專利名稱：Cd133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞的制法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本 發(fā)明涉及CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用、以及包括該樹突狀細胞的疫苗。特別地，本發(fā)明涉及CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞及其制備方法、該CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用、以及包括該CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的疫苗。
背景技術(shù)：
目前腦膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療和化療。但現(xiàn)有的腦膠質(zhì)瘤治療方法不能根治腦膠質(zhì)瘤。主要原因是構(gòu)成腦膠質(zhì)瘤的細胞中含腦膠質(zhì)瘤干細胞，其具有細胞的生物學(xué)特性，即自我更新、多潛能分化、高耐藥性的(例如對化療藥物的高耐藥性的及對放射治療的高耐輻射性)及極少數(shù)的腦膠質(zhì)瘤干細胞還驅(qū)動腦膠質(zhì)瘤的形成。因此腦膠質(zhì)瘤干細胞是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展(腦膠質(zhì)瘤的生長、腦膠質(zhì)瘤產(chǎn)生耐藥性的、腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)和腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移等)的真正元兇?，F(xiàn)有技術(shù)已嘗試使用樹突狀細胞免疫治療方法來治療癌癥，即從患者腦膠質(zhì)瘤中將腦膠質(zhì)瘤細胞分離出來，通過裂解該腦膠質(zhì)瘤細胞得到抗原，并將該抗原負載到患者的樹突狀細胞上。如此得到的靶向腦膠質(zhì)瘤細胞的樹突狀細胞，可以用于治療癌癥。例如 CN1705489A中公開了將腫瘤細胞制備得到的抗原負載到樹突狀細胞上，并用所得樹突狀細胞治療癌癥的方法?，F(xiàn)有技術(shù)僅公開了如何得到相關(guān)腦膠質(zhì)瘤干細胞，但并未教導(dǎo)對獲取的腦膠質(zhì)瘤干細胞進行處理。并且，現(xiàn)有技術(shù)的上述方法雖然以腦膠質(zhì)瘤細胞為靶標，但是該方法仍然存在腦膠質(zhì)瘤在放療和化療后耐藥性、復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高的問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有以腦膠質(zhì)瘤細胞為靶標的癌癥免疫治療方法仍然存在腦膠質(zhì)瘤在放療和化療后耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題，本發(fā)明的目的是提供一種CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞及其制備方法、該CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用、制備該CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的試劑盒，以及包括該CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的疫苗。多數(shù)認為經(jīng)與大劑量化療藥物接觸后，腦膠質(zhì)瘤細胞會被全部殺死，但是后來發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)經(jīng)與大劑量化療藥物接觸后，腦膠質(zhì)瘤細胞不但不會被完全殺死，而且還存在少量的腦膠質(zhì)瘤干細胞，起著對腦膠質(zhì)瘤的耐藥性、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明提供了一種CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的制備方法， 該方法包括通過裂解CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞得到腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物，將樹突狀細胞與CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物接觸得到負載腦膠質(zhì)瘤抗原的抗癌樹突狀細胞，其中，所述CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞通過以下方法制備，該方法包括 所述分選方法為在分離分選中使用CD133單克隆抗體偶聯(lián)的免疫磁珠或通過 CD133流式抗體進行流式細胞儀的分選技術(shù)，在組織直接來源和培養(yǎng)擴增后的腦膠質(zhì)瘤干細胞進行分離分選得到的腦膠質(zhì)瘤干細胞。所述腦膠質(zhì)瘤干細胞經(jīng)過熱休克和反復(fù)凍融得到腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物；將所述的腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物與樹突狀細胞接觸，制備得到CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞。本發(fā)明還提供了一種CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，其特征在于，所述樹突狀細胞為本發(fā)明所述的CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞疫苗在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。由于本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞經(jīng)過分選，由此得到的腦膠質(zhì)瘤干細胞更具有特異的靶向性，因此，由本發(fā)明提供的CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的藥物， 能夠在體內(nèi)和體外殺死引起腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的腦膠質(zhì)瘤干細胞，從而為腦膠質(zhì)瘤的根治提供了可能。


圖1為制備例1和2的腦膠質(zhì)瘤干細胞通過流式細胞術(shù)檢測的細胞流式圖；圖2CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞，流式細胞儀檢測負載DC表型變化情況。圖3顯示了由所示經(jīng)分選后的制備例1和未分選的制備例1所得兩種抗原組合物分別負載樹突狀細胞，得到兩種細胞毒性τ淋巴細胞(CTL)，由該兩種CTL細胞分別對化療藥物分選的以及未分選的腦膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生的應(yīng)答結(jié)果對比圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種⑶133+腦膠質(zhì)瘤干細胞的制備方法，其中，該方法包括對腦膠質(zhì)瘤干細胞進行分離分選的步驟，所述分離分選通過使腦膠質(zhì)瘤干細胞通過分選完成，所述分選方法選自免疫磁珠法、流式細胞術(shù)、親和板結(jié)合分離法和免疫溶解法中。優(yōu)選地，所述分離分選通過使腦膠質(zhì)瘤干細胞通過分選完成，所述分選方法選自免疫磁珠法和流式細胞術(shù)中。本發(fā)明提供的⑶133+腦膠質(zhì)瘤干細胞的制備方法可以在分離分選中使用⑶133 單克隆抗體偶聯(lián)的免疫磁珠或通過CD133流式抗體進行流式細胞儀的分選技術(shù)，在組織直接來源和培養(yǎng)擴增后的腦膠質(zhì)瘤干細胞進行分離分選得到的腦膠質(zhì)瘤干細胞。本發(fā)明適用于所有能夠從中分離出腦膠質(zhì)瘤干細胞的各種腦膠質(zhì)瘤。例如，所述腦膠質(zhì)瘤可以選自由星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、轉(zhuǎn)移性腦膠質(zhì)瘤和復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤所組成的組中。其中，所述轉(zhuǎn)移瘤性癌可以選自移瘤性腦膠質(zhì)瘤和復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤所組成的組中。所 述方法還包括從離體腦膠質(zhì)瘤組織和/或腦膠質(zhì)瘤干細胞系中分離腦膠質(zhì)瘤干細胞。手術(shù)從患者體內(nèi)取出的腦膠質(zhì)瘤組織，屬于廢棄的離體腦膠質(zhì)瘤組織。本發(fā)明可以適用常規(guī)的方法得到腦膠質(zhì)瘤干細胞，并從中分離出腦膠質(zhì)瘤干細胞。此外，由現(xiàn)有商業(yè)上能夠買到的細胞系培養(yǎng)物也能從中得到相應(yīng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞，即可以從美國典型物保藏中心(ATCC)買到、并且能夠從中分離出相應(yīng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞的細胞株系。腦膠質(zhì)瘤干細胞通常借用正常細胞標志和/或腦膠質(zhì)瘤干細胞標志進行檢測。例如NS可確定細胞分化程度，是細胞標志的重要核蛋白。此外，腦膠質(zhì)瘤干細胞常表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定性，經(jīng)化療藥物后，盡管可消滅絕大多數(shù)腦膠質(zhì)瘤細胞，使瘤體變小甚至消失， 但是殘留的極少數(shù)腦膠質(zhì)瘤干細胞可能已被賦予細胞樣的生物學(xué)特性，易發(fā)生惡性突變， 產(chǎn)生藥物抵抗和放射抵抗。本發(fā)明還提供了一種腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物的制備方法，該方法包括用生理鹽水洗滌并重懸腦膠質(zhì)瘤干細胞，然后裂解腦膠質(zhì)瘤干細胞的步驟，其中，所述腦膠質(zhì)瘤干細胞本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞。所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決定。將本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物在注射給患者時殘留的培養(yǎng)基組分不會引起患者不適即可。裂解本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的各種裂解方法實現(xiàn)。出于不在裂解腦膠質(zhì)瘤干細胞后增加新的物質(zhì)的考慮，優(yōu)選所述裂解腦膠質(zhì)瘤干細胞的步驟包括熱休克和/或反復(fù)凍融；所述熱休克裂解的條件包括在37 50°C下保持lh-6h，優(yōu)選包括在40 45°C下保持lh-4h ；所述反復(fù)凍融的次數(shù)為3-5次，每兩次的間隔時間是 10min-2h，優(yōu)選為20min-lh，所述冷凍的溫度范圍是零下120°C -零下196°C (可以使用液氮、干冰等來實現(xiàn))，優(yōu)選零下120°C -零下196°C，所述融化的溫度范圍是10°C _37°C，優(yōu)選為20°C-37°C。由于經(jīng)熱休克后，本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞會產(chǎn)生熱休克蛋白，裂解后仍然存在所述熱休克蛋白。熱休克蛋白的存在有助于負載后的樹突狀細胞免疫應(yīng)答。因此，更優(yōu)選所述裂解腦膠質(zhì)瘤干細胞的步驟包括熱休克和反復(fù)凍融；所述熱休克裂解的條件包括在40-45°C下保持lh-3h ；所述反復(fù)凍融的次數(shù)為3-5次兩次的間隔時間是ZOmin-IhJy^S 冷凍的溫度范圍是零下196°C，所述融化的溫度范圍是25°C。裂解完成后，通常通過離心和過濾的步驟除去裂解液中過大的細胞碎片，例如，通過600rpm離心Imin除去，然后上清用0. 45 μ m濾膜過濾。所述組合物的基本成分包括生理鹽水。裂解得到的本發(fā)明的抗原組合物可以在-80°C中保存。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。其中，所述腦膠質(zhì)瘤干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何能夠用于培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤干細胞的培養(yǎng)基，例如DMEM/F12等。所述腦膠質(zhì)瘤干細胞培養(yǎng)體系包括腦膠質(zhì)瘤干細胞和 3mL-50mL的腦膠質(zhì)瘤干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述組合物來自細胞濃度為1 X IO5到1 X IO8細胞/mL、優(yōu)選為1 X IO6到5 X IO7細胞/mL的本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞。細胞濃度過大可能會引起患者過度的免疫應(yīng)答反應(yīng)， 反之細胞濃度過小，則不足以引起患者的免疫應(yīng)答反應(yīng)。所述組合物還包括人血白蛋白； 其中，以所述組合物為基準，所述人血白蛋白的含量為1-5重量體積％，優(yōu)選為2-3重量體
本發(fā)明還提供了一種抗癌樹突狀細胞的制備方法，該方法包括將正常樹突狀細胞與腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物接觸，得到負載腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原的樹突狀細胞，其中， 所述腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物為本發(fā)明所述的腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物。優(yōu)選所述正常樹突狀細胞與制備腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物的腦膠質(zhì)瘤干細胞來自同一個體。這樣可以最大限度地避免由于免疫排斥反應(yīng)而引起的副作用。

其中在裂解腦膠質(zhì)瘤干細胞制備被負載的所述抗原組合物前，所述腦膠質(zhì)瘤干細胞經(jīng)用于培養(yǎng)樹突狀細胞的培養(yǎng)基洗滌三次。所述樹突狀細胞負載腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原時，正常樹突狀細胞與腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物接觸的時間可以是本領(lǐng)域常規(guī)使用的任意的接觸時間，優(yōu)選是l_24h，更優(yōu)選是2-12小時。本發(fā)明還提供了由上述的方法得到的抗癌樹突狀細胞。本發(fā)明還提供了一種樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，其中，所述樹突狀細胞為本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞。在制備樹突狀細胞疫苗之前，用生理鹽水洗滌并重懸所述抗癌樹突狀細胞。所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決定。將本發(fā)明的樹突狀細胞疫苗在注射給患者時殘留的培養(yǎng)基組分不會引起患者不適即可。所述組合物包括 1 X IO5到5 X IO7個/mL本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞；優(yōu)選為5 X IO5到1 X IO7個/mL。所述組合物還包括人血白蛋白；其中，以所述組合物為基準，所述人血白蛋白的含量為1-5重量體積％，優(yōu)選為2-3重量體積％。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。所述腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物來自細胞濃度為1 X IO5到1 X IO8細胞/mL，優(yōu)選為IXlO6到5X107細胞/mL的本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞。所述細胞濃度過大造成浪費，反之細胞濃度過小，則不足以使樹突狀細胞負載上足夠的抗原。所述樹突狀細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何能夠用于培養(yǎng)樹突狀細胞的培養(yǎng)基，例如RPMI/1640等。所述樹突狀細胞培養(yǎng)體系包括腦膠質(zhì)瘤干細胞和lmL-100mL、優(yōu)選 30-80mL的樹突狀細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，所述巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)在腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，終濃度100IU/mL-2500IU/mL。所述白介素_4在腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，終濃度100IU/mL-1500IU/mL。所述干擾素α 在腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，終濃度100IU/ mL-2000IU/mL。所述腦膠質(zhì)瘤壞死因子α在腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，終濃度0. 5ng/mL-100ng/mL。所述組合物還包括人血白蛋白；其中，以所述組合物為基準，所述人血白蛋白的含量為1-5重量體積％，優(yōu)選為2-3重量體積％。本發(fā)明還提供了一種治療癌癥的方法，其包括給患者施用選自由本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物、本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞以及本發(fā)明的樹突狀細胞疫苗所組成的組中的藥物。優(yōu)選所述施用的方式為注射。具體地，施用腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物的方式選自由腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射和皮內(nèi)注射中的一種或幾種；施用所述樹突狀細胞疫苗的方式為在淋巴結(jié)部位皮下或皮內(nèi)注射。優(yōu)選施用所述樹突狀細胞疫苗的方式為在腹部溝或腋下進行皮下或皮內(nèi)注射。所述腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物優(yōu)選來自細胞濃度為IX IO5到IX IO8細胞/mL 的本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞，其有效量為0. lmL-5mL/個體；所述樹突狀細胞疫苗優(yōu)選包括 1 X IO5到5 X IO7個/mL本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞，其有效量為0. lmL-2mL/個體。更優(yōu)選所述腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物優(yōu)選來自細胞濃度為IXlO5到IX IO8細胞/mL的本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤干細胞，其有效量為0. 2mL-2mL/個體；所述樹突狀細胞疫苗優(yōu)選包括1 X IO5到 5 X IO7個/mL本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞，其有效量為0. 5mL-2mL/個體。以上所述腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物和所述樹突狀細胞疫苗都是一次注射的劑量，一個療程四次注射，間隔一周。兩種組合物一般在注射完第一針后的第三天到第七天起效。所述有效的標準是起免疫促進的細胞因子如白介素2、白介素12、干擾素γ和腦膠質(zhì)瘤壞死因子α等的升高；起免疫抑制的細胞因子如白介素6、白介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β 和表皮細胞生長因子等的降低；以及T淋巴細胞亞群變化，即⑶3、⑶4、⑶8的陽性率的升高或改善，⑶16/56陽性率的升高，以及⑶4⑶25R)xP3三陽性率的降低。一個療程結(jié)束后， 可以間隔三個月后繼續(xù)給藥，可以治療兩個或四個療程；如有必要，間隔時間為六個月或1 年還可繼續(xù)再治療，只要患者一直存活在。其中，所述有效標準還可以分為以下三個等級1.患者血液細胞因子檢測起免疫促進的細胞因子如白介素2、白介素12、干擾素Y和腦膠質(zhì)瘤壞死因子 α等的升高；起免疫抑制的細胞因子如白介素6、白介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β和表皮細胞生長因子等的降低；以及T淋巴細胞亞群變化，S卩⑶3、⑶4、⑶8的陽性率的升高或改善， ⑶16/56陽性率的升高，以及⑶4⑶25R)xP3三陽性率的降低等。2.患者腦膠質(zhì)瘤標志物檢測，如甲胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白等腦膠質(zhì)瘤特異抗原的表達的降低，主要是通過酶免和化學(xué)發(fā)光檢測等。3、影像學(xué)檢測，如CT、核磁共振和B超檢測，能檢測到治療前后腦膠質(zhì)瘤組織縮優(yōu)選所述腦膠質(zhì)瘤干細胞和/或所述樹突狀細胞來自于同一患者，這樣可以最大限度地避免免疫排斥反應(yīng)造成的副作用。此外，本發(fā)明提及的細胞可以是商業(yè)上可供的細胞系。并且現(xiàn)有長期冷凍保藏細胞的技術(shù)已經(jīng)非常成熟，比如在液氮(零下196°C )下凍存細胞，例如臍帶血細胞保藏。本領(lǐng)域技術(shù)人員完成可以利用上述技術(shù)保藏本發(fā)明涉及的腦膠質(zhì)瘤組織、腦膠質(zhì)瘤干細胞和樹突狀細胞，樹突狀細胞可以來源外周血、骨髓和臍帶血等。以下，對本發(fā)明的具體實施例進行說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些示例。實施例1 腦膠質(zhì)瘤組織中的腦膠質(zhì)瘤干細胞的分離和培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤組織來自沈歲男性患者，該患者經(jīng)病理檢查確診為IV級腦膠質(zhì)瘤。與該患者簽署了知情同意書，在進行手術(shù)時采集其腦膠質(zhì)瘤組織。用眼科剪將腦膠質(zhì)瘤組織剪碎成為約Imm3的小塊。所得剪碎的組織小塊用0. 25%胰酶溶液以1克0. 5mL的重量體積比消化5分鐘后，加入是胰酶溶液體積五分之一的小牛血清(美國Hyclone公司)終止， 以IOOOrpm離心收集消化好的組織小塊，傾去胰酶溶液上清，然后用含0. 1% dispase (分散酶，美國西格瑪)(llU/mg)和0. 01% DNAse (DNA酶，上海生工)的HBSS (漢斯緩沖液，上海生工)以1克ImL的重量體積比洗滌三次，所得離心沉淀用胰酶(美國西格瑪)以1 克ImL的體積比在37°C下混勻接觸10分鐘，然后在IOOOrpm下離心5min收集細胞，用以 1克ImL的重量體積比用杜爾貝可改良伊格爾-F12培養(yǎng)基重懸。所得重懸液用40_mm分子篩(美國BD公司)過濾。用所述孔徑的分子篩過濾，截留的是大片細胞碎片和未被消化的細胞團，濾出的是細胞懸液。取1份50 μ U2 X IO6個)上述得到細胞懸液分別添加到有220 μ L PE-CD133 (BD 公司)的離心管中。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的1 X磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的IXPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，CD133+的腦膠質(zhì)瘤干細胞占所得洗滌后的細胞的0.32%， 見附圖1中A的流式柱狀圖。收集剩余的所述細胞懸液后，向其中含有5ng/mL B27、40ng/mL人表皮生長因子 (epidermal growth factor，EGF)、40ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子(bEGF)和 30mg/mL 胰島素的杜爾貝可改良伊格爾 _F12(Dulbecco，s modified Eagle，s medium_F12) (DMEM/ F12)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)使細胞懸液濃度被稀釋為2X105細胞/mL。然后將每5mL 所得稀釋的細胞懸液轉(zhuǎn)移至25cm2滅菌塑料培養(yǎng)瓶中在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。培養(yǎng)所得細胞呈神經(jīng)球狀生長，傾去培養(yǎng)基，然后用5mLHBSS洗滌一次，傾去洗滌液。所述洗滌過程去掉了懸浮的細胞碎片和未貼壁生長的細胞。并添加新鮮的含有8ng/mL B27、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基。當細胞生長達到培養(yǎng)瓶底面的90 %時，用胰酶消化后，用含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和 20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)(1瓶傳幾個瓶，每瓶起始培養(yǎng)的細胞密度為2 X IO5細胞/mL)。按照上述傳代條件再傳4代，得到神經(jīng)球狀的細胞。取1瓶培養(yǎng)到5代的腦膠質(zhì)瘤干細胞，經(jīng)胰酶消化，離心后細胞沉淀用ImLl XPBS 重懸，計數(shù)。取1份50yU2X106個)上述的傳代得到細胞懸液分別添加到有20 μ L PE-⑶133 (BD公司)的離心管中。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的1 XPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用 FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，CD133+的腦膠質(zhì)瘤干細胞占所得洗滌后的細胞的7. 95%，見附圖1中B的流式柱狀圖。實施例2 從腦膠質(zhì)瘤癌細胞系U87-MG中培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞將購自美國ATCC的腫瘤細胞系的腦膠質(zhì)瘤U87-MG細胞，取1份50 μ U2 X IO6個) 細胞懸液分別添加到有20 μ L PE-⑶133 (BD公司)的離心管中。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的IXPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結(jié)果檢出CD133+的腦膠質(zhì)瘤干細胞為0. 27%，見附圖1中C的流式柱狀圖。將上述購自美國ATCC的腦膠質(zhì)瘤U87-MG細胞，用添加了 5ng/mL N2、25ng/mL人表皮生長因子、40ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和30mg/mL胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基在 37°C>5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
培養(yǎng)所得細胞呈神經(jīng)球狀生長，傾去培養(yǎng)基，然后用5mLHBSS洗滌一次，傾去洗滌液。所述洗滌過程去掉了懸浮的細胞碎片和未貼壁生長的細胞。并添加新鮮的含有15ng/ mL N2、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾_F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基。當細胞生長達到培養(yǎng)瓶底面的90%匯合時，用胰酶消化后，用含有15ng/mL N2、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。按照上述傳代條件再傳4代，得到神經(jīng)球狀的細胞。取1瓶培養(yǎng)到5代的腫瘤干細胞，經(jīng)胰酶消化，離心后細胞沉淀用ImLlXPBS 重懸，計數(shù)。取1份50μ U2X IO6個)上述的傳代得到細胞懸液分別添加到有20 μ L PE-⑶133 (BD公司)的離心管中。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的IXPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用 FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，CD133+的腦膠質(zhì)瘤干細胞占所得洗滌后的細胞的3. 97%，見附圖1中D的流式柱狀圖。實施例3 經(jīng)免疫磁珠法分選腦膠質(zhì)瘤干細胞的制備取1-3瓶75cm2塑料培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)有實施例1或2的腦膠質(zhì)瘤干細胞，經(jīng)胰酶消化，離心后細胞沉淀用ImL RPMI 1640培養(yǎng)基重懸計數(shù)，得到5X IO7細胞/mL的細胞懸液。將得到的細胞用緩沖液按80 μ L/107個細胞重懸，加入⑶133微珠20 μ L/107個細胞，混勻，4 8°C孵育15min，緩沖液lmL/ΙΟ7個細胞洗滌細胞，1500r/min離心lOmin，完全去除上清，用500yL緩沖液重懸，所得細胞懸液加入MS分選柱(德國美天旎)中，收集先行流出的未標記細胞組分，并用1500 μ L緩沖液沖洗MS柱，此為⑶133陰性細胞。將分選柱移出磁場，ImL緩沖液快速將分選柱上滯留的細胞洗脫下來，這些細胞是磁性標記的CD133 陽性細胞。實施例4 經(jīng)流式細胞術(shù)分選腦膠質(zhì)瘤干細胞的制備取1-3瓶75cm2塑料培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)有實施例1或2的腦膠質(zhì)瘤干細胞，經(jīng)胰酶消化，離心后細胞沉淀用ImL RPMI 1640培養(yǎng)基重懸計數(shù)，得到5X IO7細胞/mL的細胞懸液。將分選前的標本、對照管、分選后陰性管標本及分選后陽性管標本進行流式細胞儀分析。在上述富集細胞管中加入100 μ L緩沖液，10 μ 1⑶133抗體混勻，4°C黑暗中孵育 IOmin,加入1000 μ L緩沖液1500r/min離心lOmin，完全去除上清液，加入500 μ L緩沖液混勻，送流式細胞分選，設(shè)陰性對照和空白對照。通過流式細胞分選得到CD133陽性的細胞。按照制備例3-4的方法分別制備腦膠質(zhì)瘤干細胞。其中，不同點如表1所示表 權(quán)利要求
1.一種CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的制備方法，該方法包括通過裂解腦膠質(zhì)瘤干細胞得到腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物，將樹突狀細胞與腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物接觸得到負載腦膠質(zhì)瘤抗原的抗癌樹突狀細胞，其特征在于，所述腦膠質(zhì)瘤干細胞通過以下方法制備，該方法包括對腦膠質(zhì)瘤干細胞進行分離分選的步驟，所述分離分選通過使腦膠質(zhì)瘤干細胞通過分選完成，所述分選方法選自免疫磁珠法、 流式細胞術(shù)、親和板結(jié)合分離法和免疫溶解法中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細胞分選方法為免疫磁珠法和流式細胞術(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法包括對腦膠質(zhì)瘤干細胞進行分離分選的步驟，所述分選方法為在分離分選中使用CD133單克隆抗體偶聯(lián)的免疫磁珠或通過CD133流式抗體進行流式細胞儀的分選技術(shù)，在組織直接來源和培養(yǎng)擴增后的腦膠質(zhì)瘤干細胞進行分離分選得到的腦膠質(zhì)瘤干細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述腦膠質(zhì)瘤選自由星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、轉(zhuǎn)移性腦膠質(zhì)瘤和復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤所組成的組中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括從離體腦膠質(zhì)瘤組織和/或腦膠質(zhì)瘤細胞系中分離腦膠質(zhì)瘤干細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解腦膠質(zhì)瘤干細胞的步驟包括熱休克和/或反復(fù)凍融；所述熱休克的條件包括在37 50°C下保持lh-6h ；所述反復(fù)凍融的次數(shù)為3-5次兩次的間隔時間是10min-2h，所述冷凍的溫度范圍是零下120°C -零下 196°C，所述融化的溫度范圍是10°C -37°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解腦膠質(zhì)瘤干細胞的步驟包括熱休克和反復(fù)凍融；所述熱休克的條件包括在40-45°C下保持lh-4h ；所述反復(fù)凍融的次數(shù)為 3-5次兩次的間隔時間是20min-lh，所述冷凍的溫度范圍是零下120°C -零下196°C，所述融化的溫度范圍是20°C -37°C。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物裂解自細胞濃度為1 X IO5到1 X IO8細胞/mL的腦膠質(zhì)瘤干細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述正常樹突狀細胞與制備腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物的腦膠質(zhì)瘤干細胞來自同一個體，或腦膠質(zhì)瘤干細胞來自腦膠質(zhì)瘤干細胞系培養(yǎng)獲得的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述正常樹突狀細胞與腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原組合物接觸的時間是l-12h。
11.由權(quán)利要求1-10中任意一項所述的方法得到的抗癌樹突狀細胞。
12.一種樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，其特征在于，所述樹突狀細胞為權(quán)利要求14所述的抗癌樹突狀細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的疫苗，其中，所述疫苗包括1X IO5到5 X IO7個/mL所述抗癌樹突狀細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的疫苗，其特征在于，所述組合物還包括人血白蛋白；其中， 以所述組合物為基準，所述人血白蛋白的含量為1-5重量體積％。
15.權(quán)利要求14所述的抗癌樹突狀細胞在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的制備方法、該CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞在制備抗腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用，以及包括該CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的疫苗。由本發(fā)明提供的CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞以及包括該CD133+腦膠質(zhì)瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的免疫組合物制備的藥物，能夠在體內(nèi)和體外殺死引起腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的腦膠質(zhì)瘤干細胞，從而為克服腦膠質(zhì)瘤耐藥性、根治腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了可能。
文檔編號A61P35/00GK102154208SQ20101060890
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者沈達青 申請人:沈達青