專利名稱：一種人工加工熊膽粉及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從動物體內(nèi)提取膽汁的方法、膽粉的生產(chǎn)方法及膽粉，特別尤其 一種從熊的體內(nèi)提取膽汁的方法、熊膽粉的生產(chǎn)方法及優(yōu)質(zhì)熊膽粉。
背景技術(shù)：
熊膽，是熊科動物黑熊Selenarctos thibetanus (G. Cuvier)、東北馬熊 Ursus arctos lasiotus Gray或棕熊tosus arctos L.膽囊內(nèi)的干燥膽汁。在中國，主產(chǎn)云南、黑 龍江、吉林。此外，貴州、四川、青海、西藏、新疆、甘肅、湖北、湖南、陜西、福建等地亦產(chǎn)。熊 膽中的主要成份是膽汁酸類的堿金屬鹽，此外，還含有膽留醇及膽色素。從黑熊膽中可得約 20%的?；切苊撗跄懰?，為熊膽的主要成分，被水解則生中磺酸與熊脫氧膽酸。熊膽又含少 量鵝脫氧膽酸及膽酸。熊脫氧膽酸為鶴脫氧膽酸的立體異構(gòu)物，乃熊膽的特殊成分，可與它 獸的膽相區(qū)別。熊膽能清熱解毒，明目，具有解痙、抗驚厥、利膽作用，此外，對流感嗜血桿菌、大腸 桿菌、肺炎球菌、甲型鏈球菌、綠膿假單胞菌、卡他奈瑟菌等均有抑制作用。在治療膽結(jié)石、 急性黃疸型肝炎和慢性乙型肝炎、急性結(jié)膜炎和白內(nèi)障、抗腦血栓和腦缺血、抗腫瘤、抗?jié)?瘍、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、降血脂及抗衰老等方面均發(fā)揮著藥理作用及保健功效。傳統(tǒng)的制備方法一直是殺熊取膽，致使藥源動物瀕于滅絕。20世紀80年代后期， 國內(nèi)開發(fā)和逐步應(yīng)用活熊膽囊造漏術(shù)插入引流管采集膽汁(有管引流采集法)或有管引流 連續(xù)取膽汁技術(shù)(有管連續(xù)引流采集法)，來生產(chǎn)引流熊膽粉。連續(xù)有管引流生產(chǎn)熊膽粉的 技術(shù)不足是，引流管在熊體內(nèi)長期存留，容易引起創(chuàng)口局部發(fā)炎和感染；同時有管引流連續(xù) 采集也影響熊膽汁的自身代謝。專利號為ZL 01112258. 7的發(fā)明公開了一種人造熊膽粉的制備方法，用禽膽汁通 過生物抽取，分別獲得?；切苋パ跄懰峤M份、膽汁色素成份和膽汁酸組份，然后將這些組份 進行測定后按比例加工配制成人造熊膽粉。雖然人造熊膽粉含有天然熊膽中的一些主要成 份，但其組份單一，制備工藝復(fù)雜，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。目前市售熊膽粉價格昂貴，易吸潮，熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷枯^低，使其在醫(yī) 藥及保健方面的應(yīng)用受到極大的限制。本發(fā)明采用人工無管引流采集熊膽汁，此方法可以明顯減少膽囊的感染，提高膽 汁的產(chǎn)量與質(zhì)量，減少因有管存留對膽囊的破壞；同時，還可以減少黑熊的手術(shù)次數(shù)。通過 外科造瘺術(shù)在膽囊切開創(chuàng)口，并與肌肉組織形成瘺管后，可用于每日非連續(xù)、定時定量進行 采集，使膽汁在膽囊里充分濃縮，從而獲得優(yōu)質(zhì)膽汁。即使長期采集，也不會對黑熊自身利 用膽汁(供其生理和生長發(fā)育所需)造成影響。通過此方法提取的膽汁制成的熊膽粉，外觀色澤純正，不吸潮，利于儲運和加工成 口服劑型，而且熊膽粉中牛磺熊去氧膽酸含量明顯高于目前市售的普通熊膽粉。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題提供一種從熊的體內(nèi)提取膽 汁的方法和一種人工熊膽粉及其制備方法，本發(fā)明的人工熊膽粉中的有效成分含量高，含 水量低，不吸潮，適于儲藏、存放和運輸，而且熊膽粉的療效高，明顯提高了其應(yīng)用效果。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種從熊的體內(nèi)提取膽汁的方法。其中，在熊的膽囊上切開創(chuàng)口，并與肌肉組織形成瘺管，扎緊；痊愈后擠動瘺口采 集膽汁。其中，在熊的腹中線劍突向下1 IOcm處，切開皮下組織，拉出膽囊；在膽囊切開 1 3cm的創(chuàng)口，并與肌肉組織形成瘺管，扎緊。特別是，于腹中線劍突向下1 IOcm處，切開皮下組織，鈍性分離肌肉，切開肌膜、 腹膜，拉出膽囊；在膽囊切開1 3cm的創(chuàng)口，并與肌肉組織形成瘺管，用縫合線適度扎緊； 再固定膽囊和膽囊皮膚；分別縫合腹膜、脂肪、肌膜、肌肉和皮膚；然后清洗和消毒術(shù)口。其中，在熊術(shù)后蘇醒2 4小時，飼喂營養(yǎng)液。特別是，營養(yǎng)液為蜂蜜水、糖水或雞蛋水。其中，在術(shù)后1-15天內(nèi)，給熊予肌注或口服抗生素。其中，每天定時采集熊膽汁1 3次，每天采集總量為50 200mL。其中，熊為黑熊，優(yōu)選為養(yǎng)殖于亞洲的黑熊，進一步優(yōu)選為養(yǎng)殖于中國福建省的黑熊。本發(fā)明另一方面提供一種人工加工熊膽粉，在365nm下呈亮黃綠色熒光，即在 365nm的紫外光下呈亮黃綠色熒光。特別是，所述熊膽粉的有效成分?；切苋パ跄懰岬淖贤馓卣魑詹ㄩL為198nm ； 在其后出現(xiàn)的色譜峰中，還有2個色譜峰的紫外吸收波長也是198nm。其中，熊膽粉采用高效液相色譜法測定的色譜峰中，在甲醇溶劑峰后保留時間為 3. 3-3. 4分鐘的色譜峰的紫外特征吸收波長為198nm和；其中，所述高效液相色譜 法的色譜條件流動相-甲醇0. 03mol/L磷酸二氫鈉(65 30)；用磷酸調(diào)PH4. 4 ；流速 l.Oml/min;檢測波長210nm;檢測器Agilent 1100 DAD ；柱溫30°C；柱子Hypersil ODS sum 4. 6 X250mmo特別是，還含有M9nm和494nm的紫外特征吸收峰。其中，所述熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷?gt; 40%，優(yōu)選> 40-60%，進一步優(yōu)選為 40-45% ο特別是，所述熊膽粉的水分含量< 2%。本發(fā)明的優(yōu)質(zhì)熊膽粉，經(jīng)高效液相色譜DAD檢測器采集各峰的紫外指紋圖譜，主 要有效成分?；切苋パ跄懰岷土硗?個主要色譜峰的紫外吸收譜波長都是198nm，3. 5分出 峰的雜質(zhì)色譜峰的紫外吸收波長為198nm、2^nm，其余雜質(zhì)峰均無紫外吸收峰；其中，將所述熊膽粉首先溶于水后，采用乙酸乙酯萃取，得到熊膽粉的乙酸乙酯萃 取物和水溶性物質(zhì)，其中，所述乙酸乙酯萃取物的紫外吸收波長為；所述水溶性物質(zhì) 的紫外吸收波長為M9nm和494nm ；其中，將所述熊膽粉以甲醇溶解，然后去除不溶部分，得熊膽粉甲醇溶解物，所述 甲醇溶解物的紫外吸收波長為249nm和^2nm。本發(fā)明的優(yōu)質(zhì)熊膽粉，經(jīng)薄層層析，于254nm紫外燈下可檢出7個藍色熒光斑點，
4其Rf值分別為0. 96,0.8,0.7,0. 54，0. 46，0. 4，0. 2 ；于365nm紫外燈下可檢出9個亮藍色 熒光斑點，其 Rf 值分別為 0. 96，0. 84，0. 76，0. 56，0. 5，0. 4，0. 7，0. 18,0. 1。其中，Rf 值為
0. 18的亮藍色熒光斑點，為其特有斑點。本發(fā)明又一方面提供了一種人工加工熊膽粉的生產(chǎn)方法，包括如下步驟1)將熊膽汁靜置澄清，獲得上清液；2)將上清液進行除雜處理，得到水溶性熊膽汁；3)對水溶性熊膽汁進行干燥處理，粉碎，過篩，即得。其中，步驟1)中所述靜置澄清的溫度為4 10°C，靜置時間為2 M小時；步驟 2)中采用離心、過濾或吸附處理方法對熊膽汁上清液進行所述的除雜處理；步驟幻中所述 的干燥處理選擇烘干、真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。特別是，所述離心除雜處理的轉(zhuǎn)速為10000 12000rpm，時間為10-120min ；所述 過濾處理為加壓過濾，過濾處理的相對壓力為0. 1 0. 3MPa ；所述吸附除雜處理是采用大 孔吸附樹脂進行吸附除雜。其中，過濾處理的過濾精度為0. 2-0. 5微米；所述大孔樹脂選擇為DlOl型大孔樹脂。特別是，所述的大孔吸附樹脂與熊膽汁上清液的重量之比為1 80 1。其中，所述的真空干燥的相對壓力為-0. 05 -0. 095MPa ；干燥溫度為30 60°C; 干燥時間為8-60小時。特別是，所述的烘干溫度為60 80°C ；烘干時間為M 48小時。特別是，所述冷凍干燥為將熊膽汁在_40°C下預(yù)凍3 5小時，接著在-40 _15°C 下升華干燥18 M小時，然后再于-15 30°C下干燥12 20小時。尤其是，冷凍干燥的相對壓力為2_20MPa。 特別是，將水溶性熊膽汁在射流速度300 990米/秒，溫度為30 60°C、相對壓 力為-0. 04 -0. 09MPa的條件下進行所述的噴霧干燥。其中，所述的經(jīng)過干燥處理后的粉碎的熊膽粉過100 180目篩。本發(fā)明另一方面提供一種按照上述方法制備而成的人工加工熊膽粉。其中，熊膽粉在365nm下呈亮黃綠色熒光，即在365nm的紫外光下呈亮黃綠色熒 光。特別是，所述熊膽粉的有效成分?；切苋パ跄懰岬淖贤馓卣魑詹ㄩL為198nm ； 在其后出現(xiàn)的色譜峰中，還有2個色譜峰的紫外吸收波長也是198nm。其中，熊膽粉采用高效液相色譜法測定的色譜峰中，在甲醇溶劑峰后保留時間為 3. 3-3. 4分鐘的色譜峰的紫外特征吸收波長為198nm和；其中，所述高效液相色譜 法的色譜條件流動相-甲醇0. 03mol/L磷酸二氫鈉(65 30)；用磷酸調(diào)PH4. 4 ；流速 l.Oml/min;檢測波長210nm;檢測器Agilent 1100 DAD ；柱溫30°C；柱子Hypersil ODS sum 4. 6 X250mmo特別是，還含有M9nm和494nm的紫外特征吸收峰。其中，所述熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷?gt; 40%，優(yōu)選> 40-60%，進一步優(yōu)選為 40-45% ο特別是，所述熊膽粉的水分含量< 2%。
本發(fā)明再一方面提供一種優(yōu)質(zhì)人工提純熊膽粉。其中，熊膽粉為玻璃樣光澤的亮金黃色或鮮黃色粉末，呈亮黃色熒光且不吸潮。其中，所述熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷?gt; 40%，優(yōu)選> 40-60%，進一步優(yōu)選為 40-45% ο本發(fā)明又一方面提供一種人工熊膽粉在制備用于治療和預(yù)防肝炎、肝纖維化、膽 結(jié)石、抗腫瘤、抗病毒、眼病、解熱藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點如下1、通過人工無管引流技術(shù)，在熊的膽囊上切開創(chuàng)口，并與肌肉組織形成瘺管，扎 緊；痊愈后擠動瘺口采集膽汁。該方法可用于非連續(xù)、定時定量和長期采集，而且不會對熊 自身利用膽汁造成影響。2、本發(fā)明制備的人工加工熊膽粉外觀色澤純正，不吸潮，吸濕率彡2% ；熊膽粉中 ?；切苋パ跄懰岷扛?，達到40%以上，其有效成分?；切苋パ跄懰岷匡@著高于目前市 售的普通熊膽粉，利于熊膽粉的儲運和加工，尤其利于口服劑型的制備。3、本發(fā)明的人工加工熊膽粉的制備方法簡單，工藝條件溫和，成本低廉，費用低。


圖1 反相高效薄層板RP-ISF254，展開劑氯仿-丙酮-冰醋酸(7 2 1)，展距 5cm。紫外燈254nm下熒光照片；體積之比為7 :2:1圖2:反相高效薄層板RP-ISF254，展開劑氯仿-丙酮-冰醋酸(7 2 1)，展距 5cm。紫外燈365nm下熒光照片；圖3 本發(fā)明實施例4制備的熊膽粉高效液相色譜圖；圖4 本發(fā)明實施例4的熊膽粉高效液相色譜-3D圖；圖5 本發(fā)明實施例4的熊膽粉在保留時間2. 635分鐘的甲醇溶劑色譜峰的高效 液相色譜-3D圖(紫外吸收波長198nm)；圖6 本發(fā)明實施例4的熊膽粉在保留時間3. 355分鐘的色譜峰的高效液相色 譜-3D圖(紫外吸收波長198nm,226nm)；圖7 本發(fā)明實施例4的熊膽粉在保留時間11. 02分鐘的色譜峰的高效液相色 譜-3D圖(?；切苋パ跄懰嶙贤馕詹ㄩL198nm)；圖8 本發(fā)明實施例4的熊膽粉在保留時間20. 74分鐘的色譜峰的高效液相色 譜-3D圖(紫外吸收波長198nm)；圖9 本發(fā)明實施例4的熊膽粉在保留時間31. 218分鐘的色譜峰的高效液相色 譜-3D圖(紫外吸收波長198nm)；圖10 熊膽粉在254nm紫外燈下熒光照片圖；圖11 熊膽粉在356nm紫外燈下熒光照片圖。照片附圖標記說明1.本發(fā)明實施例4制備的熊膽粉樣品；2.對照例1熊膽粉樣品；3.對照例2熊膽 粉樣品具體實施例方式以下通過試驗例來進一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果，這些試驗例包括了本發(fā)明藥物的藥效學(xué)試驗。試驗例1熊膽粉抗腫瘤作用試驗材料本發(fā)明實施例4制備熊膽粉，Ig/瓶；第一對照熊膽粉，IOg/袋(對照例1熊膽粉， 四川省養(yǎng)麝研究所生產(chǎn))；第二對照熊膽粉，5g/瓶(對照例2的熊膽粉，黑龍江省黑寶藥業(yè) 股份有限公司生產(chǎn))；陽性對照藥環(huán)磷酰胺(CTX，上海華聯(lián)制藥集團生產(chǎn))。1.對B16小鼠黑色素瘤的抑瘤作用1)試驗方法無菌條件下取對數(shù)生長期的B16小鼠黑色素瘤培養(yǎng)細胞，制備成2. 5XlOVml的 B16小鼠黑色素瘤培養(yǎng)細胞懸液。取C57BL/6小鼠70只，體重150_200g，雌雄各半，接種B16小鼠黑色素瘤培養(yǎng)細 胞懸液，接種量為0. 2ml/只小鼠；接種后的第二天將小鼠隨機分成7組，每組10只，即給藥 高、中、低劑量組，第一對照熊膽粉、第二對照熊膽粉、陽性對照藥物組和陰性對照組羧甲基 纖維素(CMC)；給藥高、中、低劑量組分別口服給予本發(fā)明熊膽粉，隔天給藥一次，給藥高劑 量組^Omg/kg ；給藥中劑量組130mg/kg ；給藥低劑量組65mg/kg ；第一對照熊膽粉口服給 藥，隔天給藥一次，給藥劑量為^K)mg/kg，第二對照熊膽粉口服給藥，隔天給藥一次，給藥劑 量為^Omg/kg，陽性藥物組腹腔注射給予CTX100mg/kg，每天給藥一次；陰性對照組口服給 予等重量的CMC混懸液，隔天給藥一次，各組小鼠在給藥3周后處死，剖取小鼠的肺臟，計測 每只小鼠肺臟所轉(zhuǎn)移的集落數(shù)。腫瘤抑制率計算以各組小鼠的腫瘤平均集落數(shù)，按下列公式計算腫瘤抑制率
腫瘤抑制率％ =[(對照組平均集落數(shù)-給藥組平均集落數(shù))/對照組平均集落 數(shù)]X100%。2)試驗結(jié)果不同給藥組的抗腫瘤轉(zhuǎn)移療效比較結(jié)果見表1。表1熊膽粉對小鼠黑色素瘤B16療效試驗(n = 3)
權(quán)利要求
1.一種人工加工熊膽粉，在365nm下呈亮黃色熒光。
2.如權(quán)利要求1所述的熊膽粉，其特征是?；切苋パ跄懰岬淖贤馓卣魑詹ㄩL為 198nm ；在其后出現(xiàn)的色譜峰中，還有2個色譜峰的紫外吸收波長也是198nm。
3.如權(quán)利要求1所述的熊膽粉，其特征是采用高效液相色譜法測定的色譜峰中， 在甲醇溶劑峰后保留時間為3. 3-3.4分鐘的色譜峰的紫外特征吸收波長為198nm和 226nm ；其中，所述高效液相色譜法的色譜條件流動相甲醇_0. 03mol/L磷酸二氫鈉，甲 醇與0.03mol/L磷酸二氫鈉的體積之比為65 30 ；用磷酸調(diào)pH為4. 4 ；流速1. Oml/ min ；檢測波長210nm ；檢測器Agilent 1100 DAD ；柱溫30°C ；柱子Hypersil ODS sum 4. 6 X 250mm。
4.如權(quán)利要求1或2所述的熊膽粉，其特征是水分含量<2%，其中?；切苋パ跄懰岷?量彡40%。
5.一種人工加工熊膽粉的制備方法，包括如下步驟1)將熊膽汁靜置澄清，獲得上清液；2)將上清液進行除雜處理，得到水溶性熊胭汁；3)對水溶性熊膽汁進行干燥處理，粉碎，過篩，即得。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是步驟1)中所述靜置澄清的溫度為4-10°C， 時間為2-24小時。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是采用離心、過濾或吸附方法對熊膽汁上清 液進行所述的除雜處理。
8.如權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征是步驟幻中所述的干燥處理選擇烘干、 真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。
9.一種人工熊膽粉，其特征是按照如權(quán)利要求5-8任一所述方法制備而成。
10.如權(quán)利要求9所述人工熊膽粉在制備治療和預(yù)防肝炎、肝纖維化、膽結(jié)石、抗腫瘤、 抗病毒、眼病、解熱藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熊膽汁的提取方法，在熊的膽囊上切開創(chuàng)口，并與肌肉組織形成瘺管，扎緊；痊愈后擠動瘺口采集膽汁。該方法可用于非連續(xù)、定時定量和長期采集，而且不會對熊自身利用膽汁造成影響。本發(fā)明公開了一種優(yōu)質(zhì)熊膽粉及其制備方法，該熊膽粉在365nm紫外燈下呈亮黃色熒光，其在198nm下有3個色譜峰；制備方法包括將膽汁靜置、分離、干燥后粉碎過篩，即得，制備的熊膽粉外觀色澤純正，熊膽粉中牛磺熊去氧膽酸含量高，不吸潮，利于儲運和加工。
文檔編號A61P35/00GK102114044SQ20101061777
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者陳志鴻 申請人:福建歸真堂藥業(yè)股份有限公司