專利名稱：一種咖啡酰酒石酸及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥的生產(chǎn)方法，具體是從苦碟子中藥材中提取分離咖啡酒石酸的方法。
背景技術(shù)：
咖啡酰酒石酸是制備抗菌、抗病毒藥物的原料。目前已有從紫維菊中提取咖啡酰酒石酸的報(bào)道，其方法是按原料比水為1 :2-5的比例加水溶解，濾液加到裝有酸性大孔吸附樹脂層析柱中，依次用三種梯度的洗脫液洗脫，收集洗脫液，調(diào)至酸的體積份數(shù)為 0. 05%-10%，用95%乙醇解吸，減壓蒸干，即得咖啡酰酒石酸。目前尚未有從抱莖苦荬菜中提取咖啡酰酒石酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種咖啡酰酒石酸。本發(fā)明的另一目的，是提供一種咖啡酒石酸的制備方法和用咖啡酰酒石酸對抱莖苦荬菜及其制劑的質(zhì)量控制以及對咖啡酰酒石酸制劑的質(zhì)量控制。采用的技術(shù)方案是
一種用咖啡酰酒石酸，其特征是由抱莖苦荬菜提取、分離制備成。一種用咖啡酰酒石酸的制備方法，是將抱莖苦荬菜藥材常規(guī)加水煎煮兩次，合并煎煮液，濃縮，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3 4，加乙醇至含醇量60% 70%，靜置12小時(shí)，離心， 分取上清液，減壓回收乙醇至濃縮液無醇味，過濾，濾液調(diào)節(jié)PH值4 5，通過預(yù)先處理好的大孔樹脂柱純化，用水洗脫，收集洗脫液，
洗脫液濃縮，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值3 4，用正丁醇萃取4 6次，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH值1 2，用正丁醇萃取4 6次，合并正丁醇液，用1%碳酸氫鈉溶液萃取4 6次，合并萃取液，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值1 2，用醋酸乙酯萃取8 10次，合并萃取液，減壓濃縮至干，加醋酸乙酯溶解，溶液通過預(yù)先處理好的硅膠柱，分別用醋酸乙酯、醋酸乙酯-甲醇(1 :1)、甲醇洗脫， 收集甲醇洗脫液減壓濃縮至干，得白色粉末，在甲醇中重晶2次，得到無色針狀結(jié)晶咖啡酰酒石酸。用從抱莖苦荬菜中提取的咖啡酰酒石酸，其特征在于能制備成注射液、粉針劑、片劑、膠囊劑和顆粒劑以及緩控釋劑。用從抱莖苦荬菜中提取的咖啡酰酒石酸，其特征是用于測定抱莖苦荬菜的方法為
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0. 4%磷酸溶液，乙腈與0. 4%磷酸溶液配比為10 90,為流動(dòng)相；檢測波長為；理論板數(shù)以咖啡酰酒石酸峰記算應(yīng)不低于3000 ；
對照品溶液的制備精密稱取咖啡酰酒石酸對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. Img 的溶液，搖勻，即得；供試品溶液制備取本品粉末過40目篩，精密稱定0.5g，置50ml聚塞錐形瓶中，精密加入5% 10%的甲酸甲醇溶液20ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘 1小時(shí)，再稱定重量，用5% 10%的甲酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 20μ 1，注入液相色譜儀，測定， 即得。用從抱莖苦荬菜中提取咖啡酰酒石酸，其特征在于測定抱莖苦荬菜制劑的質(zhì)量控制方法為
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0. 4%磷酸溶液，乙腈與0. 4%磷酸溶液配比為10 :90，為流動(dòng)相；檢測波長為；理論板數(shù)以咖啡酰酒石酸峰記算應(yīng)不低于3000 ；
對照品溶液的制備精密稱取咖啡酰酒石酸對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. Img 的溶液，搖勻，即得；
供試品溶液制備取相應(yīng)制劑，提取，定容，制備成供試品溶液； 測定法分別精密吸取對照品溶液5 20 μ 1、供試品溶液5 20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。本發(fā)明公開了從抱莖苦荬中提取咖啡酰酒石酸的方法，提取的咖啡酰酒石酸能作為主要活性成制備抗菌、抗病毒藥物；用于抱莖苦荬菜及其制劑的質(zhì)量控制、咖啡酰酒石酸制劑的質(zhì)量控制。
具體實(shí)施例方式一種用咖啡酰酒石酸的制備方法，包括下述工藝步驟
1、取抱莖苦荬菜，水煎煮提取二次，第一次加水8倍量，提取1-2小時(shí)，第二次加水6倍量提取1小時(shí)，合并濾液，濃縮至相密度在60°C溫度下為1. 10 1. 20，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為 3-4，再加乙醇至含醇60—70%，靜置12小時(shí)，離心過濾(轉(zhuǎn)速3000 4000轉(zhuǎn)/分)，分取上清液，減壓回收乙醇至濃縮液無醇味，過濾；濾液調(diào)節(jié)PH值為4-5，通過預(yù)先處理好的AB8 型大孔樹脂柱純化，用水洗脫(每一體積樹脂上6體積樣品；吸附流速為4體積/小時(shí)；洗脫劑量為4體積樹脂)，收集洗脫液，洗脫液濃縮至相對密度在60°C溫度下為1. 10 1. 20，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3-4，用正丁醇萃取4-6次(每次用量為十分之一目標(biāo)溶液
體積)，棄去正丁醇萃取液，再用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為1-2，再用正丁醇萃取4-6次(每次用量為十分之一目標(biāo)溶液體積)，合并萃取液，用1%碳酸氫鈉溶液萃取4 6次(每次用量為十分之一目標(biāo)溶液體積)，合并萃取液，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為1-2，用醋酸乙酯(每次用量為十分之一目標(biāo)溶液體積)萃取8-10次，合并萃取液，減壓濃縮至干，加醋酸乙酯適量使溶解，溶液通過預(yù)先處理好的硅膠柱(層析硅膠200 300目，6倍目標(biāo)樣品質(zhì)量)，分別用醋酸乙酯 (4倍層析硅膠體積)、醋酸乙酯-甲醇(4倍層析硅膠體積)、甲醇(4倍層析硅膠體積)洗脫， 收集甲醇洗脫液減壓濃縮至干，得白色粉末，在甲醇中重晶2次，即得。下列實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明咖啡酰酒石酸在抗菌、抗病毒方面的藥理作用。1抑菌效果試驗(yàn) 1. 1方法及結(jié)果
1. 1. 1方法精密稱取咖啡酰酒石酸適量，加注射用水分別制成0. 5μ g/ml、l. 0μ g/ml, 5. 0 μ g/ml, 20 μ g/ml, 35 μ g/ml 5 個(gè)濃度，121 °C，20 min 滅菌，放入直徑 0. 5cm 滅菌
濾紙片浸潤后備用。用劃線法將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、副傷寒桿菌的菌株接種在制作好的培養(yǎng)基中，置37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，取出后放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。分別取上述菌株的新鮮培養(yǎng)物，在無菌操作條件下，用涂布棒均勻涂抹在瓊脂培養(yǎng)基上。再用無菌鑷將在各不同濃度藥液中浸潤的紙片均勻間隔貼于各瓊脂培養(yǎng)基表面，輕壓紙片使接觸良好，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中(各樣品重復(fù)3次)。24h后取出，用卡尺準(zhǔn)確測量各培養(yǎng)皿中濾紙片有效抑菌圈的直徑。1.1. 2 結(jié)果見表 1。
表1 咖啡酰酒石酸抑菌效果試驗(yàn)
菌株濃度(μ g/ml)抑菌圈(cm)
金葡菌 SA0. 50. 75 0. 75 0. 76
1 0. 81 0.82 0.82 50. 96 0.98 0.97
201.09 1.08 1.08
351. 14 1. 12 1. 12
大腸桿菌 EC0. 50. 76 0. 76 0. 76
1 0.80 0.81 0.80 50.94 0.94 0.94
201.06 1.07 1.08
351.09 1.10 1.10
綠膿桿菌 BA0. 50. 73 0. 73 0. 72
10.84 0.85 0.83
50.98 0.97 0.97
201.06 1.06 1.05
351.08 1.08 1.08
副傷寒桿菌 BP 0. 50.81 0.81 0.80
1 0. 86 0.86 0.88 51. 00 0.99 0.97
201. 05 1.07 1.05
351. 08 1.08 1.09
1.2結(jié)論從表1可以看出，咖啡酰酒石酸對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、副傷寒桿菌均有較好的抑菌作用。隨著濃度的增高，抑菌效果也隨之增高。2咖啡酰酒石酸對豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus, PPV)的作用 2. 1方法
2. 1. 1 咖啡酰酒石酸對H(-15細(xì)胞的安全濃度測定先將咖啡酰酒石酸稀釋成適宜濃度，然后取500 μ 1咖啡酰酒石酸稀釋液用細(xì)胞維持液倍比稀釋后，加到長成單層的 ΡΚ-15細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0. Iml /孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對照，置5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)96h，每天觀察CPE情況，測得咖啡酰酒石酸對冊_15細(xì)胞的最大安全濃度為45yg/ml。2. 1. 2病毒毒力測定(TCID5tl)按常規(guī)方法，將細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞數(shù)調(diào)整至IXlO6個(gè)/ml，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0. Iml/孔，CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。待細(xì)胞長成單層后，接種稀釋度分別為10—1 10—11的病毒液，0. Iml/孔，每個(gè)稀釋度接種4孔，5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)96h，每天觀察CPE情況。按Reed-Muench公式計(jì)算TCID5tl，測得PPV TCID50 為 l(T6/ml。2. 1. 3 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞病變(CPE) H(-15傳代細(xì)胞加入96孔板，24 3 后可長成致密的單層，正常細(xì)胞呈三角形、多角形、圓形等多種形態(tài)，細(xì)胞輪廓清晰。接種PPV 96 120h后，細(xì)胞多角形輪廓逐漸失去棱角，脫落、變圓、團(tuán)縮，聚集成堆。
2. 2. 1咖啡酰酒石酸對PPV的阻斷作用在安全濃度的基礎(chǔ)上將咖啡酰酒石酸分別倍比稀釋成9個(gè)稀釋度，加到長至單層的Η -15細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板
上，0.1ml/孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔。37°C作用4h，棄去藥液，每孔加入 IOOTCID5ci病毒液0. Iml,另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照，5%0)2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒對照組的細(xì)胞病變達(dá)到75以上時(shí)，記錄各組CPE情況。觀察細(xì)胞生長情況， 其結(jié)果見表2。表2咖啡酰酒石酸對PPV的阻斷作用
藥物濃度(yg/ml) 45 22. 5 11. 3 5.7 2.8 1.4 0. 7 0. 35 0. 18
病毒對照空白對照
孑Li~-----
++ +++ +++ +++ -
孑L 2------
+ +++ +++ +++ -
孑L 3------++
+++ +++ +++ -
孔 4-------++
+++ +++ +++ -
試驗(yàn)結(jié)果表明，咖啡酰酒石酸在體外對PPV的阻斷作用比較明顯，咖啡酰酒石酸的最小阻斷濃度為1. 4 μ g/ml，可見咖啡酰酒石酸與H(-15細(xì)胞作用后，再接種PPV，與病毒和細(xì)胞對照組相比，咖啡酰酒石酸濃度為1. 4 45 μ g/ml時(shí)均能影響PPV對細(xì)胞的致病變作用。2.2.2咖啡酰酒石酸對PPV的抑制作用測定將 IOOTCID50病毒液接種至長成單層H(-15的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0. Iml/孔，5% CO2培養(yǎng)箱 37°C培養(yǎng)4h，再加入倍比稀釋的咖啡酰酒石酸，0.1ml /孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒對組的細(xì)胞病變達(dá)到 75%時(shí)，記錄各組CPE情況，記錄方法同2. 2. 1。觀察細(xì)胞生長情況，其結(jié)果見表3。
表3咖啡酰酒石酸對PPV的抑制作用
藥物濃度(μ g/ml) 45 22. 5 11. 3 5.7 2.8 1.4 0. 7 0. 35 0. 18
病毒對照空白對照
權(quán)利要求
1.一種咖啡酰酒石酸，其特征是由抱莖苦荬菜提取分離制備成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的咖啡酰酒石酸的制備方法，包括下述工藝步驟取抱莖苦荬菜，水煎煮提取二次，第一次加水8倍量，提取1-2小時(shí)，第二次加水6倍量提取1小時(shí)，合并濾液，濃縮至相對密度在60°C溫度下為1. 10 1. 20，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為 3-4，再加乙醇至含醇60—70%，靜置12小時(shí)，離心過濾，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3000—4000轉(zhuǎn)/分， 分取上清液，減壓回收乙醇至濃縮液無醇味，過濾；濾液調(diào)節(jié)PH值為4-5，通過預(yù)先處理好的AB8型大孔樹脂柱純化，用水洗脫，每一體積樹脂上6體積樣品；吸附流速為4體積/小時(shí)；洗脫劑量為4體積樹脂，收集洗脫液，洗脫液濃縮至相對密度在60°C溫度下為1. 10 1. 20，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3-4，用正丁醇萃取4-6次，每次用量為十分之一目標(biāo)溶液體積，棄去正丁醇萃取液，再用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為1-2，再用正丁醇萃取4-6次，每次用量為十分之一目標(biāo)溶液體積，合并萃取液，用1%碳酸氫鈉溶液萃取4 6次，每次用量為十分之一目標(biāo)溶液體積，合并萃取液，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值為1-2，用醋酸乙酯萃取8—10次，每次用量為十分之一目標(biāo)溶液體積，合并萃取液，減壓濃縮至干，加醋酸乙酯適量使溶解，溶液通過預(yù)先處理好的硅膠柱，層析硅膠200 300目，6倍目標(biāo)樣品質(zhì)量，分別用4倍層析硅膠體積的醋酸乙酯、4倍層析硅膠體積的醋酸乙酯-甲醇、4倍層析硅膠體積的甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液減壓濃縮至干，得白色粉末，在甲醇中重晶2次，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種咖啡酰酒石酸，其特征在于制得的咖啡酰酒石酸能制備成注射液、粉針劑、片劑、膠囊劑和顆粒劑以及緩控釋劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種咖啡酰酒石酸，其特征在于用它測定抱莖苦荬菜的方法為色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0. 4%磷酸溶液，乙腈與0. 4%磷酸溶液配比為10 90,為流動(dòng)相；檢測波長為；理論板數(shù)以咖啡酰酒石酸峰記算應(yīng)不低于3000 ；對照品溶液的制備精密稱取咖啡酰酒石酸對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. Img 的溶液，搖勻，即得；供試品溶液制備取本品粉末過40目篩，精密稱定0.5g，置50ml聚塞錐形瓶中，精密加入5% 10%的甲酸甲醇溶液20ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘 1小時(shí)，再稱定重量，用5% 10%的甲酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 20μ 1，注入液相色譜儀，測定， 即得。
全文摘要
一種咖啡酰酒石酸，其特征是由抱莖苦荬菜提取分離制備成本發(fā)明公開了從抱莖苦荬中提取咖啡酰酒石酸的方法，提取的咖啡酰酒石酸能作為主要活性成制備抗菌、抗病毒藥物；用于抱莖苦荬菜及其制劑的質(zhì)量控制、咖啡酰酒石酸制劑的質(zhì)量控制。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102531900SQ20101059552
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者李志強(qiáng), 王學(xué)東, 王淞林, 生可心, 馬占芝 申請人:沈陽雙鼎制藥有限公司