β -actin組；從左至右阿魏酸濃度依次為0 mg/L,7. 8 mg/L、3L2 mg/L、125 mg/L,500 mg/L ；與對(duì)照組比較，7. 8 500 mg/L的阿魏酸可以促進(jìn)成 骨相關(guān)基因的表達(dá)；
圖5為阿魏酸對(duì)成骨相關(guān)基因AKP表達(dá)的作用； 圖6為阿魏酸對(duì)成骨相關(guān)基因Osteopontin表達(dá)的作用； 圖7為阿魏酸對(duì)成骨相關(guān)基因Collagen I表達(dá)的作用；
圖8為阿魏酸對(duì)成骨細(xì)胞周期分布的影響，其中，與對(duì)照組比較，7.纊500 mg/L的阿魏 酸可以增加成骨細(xì)胞&/M期百分含量。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1
以新生SD乳鼠頭蓋骨原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，取第三代細(xì)胞進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)， 96孔板每孔加細(xì)胞100 μ 1，細(xì)胞密度為1 X IOVmL,條件培養(yǎng)基(含地塞米松10_ 8 mmol / L、維生素C 0. 05 g/L、i3-甘油磷酸鈉10 mmol /L)中含阿魏酸的終濃度分別為500、125、 31. 2,7. 8 mg/L，各濃度組設(shè)三復(fù)孔，應(yīng)用CCK-8法、堿性磷酸酶(AKP)法、茜素紅染色方 法觀察阿魏酸對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖、ALP表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)形成的影響，同時(shí)應(yīng)用 RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)指標(biāo)Collagen- I、AKP、0steOpOntin等的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 阿魏酸對(duì)成骨細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響(圖廣8)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(一)CCK-8試劑盒方法被廣泛用于生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī) 模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等，具有靈敏度高、檢測(cè) 快速、使用方便、對(duì)細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明在檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖作用中，阿魏酸 7.8、31.2、125、500 mg/L四個(gè)濃度組與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)，組間比較，500mg/L組與其他濃度組存在顯著性差異(p<0. 01)。說明阿魏酸在7.纊500 mg/L 濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的功能。(二)堿性磷酸酶(AKP)是成骨細(xì)胞分化的早期特異性標(biāo)志之一，AKP活性的高低 可以直接反應(yīng)成骨細(xì)胞分化的程度。通過檢測(cè)成骨細(xì)胞AKP的活性，我們發(fā)現(xiàn)阿魏酸7. 8、 31.2,125,500 mg/L四個(gè)濃度組與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)，表明阿 魏酸在7.纊500 mg/L濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的功能。(三)鈣化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞分泌的膠原親合鈣鹽而成，是成骨細(xì)胞分化成熟的重 要標(biāo)志。本研究中，我們通過茜素紅染色法檢測(cè)阿魏酸對(duì)成骨細(xì)胞礦化功能的影響，通過 比較鈣化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量(如圖3)，可以發(fā)現(xiàn)在7.纊250 mg/L濃度范圍內(nèi)，阿魏酸可以促 進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成，而到500 mg/L濃度時(shí)，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量未見明顯增加，表明在 7.纊250 mg/L濃度范圍內(nèi)阿魏酸可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化。(四)成骨細(xì)胞功能的改變伴隨有相關(guān)基因表達(dá)狀態(tài)的變化。CollagenI、 Osteopontin.AKP等基因與成骨細(xì)胞增殖、分化等的功能息息相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，我們的研究 表明阿魏酸在7.纊500 mg/L濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞基因的表達(dá)。(五)細(xì)胞周期檢 測(cè)可以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，G2M期的百分比一定程度上可以定量反映細(xì)胞增殖狀態(tài)。本 實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果表明，7.壙500 mg/L的阿魏酸具有促進(jìn)成骨細(xì)胞 增殖的功能。
權(quán)利要求
1.阿魏酸在制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化或礦化的藥物中的應(yīng)用。
2.阿魏酸在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的阿魏酸的應(yīng)用，其特征在于所述阿魏酸的用量為7.8飛00 mg/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的阿魏酸的應(yīng)用，其特征在于所述阿魏酸的用量為31.2mg/L0
全文摘要
本發(fā)明公開了阿魏酸在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的作用，因此可以用于制備防治骨質(zhì)疏松的藥物。由于阿魏酸是當(dāng)歸的主要水溶性單提成分，因此藥材來源充足、方便，用于制備防治骨質(zhì)疏松具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K31/192GK102125542SQ20101056966
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者盧麗, 李青南, 楊國(guó)柱, 陸幸妍, 陳珺, 高建林 申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院