專利名稱：夏枯草及其提取物在制備抑制血管生成產(chǎn)品中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及夏枯草及其提取物抑制血管生長(血管新生)的新用途，特別涉及夏枯草及其提取物在制備抑制血管生成產(chǎn)品中的應用。
背景技術(shù)：
血管新生是指由原已存在的毛細血管通過出芽形成新的毛細血管的過程。它不僅是機體正常發(fā)育、生殖和組織修復等生理過程的基礎，也在多種病理過程中起重要作用。若血管新生過度，與類風濕、腫瘤、視網(wǎng)膜眼底病和牛皮癬等疾病有關(guān)，血管新生抑制劑潛在及廣泛的用途使其成為當前藥物研發(fā)熱點。(Judah Folkman. Angiogenesis :an organizing principle for drug discovery ？ Drug Discovery,2007,6 (4) :273-286.)
夏枯草(Prunella vulgaris Linn.)為常用傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒味苦，具有清火明目、散結(jié)消腫的功效，歷代醫(yī)家多用于治療瘟病、乳癰、目痛、黃疸、淋病和高血壓等病癥?，F(xiàn)代藥理學研究證明夏枯草具有廣泛的藥理作用，如具有降壓、降糖、抗菌、 抗炎、抗過敏、抗氧化、清除自由基及抗病毒等作用，國外夏枯草作為一種自我康復藥物，在緩解咽喉疼痛、發(fā)熱及加速傷口愈合等方面得到廣泛的應用并受到重視。
篩選血管生成活性物質(zhì)可利用內(nèi)環(huán)境與人體相似，且血管新生過程易于觀察的動物模型來檢測，其中雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoie membrane, CAM)是研究血管形成與抗血管形成的理想體內(nèi)模型。血管新生主要發(fā)生在胚胎發(fā)育過程中，雞胚孵育第3-5 天、7-10天血管生長最活躍，12天以后CAM血管逐漸萎縮，故選取8-12天為藥物刺激最佳時間，利用立體顯微鏡，觀察并計算血管的數(shù)量。該技術(shù)不僅可用于定性、定量研究體內(nèi)血管新生，還具有實驗材料易得、操作簡便、實驗周期短、不需要特殊設備、結(jié)果易于觀察和適合大樣本重復等優(yōu)點而得到廣泛應用。最早將CAM作為腫瘤轉(zhuǎn)移和侵蝕模型開展研究也正是基于其豐富和直觀的血管生長特性(Leighton，J. Invasion and metastasis of heterologous tumors in the chick embryo. In "Progress. Experimental Tumor Research"1964 ；14 :98.)。目前CAM模型用于評價新藥的作用已經(jīng)得到了美國食品和藥品管理局的認可(Vargas A, Zeisser-Labouebe Μ, Lange N, et al. The chick embryo and its chorioallantoic membrane(CAM)for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Adv Drug Deliv Rev,2007,59(11) :1162-1176.)。
基于CAM模型評價中藥對血管生成活性的影響和作用，不但能進一步挖掘傳統(tǒng)中藥的價值，還能對血管生成性疾病的治療，延長人類壽命作出貢獻。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供夏枯草及其提取物的新用途。表現(xiàn)在制備抑制血管生成的藥物及保健品中單獨使用或與其他藥物和有效成分配伍使用。
上述夏枯草提取物可為夏枯草水或醇提取物。夏枯草水提取物也可按照常規(guī)方法進行制備，如可用下述方法得到選取藥材夏枯草(唇形科植物夏枯草I^imella vulgarisLinn.的花、果穗及全草)加入5 10倍純水，加熱，煮沸后保持微沸狀態(tài)繼續(xù)加熱0. 5 1小時，然后過濾收集濾液1 ；接著在濾渣中再加入5 10倍純水，加熱，煮沸后保持微沸狀態(tài)繼續(xù)加熱0. 5 1小時，然后過濾收集濾液2 ；將濾液1與濾液2混勻，干燥得到夏枯草水提取物。
夏枯草醇提取物可按照常規(guī)方法進行制備，如可用下述方法得到粉碎的夏枯草和無水乙醇或50%乙醇以1 10 (體積分數(shù))混合，沸水回流證，收集提取液，粗濾后殘渣再次沸水回流池，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到夏枯草醇提濃縮液。
用夏枯草或提取物制備的藥物可以制成片劑、膠囊、口服液、粉劑、顆粒劑、膏劑、 霜劑、注射劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
用夏枯草或提取物制備的保健品可以制成片劑、膠囊、口服液、粉劑、顆粒劑、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明采用CAM這一模式生物，以整體動物實驗作為檢測手段，采用血清藥理學方法觀察夏枯草對血管生成的影響，發(fā)現(xiàn)夏枯草可顯著抑制血管生成，藥效作用比西藥反應停更明顯，CAM視野下無密集血管生成，未能見到清晰的血管脈絡狀網(wǎng)絡，為該藥的作用機制研究提供了新的內(nèi)容和方向，也為中藥開發(fā)利用研究提供了新的思路和手段。


圖1為夏枯草提取物以及反應停抑制CAM血管生成圖。 圖2.為夏枯草提取物以及反應停對血管數(shù)量影響的結(jié)果
實驗研究、夏枯草抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成的試驗
1 材料
1.1 雞胚
購于種雞或養(yǎng)雞場。
1.2藥物和試劑
夏枯草水提取物按照下述方法進行制備選取藥材夏枯草(唇形科植物夏枯草 Prunella vulgaris Linn.花、果穗及全草)水煎兩次，煎液過濾，混合后加熱濃縮至Ig/ mL，此為夏枯草水提取物。
夏枯草醇提取物按照下述方法進行制備粉碎的夏枯草和無水乙醇或50%乙醇以1 10 (體積分數(shù))混合，沸水回流證，收集提取液，粗濾后殘渣再次沸水回流池，合并 2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到夏枯草醇提濃縮液lg/mL。
反應停(化學名α-苯酞茂二酰亞胺，通用名沙利度胺，酞胺哌啶酮。Sigma公司)。
混合纖維素酯微孔濾膜(0.45 μ m，上海興亞凈化材料廠)；定性濾紙(杭州富陽特種紙廠)；其余試劑均為國產(chǎn)。
1. 3 儀器
MIR-553恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，S6E體視顯微鏡(德國Leica公司)， XTS30-D體視顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)，臺式離心機(上海安亭公司)、MLS-3780 高壓滅菌鍋(日本SANYO公司)等。
2 方法
2. 1試驗分組及含藥血清制備
雄性昆明種小鼠隨機分成夏枯草水提取物組、夏枯草無水乙醇提取物組、夏枯草 50%乙醇提取物組、西藥反應停陽性對照組和生理鹽水對照組，兩個藥物組常規(guī)按體重灌胃給與相當于人臨床用藥劑量5倍的藥物，生理鹽水組采用等劑量的生理鹽水，一日1次， 于第5d最后1次灌服藥物后lh，摘眼球取血，離心制備血清約0. 5mL，置于無菌試管中， 56°C滅活30min，密封_20°C冰箱中凍存。
2. 2雞胚培養(yǎng)
種蛋以1%。新潔爾滅水溶液浸洗揩干，氣室朝上，置于(37士0. 5) °C恒溫箱中孵化培養(yǎng)，內(nèi)置濕盤保持相對濕度在65%，每天翻蛋2次，3d后于透射燈下觀察種蛋生長情況， 剔除未受精卵。
2. 3雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗
取7d齡雞胚，隨機分組，碘伏消毒蛋氣室表面，用砂輪和解剖針啟開約lcm2的窗口，暴露CAM，無菌膠帶封口，繼續(xù)孵化。隔日，取直徑約0. 5cm,經(jīng)預先高壓滅菌的混合纖維素微孔濾膜片作為載體置于CAM上，并分別滴加不同組別的含藥血清20 μ L于載體上，密封后繼續(xù)孵育72h，加1 1甲醇和丙酮混合液室溫固定15min，以載體為中心剪下CAM約 3cm2，展膜于濾紙上，涼干。
2. 4結(jié)果觀察
以濾紙為背景，體視顯微鏡下查看載體周圍的血管數(shù)，比較各組血管生成情況。
2. 5統(tǒng)計學分析
采用ANOVA方差檢驗分析壽命實驗結(jié)果，定量資料以又士S表示；采用兩樣本t檢驗方法比較組間血管數(shù)量差異。
3 結(jié)果
3. ICAM血管生成表現(xiàn)形式
圖1.藥物影響血管生成的鏡檢結(jié)果
由圖1可見，CAM自然狀態(tài)的血管生成呈葉脈狀，給藥組在載體周圍呈現(xiàn)不同程度放射狀生長的血管網(wǎng)，其中西藥反應停組、夏枯草醇提取物組和夏枯草50%醇提取物組視野中的血管數(shù)量少于生理鹽水對照組，但仍可見到清晰的血管網(wǎng)絡，而夏枯草水提取物組不僅無密集血管生成，視野下未能見到清晰的血管脈絡狀網(wǎng)絡。
3. 2血管計數(shù)
表1.各組血管生長數(shù)量(X士 SD，η = 9)
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組別血管數(shù)量
生理鹽水組
反應停組
夏枯草水提取物組
夏枯草醇提取物組
夏枯草50 %醇提取物組114. 33 士 17. 5 71. 89 士 11. 72= 25. 00 士 7. 58*# 75. 11 士 8. 81* 77. 89 士 8. 10*
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與生理鹽水組相比P < 0. 01，#與反應停組相比P < 0. 01
上述實驗結(jié)果從形態(tài)和數(shù)量兩方面定性、定量地表明夏枯草提取物具有顯著的抑制血管生長作用，其中夏枯草水提取物抑制效果比西藥反應停更顯著，醇提取物的抑制作用與西藥反應停相當。
具體實施方式
下述實施例中所述實驗方法適用于藥品和保健品制備，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1、夏枯草提取物的片劑制備
夏枯草加入5 10倍純水，分2次煎煮，合并藥液濃縮至藥液比1 1，加入過 100目篩的輔料混勻，選用乳糖，淀粉，糊精為稀釋劑，CMS-Na為崩解劑，乙醇為潤濕劑，外加的硬脂酸鎂為潤滑劑，制備合適軟材，經(jīng)16目篩網(wǎng)制粒，80°C干燥，整粒，上機壓片， 包薄膜衣，即得成品，平均片重約為每片0. ^g，劑量為每片0. 125g。
實施例2、夏枯草提取物的膠囊制備
夏枯草水提物或醇提物，加入過100目篩的輔料混勻，選用乳糖，淀粉，糊精為稀釋劑，乙醇為潤濕劑，擠壓過40目篩制粒，于60°C干燥，過篩整粒，灌注1號膠囊，制得成品， 劑量為每膠囊0. 125g，每膠囊重約0. 3g。
實施例3、夏枯草提取物的口服液制備
夏枯草加入5 10倍純水，分2次煎煮，合并2次煎煮液，濃縮成藥液比1 1，經(jīng)澄清劑處理工藝去除鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、蠟質(zhì)等膠體不穩(wěn)定成分，沉淀后取上清液，加純化水至規(guī)定體積煮沸，冷卻后分裝成IOml/支，100°C滅菌30分鐘即得成品，每支劑量為0. 125g。
本發(fā)明中，夏枯草提取物對血管生長具有極顯著的抑制作用，提示該藥物及其提取物在血管生成性疾病方面的潛在價值。
權(quán)利要求
1.夏枯草或夏枯草提取物在制備抑制血管生成產(chǎn)品中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物或保健品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于所述夏枯草提取物為夏枯草水或醇提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了夏枯草或其提取物的新用途。夏枯草或其提取物的新用途為抑制血管生成，在類風濕性疾病、腫瘤、視網(wǎng)膜眼底病和牛皮癬等血管異常增生性疾病治療中具有廣闊的應用前景。本發(fā)明不僅為該藥的開發(fā)應用研究提供了新的內(nèi)容和方向，也為中藥治療血管異常增生性疾病研究提供了新的手段。
文檔編號A61P35/00GK102526182SQ20101061067
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者宋軍, 王閩慧 申請人:宋軍, 王閩慧