專利名稱：一種蛋白質(zhì)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及絕經(jīng)期促性腺素 及其穩(wěn)定劑的組合物，它具有良好的穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
絕經(jīng)期促性腺素(Human Menopausal Gonadotropins，簡(jiǎn)稱HMG)含有卵泡刺激素 (Follicle-stimulating hormone,簡(jiǎn)禾爾 FSH)禾口黃體生成激素(leuteinizing hormone,簡(jiǎn) 稱LH)兩種活性成分，是由垂體產(chǎn)生的糖蛋白激素，它由α鏈和β鏈兩個(gè)亞基組成。FSH的 α亞基與黃體生成激素(leuteinizing hormone，簡(jiǎn)稱LH)和絨毛膜促性腺素(chorionic gonadotropin，簡(jiǎn)稱CG)的α亞基完全相同，具有92個(gè)氨基酸，分子量約為14500D，第52 和78位置上的天冬酰胺是發(fā)生N-糖基化的氨基酸。FSH的β亞基由111個(gè)氨基酸組成， 分子量約為18000 D，其中第7和M位置上的天冬酰胺是發(fā)生N-糖基化的氨基酸。而LH 的β亞基由121個(gè)氨基酸組成，分子量約為14800 D ；CG的β亞基則有145個(gè)氨基酸，分 子量22000-39000 DH。HMG中FSH和LH的生物效價(jià)比例為10 1至1 10之間，通常為 2 1 至 1 1。監(jiān)床上HMG主要用于治療不育癥以及體外的輔助生殖。HMG可以從絕經(jīng)期婦女的 尿液中提取出來(lái)，也可通過(guò)DNA重組技術(shù)分別制備FSH和LH。HMG的制劑形式通常為凍干粉針，使用方式為肌肉注射。高純度絕經(jīng)期促性腺素 (PHMG)是HMG的后繼產(chǎn)品，它是將HMG進(jìn)行進(jìn)一步的純化，去除大量雜蛋白而獲得的純度 高、雜質(zhì)少的產(chǎn)品，因此不會(huì)造成人體的過(guò)敏反應(yīng)，并且由于這些優(yōu)點(diǎn)它可以用于皮下注 射，提高患者的順應(yīng)性，方便患者的使用、減輕痛苦，PHMG的制劑形式可以為凍干粉針，也可 以是水針。在HMG和pHMG制劑的研制方面，獲得一種穩(wěn)定性良好、使用方便、安全性高的劑型 是患者、醫(yī)生所需要的以及各制造廠商致力于開(kāi)發(fā)的方向。但目前的現(xiàn)有技術(shù)并不穩(wěn)定，對(duì) 于制劑的運(yùn)輸過(guò)程、儲(chǔ)存過(guò)程的溫度控制都要求較苛刻，稍有不慎就容易導(dǎo)致產(chǎn)品失去活 性或降解，特別是在高純度絕經(jīng)期促性腺素領(lǐng)域，這個(gè)問(wèn)題尤其突出。US5650390公開(kāi)了一 種含有HMG，蔗糖和甘氨酸的制劑配方。W020041U^6A1公開(kāi)了含有HMG，蔗糖和表面活性 劑吐溫(Tween)以及L-蛋氨酸的制劑配方。W02004087213公開(kāi)了含有HMG，蔗糖和表面活 性劑普流尼克(Pluronic)以及L-蛋氨酸的制劑配方。雖然上述三種制劑配方還算比較穩(wěn) 定，但由于添加了多種表面活性劑及賦形劑給制劑的安全性帶來(lái)了很大的隱患。因此本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)出一種具有良好穩(wěn)定性、使用方便、安全有效的絕經(jīng)期 促性腺素的制劑形式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種含有絕經(jīng)期促性腺素包括高純度的絕經(jīng)期促性腺素的藥物 組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種蛋白質(zhì)組合物，所述的組合物包含絕經(jīng)期促性 腺素(HMG)和/或其變體，和蔗糖。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是液體形式或固體形式。在另一優(yōu)選例中，所述的固體形式是冷凍干燥粉末。在另一優(yōu)選例中，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述固體形式的組合物中含有0. 1-200FSH 國(guó)際單位/mg組合物。在另一優(yōu)選例中，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述固體形式的組合物中含有0. 5-50FSH國(guó) 際單位/mg組合物。在另一優(yōu)選例中，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述固體形式的組合物中含有1-20 FSH國(guó) 際單位/mg組合物。在另一優(yōu)選例中，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述液體形式的組合物中含有1-2000FSH國(guó) 際單位/mL組合物。在另一優(yōu)選例中，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述液體形式的組合物中含有30-1000FSH 國(guó)際單位/mL組合物。在另一優(yōu)選例中，所述組合物所含有的絕經(jīng)期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)與 黃體生成素(LH)的生物效價(jià)比例范圍為10 1至1 10之間；較佳地，為3 1至1 2 之間；更佳地為2 1至1 1之間。在另一優(yōu)選例中，所述組合物所含有的絕經(jīng)期促性腺素是高純度絕經(jīng)期促性腺素 (pHMG)，其比活不低于5000FSH國(guó)際單位/mg蛋白；較優(yōu)選為比活不低于6000FSH國(guó)際單位 /mg蛋白；更優(yōu)選為比活不低于8000FSH國(guó)際單位/mg蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述組合物所含有的絕經(jīng)期促性腺素來(lái)自人尿來(lái)源的絕經(jīng)期促 性腺素和/或其變體。在另一優(yōu)選例中，所述組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的載體；所述的藥學(xué)上可 接受的載體，可以選自以下物質(zhì)中的一種或一種以上pH調(diào)節(jié)劑、非離子表面活性劑、防腐
劑、鹽、二糖、甘露醇。在另一優(yōu)選例中，所述的pH調(diào)節(jié)劑是磷酸鹽。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于制備上述的本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)組合物的 方法，所述的方法包括步驟(1)制備含絕經(jīng)期促性腺素和蔗糖的水溶液；(2)將水溶液分裝到瓶中；和(3)壓塞、密封或進(jìn)行冷凍干燥后再壓塞、密封，得到上述的本發(fā)明提供的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(1)中的水溶液的PH為6. 0-8. 5 ；優(yōu)選6. 5-8. 0。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種上述的本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)組合物在制備治療 不育綜合癥的藥物中的用途。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種具有良好穩(wěn)定性、使用方便、安全有效的絕經(jīng)期促性腺素 的制劑形式。
具體實(shí)施例方式發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)期促性腺素與合適的穩(wěn)定劑一蔗糖組合后，可以得到穩(wěn)定的組合物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，此時(shí)蔗糖不僅起稀釋劑和賦形劑的作用，更重要的是起保護(hù)劑的作 用，它可以保護(hù)糖蛋白分子在冷凍干燥過(guò)程中和以后的儲(chǔ)存過(guò)程中可能發(fā)生的構(gòu)象變化所 導(dǎo)致的變性失活，另外一方面，它對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性也有很大的提高。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完 成了本發(fā)明。如本文所用，“絕經(jīng)期促性腺素”、“尿促性素”和“HMG”可以互換使用，都是指一類 由垂體產(chǎn)生的糖蛋白激素或其變體，含有FSH和LH兩種活性成分?？梢允侵亟M的絕經(jīng)期促 性腺素或其變體、或是人尿來(lái)源的絕經(jīng)期促性腺素或其變體。如本文所用，“卵泡刺激素”和“FSH”可以互換使用，都是指一類用于促進(jìn)精子或卵 泡產(chǎn)生、促進(jìn)卵巢發(fā)育的激素或其變體，其可在天然情況下由垂體前葉分泌，可從絕經(jīng)期婦 女的尿液中提取或可通過(guò)重組技術(shù)獲得的。如本文所用，“黃體生成激素”和“LH”可以互換使用，都是指是由腦垂體前葉嗜堿 性細(xì)胞分泌的，作用于成熟的卵胞，能引起排卵并生成黃體的一類激素或其變體。如本文所用，“雜質(zhì)”是指除了絕經(jīng)期促性腺素之外的其它物質(zhì)，是指除FSH、LH以 外的雜蛋白，如降解亞基、聚合亞基等。在探索改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)方法的過(guò)程中，發(fā)明人注意到將絕經(jīng)期促性腺素與蔗糖進(jìn)行 適當(dāng)?shù)呐浔?，特別是絕經(jīng)期促性腺素和蔗糖的濃度在一個(gè)合適范圍內(nèi)，那么此時(shí)蔗糖會(huì)起 到保護(hù)劑的作用，防止糖蛋白分子在冷凍干燥過(guò)程中和以后的儲(chǔ)存過(guò)程中可能發(fā)生的構(gòu)象 變化所導(dǎo)致的變性失活。本發(fā)明提供的組合物中含有絕經(jīng)期促性腺素；蔗糖；和/或藥學(xué)上可接受的載體。 以組合物的總重量計(jì)，蔗糖和絕經(jīng)期促性腺素的重量之和是組合物總重量的6-100%，較佳 地是80-99 %，更佳地是90-98 %。劑型為凍干粉針的情況下，在每毫克本發(fā)明提供的組合物中，以FSH生物效價(jià)計(jì)， 含量在0. 1-200 FSH國(guó)際單位，較佳地為0. 5-50FSH國(guó)際單位，更佳地為1_20 FSH國(guó)際單 位。劑型為水針的情況下，在每毫升本發(fā)明提供的組合物中，以FSH生物效價(jià)計(jì)，含量 在1-2000 FSH國(guó)際單位，較佳地為30-1000 FSH國(guó)際單位。在本發(fā)明提供的組合物中，絕經(jīng)期促性腺素和蔗糖的重量比為 0.00001 1-1 1，較佳地為 0.0001 1-0.01 1。在本發(fā)明提供的組合物中，所述的絕經(jīng)期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)與黃體 生成素(LH)的生物效價(jià)比例為10 1至1 10之間；較優(yōu)選為3 1至1 2之間；更 優(yōu)選為2 1至1 1之間。如本文所用，“高純度絕經(jīng)期促性腺素(purified Human Menopausal Gonadotropins,pHMG) ”是指比活在5000 FSH國(guó)際單位(IU)/mg蛋白以上的HMG，優(yōu)選比活 在6000 FSH IU/mg蛋白以上，更佳地為比活在8000 FSH IU/mg蛋白以上。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種 賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施 用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另 外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如崩解劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。所述藥物組合物可以根據(jù)不同給藥途徑而制備成各種劑型。這些劑型以下面方式 之一施用口服、噴霧吸入、直腸用藥、鼻腔用藥、頰部用藥、局部用藥、非腸道用藥，如皮下、 靜脈、肌肉、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲(chǔ)器用藥。其 中治療時(shí)優(yōu)選皮下或肌肉給藥方式。另外需要指出，本發(fā)明藥物組合物中有效成分的使用劑量和使用方法取決于諸多 因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況、有效成分活性強(qiáng)度、服用、代 謝速率、病癥的嚴(yán)重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷。建議安全有效量，以FSH生物效價(jià)計(jì)通 常至少約30 FSH國(guó)際單位/天，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約600 FSH國(guó)際單位/天，較 佳地該劑量是約75-450 FSH國(guó)際單位/天。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康 狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明提供的組合物具有良好的穩(wěn)定性。本發(fā)明的穩(wěn)定的藥物組合物可以這樣制備將磷酸鹽、蔗糖先用水溶解，然后加入 絕經(jīng)期促性腺素，攪拌均勻，壓塞、密封或進(jìn)行冷凍干燥后再壓塞、密封。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、提供了一種絕經(jīng)期促性腺素的組合物，便于保存和運(yùn)輸；2、本發(fā)明方法獲得的絕經(jīng)期促性腺素的藥物組合物，具有良好的穩(wěn)定性。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件、或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。生物效價(jià)的測(cè)定方法按照中國(guó)藥典2005版附錄XII M、附錄XII N的方法測(cè)定 FSH、LH生物效價(jià)。蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法按Lowry法進(jìn)行測(cè)定。液體中FSH比活的計(jì)算方法比活=每毫升液體中FSH生物效價(jià)(IU/mL) +每毫 升液體中的蛋白含量(mg蛋白/mL)。固體中FSH比活的計(jì)算方法比活=每毫克固體中FSH生物效價(jià)(IU/mg) +每毫 克固體中的蛋白含量(mg蛋白/mg)實(shí)施例1實(shí)施例1和對(duì)照例1所用原料中，絕經(jīng)期促性腺素(HMG)購(gòu)自上海天偉生物制藥 有限公司，其FSH生物效價(jià)為330國(guó)際單位/mg，F(xiàn)SH比活為475國(guó)際單位/mg蛋白，LH生 物效價(jià)為306國(guó)際單位/mg，LH比活為440國(guó)際單位/mg蛋白。
每支含75IU FSH和75IU LH的配方1 HMG250 μ g蔗糖30mgNaH2PO4 ‘ H2O 0. 69mgNa2HPO4 · 2H20 0. 8mg制備過(guò)程按上述配方1計(jì)算出實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模所需的各個(gè)原輔料的量，先在容器中加入注射 用水，然后加入NaH2PO4 · H2O, Na2HPO4 · 2H20和蔗糖，攪拌10分鐘至完全溶解；測(cè)定pH是否在7.0 士 0.2，若不在此范圍則用IM NaOH溶液或IM HCl溶液調(diào)pH至 7. 0 士 0.2 ；將HMG加入上述溶液，攪拌10分鐘至完全溶解；測(cè)定pH是否在7.0 士0.2，若不在此范圍則用IM NaOH溶液或IM HCl溶液調(diào)pH至 7. 0 士 0.2 ；用0.22μπι Durapore膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，濾過(guò)液分裝至抗生素瓶中，半加塞，裝盤放 入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥程序如下a、擱板溫度為+4°C維持20分鐘；b、擱板溫度降至-40 °C以下維持3小時(shí)；C、開(kāi)啟冷阱，冷阱溫度降至_45°C以下；d、開(kāi)啟真空度，真空度降至IOOmTor以下；e、擱板溫度升至-10°C維持10小時(shí)；d、擱板溫度在2小時(shí)內(nèi)從-10°C升至+35°C，然后在+35°C維持5小時(shí)；f、干燥結(jié)束后充氮?dú)?，壓塞，出箱，軋蓋。對(duì)照例1每支含75IU FSH和75IU LH的對(duì)照例配方1 HMG250g甘露醇IOmgNaH2PO4 · H2O 0. 69mgNa2HPO4 ‘ 2H20 0. 8mg制備方法同實(shí)施例1。上述2個(gè)配方在40 士 2°C，RH75 士 10%下的穩(wěn)定性結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)組合物，所述的組合物包含蔗糖，和絕經(jīng)期促性腺素(HMG)和/或其變體。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物是液體形式或固體形式。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述的固體形式是冷凍干燥粉末。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述固體形式的組合 物中含有0. 1-200 FSH國(guó)際單位/mg組合物。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述固體形式的組合 物中含有0. 5-50 FSH國(guó)際單位/mg組合物。
6.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述固體形式的組合 物中含有1-20 FSH國(guó)際單位/mg組合物。
7.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述液體形式的組合 物中含有1-2000 FSH國(guó)際單位/mL組合物。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，以FSH生物效價(jià)計(jì)，所述液體形式的組合 物中含有30-1000 FSH國(guó)際單位/mL組合物。
9.如權(quán)利要求1-8任一所述的組合物，其特征在于，所述的絕經(jīng)期促性腺素中，卵泡刺 激素(FSH)與黃體生成素(LH)的生物效價(jià)比例范圍為10 1至1 10之間。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述的絕經(jīng)期促性腺素中，卵泡刺激素 (FSH)與黃體生成素(LH)的生物效價(jià)比例范圍為3 1至1 2之間；優(yōu)選為2 1至 1 1之間。
11.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述的絕經(jīng)期促性腺素是高純度絕經(jīng)期 促性腺素(pHMG)，其比活不低于5000 FSH國(guó)際單位/mg蛋白；較優(yōu)選為比活不低于6000 FSH國(guó)際單位/mg蛋白；更優(yōu)選為比活不低于8000 FSH國(guó)際單位/mg蛋白。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的絕經(jīng)期促性腺素來(lái)自人尿來(lái)源的 絕經(jīng)期促性腺素和/或其變體。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的 載體。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的載體，可以選自 以下物質(zhì)中的一種或一種以上PH調(diào)節(jié)劑、非離子表面活性劑、防腐劑、鹽、二糖、甘露醇。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述的pH調(diào)節(jié)劑是磷酸鹽。
16.一種用于制備如權(quán)利要求1-15任一所述的蛋白質(zhì)組合物的方法，其特征在于，所 述的方法包括步驟(1)制備含絕經(jīng)期促性腺素和蔗糖的水溶液；(2)將水溶液分裝到瓶中；(3)壓塞、密封或進(jìn)行冷凍干燥后再壓塞、密封，得到如權(quán)利要求1-16任一所述的組合物。
17.如權(quán)利要求16所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(1)中的水溶液的pH為 6. 0-8. 5 ；優(yōu)選 6. 5-8. 0。
18.—種如權(quán)利要求1-15任一所述的蛋白質(zhì)組合物在制備治療不育綜合癥的藥物中 的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種含有絕經(jīng)期促性腺素的組合物，所述的組合物中含有作為穩(wěn)定劑的蔗糖。本發(fā)明提供的組合物具有良好的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61K47/26GK102100908SQ20101061775
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者季斌, 季曉銘, 洪云海, 高霄梁 申請(qǐng)人:上海天偉生物制藥有限公司