專利名稱：包含過表達(dá)PhoP和/或PhoP調(diào)節(jié)子蛋白的重組BCG菌株的結(jié)核疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)核(tuberculosis，TB)疫苗。具體而言，本發(fā)明提供了重組BCG(卡介苗)菌株，所述菌株以足以引起PhoP調(diào)節(jié)子被誘導(dǎo)的水平過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子WioP。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Μ. tb)引起的，一直是全球性健康緊急事件。世界衛(wèi)生組織(WHO)的最新監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2006年有920萬新病例和170萬人死于結(jié)核病。結(jié)核預(yù)防、病例檢測和治療的挑戰(zhàn)與結(jié)核桿菌的易于傳播形成鮮明對比。結(jié)核病控制的其它威脅包括多抗藥性結(jié)核病(MDR-TB)的蔓延、廣譜耐藥性結(jié)核病 (XDR-TB)的出現(xiàn)和結(jié)核病/艾滋病毒(HIV)合并感染的破壞性影響。由于這些情況，迫切需要替代抗生素的有效方法來控制結(jié)核病。根據(jù)全球結(jié)核病控制計劃(the Global Plan to Stop TBM2006-2015年)，引入新的有效的結(jié)核病疫苗將是到2050年消除結(jié)核病的任何策略的基本組成部分。卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis) 減毒菌株，其為目前唯一可用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗。自1974年以來，BCG接種已被列入WHO 擴(kuò)大免疫計劃[1]。據(jù)估計，已有超過30億人接種了 BCG，每年BCG的接種量超過1億劑， 使它成為人類使用最廣泛的疫苗[1]。在動物感染模型中，已證明接種BCG誘導(dǎo)抵抗結(jié)核分枝桿菌攻擊的保護(hù)性免疫[2]。在人類中，已經(jīng)證明接種BCG —致保護(hù)人類抵抗包括結(jié)核性腦膜炎和粟粒性結(jié)核在內(nèi)的兒童結(jié)核病形式[3]。然而，由于其保護(hù)成年人肺結(jié)核療效的不一致性，BCG接種是有爭議的[4-6]。20世紀(jì)40年代和50年代在發(fā)達(dá)國家如英國、丹麥和北美進(jìn)行的試驗表明，該疫苗是高效(70-80%)的。然而，20世紀(jì)70年代發(fā)生在印度的一次最大的臨床試驗中，有超過沈5，000人參與，BCG接種未能提供抗結(jié)核病的可檢測的保護(hù)。幾種關(guān)于BCG保護(hù)功效變化的解釋已經(jīng)被提出[7]，所述解釋包括在臨床研究中使用的疫苗菌株的差異、試驗人群暴露于環(huán)境分枝桿菌、人群的營養(yǎng)或遺傳差異、試驗方法的差異、以及臨床結(jié)核分枝桿菌菌株的變化[5，8-11]。這些解釋不是相互排斥的，都有可能導(dǎo)致疫苗功效的異質(zhì)性。這一問題的關(guān)鍵方面涉及BCG的免疫原性。目前，許多BCG菌株用作商業(yè)疫苗。它們都是1909年至1921年期間由Calmette和Gu6rin經(jīng)過230次傳代的原始牛分枝桿菌分離菌株的后代。后來世界各地不同實驗室條件下的體外傳代一直延續(xù)到20世紀(jì)60年代， 當(dāng)時建立了冷凍種子批次。據(jù)認(rèn)為，因為過多的體外傳代(某些菌株超過1600次)，目前的 BCG菌株可能被過度弱化而不具有足以提供有效保護(hù)的免疫原性[12]。目前很清楚，BCG不是理想的疫苗，只能在有限的時期提供保護(hù)。開發(fā)新型有效的結(jié)核疫苗的目的是提供長期保護(hù)[13，14]?，F(xiàn)有的BCG疫苗在兒童中賦予抗結(jié)核病表現(xiàn)的保護(hù)作用，但其效力在10至15年期間減弱了，推測是因為BCG誘導(dǎo)的免疫保護(hù)逐漸喪失 [13]。目前，科學(xué)界一致認(rèn)為，新一代結(jié)核疫苗使用異源初免-加強(qiáng)策略來加強(qiáng)BCG誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，效果將最佳[15]。這種“初免-加強(qiáng)”策略將包括在嬰兒、幼兒暴露于結(jié)核之前
4給予其新的重組BCG(rBCG)作為“初免”，接著用不同的疫苗(蛋白/肽或DNA)進(jìn)行“加強(qiáng)” 接種，或作為年輕成年人的單獨(dú)加強(qiáng)免疫，或作為化療的輔助治療[15]。第一個重組BCG實例是rBCG30，這是過表達(dá)(約5倍)Ag85B的重組BCG-Tice菌株[16]，Ag85B是分泌蛋白，屬于包含Ag85A、Ag85B和Ag85C的分枝菌酰基(mycolyl)轉(zhuǎn)移酶家族。第二個重組BCG實例是rBCG: Δ ureC-llo+，其為BCG-巴斯德(BCG-Pasteur)脲酶缺陷型菌株，表達(dá)單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶胞素Odisteriolysin 0) [17]。使脲酶缺失是為李斯特菌溶胞素功能提供最適pH的手段，李斯特菌溶胞素?fù)p害吞噬體膜，使BCG滲漏入細(xì)胞質(zhì)，增加將可獲得的抗原提呈給CD8+T細(xì)胞的量。其他人業(yè)已嘗試通過弱化結(jié)核桿菌制備新的活疫苗，理由是這將最近似地模擬結(jié)核分枝桿菌感染后的自然免疫。實例包括結(jié)核分枝桿菌的PhoP突變體[18]和非復(fù)制型結(jié)核分枝桿菌突變菌株(AlysA ApanCD)，后者為賴氨酸和泛酸營養(yǎng)缺陷型[19]?？菇Y(jié)核保護(hù)需要細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這一過程還不完全清楚，但涉及到多種組分，包括⑶4+和⑶8+T細(xì)胞、非傳統(tǒng)的T細(xì)胞如γ δ T細(xì)胞和⑶1限制的α β T細(xì)胞[20， 21]。已證明Y-干擾素(IFN-γ)在控制小鼠和人類結(jié)核中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[22-25]。 因而，主要由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的抗原特異性IFN-Y已廣泛用作保護(hù)性免疫和疫苗效力的度量[26]。鑒定誘導(dǎo)強(qiáng)IFN-Y產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌抗原，一直是用于發(fā)現(xiàn)亞單位疫苗的主要策略。這通過結(jié)核分枝桿菌蛋白混合物(特別是培養(yǎng)物濾液蛋白)的生化分級分離來實現(xiàn)[27-30]。利用這種方法鑒定了幾種抗原，包括分泌性小蛋白ESAT-6 sxA)、ESAT-6 樣蛋白 TB9. 8 (EsxG)和 Mtb9. 9A (EsxN)、CFP-10 (EsxB)、抗原 85 復(fù)合物(Ag85A、B、C)以及幾個PE/PPE家族蛋白(如PPE18、PPE14) [31-36]?；谶@些研究，構(gòu)建了三種融合蛋白 Ag85B-ESAT-6、Ag85B-TB10. 4 (EsxH)和 Mtb72f (PPE18_Rv0125)，它們是目前最先進(jìn)的基于蛋白質(zhì)的亞單位疫苗[36-39]。亦已開發(fā)了基于DNA的亞單位疫苗，其使用復(fù)制缺陷型病毒載體例如腺病毒或痘苗病毒來遞送以刺激更多的⑶8識別所表達(dá)抗原。實例包括MAV-85A，這是表達(dá)Ag85A的痘苗病毒W(wǎng)0];和々6^8-402，這是表達(dá)48854、48858和&1!1的腺病毒-35[41]。發(fā)明概述本發(fā)明提供結(jié)核疫苗，所述結(jié)核疫苗包含過表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白WioP從而誘導(dǎo) PhoP調(diào)節(jié)子表達(dá)的重組結(jié)核分枝桿菌菌株。本發(fā)明還包括過表達(dá)WioP調(diào)節(jié)子中的一個或多個基因的重組BCG菌株。目前BCG菌株的免疫原性不足以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗結(jié)核病的最佳保護(hù)。然而，過表達(dá)WioP和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白的通過基因工程構(gòu)建的BCG菌株具有更好的免疫原性，并將提供更好的保護(hù)。在本發(fā)明實施中可有利地使用過表達(dá)WioP 的任何通過基因工程構(gòu)建的結(jié)核分枝桿菌，所述過表達(dá)以足以引起2倍(或更多)phoP調(diào)節(jié)子基因或蛋白質(zhì)誘導(dǎo)作用的水平進(jìn)行。當(dāng)將本發(fā)明的重組結(jié)核分枝桿菌給予哺乳動物宿主時，引發(fā)針對所誘導(dǎo)的PhoP調(diào)節(jié)子基因編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，這將為哺乳動物宿主提供抗結(jié)核病的保護(hù)。BCG疫苗的效價傳統(tǒng)上是通過測量結(jié)核菌素(tuberculin)敏感性(遲發(fā)型超敏反應(yīng)，DTH或PPD反應(yīng))來測定，這種反應(yīng)由所述疫苗在接種前呈結(jié)核菌素陰性的兒童中誘導(dǎo)產(chǎn)生W2]。如果所檢測的疫苗誘導(dǎo)的結(jié)核菌素敏感性低于其它菌株誘導(dǎo)的，則認(rèn)為該疫苗弱。還可通過進(jìn)行皮內(nèi)接種部位的皮膚損傷或疤痕測定。傳統(tǒng)認(rèn)為結(jié)核菌素反應(yīng)是效力的替代標(biāo)志，并在BCG歷史中發(fā)揮了重要作用，所述作用包括為國家免疫計劃選擇BCG菌株。 結(jié)核菌素反應(yīng)一直用作細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的體內(nèi)測定，并用作免疫原性的標(biāo)志[16，43]。 在英國發(fā)現(xiàn)在BCG接種嬰兒中結(jié)核菌素反應(yīng)和PPD特異性IFN- γ水平之間有強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)性[44]，在結(jié)核流行地區(qū)的另一最新研究發(fā)現(xiàn)，在未成年人中結(jié)核菌素反應(yīng)和IFN-Y釋放 (水平和頻率)二者是抗分枝桿菌免疫的互補(bǔ)測量，并非多余的測量[45]，這些支持上述說法。BCG菌株誘導(dǎo)結(jié)核菌素反應(yīng)的能力差異已經(jīng)在豚鼠和兒童中被證明W6，47]。在所檢測的12株BCG菌株中，與其它BCG菌株比較，BCG-布拉格(BCG-Prague)始終展示出最低的結(jié)核菌素反應(yīng)。因此，捷克斯洛伐克在1951年至1980年間使用的BCG-布拉格，于1981 年被BCG-俄羅斯(BCG-Russia)取代。造成BCG-布拉格結(jié)核菌素反應(yīng)低下的分子因素一直不清楚。但是，本人實驗室最近的工作發(fā)現(xiàn)，BCG-布拉格由于其phoP基因的基因突變而導(dǎo)致無功能的WioP蛋白W8]。BCG-布拉格phoP基因內(nèi)部的移碼突變，消除了 C-末端DNA 結(jié)合域的大部分，這使BCG-布拉格成為天然phoP突變體(

圖1)。WioP是WioP-PhoR雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，對結(jié)核分枝桿菌毒力很重要W9-51]。本人推測BCG-布拉格結(jié)核菌素的極低轉(zhuǎn)化可通過PhoP突變明確解釋。在結(jié)核分枝桿菌phoP缺失突變菌株中， 超過40個基因(定義為phoP調(diào)節(jié)子)被抑制[49，51，52]，其中一些是免疫原性蛋白。這些蛋白質(zhì)很可能有助于結(jié)核菌素反應(yīng)。在BCG-布拉格中，由于菌株的phoP突變，這些免疫原性蛋白不能在BCG-布拉格中正常表達(dá)，從而消除了誘導(dǎo)結(jié)核菌素反應(yīng)的能力。兩者合起來，本人推測WioP的功能直接負(fù)責(zé)BCG的結(jié)核菌素反應(yīng)。因而，過表達(dá)phoP的重組BCG菌株將引起PhoP調(diào)節(jié)子的過表達(dá)，并增強(qiáng)結(jié)核菌素反應(yīng)，這也將引起宿主更好的抗結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)。目前這個推測已經(jīng)由實驗證據(jù)證實(見表1和圖4)。另外，PhoP正向調(diào)控超過40個基因(phoP調(diào)節(jié)子)。過表達(dá)一個或多個WioP調(diào)節(jié)子基因的重組BCG菌株將產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫原性。所述BCG菌株將具有更好的抗結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)效力。本發(fā)明所使用的WioP可以是天然存在的功能性PhoP，所述功能性W10P例如來自分枝桿菌屬(Mycobacterium)，優(yōu)選來自結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌，或其同源物。圖2A呈現(xiàn)了 WioP的例示性氨基酸序列SEQ ID NO 1，圖2B呈現(xiàn)了編碼這一氨基酸序列的例示性核苷酸序列SEQ ID NO :2。這些序列代表來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv phoP基因的WioP，其如在巴斯德研究所的 TubercuList 網(wǎng)站(http//genolist. pasteur. fr/TubercuList/index. html)可獲得的基因組序列中所呈現(xiàn)。本發(fā)明涉及重組牛分枝桿菌BCG，其過表達(dá)編碼SEQ ID NO=I中所示W(wǎng)ioP的DNA。 優(yōu)選所述DNA包含SEQ ID NO :2中的核苷酸序列或由其組成。本發(fā)明涉及包含能過表達(dá)核酸的重組牛分枝桿菌BCG，所述核酸編碼SEQ ID NO 1中所示W(wǎng)ioP。優(yōu)選所述核酸包含SEQ ID NO 2中的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及包含能過表達(dá)核酸的重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述核酸編碼至少一種選自由以下組成的組(WioP調(diào)節(jié)子)的蛋白質(zhì)或多肽Rv0440、Rv0904c、Rv098U Rvl057、Rvll80、Rvll82、Rvll83、Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、Rvl361c、Rvl639c、 Rvl931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv239U Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、 Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、 Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c和Rv3825c。其蛋白質(zhì)序列可在巴斯德研究所的TubercuList 網(wǎng)站(http//Renolist. pasteur. fr/TubercuList/index, html)上獲得。優(yōu)選核酸包含選自以下的至少一種核酸分子的全部或部分Rv0440、Rv0904c、 Rv0981、Rvl057、Rvll80、Rvll82、Rvll83、Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、Rvl361c、 Rvl639c、Rvl931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、 Rv2391、Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、 Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、 Rv3767c,Rv3804c,Rv3822,Rv3823c,Rv3824c 和 Rv3825c。其核苷酸序列可在巴斯德研究所的 TubercuList 網(wǎng)站(http://genolist. pasteur. ft/TubercuList/index, html)上獲得。在一個實施方案中，重組牛分枝桿菌BCG活菌株選自現(xiàn)有的BCG菌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，存在幾種適用于本發(fā)明實施的適宜的BCG，所述BCG包括但不限于牛分枝桿菌BCG-俄羅斯(ATCC編號35740)、牛分枝桿菌BCG-Moreau (ATCC編號35736)、牛分枝桿菌BCG-日本(BCG-Japan，ATCC編號35737)、牛分枝桿菌BCG-瑞典(BCG-Sweden，ATCC編號35732)、牛分枝桿菌BCG-比克海于格(BCG-Birldiaug，ATCC編號35731)、牛分枝桿菌 BCG-布拉格(ATCC編號35742)、牛分枝桿菌BCG-葛蘭素(BCG-Glaxo，ATCC編號35741)、 牛分枝桿菌BCG-丹麥(BCG-Denmark，ATCC編號35733)、牛分枝桿菌BCG-Tice (ATCC編號 35743,27289)、牛分枝桿菌 BCG-Frappier (ATCC :35746, SM-R ；ATCC :35747, INH-R)、牛分枝桿菌 BCG-Connaught (ATCC :35745)、牛分枝桿菌 BCG-Phipps (ATCC 編號35744)、牛分枝桿菌 BCG-巴斯德(ATCC 編號；35734)、BCG-墨西哥(BCG-Mexican，ATCC 編號；35738)和牛分枝桿菌BCG-中國(上海生物制品研究所)。另外，本發(fā)明的重組結(jié)核分枝桿菌不必限于BCG菌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到， 也可使用包括結(jié)核分枝桿菌減毒菌株在內(nèi)的其它分枝桿菌菌株。在再一實施方案中，本發(fā)明疫苗可為亞單位疫苗或DNA疫苗。在某些實施方案中，疫苗經(jīng)由肺病原體遞送。例如，可在肺病原體的染色體或染色體外核酸中荷有編碼 PhoP和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白的DNA序列，所述肺病原體例如銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)減毒菌株，或其它已知的減毒真菌或病毒。作為選擇，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法遞送編碼WioP和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白的核酸， 所述方法例如經(jīng)由脂質(zhì)體、腺病毒載體等。本發(fā)明另一方面是包含重組牛分枝桿菌BCG活菌株的藥物組合物，所述菌株包含能過表達(dá)的核酸，所述核酸編碼功能性PhoP，例如SEQ ID NO 1所示的WioP。該核酸例如在SEQ ID NO 2中顯示。本發(fā)明還涉及包含能過表達(dá)核酸的重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述核酸編碼選自以下的至少一種蛋白質(zhì)或多肽Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rvl057、Rvll80、Rvll82、 Rvll83、Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、Rvl361c、Rvl639c、Rvl931c、Rv2227、Rv2276、 Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv239U Rv2392、Rv2396、Rv2590、 Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、 Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、 Rv3824c 和 Rv3825c。本發(fā)明的再一方面是包含重組牛分枝桿菌BCG活菌株的藥物組合物，所述菌株包含能過表達(dá)的核酸，所述核酸包含選自以下的至少一種核酸分子的全部或部分Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rvl057、Rvll80、Rvll82、Rvll83、Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、 Rvl361c、Rvl639c、Rvl931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、 Rv2376c、Rv2391、Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、 Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、 Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c 和 Rv3825c。在再一實施方案中，本發(fā)明疫苗可為亞單位疫苗或DNA疫苗。在某些實施方案中， 疫苗將經(jīng)由肺病原體遞送。例如，可在肺病原體的染色體或染色體外核酸中荷有編碼WioP 和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白的DNA序列，所述肺病原體例如銅綠假單胞菌減毒菌株，或其它已知的減毒真菌或病毒。作為選擇，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法遞送編碼W10P和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白的核酸，所述方法例如經(jīng)由脂質(zhì)體、腺病毒載體等。本發(fā)明的另一方面是用于哺乳動物治療或預(yù)防分枝桿菌攻擊的疫苗或免疫原性組合物，所述疫苗或組合物包含重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述菌株包含能過表達(dá)的核酸，所述核酸編碼WioP，例如在SEQ ID N0:1中所示的WioP。優(yōu)選所述核酸包含SEQ ID NO 2中所示的核苷酸序列或由其組成。本發(fā)明另一方面為用于哺乳動物治療或預(yù)防分枝桿菌攻擊的疫苗或免疫原性組合物，所述疫苗或組合物包含重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述菌株包含能過表達(dá)的核酸，所述核酸編碼選自以下的至少一種蛋白質(zhì)或多肽Rv0440、Rv0904c、Rv098U Rvl057、 Rvll80、Rvll82、Rvll83、Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、Rvl361c、Rvl639c、Rvl931c、 Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv2391、Rv2392、 Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、 Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、 Rv3822、Rv3823c、Rv3824c 和 Rv3825c。本發(fā)明再一方面為用于哺乳動物治療或預(yù)防分枝桿菌攻擊的疫苗或免疫原性組合物，所述疫苗或組合物包含重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述菌株包含能過表達(dá)的核酸，所述核酸包含選自以下的至少一種核酸分子的全部或部分Rv0440、Rv0904c、Rv0981、 Rvl057、Rvll80、Rvll82、Rvll83、Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、Rvl361c、Rvl639c、 Rvl931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv239U Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、 Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、 Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c 和 Rv3825c。在優(yōu)選實施方案中，疫苗或免疫原性組合物用于哺乳動物治療或預(yù)防結(jié)核分枝桿菌的攻擊。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明疫苗或免疫原性組合物另外包含藥物上可接受的載體。在又一優(yōu)選實施方案中，疫苗或免疫原性組合物進(jìn)一步包含佐劑。在另一實施方案中，疫苗或免疫原性組合物進(jìn)一步包含來自一個或多個其它病原體的免疫原性物質(zhì)。本發(fā)明另一方面涉及用于哺乳動物治療或預(yù)防結(jié)核分枝桿菌或牛結(jié)核桿菌攻擊的方法，所述方法包括給予哺乳動物本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物。在一個實施方案中， 哺乳動物為牛。在另一個實施方案中，哺乳動物為人。在又一實施例中，疫苗或免疫原性組合物在佐劑存在下給予。
本發(fā)明另一方面為用于治療或預(yù)防哺乳動物癌癥的方法，所述方法包括給予哺乳動物本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物。在一個實施方案中，癌癥為膀胱癌。在另一個實施方案中，疫苗或免疫原性組合物在佐劑存在下給予。本發(fā)明另一方面為本發(fā)明疫苗或免疫原性組合物在用于治療或預(yù)防哺乳動物抗癌的藥物中的用途。在一個實施方案中，癌癥是膀胱癌。附圖簡述圖1.顯示BCG-布拉格的phoP基因內(nèi)部的單核苷酸(G)插入的DNA測序色譜圖。 這一突變已通過重復(fù)PCR擴(kuò)增和DNA測序證實。圖2. A.結(jié)核分枝桿菌H37Rv的W10P氨基酸序列；B.結(jié)核分枝桿菌H37Rv的phoP DNA序列。圖3. pME穿梭載體的構(gòu)建。圖4. phoP克隆到穿梭載體pME中。用分別含有KpnI和I^stI限制性酶切位點(diǎn)(下劃線部分)的正向引物(5，-AAAAAGGTACCGCTTGTTTGGCCATGTCAAC-3‘)和反向引物(5，-AA AAACTGCAGGCTGCCGATCCGATTAACTAC-3，)從結(jié)核分枝桿菌基因組DNA擴(kuò)增1028個堿基對的產(chǎn)物。利用這些限制性酶切位點(diǎn)，用KpnI和I^stI位點(diǎn)將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到穿梭載體pME 中，以產(chǎn)生pME:phoP?？寺〉膮^(qū)域含有phoP起始位點(diǎn)上游的257個堿基對。圖5. BCG中phoP的過表達(dá)增強(qiáng)免疫原性。過表達(dá)phoP的BCG菌株實例(BCG-日本和BCG-布拉格)與對照BCG相比提高了免疫原性。分別用5X IO5CFU的標(biāo)明的重組 BCG (BCG-日本 /pME phoP、BCG-布拉格 /pME phoP)、相應(yīng)的對照 BCG (BCG-日本 /pME、 BCG-布拉格/pME)或PBS (首次接受試驗的小鼠)，來免疫C57BL/6小鼠(每組4只)。接種八周后，將小鼠處死，制備脾細(xì)胞。(A)IFN-Y產(chǎn)生的ELISA分析。脾細(xì)胞在進(jìn)行ELISA 分析之前，使用或不使用PPD ((10 μ g/ml))孵育72小時。結(jié)果來自每組4只小鼠，并且扣除了無抗原刺激的同樣樣品的讀數(shù)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。(B)CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子應(yīng)答的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色分析。使用或不使用PPD將脾細(xì)胞孵育M小時，隨后進(jìn)行表面標(biāo)記 (CD3-太平洋藍(lán)、CD4-PE-Cy-7)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子(分別為IFN- γ -ΡΕ、TNF-PE, IL-2-PE) 染色。用FACS Calibur分析樣品。測定了⑶4+Τ細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的頻率，計算并提交了每一脾的細(xì)胞總數(shù)。圖5表明，過表達(dá)phpP的BCG菌株所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答提高。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了疫苗或免疫刺激組合物，所述疫苗或組合物包括一種或多種基因工程分枝桿菌，所述基因工程分枝桿菌過表達(dá)WioP這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)和/或一種或多種PhoP調(diào)節(jié)子蛋白。BCG是牛分枝桿菌(M. bovis)減毒活菌株。人們早就知道，給予死BCG菌株引起微弱而短暫的免疫應(yīng)答。然而，人們認(rèn)識到當(dāng)前BCG活菌株的免疫原性也并非最佳，這解釋了當(dāng)前的BCG菌株為何不能提供有效的保護(hù)。目前已嘗試各種策略來提高BCG的免疫原性， 例如通過過表達(dá)抗原85 (85A或85B)，或通過在BCG中表達(dá)李斯特菌溶胞素，以允許BCG逃進(jìn)受感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，以便更好地進(jìn)行抗原提呈[15]。這兩種重組BCG菌株都已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗或接受臨床前研究用于開發(fā)為新的結(jié)核疫苗[15]。然而，結(jié)核分枝桿菌含有的基因超過4，000個，其中許多為免疫原性蛋白。很顯然，對于有待在BCG中表達(dá)以提高其免疫原性的抗原的選擇工作遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有完成，為此目的的抗原選擇往往缺乏一個明確的原理。因此，科學(xué)界的研究人員繼續(xù)尋找可在BCG中過表達(dá)的新抗原或重要基因。例如，為此目的，目前正在開發(fā)參與潛伏(‘DosR調(diào)節(jié)子’)和再激活/復(fù)蘇的抗原[53]。結(jié)核菌素反應(yīng)繼續(xù)作為一種方便有效的方法用于評估候選疫苗的免疫原性[16， 43]。支持結(jié)核菌素反應(yīng)性和保護(hù)效力之間呈正相關(guān)的證據(jù)包括對BCG-Tice的研究。 Horwitz及同事已經(jīng)將BCG-Tice作為宿主菌用于過表達(dá)抗原85B。這樣產(chǎn)生了命名為 rBCG30的重組菌株，該菌株表現(xiàn)出優(yōu)于BCG-Tice的保護(hù)效果，目前正作為候選疫苗在人臨床試驗中進(jìn)行評估[16，28，54，55]。rBCG30Tice菌株比基于BCG-Connaught的rBCG30 菌株對結(jié)核分枝桿菌攻擊顯示出更為顯著強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答和更好的保護(hù)。在最近的包括 BCG-巴斯德、BCG-Frappier、BCG-Moreau、BCG-丹麥、BCG-瑞典、BCG-Connaught、BCG-比克海于格、BCG-Phipps和BCG-墨西哥在內(nèi)的BCG菌株比較研究中，BCG-Tice顯示出最強(qiáng)的誘導(dǎo)小鼠結(jié)核菌素反應(yīng)的能力[56]，這解釋了其優(yōu)于BCG-Cormaught的效果。本發(fā)明基于我們最近的發(fā)現(xiàn)(BCG-布拉格含有遭破壞的phoP)以及本人所發(fā)現(xiàn)的 BCG-布拉格phoP突變體與其誘導(dǎo)結(jié)核菌素反應(yīng)能力下降之間的關(guān)聯(lián)。歷史上已充分認(rèn)識到，BCG菌株誘導(dǎo)兒童結(jié)核菌素反應(yīng)的能力是變化的。但是，隱含的分子機(jī)制尚不清楚。本人實驗室最近的研究發(fā)現(xiàn)，一種BCG菌株即BCG-布拉格為天然phoP突變體W8](圖1)。 WioP是結(jié)核分枝桿菌的重要毒力因子，它正向調(diào)控超過40個基因的表達(dá)W9，51，57]。因此，phoP突變是造成BCG-布拉格進(jìn)一步弱化的原因。然而，本人推測phoP突變也是造成 BCG-布拉格另一個重要臨床特性的原因，該特性就是誘導(dǎo)結(jié)核菌素反應(yīng)的能力極低。以往的研究表明，在檢測的所有BCG菌株中，BCG-布拉格在動物模型和兒童中表現(xiàn)出最低的誘導(dǎo)結(jié)核菌素反應(yīng)的能力W6，47]。其結(jié)核菌素反應(yīng)極低的原因尚不清楚。本人首次提出 PhoP突變是造成BCG-布拉格結(jié)核菌素反應(yīng)性低的原因，且WioP功能直接負(fù)責(zé)BCG的結(jié)核菌素反應(yīng)性或免疫原性。因此，在BCG菌株中過表達(dá)WioP和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白，將增強(qiáng)其作為疫苗的免疫原性并提高保護(hù)效力。這些新理念是有意義的，因為迄今為止WioP只被認(rèn)為是一種毒力因子，因此，結(jié)核分枝桿菌PhoP缺失突變體被認(rèn)為是一種新的候選疫苗[50]。這是首次將在BCG菌株中過表達(dá)WioP和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白作為新的疫苗策略來考慮。過表達(dá)WioP和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白的重組BCG 菌株將誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，并將提供更有效的疫苗以預(yù)防結(jié)核病。這一推測得到了我們的實驗數(shù)據(jù)的證實。微陣列分析表明，BCG-布拉格/pME:phoP的45個基因被上調(diào)了
倍)，這些基因包括屬于WioP調(diào)節(jié)子的7個基因(表1)。低程度的重疊可能是由于這些研究中不同的WioP水平所致；以往的研究比較了結(jié)核分枝桿菌phoP突變體與野生型菌株，而我們的試驗比較了 BCG-布拉格(phoP突變體)和過表達(dá)phoP的BCG-布拉格。與本專利申請相關(guān)的一個重要發(fā)現(xiàn)是BCG中phoP的過表達(dá)，不僅增加了 Ag85A和PPE18的表達(dá)，還增加了 10 種 ESAT-6/CFP-10 樣蛋白(Esxl、J、K、L、M、N、O、P、V、W)和 7 種其它 PE/PPE 蛋白的表達(dá)(表1)，其中許多是已知的有效T細(xì)胞抗原，其中的幾個已開發(fā)為亞單位疫苗的組分(如Ag85A、PPE18、EsxN) [35，38，40，41]。這些結(jié)果支持本人的推測，即BCG中phoP的過表達(dá)提高了多種有效T細(xì)胞抗原的表達(dá)。我們的結(jié)論進(jìn)一步得到了直接證據(jù)的支持，即在 BCG菌株如BCG-日本中過表達(dá)phoP，誘導(dǎo)提高的⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答；與對照BCG(BCG-日本) 比較，無論是PPD誘導(dǎo)的IFN- γ產(chǎn)生的量級(ELISA測定)，還是PPD特異性的產(chǎn)生IFN- γ的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量(通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞儀測定)，都顯著增加O倍，P < 0.001)(圖5)。由于IFN-γ在控制結(jié)核病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22-25]，并一直是最常用的篩選結(jié)核疫苗的生物標(biāo)志D6]，因此這一結(jié)果表明，過表達(dá)WioP的重組BCG菌株比目前的 BCG菌株具有更好的保護(hù)效力。觀察到過表達(dá)phoP的BCG-布拉格有類似的結(jié)果(圖5)。 這些結(jié)果支持本人的推測，即BCG-布拉格的phoP突變是造成其免疫原性低的原因，因為在 BCG-布拉格中phoP過表達(dá)使其水平恢復(fù)到BCG-日本的水平。BCG-日本中更多抗原蛋白的存在可以解釋由BCG-日本/pME: phoP誘導(dǎo)的應(yīng)答水平高于BCG-布拉格/pME: phoP水平的原因，即BCG-日本是比“晚期”菌株如BCG-布拉格含有更少基因組缺失的“早期”BCG菌株[58，59]。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了本人發(fā)明的關(guān)鍵理念，即在BCG菌株或其它分枝桿菌株中PhoP的過表達(dá)將增強(qiáng)免疫原性。牛分枝桿菌BCG還用于膀胱癌的治療。許多臨床隨機(jī)對照試驗表明，BCG膀胱內(nèi)給藥可以預(yù)防或延緩腫瘤復(fù)發(fā)WO]。BCG如何發(fā)揮這種作用的詳細(xì)情況仍有待確定。然而， 抗腫瘤應(yīng)答需要完整的T細(xì)胞應(yīng)答，并涉及提高包括TNF-α和IL-6在內(nèi)的Thl型細(xì)胞因子的表達(dá)Wl]。因此，證明免疫原性提高的BCG菌株可提供提高的抗腫瘤活性?？傊?，我們用過表達(dá)WioP和/或一種或多種WioP調(diào)節(jié)子蛋白的重組BCG菌株作為疫苗，預(yù)防結(jié)核和其它分枝桿菌感染。這些重組BCG菌株將誘導(dǎo)更好的針對結(jié)核的免疫保護(hù)。在本發(fā)明基因工程(即重組)分枝桿菌中，WioP蛋白被過表達(dá)，即該蛋白表達(dá)水平超過了合適的對照生物體的表達(dá)水平，所述對照生物體例如未進(jìn)行基因工程改造以過表達(dá)WioP的同樣的分枝桿菌。本領(lǐng)域的技術(shù)人員非常熟悉蛋白質(zhì)活性的比較測量法，及用于所述測量的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)和對照?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)已知的任何合適方法實施分枝桿菌的WioP或WioP調(diào)節(jié)子蛋白的過表達(dá)。通常所述方法應(yīng)包括將編碼WioP或WioP調(diào)節(jié)子蛋白的核酸序列連接到表達(dá)調(diào)控序列，該調(diào)控序列在自然界不與PhoP基因或WioP調(diào)節(jié)子基因連接。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，許多這樣的表達(dá)調(diào)控序列是已知的，并適合用于本發(fā)明。例如，如果需要PhoP或 WioP調(diào)節(jié)子基因的組成型表達(dá)，那么表達(dá)調(diào)控序列(例如啟動子及相關(guān)序列)包括但不限于分枝桿菌最適啟動子(optimal promoter) :hsp65、ace或msp 12啟動子、T7啟動子等等。作為選擇，PhoP過表達(dá)可為誘導(dǎo)型的，例如在四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子控制下的誘導(dǎo)型。根據(jù)本發(fā)明編碼的蛋白質(zhì)、多肽或肽包括天然存在的蛋白質(zhì)、多肽或肽，或具有與天然存在的蛋白質(zhì)、多肽或肽相同功能的其同源物。所述同源物包括與天然存在的蛋白質(zhì)、 多肽或肽(例如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列)具有以下同源性的的蛋白質(zhì)、多肽或肽 至少60 %，優(yōu)選約70 %或更多、80 %或更多，最優(yōu)選90 %或更多，例如95 %、96 %、97 %、98 或99%。所述同源物包括在天然存在的蛋白質(zhì)、多肽或肽的氨基酸序列中(例如在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中)，含一個或多個(例如1-50、1-20、1-10、1-5)氨基酸殘基的取代、添加或缺失的蛋白質(zhì)、多肽或肽。所述同源物尤其包括具有一個或多個保守氨基酸取代的蛋白質(zhì)、多肽或肽。本文所用術(shù)語“PhoP”或“PhoP蛋白”，指雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)WioP-PhoR中的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白PhoP，其亦為轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)本發(fā)明編碼的WioP包括天然存在的功能性的WioP，例如來自分枝桿菌屬，優(yōu)選來自結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌的功能性PhoP，或如上所述的其同源物。WioP的例示性氨基酸序列在圖2A SEQ ID NO :1中顯示。本文所用術(shù)語“WioP調(diào)節(jié)子”指由WioP正向調(diào)控的基因。本文所用術(shù)語“過表達(dá)”指目的基因的蛋白質(zhì)水平為細(xì)菌中內(nèi)源性同種蛋白的2 倍或更多倍，可以通過基因工程如使用多拷貝質(zhì)粒和/或強(qiáng)啟動子來實現(xiàn)過表達(dá)。核酸分子變異修飾可對本申請揭示的核酸分子DNA序列進(jìn)行多種修飾，這些修飾對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見。本發(fā)明包括本申請所揭示序列(或其片段)的核苷酸修飾，所述修飾在細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞中編碼與本申請揭示的蛋白質(zhì)或肽具有相同功能的蛋白質(zhì)或肽。修飾包括一個或多個(例如1-50、1-20、1-10、1-5)核苷酸的取代、插入或缺失，或改變一個或多個(例如1-50、1-20、1-10、1-5)核苷酸的相對位置或順序。核酸分子可編碼WioP或WioP調(diào)節(jié)子蛋白中的保守氨基酸變化。本發(fā)明包括編碼W10P和WioP調(diào)節(jié)子蛋白中的保守氨基酸變化及產(chǎn)生沉默氨基酸變化的功能等同的核酸分子。用于憑經(jīng)驗鑒別保守氨基酸取代組的方法為本領(lǐng)域所熟知(參見例如mi， Thomas D. "Discovering Emperically Conserved Amino Acid Substitution Groups in Databases of Protein Families”(“在蛋白家族數(shù)據(jù)庫中憑經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)保守氨基酸取代組”)(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov:80/entrez/query. fcRi ？ cmd = Retrieve&db = PubMed&list uids = 8877523&dopt = Abstract)。核酸分子可編碼WioP和/或WioP調(diào)節(jié)子基因的非保守氨基酸的取代、添加或缺失。本發(fā)明包括產(chǎn)生WioP和/或I^hoP調(diào)節(jié)子蛋白的氨基酸序列內(nèi)的非保守氨基酸變化的功能等同的核酸分子。功能上等同的核酸分子包括DNA和RNA，其編碼具有非保守氨基酸取代(優(yōu)選化學(xué)上相似的氨基酸的取代)、添加或缺失的肽及蛋白質(zhì)，所述肽及蛋白質(zhì)仍保留本申請揭示的WioP和WioP調(diào)節(jié)子蛋白或肽的相同或類似功能。本發(fā)明包括編碼WioP和 PhoP調(diào)節(jié)子蛋白的片段或變體的DNA或RNA。所述片段可用作免疫原并用于免疫原組合物中。所述片段和變體的WioP和WioP調(diào)節(jié)子樣活性通過下述測定來鑒別。序列同一性本發(fā)明的核酸分子還包括與本發(fā)明的核酸分子具有至少大約以下同一性的核酸分子(或其片段)60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性，或最優(yōu)選至少99% 或99. 5%同一性，其為能夠在細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的核酸分子。同一性指經(jīng)比對以獲得最高等級匹配的兩個核苷酸序列的相似性。同一性根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來計算。例如，如果一個核苷酸序列(稱為“序列A”)與SEQ ID NO :2的一部分有90%的同一性，那么序列A除了可能包括SEQ ID NO 2中所述部分的每100個核苷酸多達(dá)10個點(diǎn)突變(例如用其它核苷酸取代)外，應(yīng)與SEQ ID NO 2的所述部分相同。序列同一性(每個構(gòu)建體優(yōu)選沒有編碼核酸分子插入)優(yōu)選設(shè)定為與SEQ ID NO 2中提供的序列或其互補(bǔ)序列至少約以下同一性70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性， 或最優(yōu)選至少99%或99. 5%同一性。序列同一性優(yōu)選用來自Bioinformatics (威斯康星
12大學(xué)(University of Wisconsin))的GCG程序進(jìn)行計算。其它程序也可用于計算序列同一性，所述其它程序例如Clustal W程序(優(yōu)選用默認(rèn)參數(shù)，Thompson, JD等，Nucleic Acid Res. 22 :4673-4680) ；BLAST P ；BLAST X 算法；基因組研究所(The Institute for Genomic Research)的鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium) BLASTN(http: tigrblast. tigr. org/) ；We 11 come Trust Sanger Institute的牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG(巴斯德)、 海分枝桿菌(M. mastarinum)、麻風(fēng)病桿菌(M. leprae)、結(jié)核分枝桿菌BLASTN(http:// www, sanger. ac. uk/Pro iects/Microbes/)；巴斯德研究所的結(jié)核分枝桿菌BLAST搜索 (Tuberculist) (http//Renolist. pasteur. fr/TubercuList/)；巴斯德石if究所(Institute Pasteur)的麻風(fēng)病桿菌 BLAST 搜索(Leproma) (http //genolist. pasteur. fr/Leproma/)； 明尼蘇達(dá)大學(xué)(University of Minnesota)微生物基因組計劃的副結(jié)核分枝桿菌 (M. Paratuberculosis)BLASTN(http//www, cbc. umn. edu/ResearchProiects/Ptb/ 禾口 http //www, cbc. umn. edu/ResearchPro iects/AGAC/Mptb/Mptbhome. html)；美國國家生 iIUii^ffEΦ^^ (the National Center for Biotechnology Information-USA)白勺#禾中 BLAST 搜索(http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)；和 GenomeNet 的各種 BLAST 搜索 (B ioinformatics Center-Institute for Chemical Research)(http://blast, genome, ad. jp/)。因為遺傳密碼具有簡并性，所以SEQ ID NO 2中的核酸序列不是唯一能編碼具有 WioP活性的多肽的序列。本發(fā)明包括具有與SEQ ID NO :2所述的核酸分子相同的基本遺傳信息的核酸分子。與本申請中所述序列比較有一個或多個核酸改變并導(dǎo)致產(chǎn)生SEQ ID NO 1中所示的多肽的核酸分子(包括RNA)落入本發(fā)明范圍內(nèi)?？捎贸Ｒ?guī)DNA-DNA或DNA-RNA雜交技術(shù)分離編碼WioP和WioP調(diào)節(jié)子蛋白的核酸的其它功能等同物形式。雜交本發(fā)明包括具有足以在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與本申請所述核酸分子雜交(雜交技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知)的同一性的序列的DNA。本發(fā)明還包括與SEQ ID NO :2中的一個或多個序列或其互補(bǔ)序列雜交的核酸分子。所述核酸分子優(yōu)選在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交(參見 Sambrook 等· Molecular Cloning :A Laboratory Manual,最新版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)。高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌優(yōu)選低鹽(優(yōu)選約 0.2%的 SSC)和約50-65°C的溫度。疫苗本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道重組活疫苗的制備。通常將所述疫苗制備為注射劑，作為液體溶液劑或混懸劑；也可制備為適合在注射前溶于液體中的溶液劑或混懸劑的固體形式。亦可乳化所述制劑，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)包裹在脂質(zhì)體中。通常讓活免疫原性成分與藥物上可接受并與活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑為例如水、鹽、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。另外，如果需要，疫苗可包含少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖劑和/或增強(qiáng)疫苗效力的佐劑。可能有效的佐劑實例包括但不限于氫氧化鋁、N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(CGP 11637， 稱為nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1' -2' -二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)和RIBI，RIBI含有在2%角鯊烯/Tween 80 乳液中的從細(xì)菌中提取的三種組分單磷酰脂質(zhì)A、海藻糖二霉酸酯和細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)?？赏ㄟ^測量因給予重組牛分枝桿菌BCG活疫苗而產(chǎn)生的針對免疫原性多肽的抗體的量來測定佐劑的有效性，所述免疫原性多肽含有結(jié)核分枝桿菌抗原序列，所述疫苗還含有各種佐劑。疫苗通過注射(例如皮下或肌肉注射)常規(guī)胃腸外給予。適于其它給藥方式的另外的制劑包括栓劑及在某些情況下的口服制劑。對于栓劑，傳統(tǒng)的粘合劑和載體可包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；所述栓劑可由含有0. 5% -10%、優(yōu)選-2%活性成分的混合物形成?？诜苿┌ㄍǔ２捎玫馁x形劑，例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、 糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物制成溶液劑、混懸劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或散劑的形式，并含有10% -95%的活性成分，優(yōu)選25% -70%的活性成分。疫苗以與劑量制劑相容的方式給予并以有效預(yù)防和/或治療的量給予。疫苗可以以單劑量方案給予，或優(yōu)選以多劑量方案給予。多劑量方案是這樣的方案，其中初次接種疫苗過程可用1-10個單獨(dú)的劑量，接著在維持和或加強(qiáng)免疫應(yīng)答所需的隨后時間間隔給予其它劑量，例如在1-4個月給予第二劑量，如果需要，幾個月后給予隨后的劑量。給藥方案至少部分還將根據(jù)個體需要來確定，并且有賴于從業(yè)人員的判斷。另外，聯(lián)合其它免疫調(diào)節(jié)劑(例如免疫球蛋白)給予重組牛分枝桿菌BCG活疫苗。本發(fā)明主題亦為多價疫苗配方，所述多價疫苗配方作為待混合的混合物包含如上所定義的重組牛分枝桿菌BCG活疫苗與另一種疫苗，特別是如上所定義的另一種重組牛分枝桿菌BCG活疫苗，這些疫苗包含不同的插入序列。藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物用于哺乳動物針對結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌攻擊的治療或預(yù)防。本發(fā)明的藥物組合物也用于治療患有退行性疾病、機(jī)能障礙或身體狀態(tài)異常例如癌癥的患者。藥物組合物可通過例如片劑、氣霧劑給予、氣管內(nèi)灌注和靜脈注射方法給予人或動物。
實施例實施例1.過表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白phoP的BCG菌株的構(gòu)建如下獲得含有T7啟動子的卡那霉素(kanamycin)抗性穿梭載體用EcoRI酶切 PDrive克隆載體(自Qiagen獲得)，經(jīng)自我連接產(chǎn)生pDRI。用kpl消化pDRI，分離1903個堿基對的片段產(chǎn)物。用SspI消化pMD31穿梭載體(Wu等，1993，Molecular Microbiology, 7，407-417)，分離3379個堿基對的片段。這兩個由kpl產(chǎn)生的片段連接產(chǎn)生pME (5282個堿基對)，其含有PDRIVE的原始T7啟動子(見圖3)。用分別含有KpnI和pstl酶切位點(diǎn)(下劃線部分)的正向引物(5，-AAAAAGGTACC GCTTGTTTGGCCATGTCAAC-3，)和反向引物(5，-AAAAACTGCAGGCTGCCGATCCGATTAACTAC-3‘)， 從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株(ATCC 25618)擴(kuò)增野生型結(jié)核分枝桿菌phoP基因。設(shè)計正向引物使其含有PhoP起始密碼子上游的257個堿基對，這使得可正確表達(dá)phoP基因。用來自野生型結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組DNA為模板實施PCR反應(yīng)。用KpnI和I^stI消化所得到的PCR產(chǎn)物，將得到的片段克隆到pME載體中，從而產(chǎn)生定名為pME:phoP的質(zhì)粒 (圖4)。通過DNA測序確證該構(gòu)建體。如下完成重組BCG的產(chǎn)生用pME:phoP質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化牛分枝桿菌BCG-日本(ATCC 35737)和牛分枝桿菌BCG-布拉格(ATCC3574》細(xì)胞，將經(jīng)電穿孔的細(xì)胞涂布到補(bǔ)充10% OADC(Difco)和25 μ g/ml卡那霉素的7H11培養(yǎng)基平板上。37°C孵育4周后，挑選單菌落，在補(bǔ)充10% ADC (Difco)和25 μ g/ml卡那霉素的7H9液體培養(yǎng)基中生長。在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，從所挑選的菌落分離質(zhì)粒DNA，用限制性酶切和凝膠電泳檢查。所有菌落給出的質(zhì)粒DNA的大小及限制性酶切圖譜皆表明構(gòu)建體轉(zhuǎn)化成功，由此建立了新的重組 BCG-日本/pME:phoP和重組BCG-布拉格/pME:phoP。隨后將Iml培養(yǎng)液和Iml 50%無菌甘油溶液混合并保存于-80°C，來制備BCG-日本/pMEphoP和BCG-布拉格/pMEphoPphoP 冷凍貯液。實施例2.過表達(dá)phoP的重組BCG-布拉格基因誘導(dǎo)的測定為了測定phoP過表達(dá)對BCG基因表達(dá)的影響，進(jìn)行微陣列分析以比較BCG-布拉格/pME:phoP和荷有pME空載體的野生型BCG-布拉格的轉(zhuǎn)錄概況。讓菌株在補(bǔ)充10% ADC(Difco)和0. 05%吐溫80的7H9液體培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)，直到0D_值達(dá)到0. 4至 0. 5。為了分離總RNA，沉淀細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移至含有Iml細(xì)菌RNA保護(hù)試劑(RNA protect Bacterial Reagent, Qiagen)的2毫升帶螺帽管中，室溫下孵育5分鐘。細(xì)胞再次沉淀， 用 400 μ 1 裂解液(20mM NaCH3COOH^O. 5% SDSUmM EDTA，pH 4)禾口 Iml 酚 / 氯仿(pH 4. 5， Sigma)重新懸浮。通過三次30秒-脈沖用玻璃珠擊打破碎細(xì)胞。然后，將細(xì)胞于65°C孵育 4分鐘，然后4°C5分鐘，以13000rpm離心5分鐘。然后，用300 μ 1氯仿/異戊醇Q4 1) 提取上清液，并用異丙醇沉淀。然后用標(biāo)準(zhǔn)程序分離總RNA。為制備cDNA，用 100 μ 1 總體積(25mM Tris pH 8. 4,37. 5mMKCl、3mM MgClJPO. IM DTT)中的 2μ1 Superscript II 逆轉(zhuǎn)錄酶 Qnvitrogen)、25 μ g 9 聚物隨機(jī)引物和 2ul dNTP 混合物(0. 5mM dATP、0. 5mM dCTP、0. 5mM dGTP、0. 25mM dTTP、0. 25mM 5-(3-氨基烯丙基)-dUTP)在42°C過夜逆轉(zhuǎn)錄25 μ g總RNA。通過加入1/3體積的IM NaOH水解RNA，然后在 65°C孵育20分鐘后用1/3體積HCl中和。用QIAquick柱^jiagen)純化cDNA。在室溫下標(biāo)記 cDNA 1小時，然后用4M羥胺終止。純化標(biāo)記的cDNA，每個樣品2 μ g與15，000-feature結(jié)核分枝桿菌H37Rv ORF陣列進(jìn)行雜交，每個ORF用三個不同的探針(Agilent Technologies), 用Gen印ix專業(yè)4200A掃描儀進(jìn)行掃描。實施微陣列顯著性分析(SAM)來鑒定顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，結(jié)果示于表1。結(jié)果表明，與攜帶空載體的對照BCG比較，攜帶pME:phoP質(zhì)粒的重組BCG菌株顯示出45種基因的表達(dá)提高，這些基因包括熟知的T細(xì)胞抗原Ag85A、10種ESAT-6/CFP-10 樣蛋白(EsxI、J、K、L、M、N、0、P、V、W)、PPE18 和另外 7 種 PE/PPE 蛋白。表1.在過表達(dá)phoP的BCG-布拉格中上調(diào)的45個基因列表。7個與WioP調(diào)節(jié)子重疊的基因以紅色突出顯示，10個esx家族基因以藍(lán)色突出顯示。數(shù)據(jù)來自3個生物重復(fù)樣品，并經(jīng)SAM分析產(chǎn)生，Q值彡10%。
權(quán)利要求
1.重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述菌株包含能過表達(dá)核酸，所述核酸編碼WioP蛋白。
2.權(quán)利要求1的重組牛分枝桿菌BCG活菌株，其中所述W10P蛋白來自結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)或牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。
3.權(quán)利要求1的重組牛分枝桿菌BCG活菌株，其中所述核酸編碼(i)SEQID NO 1中所示的氨基酸序列；或(ii)在SEQID NO :1所示的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸取代、添加或缺失的 PhoP蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的重組牛分枝桿菌BCG活菌株，其中所述核酸包含(i)SEQ ID NO 2中所示的核苷酸序列；( )在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與(i)中的核苷酸序列雜交的序列；(iii)具有與SEQID NO :2中所示的核苷酸序列至少60%序列同一性的序列。
5.重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述菌株包含能過表達(dá)核酸，所述核酸編碼至少一種選自以下的蛋白質(zhì)或多Jft :Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rvl057、Rvll80、Rvll82、Rvll83、 Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、Rvl361c、Rvl639c、Rvl931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、 Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv239U Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、 Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、 Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c 和 Rv3825c0
6.重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述菌株包含能過表達(dá)核酸，所述核酸包含選自以下的至少一種核酸分子的全部或部分Rv0440、Rv0904c、Rv0981、Rvl057、Rvll80、Rvll82、 Rvll83、Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、Rvl361c、Rvl639c、Rvl931c、Rv2227、Rv2276、 Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv239U Rv2392、Rv2396、Rv2590、 Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、Rv3343c、Rv3477、Rv3478、 Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、 Rv3824c 和 Rv3825c。
7.重組牛分枝桿菌BCG活菌株，所述菌株包含能過表達(dá)核酸，所述核酸包含具有與選自以下的至少一種核酸分子至少60%序列同一性的序列Rv0440、Rv0904c、Rv0981、 Rvl057、Rvll80、Rvll82、Rvll83、Rvll84c、Rvll85c、Rvll95、Rvll96、Rvl361c、Rvl639c、 Rvl931c、Rv2227、Rv2276、Rv2288、Rv2289、Rv2329c、Rv2332、Rv2375、Rv2376c、Rv239U Rv2392、Rv2396、Rv2590、Rv2987c、Rv3135、Rv3136、Rv3197、Rv3312A、Rv3331、Rv3332、 Rv3343c、Rv3477、Rv3478、Rv3479、Rv3486、Rv3487c、Rv3613c、Rv3686c、Rv3689、Rv3767c、 Rv3804c、Rv3822、Rv3823c、Rv3824c 和 Rv3825c。
8.權(quán)利要求1-5中任一項的重組牛分枝桿菌BCG活菌株，其中所述核酸分子經(jīng)過修飾。
9.權(quán)利要求1-5中任一項的重組牛分枝桿菌BCG活菌株，其中所述牛分枝桿菌BCG菌株選自現(xiàn)有的BCG菌株，所述現(xiàn)有的BCG菌株包括但不限于牛分枝桿菌BCG-俄羅斯(ATCC 編號35740)、牛分枝桿菌BCG-Moreau (ATCC編號35736)、牛分枝桿菌BCG-日本(ATCC編號35737)、牛分枝桿菌BCG-瑞典(ATCC編號35732)、牛分枝桿菌BCG-比克海于格(ATCC 編號35731)、牛分枝桿菌BCG-布拉格(ATCC編號35742)、牛分枝桿菌BCG-葛蘭素(ATCC 編號35741)、牛分枝桿菌BCG-丹麥(ATCC編號35733)、牛分枝桿菌BCG-Tice (ATCC編號35743、27289)、牛分枝桿菌 BCG-Frappier (ATCC 35746，SM-R ；ATCC 35747，INH—R)、 牛分枝桿菌 BCG-Connaught (ATCC :35745)、牛分枝桿菌 BCG-Phipps (ATCC 編號35744)、牛分枝桿菌BCG-巴斯德(ATCC編號35734)、BCG-墨西哥(ATCC編號35738)和牛分枝桿菌 BCG-中國(上海生物制品研究所)。
10.藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-7中任一項的重組牛分枝桿菌BCG活菌株。
11.用于哺乳動物治療或預(yù)防分枝桿菌攻擊的疫苗或免疫原性組合物，所述疫苗或免疫原性組合物包含權(quán)利要求1-7中任一項的重組牛分枝桿菌BCG活菌株。
12.權(quán)利要求9的疫苗或免疫原性組合物，其中所述分枝桿菌為結(jié)核桿菌或牛分枝桿菌。
13.權(quán)利要求8或9的疫苗或免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含藥物上可接受的載體。
14.權(quán)利要求8或9所述的疫苗或免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。
15.權(quán)利要求8-12中任一項的疫苗或免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含來自一種或多種其它病原體的免疫原性物質(zhì)。
16.用于哺乳動物治療或預(yù)防結(jié)核桿菌或牛分枝桿菌攻擊的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物權(quán)利要求1-7中任一項的重組牛分枝桿菌BCG活菌株。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述哺乳動物為牛。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述哺乳動物為人。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述疫苗或免疫原性組合物在佐劑存在下給予。
20.用于哺乳動物治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物權(quán)利要求 1-7中任一項的重組牛分枝桿菌BCG活菌株。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述疫苗或免疫原性組合物在佐劑存在下給予。
22.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述癌癥為膀胱癌。
全文摘要
本發(fā)明提供包含能過表達(dá)核酸的重組牛分枝桿菌BCG活菌株和結(jié)核(TB)疫苗或免疫原性組合物，所述核酸編碼PhoP蛋白和/或一種或多種phoP調(diào)節(jié)子蛋白。本發(fā)明還提供用所述菌株為哺乳動物治療或預(yù)防結(jié)核桿菌或牛分枝桿菌攻擊的方法。
文檔編號A61K39/04GK102439134SQ201080005563
公開日2012年5月2日 申請日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者劉軍 申請人:劉軍, 深圳恒美志毅生物科技有限公司