專利名稱：海帶內(nèi)生活性菌株的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)生菌的分離純化方法，特別是一種操作簡單、成本低廉的海帶 內(nèi)生活性菌株的分離純化方法。
背景技術(shù)：
海帶(laminaria japonica)是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物。海帶 作為一種重要的海洋資源，其食用與藥用價值早為世人所知，我國就有食用海帶并利用其 治療和預防癭病(甲狀腺腫大)的記載。隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)海帶在醫(yī) 療保健方面有更多的功效，如從海帶中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗HIV 和增強免疫功能，對治療心腦血管疾病和中、早期慢性腎衰等均有一定的作用。海帶中還 含有一些共附微生物，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今未止還沒有被充分利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種操作簡單、成本低 廉的海帶內(nèi)生活性菌株的分離純化方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是海帶內(nèi)生活性菌株的分離純化方法，其特征在于依次 按如下步驟進行
a.采集正常生長無病害的海帶，用無菌海水沖洗海帶3飛次；
b.用滅菌剪刀將海帶剪成1.5^2. 5cm2小塊，濃度75%的酒精漂洗3(T90s后用無菌水 沖洗；用濃度0. 1%的氯化汞漂洗6 18s，用無菌水沖洗；
c.將海帶塊研磨后加入等質(zhì)量的無菌水，混勻后再均勻涂布接種到平板培養(yǎng)基；
d.37°C下培養(yǎng)7天，分別挑取單個形態(tài)各異的菌落，在平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，直到 出現(xiàn)純菌株。所述平板培養(yǎng)基為淡水/海水牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基或淡水/海水高氏固體培 養(yǎng)基或淡水/海水薩氏固體培養(yǎng)基。本發(fā)明是以來源豐富、價格便宜的海帶為原料，操作簡單、成本低廉，所分離純化 的海帶內(nèi)生菌株具有多種活性，可應(yīng)用于藥品、生物農(nóng)藥和食品保鮮、防腐劑及化妝品的添 加劑等，具有產(chǎn)業(yè)價值。
具體實施例方式
本發(fā)明實施例依次按如下步驟進行
a.從海底采集正常生長無病害的海帶，用無菌海水沖洗海帶3飛次；
b.用滅菌剪刀將海帶剪成2cm2小塊，濃度75%的酒精漂洗90s后用無菌水沖洗干凈； 再用濃度0. 1%的氯化汞漂洗18s，用無菌水沖洗干凈；
c.將海帶塊研磨后加入等質(zhì)量的無菌水制成海帶研磨液，混勻后均勻涂布接種于平 板培養(yǎng)基上；
d.37°C下培養(yǎng)7天，分別挑取單個形態(tài)各異的菌落，在平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，重復該步驟，直到有純菌株出現(xiàn)。為了能分離到盡可能多的海帶內(nèi)生菌，本發(fā)明實施例的平板培養(yǎng)基分別選取了淡 水/海水牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，淡水/海水高氏固體培養(yǎng)基，淡水/海水薩氏固體培養(yǎng) 基。結(jié)果共分離出內(nèi)生菌27株，其中淡水牛肉膏12株、淡水薩氏3株、海水牛肉膏6株、海 水高氏1株、海水薩氏5株。實驗及結(jié)果
1.紙片法檢測發(fā)酵液的抑菌活性將大腸桿菌Escherichia coli (EC)、變形桿 菌 Proteus vulgaris (PV)、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (SA)、產(chǎn)氣桿菌 Enterobacter aerogenes (EA)和枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis (BS)分別接種于牛肉 膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24 h作指示菌，上述菌種均可購自上海坤肯生物化工有限 公司。分別用移液槍取指示菌液100 μ L于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，用無菌三角涂棒 涂抹均勻，然后將牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板分成六個區(qū)，每個區(qū)分別放入一張濾紙片， 再分別用移液槍移取本發(fā)明實施例分離純化的海帶內(nèi)生菌株發(fā)酵產(chǎn)物樣品10 μ L滴入濾 紙片中央，置于37 ！培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理做3次重復，陽性對照為75%酒精，陰性對照 為相應(yīng)菌株的空白培養(yǎng)基。三天后觀察指示菌的生長情況，測定抑菌圈的直徑大小。結(jié)果 本發(fā)明實施例分離純化的27株菌種中，有抑菌活性的菌種共20株，其中淡水牛肉膏8株、 淡水薩氏2株、海水牛肉膏6株、海水薩氏4株，尤其對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大 腸桿菌的抑菌效果非常顯著，因此用這些菌株發(fā)酵產(chǎn)物開發(fā)食品添加劑可因其抑菌活性而 延長產(chǎn)品的保藏時間，還可直接開發(fā)成食品保鮮防腐劑。由于該菌株發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡 萄球菌作用明顯，因此可以作為治療皮膚表淺創(chuàng)傷的藥物或應(yīng)用于化妝品的添加劑。2.抑制植物病原菌活性的檢測在無菌條件下，用移液槍移取本發(fā)明實施例分離 純化的菌株發(fā)酵液1. 5 mL，加入到冷卻至40°C左右的沙氏培養(yǎng)基中搖勻，使其最終體積為 15 ml，凝固后分別用孔徑為0. 8 cm的打孔器取菌落邊緣生長旺盛的植物病原菌菌餅接種 到含有本發(fā)明實施例活性菌株發(fā)酵液的沙氏培養(yǎng)基平板上。每個培養(yǎng)皿接種1個菌餅，每 種植物病原菌3個重復。以待檢菌的相應(yīng)空白培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)基作為對照，置于27 °C的 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，拍照、測量直徑，方法是按照十字交叉測量2次，以其平 均值代表菌落直徑的大小。根據(jù)抑制率的計算公式如下純生長量=菌落平均直徑_菌 餅直徑，抑制率=(對照純生長量-處理純生長量)/對照純生長量進行計算。結(jié)果表明 對番茄灰霉，谷鐮刀菌，毛霉菌，辣椒青枯，番茄早疫，VD-8，蘋果紅粉，棉花枯萎，西瓜枯萎， 玉米早疫，雪霉葉枯，瓜類枯萎都有抑制效果，上述菌種均可購自上海坤肯生物化工有限公 司。實驗說明本發(fā)明實施例分離純化的菌株具有很強的抑制植物病原菌活性，可作為粉劑 或液體制劑用于生物農(nóng)藥的制備。3.抑菌活性物質(zhì)的性質(zhì)確定從本發(fā)明實施例分離純化的具抑菌活性的菌株中， 選取從淡水牛肉膏培養(yǎng)基上純化出的2株和海水薩氏培養(yǎng)基上純化出的1株菌分別接種液 體培養(yǎng)基。接種好的液體培養(yǎng)基在搖床上140r/min、37°C下振蕩培養(yǎng)4天。再對菌株的 抑菌活性進行優(yōu)化培養(yǎng)，即淡水牛肉膏2株的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25度，pH為9，培養(yǎng)時 間6天，液體培養(yǎng)基中蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L。海水薩氏1株的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25 度，PH為5，培養(yǎng)時間6天，體培養(yǎng)基中蔗糖50g/L、蛋白胨6g/L。
所得發(fā)酵液3500r/min離心30min去菌體，收集上清液，用85%的硫酸銨沉淀一 夜。再用10000r/min、4°C下離心30min，過濾收集沉淀。沉淀用PBS緩沖液溶解后分裝到 截留分子量為3500Da的透析袋內(nèi)，透析3天，冷凍干燥后得到粗蛋白樣品。將樣品按5mg/ mL濃度溶解于雙蒸水后，再次進行濾紙片法抑菌試驗，結(jié)果抑菌活性良好。實驗結(jié)果表明 這三種菌株的抑菌活性成分為蛋白質(zhì)，因此用這些蛋白開發(fā)功能性食品或食品添加劑可因 其抑菌活性而延長產(chǎn)品的保藏時間，因它們對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，也可應(yīng)用于 化妝品添加劑。4.海蝦毒性實驗分別取上述方法制備的三種粗蛋白樣品(8 mg/mL)0. 05mL加到 3個帶刻度的試管中，再在每試管中加入約4 mL海水和10只健康的海蝦無節(jié)幼體，最后用 海水加至5 mL ；另取3只試管，也加入10只健康的海蝦無節(jié)幼體，再用海水加至5 mL，作為 空白對照。24°C置日光燈下，24 h后計數(shù)存活海蝦。每個實驗重復三次。實驗結(jié)果表明 三種蛋白處理的海蝦存活率達為22. 5%, 25. 4%和27. 67%，該粗蛋白具有一定的海蝦毒性活 性。海蝦幼蟲曾被許多活性測試系統(tǒng)應(yīng)用，有研究發(fā)現(xiàn)海蝦毒性法和9KB (人鼻咽癌)細 胞毒性實驗呈現(xiàn)很好的相關(guān)性(P = 01036 , kappa = 0156)。細胞毒的ED50 —般是海 蝦毒LD50的1/ 10，可用海蝦毒性法代替昂貴而繁雜的體內(nèi)體外抗腫瘤實驗，指導對具細 胞毒和3PS ( P388，體內(nèi)老鼠白血病)活性提取物的分離。海蝦毒性法具快速(24h)，便宜 和簡單(如不需無菌操作)等優(yōu)點，本實驗結(jié)果表明以本發(fā)明實施例所分離純化的菌種發(fā)酵 液制備的蛋白質(zhì)具有抗腫瘤活性，可應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。5.超氧陰離子自由基(02_)清除作用的測定取鄰苯三酚0. 1 mL于試管中，加入 PH 8. 2的Tris-HCl緩沖溶液5 mL，加入本發(fā)明實施例分離純化的菌株發(fā)酵產(chǎn)物0. 25 mL, 迅速混勻。在25°C反應(yīng)15 min。使用1 cm比色皿，以蒸餾水做空白對照，在320 nm處時 測吸光度A ”并測定樣液本底的吸光度值^。菌株發(fā)酵產(chǎn)物對超氧陰離子自由基清除率的 計算公式如下清除率S (%) =Ao - (Ai — Aj)/AoX 100%。式中，Ao為試劑空白的吸光度 值A(chǔ)i為樣液的吸光度值*為樣液本底的吸光度值。雖然超氧陰離子自由基(O2—)不能直 接誘導生物和食品體系中的脂類氧化，但它會在金屬離子催化下發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生有 高活性的· 0H，因此常用樣品對超氧陰離子自由基(02_)的清除能力來反映其抗氧化活性。 經(jīng)清除率公式S(%)= Ao- (Ai-Aj)AoXlOO計算超氧陰離子自由基清除率。結(jié)果在分離 純化得到的27株菌種中，超氧陰離子自由基(02_)清除作用比較好的菌株有淡水牛肉膏2 株，分別為59. 3%和52. 3% ；海水薩氏2株，分別為57. 8%，46. 6%。因此這些菌株的發(fā)酵產(chǎn) 物可用作抗氧化藥物的制備或食品抗氧化添加劑。
權(quán)利要求
1.一種海帶內(nèi)生活性菌株的分離純化方法，其特征在于依次按如下步驟進行a.采集正常生長無病害的海帶，用無菌海水沖洗海帶3飛次；b.用滅菌剪刀將海帶剪成1.5^2. 5cm2小塊，濃度75%的酒精漂洗3(T90s后用無菌水 沖洗；用濃度0. 1%的氯化汞漂洗6 18s，用無菌水沖洗；c.將海帶塊研磨后加入等質(zhì)量的無菌水，混勻后再均勻涂布接種到平板培養(yǎng)基；d.37°C下培養(yǎng)7天，分別挑取單個形態(tài)各異的菌落，在平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，直到 出現(xiàn)純菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶內(nèi)生活性菌株的分離純化方法，其特征在于所述平板培 養(yǎng)基為淡水牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、海水牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、淡水高氏固體培養(yǎng) 基、海水高氏固體培養(yǎng)基、淡水薩氏固體培養(yǎng)基和海水薩氏固體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開一種操作簡單、成本低廉的海帶內(nèi)生活性菌株的分離純化方法，依次按如下步驟進行采集正常生長無病害的海帶，用無菌海水沖洗海帶3~5次；用滅菌剪刀將海帶剪成1.5~2.5cm2小塊，濃度75%的酒精漂洗30~90s后用無菌水沖洗；用濃度0.1%的氯化汞漂洗6~18s，用無菌水沖洗；將海帶塊研磨后加入等質(zhì)量無菌水，混勻后均勻涂布接種到平板培養(yǎng)基；37℃下培養(yǎng)7天，分別挑取單個形態(tài)各異的菌落，在平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，直到出現(xiàn)純菌株。
文檔編號A61K8/99GK102102082SQ20101059145
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者張付云, 張瑛, 李偉, 李妍, 楊陽 申請人:大連海洋大學