專利名稱：人miR-1233反義核酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學材料技術領域和藥物領域。具體地，本發(fā)明涉及一種 microRNAs(miRNA)的用途，尤其是涉及人microRNA_1233 (人miR-1233)反義核酸及其應 用。該反義核酸可與人miR-1233互補，從而抑制人miR-1233的表達而起到抗腫瘤的作用。 本發(fā)明還涉及含有該miRNA反義核酸的藥物組合物。
背景技術：
miRNAs是小的非編碼RNA，長度為20-25bp，通常是由RNA聚合酶II(Pol II) 轉錄的，一般最初產物為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的 pri-miRNA。這些pri_miRNA在RNase III Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成 70個核苷酸組成的pre-miRNA前體產物。RAN-GTP和exportin 5將這種前體分子輸送到細 胞質中。隨后，另一個RNase III Dicer將其剪切產生約為22個核苷酸長度的雙鏈。這種 雙鏈很快被引導進入(miRISC)復合體中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的單鏈miRNA 保留在這一復合物中。成熟的miRNA結合到與其互補的mRNA的位點通過兩種依賴于序列 互補性的機制負調控基因表達，與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質翻譯水平上抑制其 表達。然而，最近也有證據表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種機制 的miRNA結合位點通常在mRNA的3’端非翻譯區(qū)。如果miRNA與靶位點完全互補(或者幾 乎完全互補)，那么這些miRNA的結合往往引起靶分子mRNA的降解。miRNAs在物種進化中 相當保守，在動物，植物和真菌等中發(fā)現的miRNAs表達均有嚴格的組織特異性和時序性。目前，只有很小一部分miRNAs的生物學功能得到闡明。這些miRNAs調節(jié)細胞生 長和組織分化，與生物生長發(fā)育有關。一系列的研究表明miRNAs在細胞生長和凋亡，血細 胞分化，同源異形盒基因調節(jié)，神經元的極性，胰島素分泌，大腦形態(tài)形成，心臟發(fā)生，胚胎 后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。例如，miR-273參與線蟲的神經系統(tǒng)發(fā)育過程；miR-430 參與斑馬魚的大腦發(fā)育；miR-181控制哺乳動物造血細胞分化為B細胞；miR-375調節(jié)哺乳 動物胰島細胞發(fā)育和胰島素分泌；miR-143在脂肪細胞分化起作用；miR-196參與了哺乳動 物四肢形成，miR-1與心臟發(fā)育有關。另有研究人員發(fā)現許多神經系統(tǒng)的miRNAs在大腦皮 層培養(yǎng)中受到時序調節(jié)，表明其可能控制著區(qū)域化的mRNA翻譯。miRNA表達與多種癌癥相關，并且這些基因可能起到腫瘤抑制基因或是癌基因作 用。最先在B細胞慢性淋巴性白血病(CLL)中發(fā)現有miRNA表達水平的改變，隨后陸續(xù)在 各種人類腫瘤中均檢測到miRNA表達水平的變化。研究發(fā)現，miRNAs與腫瘤形成相關，既能 發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用(如miR-15a和miR-16-l)，又能起到癌基因的作用(如miR-155 和miR-17-92簇)。目前認為，在腫瘤細胞中，有些miRNA成熟體或前體表達水平異常，而 表達異常的miRNA通過影響靶mRNA翻譯發(fā)揮作用，參與腫瘤形成過程，并起重要作用。如 Ras原癌基因受let-7家族的調控，BCL2抗凋亡基因受miR-lfe-miR-16-l簇調控，E2F1轉 錄因子受miR-17-92簇調控，BCL6抗凋亡基因受miR-127的調控等。miRNAs的表達下調也 和腫瘤發(fā)生有密切關系，這預示著miRNA具有癌基因的功能。例如，miR-143和miR-145在結腸癌中明顯下調。有趣的是，其發(fā)夾結構的前體分子在腫瘤和正常組織中含量相似，這表 明，miRNAs的表達下調可能是由于其加工過程受到破壞。但是，miR-143和miR-145的腫瘤 抑制基因功能可能不僅僅局限于結腸癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、淋巴癌等細胞系中 其表達量也明顯下調。另一個報道表明，miR-21在膠質母細胞瘤中表達增加。這個基因在 腫瘤組織中的表達量比在正常組織中高5-100倍。miRNAs是天然的反義作用因子，能夠調控與真核生物生存和增殖相關的多種基 因。在腫瘤治療方面，miRNA的應用前景光明。在利用miRNA作為治療靶點方面，已有實驗 數據支持如在吉西他濱(gemcitabine)治療的過程中，出現miRNA表達譜的變化；調控部 分miRNA的表達水平(如使miR-21過表達)，能增進膽管癌細胞對化療藥物的敏感性。通 過引入與具有癌基因特性的miRNA互補的合成的反義寡聚核苷酸——抗miRNA寡聚核苷酸 (AMOs)——可能有效的滅活腫瘤中的miRNAs，延緩其生長。臨床上，可以通過經常的或者持 續(xù)的2’ -0-甲基化或者鎖核酸(LNA)等修飾的反義寡聚核苷酸給藥使miRNA失活。這些 修飾使得寡核苷酸更穩(wěn)定，比其他治療手段毒性更低。使用antagomirs (與膽固醇偶聯的 AMOs)，注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性，因而可能成為一種有希望的治療 藥物。相反的，過表達那些具有腫瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7家族，也可以用于治 療某些特定的腫瘤。反義寡聚核苷酸(Flanagan WM. Antisense comes of age. Cancer & Metastasis Reviews 1998 ;17(幻169-76)是指一段可以與其靶基因的堿基互補的核苷酸。反義寡聚 核苷酸可以抑制相應基因的表達。人microRNA-1233 (has-miR-1233)位于 15 號染色體，前體序列為⑶GA⑶GGGAGGC CAGGGCACGGCAGGGGGAGCUGCAGGGCUAUGGGAGGGGCCCCAGC ⑶ CUGAGCCCUGUCCUCCCGCAG。含有 1 個 成熟 microRNA :hsa_miR-1233 (MIMAT0005588，序列為 UGAGCCCUGUCCUCCCGCAG)。目前還沒 有關于microRNA-1233的功能和表達水平的研究報道。近三十年，盡管臨床上腫瘤的綜合治療已很普遍，但以手術為主，放化療為輔的綜 合治療對腫瘤患者的生存率提高并不明顯，5年總體生存率仍然較低，徘徊在30% 55% 左右，并沒有顯著提高，中晚期患者的5年生存率更低，約為20%。而且這些方法都存在各 自的局限性，特別是對中晚期和復發(fā)患者療效不佳，對伴有遠處轉移者療效更差。因此，尋 找更安全有效的治療途徑是提高腫瘤患者生存率和生存質量所亟待解決的難題。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的主要問題是提供一組新的miR-1233的反義核酸(抑制劑)，用于 高效、低毒或無毒地抑制miR-1233的表達，進而治療由miR-1233過度表達引發(fā)的疾病，包 括腫瘤，尤其為腦膠質瘤。本發(fā)明要解決的另一問題是提供上述反義寡聚核苷酸在制備治療mir-1233過度 表達的相關疾病的藥物中的用途。本發(fā)明要解決的再一問題是提供一種包含上述反義核酸的藥物組合物。本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，設計并合成了一系列專一性針對miR-1233不 同區(qū)域的長度不同的反義核酸，并在培養(yǎng)細胞中驗證具有抑制效果的反義核酸。研究顯示， 這些反義核酸能夠抑制腫瘤細胞的生長和惡性增殖能力。
本發(fā)明設計了一系列可以結合于miR-1233不同位置的反義核酸分子，在培養(yǎng)細 胞U87/MG中，驗證對miR-1233表達特異性抑制的反義核酸對細胞生長能力、增殖能力的影 響，反義核酸分子長度可以包含13 25個核苷酸殘基，均有不同程度的抑制人腫瘤細胞生 長能力、增殖能力的特性，其中最短的反義核酸長度為13個堿基，不同長度的反義核酸均 具有良好的腫瘤細胞生長及增殖抑制活性。因此，上述反義核酸均可用來制備抑制腫瘤細 胞生長能力、增殖能力的制劑，其中優(yōu)選miR-1233高表達的腫瘤細胞。在此基礎上完成了 本發(fā)明。本發(fā)明的第一方面，提供了一種miR-1233的反義寡聚核苷酸，所述反 義寡聚核苷酸抑制人細胞內miR-1233的表達。通常，所述反義寡聚核苷酸與 5’ -UGAGCCCUGUCXUCCCGCAG-3，中連續(xù)13 20個核苷酸序列互補。在本發(fā)明的一個優(yōu)選 實施例中，所述反義寡聚核苷酸的長度為18 20個核苷酸。更佳地，所述反義寡聚核苷酸 的序列是 5，-CUGCGGGAGGACAGGGCUCA-3，。從目前來看，核酸雜交中RNA與miRNA的雜交親和力比DNA與miRNA雜交的親和 力要高，具有很高的藥用價值。但是人工合成DNA的成本遠遠比合成RNA的成本低，也具有 很好的市場潛力。而且也可以采用核糖RNA單體與脫氧核糖DNA單體嵌合相連而成的反義 核酸作為藥物進行開發(fā)。本發(fā)明設計的一系列反義核酸分子，既包括DNA分子，也包括RNA 分子，兩種分子均具有抑制miR-1233表達的活性。本發(fā)明設計的反義核酸，其序列具有特異性生物學活性，其對于某一基因互補的 位點的反義核酸所互補的長度有很大關系，如互補的長些，則生物學活性會更高些，抑制效 果也會更好一些，在增加或減少一個至數個堿基而互補于同一基因位點的反義核酸，同樣 也具有不同程度的生物學活性，也可達到不同程度的抑制腫瘤細胞生長與增殖的作用，本 發(fā)明的研究表明，最短可達13個堿基仍然具有抑制miR-1233表達的作用。反義核酸研究 中，各種化學修飾方法很多，包括選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種 的組合等。應當明確的是，任何能夠增加反義核酸穩(wěn)定性和生物利用度的修飾方法都可以 應用，如膽固醇修飾、PEG修飾、硫代修飾、2’ -甲氧基修飾等。本文中所述反義寡聚核苷酸 經過2’ -甲氧基修飾。本發(fā)明的上述反義核酸具有抑制miR-1233表達的效果。當將上述反義核酸轉染 到miR-1233高表達的細胞株U87中后，能夠有效抑制腫瘤細胞的生長和惡性增殖能力。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明寡聚核苷酸以及藥 學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括但不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇 及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例 如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性且可被人和/或動物所接 受的量。所述“藥學上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒 性、刺激和變態(tài)反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明的反義寡聚核苷酸的用途，用于制備治療以 下疾病的藥物治療人體與miR-1233過表達有關的疾病，包括腫瘤，優(yōu)選為腦膠質瘤。如本文所用，“反義寡聚核苷酸”指反義的核苷酸寡聚物。反義寡聚核苷酸通過堿基互補(A-T，A-U, G-C)配對與雙鏈DNA形成三鏈(反基因)，或與單鏈RNA形成雜交雙鏈 (反義)，從而阻斷基因的復制、轉錄或轉錄后mRNA的加工和翻譯。同時，雙鏈RNA能被細 胞內的核糖核酸酶H(RNaseH)所降解，從而更有效地阻斷靶基因的表達。由于反義核苷酸 只能與反向互補的靶序列結合，具有專一性高，副作用小的特點。本發(fā)明的反義寡核苷酸的長度沒有特別限制，一般來說，為了達到雜交的專一性， 反義寡聚核苷酸需要至少13個單體組成的核苷酸。通常反義寡聚核苷酸的長度為13 35bp，對于miRNA成熟體來說，較佳的反義寡聚核苷酸長度為18 25bp。


圖1顯示了 miR-1233反義寡聚核苷酸抑制腫瘤細胞U87/MG細胞的生長 和增殖，A，B為轉染了 FAM標記的陰性對照后的U87/MG細胞；C為轉染陰性對照 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)后 U87/MG 細胞狀態(tài)；D 為轉染 miR-1233 反義寡聚核苷 酸(5，-CUGCGGGAGGACAGGGCUCA-3，)后 U87/MG 細胞狀態(tài)。
具體實施例方式本發(fā)明的反義寡聚核苷酸，其序列與5’ -UGAGCCCUGUCXUCCCGCAG-3，中連續(xù)13 25個核苷酸序列互補，并且亦不與其他基因的RNA序列互補。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例 中，所述反義寡聚核苷酸的序列為5' -CUGCGGGAGGACAGGGCUCA-3'。本發(fā)明提供的反義寡 聚核苷酸可以為修飾產物，它含有至少兩個，通常至少4個，較佳的至少6個，更佳的至少8 個核苷酸沒有毒性副作用的修飾的核苷酸，所述修飾方式包括2’位甲氧基取代、硫代修飾 等。為了增加反義寡聚核苷酸的細胞攝取率，還可以在上述修飾的基礎上對反義寡聚核苷 酸進行膽固醇修飾或者PEG化修飾。上述修飾后的寡聚核苷酸能繼續(xù)與靶序列有效配對， 而且比普通的未經修飾的核糖核酸或者脫氧核糖核酸在體內具有更長的半衰期。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、反義寡聚核苷酸作用于特異性的靶位點，非特異性結合的位點很少，專一性 尚；2、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸經過適當的化學修飾，具有毒性低、副作用小和 半衰期長等特點；3、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸具有很好的抑制效果，對腫瘤細胞生長的抑制率 超過65%。下面將結合實施例及附圖進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應當理解，列舉這些實 施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例l、miR-1233反義寡聚核苷酸對人神經膠質細胞瘤細胞系U87/MG抑制活性 檢測首先，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成miR-1233反義寡聚核苷酸，序列為 5' -CUGCGGGAGGACAGGGCUCA-3'。在實施例中涉及的所用序列均由上海吉瑪制藥技術有限 公司合成。細胞培養(yǎng)
U87/MG細胞(購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)，10% FBS-DMEM培 養(yǎng)基(FBS購自Gibco，DMEM購自Hyclone)培養(yǎng)，37°C，5% CO2培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的 U87/MG細胞，離心計數，以2X IO3每孔鋪于96孔板內，37°C,5% CO2培養(yǎng)24h。轉染1)轉染前一天，在96孔板中用適量不含抗生素的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)細胞，使轉染時 細胞的匯合度達到30 50% ；2)轉染樣品按照如下方法準備寡聚物-Lipofecta mine 2000復合物a.用25μ1不含血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基(Gibco)分別稀 釋 miR-1233 反義寡聚核苷酸(5 ‘ -CUGCGGGAGGACAGGGCUCA-3 ‘)、陰性對照 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)、FAM標記的陰性對照，加入孔內后終濃度為50nM，輕輕 混勻，每個轉染設3個復孔；b.使用前輕輕混勻 Lipofecta mine 2000 (Invitrogen)，然后取 0. 25 μ 1 稀釋到 25 μ 1的Opti-MEM: I培養(yǎng)基，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；c.孵育5min后，稀釋的Lipofecta mine 2000分別與稀釋的反義核苷酸及對照 混合，輕輕混勻后在室溫下孵育20min，以允許復合物的形成；3)將復合物加入到每一個包含細胞和培養(yǎng)基的孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混 合；反義核苷酸及對照的終濃度為50nM。4) 37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育72小時后，顯微鏡觀察U87/MG細胞，照相。如圖1所示，轉染72小時后，超過80%的U87/MG細胞成功轉染了 FAM標記的陰性 對照(圖A，B)；轉染陰性對照后，U87/MG細胞完整，透光性強(圖C)；轉染miR-1233反義 寡聚核苷酸后大部分U87/MG細胞死亡(圖D)?；贛TT的細胞毒性實驗向上一步驟中得到的細胞，加入配制好的MTT(Sigma)5mg/ml(用0.9%的生理鹽 水配制)，每孔加入20 μ 1，37°C，5% CO2孵育4小時后吸去培養(yǎng)基及MTT，每孔加入DMSO 100 μ 1并通過酶標儀讀取0D570-0D630的吸光度值。
權利要求
1.一種反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸包含與下述核苷酸序列中 13 25個連續(xù)的核苷酸互補的序列5，-UGAGCCCUGUCCUCCCGCAG-3，。
2.如權利要求1所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸序列為 5’ -CUGCGGGAGGACAGGGCUCA-3’。
3.如權利要求1所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸為核糖核 苷酸、脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體。
4.如權利要求1 3中任一項所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷 酸進一步被修飾。
5.如權利要求4所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述修飾選自核糖修飾、堿基修 飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合。
6.如權利要求5所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述修飾選自硫代修飾、2’-甲 氧基修飾和膽固醇修飾中的一種或幾種。
7.如權利要求1 6中任一項所述的反義寡聚核苷酸用于制備治療mir-1233過度表 達的相關疾病的藥物的用途。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸與其他治療藥物聯合 施用。
9.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述miR-1233過度表達的相關疾病為腫瘤， 優(yōu)選為腦膠質瘤。
10.一種藥物組合物，其特征在于，含有治療有效量的權利要求1 6中任一項所述的 反義寡聚核苷酸以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種抑制人microRNA-1233表達的反義寡聚核苷酸及其應用。該反義寡聚核苷酸特異性結合于人miR-1233，包含與5’-UGAGCCCUGUCCUCCCGCAG-3’核苷酸序列中至少13個連續(xù)核苷酸互補的序列，特別是序列5’-CUGCGGGAGGACAGGGCUCA-3’。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸可以為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或二者的嵌合體，并可對鏈中任一核苷酸進行修飾。本發(fā)明的miR-1233反義寡核苷酸能夠有效抑制人腦膠質瘤細胞中miR-1233表達，抑制該細胞生長和增殖，從而有效治療腦膠質瘤及其他miR-1233高表達的腫瘤。
文檔編號A61K48/00GK102140469SQ20101061300
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權日2010年12月30日
發(fā)明者丁侃, 張佩琢, 李捷, 段春曉, 沈孝坤 申請人:中國科學院上海藥物研究所, 蘇州吉瑪基因股份有限公司