專利名稱：用于治療或預(yù)防hiv感染的三聚體hiv融合抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開描述了三聚體HIV融合抑制劑，該抑制劑包含對應(yīng)于HIV跨膜糖蛋白的 N-端七元重復(fù)(NHR或HRl)或C-端七元重復(fù)(CHR或HR2)序列的肽和三聚化基序。本發(fā)明還公開了通過施用此類三聚體HIV融合抑制劑來治療HIV感染或預(yù)防HIV性傳播的方法。
背景技術(shù)：
人免疫缺陷病毒(HIV)是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，其感染人免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ。2007年，全世界約3320萬人與HIV共存，約270萬人新受感染，200 萬患者由于 AIDS 而失去生命。目前 U. S. Food and Drug Administration (FDA) 批準(zhǔn)了 25種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物用于治療HIV感染，其中22種是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RTI)和蛋白酶抑制劑(PI)。RTI抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV繁殖所需的病毒DNA聚合酶)的活性，而 PI抑制HIV蛋白酶(被病毒用來切割新生蛋白質(zhì)以最終裝配新病毒體的酶)的活性。以不同方式組合的這些藥物的臨床應(yīng)用(被稱為高度活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART))可觀地降低了 AIDS的發(fā)病率和死亡率，并且顯著地改善了受HIV感染的患者的預(yù)期壽命。然而， 由于藥物抗性HIV變體毒株的出現(xiàn)，越來越多進(jìn)行HAART用藥法的HIV/AIDS患者不能應(yīng)答目前的RTI和PI。因此迫切需要開發(fā)新的下述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，所述藥物在抑制HIV融合和進(jìn)入以及抵抗對現(xiàn)有HAART給藥法有抗性的HIV毒株方面具有活性。性傳播是HIV最常見的傳播途徑。生殖器分泌物中存在的無細(xì)胞HIV和與細(xì)胞聯(lián)結(jié)的HIV均可以被性傳播。HIV流行病的持續(xù)傳播是缺乏安全性行為的證明。因此迫切需要開發(fā)可局部應(yīng)用的、安全、有效并且負(fù)擔(dān)得起的抗-HIV藥劑，用于預(yù)防HIV性傳播。病毒包膜糖蛋白(Env)gpl20和gp41介導(dǎo)的病毒融合和進(jìn)入事件是HIV 1型 (HIV-I)感染的第一個步驟，也是最關(guān)鍵的步驟。gpl20與細(xì)胞受體⑶4和輔助受體CXCR4 或CCR5結(jié)合后，gp41 N-端的融合肽被暴露，使其能夠插入靶細(xì)胞膜中。gp41中發(fā)生一系列構(gòu)象改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)成為其促進(jìn)融合的狀態(tài)(fusogenic state)，使得病毒和靶細(xì)胞膜密切接近并促進(jìn)膜融合。gp41外結(jié)構(gòu)域的核心結(jié)構(gòu)由兩個4-3疏水七元重復(fù)(HR)區(qū)組成，它們被定義為 N-端七元重復(fù)(NHR或HRl，殘基540-590)和C-端七元重復(fù)(CHR或HR2，殘基624-666)。 晶體學(xué)研究顯示，CHR能夠與NHR相互作用，形成被稱作“發(fā)夾三聚體”或“六螺旋束”(6-HB) 的構(gòu)象，其中三個平行的NHR形成三聚體卷曲螺旋核心，三個CHR反向平行地包裝成沿著內(nèi)部卷曲螺旋表面的高度保守的疏水溝。源自NHR和CHR區(qū)的肽分別被稱作NHR-肽和CHR-肽。一些CHR-肽是有效的HIV 融合抑制劑，它們通過與病毒gp41內(nèi)部NHR三聚體結(jié)合以干擾6-HB形成而發(fā)揮作用。在 20世紀(jì)90年代初期，發(fā)現(xiàn)了第一種在納摩爾水平上具有抗HIV活性的高度有效的CHR-肽。 隨后報道了在低納摩爾水平上抑制HIV-I-介導(dǎo)的融合的兩種類似物肽，Τ20ΦΡ-178)和 C34。T20(Fuzeon ；恩夫韋地(enfuvirtide))已被US FDA批準(zhǔn)為新一類抗HIV藥物—— HIV融合抑制劑的第一個成員。對不能應(yīng)答目前的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(包括RTI和PI)的HIV/AIDS患者而言， T20是有效的補(bǔ)救療法。然而，T20的臨床使用由于其低效、半衰期短、生產(chǎn)成本高并且易于誘導(dǎo)藥物抗性而受到限制。期望使用分子克隆技術(shù)表達(dá)包含與三聚體化基序融合的CHR序列的重組蛋白，以生產(chǎn)具有經(jīng)改進(jìn)的效力、相對長的半衰期、更低生產(chǎn)成本和經(jīng)改進(jìn)的抗性譜的CHR三聚體。除了 CHR以外，NHR也是工程改造的肽抑制劑或蛋白質(zhì)抑制劑的一個關(guān)鍵靶標(biāo)。被設(shè)計為5-螺旋的NHR靶向的分子由三個NHR螺旋和兩個CHR螺旋組成，所述螺旋通過各為五個氨基酸的連接子互相連接。所述肽折疊成與6-HB相似的結(jié)構(gòu)，其中兩個NHR螺旋之間的疏水溝被暴露，用于結(jié)合病毒CHR。5-螺旋顯示具有低納米摩爾IC5tl值的針對HIV-I感染的高效力。然而，將多肽再折疊成5-螺旋束是一項困難的工作。通常，NHR-肽也應(yīng)當(dāng)通過靶向CHR從而阻斷病毒CHR與NHR的結(jié)合來展示抗病毒活性。但是線性NHR-肽的效力非常低。原因是NHR-肽趨向于在不存在CHR-肽時聚集。推測如果經(jīng)適當(dāng)設(shè)計的NHR-肽能夠形成不聚集的穩(wěn)定三聚體卷曲螺旋構(gòu)象，則它們的效率能夠與CHR-肽一樣高。存在若干種方式來構(gòu)建可溶的NHR-三聚體。首先，可以在NHR-肽區(qū)中引入分子間二硫鍵，以穩(wěn)定化三聚體構(gòu)象。所述方法的例子包括N34CCG和N35CCG-N13。其次，NHR-肽可與被設(shè)計的三聚體卷曲螺旋如GCM-pIQI的部分(IQ)或IZ融合，形成穩(wěn)定的螺旋狀三聚體，例如IQN17、IQN23和IZW7。這些可溶的NHR-三聚體可與CHR-肽同樣有效地抑制 HIV感染。在本公開中，NHR-肽或CHR-肽與對應(yīng)于折疊子(foldon，F(xiàn)d)序列的肽("Γ4纖維替代蛋白(T4 fibritin)的C-端結(jié)構(gòu)域中的三聚體化基序)連接形成高度穩(wěn)定并可溶的 NHR-三聚體或CHR-三聚體，其預(yù)計能分別比單體NHR-肽或CHR-肽更有效地抵抗HIV感染、更加可溶并且更穩(wěn)定。附圖概述

圖1展示了 gp41功能結(jié)構(gòu)域的圖示。殘基編號對應(yīng)于其在HIV_lHXB2gpl60中的位置。FP，融合肽；TR，色氨酸富集區(qū)；TM，跨膜結(jié)構(gòu)域；CP，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。圖2展示了 gp41的NHR和CHR之間和N-肽與C-肽之間的相互作用。NHR和CHR 之間的虛線指示位于NHR中e和g位置上和CHR中a和d位置上的殘基之間的相互作用。圖3展示了 N36Fd和N28Fd的序列。NHR和CHR序列分別加有下劃線和雙層下劃線。NHR中的袋形成序列(aa 565-581)和CHR中的袋結(jié)合結(jié)構(gòu)域(aa 628-635)分別為粗體和斜體。Fd序列為粗體并加有下劃線。圖4展示了 SDS-PAGE凝膠電泳，其顯示N36Fd是抗SDS但熱敏感的三聚體。
圖5展示了 SDS-PAGE凝膠電泳，其顯示N28Fd是抗SDS但熱敏感的三聚體。圖6展示了 N36和N36Fd的二級結(jié)構(gòu)的⑶光譜學(xué)分析。通過從N36Fd的光譜中減去Fd肽的光譜，計算(N36Fd)-Fd的光譜。圖7展示了擬8和N28Fd的二級結(jié)構(gòu)的⑶光譜學(xué)分析。通過從N28Fd的光譜中減去Fd肽的光譜，計算(N28Fd)-Fd的光譜。圖8展示了 C34分別與N36和N36Fd的復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)的⑶光譜學(xué)分析。通過從N36Fd+C34的光譜中減去Fd肽的光譜，計算(N36Fd+C34) -Fd的光譜。圖9展示了 C34分別與擬8和擬SFd的復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)的⑶光譜學(xué)分析。通過從N28Fd+C34的光譜中減去Fd肽的光譜，計算(N28Fd+C34) -Fd的光譜。圖10展示了 N36、N28、N36Fd和N28Fd分別對HIV-Iiiib-介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合的抑制活性。C-肽T20和Fd肽被包括在內(nèi)作為對照。圖中展示了每種肽的IC5tl值。圖11展示了 N36、N28、N36Fd和N28Fd分別對HIV-Iiiib (B亞型，X4)感染的抑制活性。C-肽T20和Fd肽被包括在內(nèi)作為對照。圖中展示了每種肽的IC5tl值。圖12展示了 N36Fd和N28Fd分別對HIV_lBal (B亞型，R5)感染的抑制活性。C-肽 T20和Fd肽被包括在內(nèi)作為對照。圖中展示了每種肽的IC5tl值。圖13展示了 N36Fd和N28Fd分別對HIV-I93iniqi (C亞型，R5)感染的抑制活性。C-肽 T20和Fd肽被包括在內(nèi)作為對照。圖中展示了每種肽的IC5tl值。圖14展示了用蛋白酶K消化不同時間后通過直接ELISA檢測到的擬SFd或T20
的殘余量。圖15展示了用蛋白酶K消化不同時間后通過HIV-Iiiib抑制實(shí)驗測試的N28Fd或 T20的剩余抗病毒效力。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面中，本文公開了用于治療HIV感染的三聚體HIV融合抑制劑，所述抑制劑由對應(yīng)于HIV跨膜糖蛋白的N-端七元重復(fù)(NHR或HRl)或C-端七元重復(fù)(CHR或HR2) 序列的肽和對應(yīng)于折疊子(Foldon) (Fd)的肽組成。在另一方面中，本文公開了用于預(yù)防HIV性傳播的三聚體HIV融合抑制劑，所述抑制劑由對應(yīng)于HIV跨膜糖蛋白的NHR (或HRl)或CHR (或HR2)序列的肽和對應(yīng)于Fd的肽組成。在另一方面中，本文公開了下述NHR-三聚體HIV融合抑制劑用于治療HIV感染或預(yù)防HIV性傳播的用途，所述NHR-三聚體HIV融合抑制劑包括SEQ ID NOs. 1-14的氨基酸序列。在另一方面中，本文公開了下述CHR-三聚體HIV融合抑制劑用于治療HIV感染或預(yù)防HIV性傳播的用途，所述CHR-三聚體HIV融合抑制劑包括SEQ ID NOs. 15-28的氨基酸序列。在另外的方面中，本文公開了 SEQ ID NOs. H8的經(jīng)保守修飾的變體用于治療HIV 感染或預(yù)防HIV性傳播的用途。在另外的方面中，本文公開了 NHR-或CHR-三聚體HIV融合抑制劑與其它抗-HIV 藥物組合用于治療HIV感染或預(yù)防HIV性傳播的用途。
在另外的方面中，NHR-或CHR-三聚體HIV融合抑制劑以選自下組的方式被施用， 所述組由肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口、粘膜、陰道、直腸和經(jīng)皮施用組成。本文公開了包含三個單體的三聚體多肽藥物組合物，其中每個單體包含具有人免疫缺陷病毒(HIV)跨膜糖蛋白的N-端七元重復(fù)(NHR或HRl)或C-端七元重復(fù)(CHR或HR2) 的氨基酸序列的肽和三聚體化基序。在另一個實(shí)施方案中，三聚體多肽藥物組合物是通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的。在另一實(shí)施方案中，三聚體化基序是折疊子。在另一實(shí)施方案中，多肽包含N-端七元重復(fù)并且所述多肽包含SEQ ID NOs. 1-14之一的氨基酸序列。還在另一實(shí)施方案中， 多肽包含SEQ ID NO. 1的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，多肽包含C-端七元重復(fù)并且所述多肽包含SEQ ID NOs. 15-28 之一的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO. 15的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，三聚體多肽是同型三聚體。在一個實(shí)施方案中，提供了抑制人免疫缺陷病毒與靶細(xì)胞融合的方法，所述方法包括施用三聚體多肽藥物組合物并抑制病毒與細(xì)胞的融合。在另一實(shí)施方案中，所述方法預(yù)防受試者被人免疫缺陷病毒感染。還在另一實(shí)施方案中，所述方法治療之前被人免疫缺陷病毒感染的患者。發(fā)明詳述在一個實(shí)施方案中，本文公開了 NHR-或CHR-三聚體HIV融合抑制劑用于治療HIV 感染或預(yù)防HIV性傳播的用途。術(shù)語“HIV融合”是指病毒生命周期的關(guān)鍵步驟，其是病毒體或受HIV-感染的細(xì)胞與靶囊泡(vesicle)或靶細(xì)胞融合所必需的。術(shù)語“HIV融合抑制劑”是指阻斷HIV或受HIV-感染的細(xì)胞與靶囊泡或靶細(xì)胞融合的任何試劑。術(shù)語“NHR三聚體”是指由源自HIV跨膜糖蛋白的NHR(或HRl)序列的肽形成的三聚體。術(shù)語“NHR單體”是指包含NHR肽序列和三聚體化基序的肽。就本公開的目的而言， 術(shù)語“肽”和“多肽”可互換使用。術(shù)語“CHR-三聚體”是指由源自HIV跨膜糖蛋白的CHR(或HR2)序列的肽形成的三聚體。術(shù)語“CHR單體”是指包含CHR肽序列和三聚體化基序的肽。本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計了可溶的NHR三聚體或CHR三聚體，它們是用三聚體化基序——折疊子(Fd)穩(wěn)定化的肽，所述折疊子是T4纖維替代蛋白C-端結(jié)構(gòu)域的 27 個氨基酸的區(qū)域(GHPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL，SEQ ID NO :29，或 GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL, SEQ ID NO :30)。折疊子是纖維替代蛋白三聚體結(jié)構(gòu)的形成所必需的，其可以被用作人工三聚體化結(jié)構(gòu)域。其天然結(jié)構(gòu)由三聚體發(fā)夾螺旋槳組成?？梢陨a(chǎn)包含折疊子結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白質(zhì)，所述折疊子結(jié)構(gòu)域通過或不通過使用天然連接子序列而與選定的NHR或CHR序列的C-端連接，這導(dǎo)致得到的融合蛋白折疊成高度穩(wěn)定的、抗SDS的三聚體。在一個實(shí)施方案中，NHR肽選自由Ν36、Ν46、Ν56、Ν54、Ν60、Ν28、附7和Ν51組成的組。在另一實(shí)施方案中，(服肽選自由(14、021、028、034、036、038和046組成的組。NHR 和CHR肽和NHR和CHR單體的氨基酸序列展示于表2中。
在一個實(shí)施方案中，NHR單體包含氨基酸序列SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQ LQARILGYIPEAPRDGQAYVRKDGEff VLLSTFL(SEQ ID NO. 1)。在本文中使用時，單字母代碼表示氨基酸殘基:A，丙氨酸；R，精氨酸；N，天冬酰胺；D，天冬氨酸；C，半胱氨酸；Q，谷氨酰胺；E，谷氨酸；G，甘氨酸；H，組氨酸；I，異亮氨酸； L,亮氨酸；K，賴氨酸；M，甲硫氨酸；F，苯丙氨酸；P，脯氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；V，纈氨酸。在另一實(shí)施方案中，NHR單體包含SEQ ID NOs. 2-14之一的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CHR單體包含氨基酸序列WMEWDREINNYTSLGHPEAPRDGQAYVRK DGEffVLLSTFL(SEQ ID NO. 15)。在另一實(shí)施方案中，CHR單體包含SEQ ID NOs. 16-28之一的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，本文公開了 SEQ ID NOs. H8的經(jīng)保守修飾的變體用于治療 HIV感染或預(yù)防HIV性傳播的用途。本文所述變體保持親本或來源分子的生物學(xué)活性。在本文中使用時，術(shù)語“經(jīng)保守修飾的變體”是指與原始肽具有相同或相似生物學(xué)活性的變體肽。例如可以制造保守的氨基酸改變，所述改變盡管改變了蛋白質(zhì)或肽的一級序列，但是不改變所述蛋白質(zhì)或肽的功能。保守的氨基酸取代典型地包括下組中的取代甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。(通常不改變一級序列的)修飾包括多肽的體內(nèi)或體外化學(xué)衍生化，例如乙酰化或羧基化。其還包括糖基化修飾，例如通過修飾多肽在合成和加工或其它加工步驟期間的糖基化模式而進(jìn)行的糖基化修飾；所述修飾例如通過將多肽暴露于影響糖基化的酶(例如哺乳動物糖基化或去糖基化酶)而進(jìn)行。具有被磷酸化的氨基酸殘基(例如磷酸酪氨酸、 磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸)的序列也包括在內(nèi)。本發(fā)明還包括是下述多肽，所述多肽使用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了修飾，從而改進(jìn)其對蛋白水解降解的抗性或優(yōu)化溶解度特性。此類多肽的類似物包括含有除天然存在的L-氨基酸之外的其它殘基(例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的多肽。本文公開的肽不限于本文所列任何特定的示范性方法的產(chǎn)物。除了基本全長的多肽以外，本公開還提供了所述多肽的具有生物學(xué)活性的片段。在本文中使用時，基本相同的氨基酸序列典型地分享大于95%的氨基酸同一性。 然而，公認(rèn)含有少于上述同源性水平的、作為剪接變體出現(xiàn)的、或通過保守氨基酸取代(或簡并密碼子的取代)被修飾的這些蛋白質(zhì)(和編碼此類蛋白質(zhì)的DNA或mRNA)包括在本公開的范圍內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所容易確認(rèn)的，已設(shè)計出多種方式用以為了比較而比對序列，例如 Henikoff and Henikoff 在 Proc. Natl. Acad Sci. USA 89 :10915(1992)中描述的 Blosum 62評分矩陣。為此目的便利地使用的算法是可廣泛獲得的(參見例如Needleman and Wunsch in J. Mol. Bio. 48 :443 (1970))。因此，本文公開了與 SEQ ID NOs 1-32 85%、90%、95%、98%、99%或 100%相同
的氨基酸序列。從適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系表達(dá)后，NHR或CHR肽自發(fā)形成三聚體。在另一實(shí)施方案中公開了異源的三聚體，其中兩種或三種不同的單體形成三聚體。為了形成具有不同單體肽的三聚體，用變性試劑(例如6M GuHCl)使不同N-肽-Fd (例如擬8Fd和N36Fd)的三聚體斷開。將離解的單體混合在一起并去除變性劑后，不同的單體形成異源的三聚體。以下的表達(dá)體系適用于表達(dá)所公開的三聚體蛋白質(zhì)哺乳動物表達(dá)體系，例如但不限于pcDNA表達(dá)體系，和GS基因表達(dá)體系；昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系，例如但不限于 Bac-to-Bac表達(dá)體系、桿狀病毒表達(dá)體系和DES表達(dá)體系；以及E. coli表達(dá)體系，包括但不限于PET、pSUMO和GST表達(dá)體系。術(shù)語“療效”是指以下之一種或多種1)抑制病毒體或受HIV-感染的細(xì)胞與靶細(xì)胞的融合；幻抑制HIV復(fù)制；幻受感染的細(xì)胞數(shù)量降低；4)存在于血清中的病毒體濃度降低；5)提高T-細(xì)胞計數(shù)；6)在一定程度上減輕或減少與HIV相關(guān)的一種或多種癥狀；和7) 減輕或減少與其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥劑的施用相關(guān)的副作用?！爸委熡行Я俊敝荚诙x實(shí)現(xiàn)療效所需的量。"EC50和EC9tl”分別是指導(dǎo)致病毒復(fù)制或病毒介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合降低50%和 90%的藥物濃度。本公開還涉及包含上述三聚體肽的藥物組合物。所公開的三聚體藥物組合物的劑量和想要的藥物濃度可取決于預(yù)期的具體用途而變化。適當(dāng)劑量或施用途徑的測定完全在常規(guī)技術(shù)人員的技巧范圍內(nèi)。動物實(shí)驗提供了用于測定人療法有效劑量的可靠指南。有效劑量的物種間按比例換算(Interspecies scaling)可以按照Mardenti，J. and Chappel 1, W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics，，In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al, Eds. , Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96 指定的原則進(jìn)行?！爸委煛笔侵钢委熜灾委熀皖A(yù)防性(prophylactic或preventative)手段，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)目標(biāo)病理學(xué)狀況或疾病。需要治療的個體包括已經(jīng)患有疾病的個體，以及易于患病的個體，或要預(yù)防疾病的個體。在一個實(shí)施方案中，疾病是存在的。在另一實(shí)施方案中，由于本文所述的方法，細(xì)胞或個體的壽命被延長。不需要過多的實(shí)驗就可以將上述三聚體肽配制用于施用給哺乳動物(包括人)， 以適合具體的應(yīng)用。另外，使用標(biāo)準(zhǔn)的劑量-應(yīng)答方案，不需要過多的實(shí)驗就可以確定組合物的適當(dāng)劑量。因此，通過本領(lǐng)域公知的手段，例如使用惰性稀釋劑或藥學(xué)可接受的載體，不需要過多的實(shí)驗就可制造被設(shè)計用于口、鼻、舌、舌下、頰、頰內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)和肺施用的組合物。組合物被封裝在明膠膠囊中或壓縮成片劑。就口治療施用的目的而言，藥物組合物可與賦形劑摻合，并以片劑、糖錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、薄餅(wafers)、口香糖等等。 “藥學(xué)可接受的載體”表示任何標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)載體。合適載體的例子是本領(lǐng)域公知的，可包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)載體，如磷酸鹽緩沖的鹽溶液、含有Polysorb 80的磷酸鹽緩沖的鹽水、水、乳液如油/水乳液，和多種類型的濕潤劑。其它載體也可包括無菌溶液、片劑、 有涂層的片劑，和膠囊。典型地，此類載體含有賦形劑如淀粉、奶、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或硬脂酸鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或植物油、膠質(zhì)、乙二醇或其它已知的賦形劑。此類載體也可以包含香料和色彩添加劑或其它成分。包含此類載體的組合物通過公知的常規(guī)方法配制。片劑、丸劑、膠囊、糖錠等等也可含有粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜化劑和調(diào)味劑。粘合劑的一些例子包括微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠。賦形劑的例子包括淀粉或乳糖。崩解劑的一些例子包括褐藻酸、玉米淀粉等等。潤滑劑的例子包括硬脂酸鎂或硬脂酸鉀。助流劑的例子是膠體二氧化硅。甜味劑的一些例子包括蔗糖、糖精等等。調(diào)味劑的例子包括薄荷、水楊酸甲酯、橙味香料等等。制備這些多種組合物中使用的材料應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)純的，并且在使用的用量下無毒?？梢岳缤ㄟ^靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、椎管內(nèi)或皮下注射，容易地腸胃外施用三聚體組合物?？梢酝ㄟ^將化合物摻入溶液或懸浮液中，來完成腸胃外施用。此類溶液或懸浮液也可以包括無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑。 腸胃外配制物也可以包含抗菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯，抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，和螯合劑如EDTA。也可以添加緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或右旋糖。腸胃外制劑可以被封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、 一次性注射器或多劑量管中。直腸施用包括向直腸或大腸內(nèi)施用藥物組合物中的三聚體組合物。這可以使用栓劑、灌腸劑、凝膠、霜劑、片劑等等來完成?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法容易地制造栓劑配制物。類似地，可以配制陰道施用形式，包括栓劑、凝膠、灌腸劑、霜劑、片劑、環(huán)(rings)等等。 組合物可以旨在以例如栓劑的形式用于直腸或陰道施用，所述栓劑會在直腸中融化并釋放藥物。用于直腸或陰道施用的組合物可含有油脂性的基質(zhì)作為合適的非刺激性的賦形劑。 此類基質(zhì)包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。對栓劑的制備而言低熔點(diǎn)蠟是優(yōu)選的， 其中脂肪酸甘油酯和/或可可脂的混合物是合適的蠟?？梢詫⑾炄诨⑼ㄟ^攪拌將環(huán)己胺化合物均勻地分散在其中。然后將熔融的均勻混合物倒入便利的一定尺寸的摸具中，使其冷卻從而固化。旨在用于局部施用的公開組合物可以適當(dāng)?shù)匕ㄈ芤?、乳液、軟膏劑、霜劑或凝膠基質(zhì)?；|(zhì)可例如包括以下一種或多種凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑如水和醇，和乳化劑與穩(wěn)定劑。增稠劑可存在于用于局部施用的藥物組合物中。經(jīng)皮施用包括組合物通過皮膚的經(jīng)皮吸收。經(jīng)皮配制物包括貼片、離子電滲裝置、 軟膏劑、霜劑、凝膠、油膏劑(salves)等等。組合物可包括修飾固體或液體劑量單位的物理形式的多種材料。例如，組合物可包括在活性成分周圍形成涂層的材料。形成涂層殼的材料可典型地是惰性的，并且可以選自例如糖、紫膠和其他腸涂層試劑?；蛘撸钚猿煞挚梢员话b在明膠膠囊或扁膠囊中。本公開的三聚體肽組合物可以根據(jù)適當(dāng)?shù)慕o藥方案，以治療有效量被施用。根據(jù)技術(shù)人員的離解，需要的精確量在受試者之間可以不同，取決于受試者的物種、年齡和一般狀況、感染的嚴(yán)重性、具體試劑和施用模式。在一些實(shí)施方案中，每天一次或多次施用以受試者體重為基礎(chǔ)約0. OOlmg/kg到約50mg/kg的組合物，以獲得想要的療效。在其他實(shí)施方案中，每天一次或多次施用以受試者體重為基礎(chǔ)約lmg/kg到約25mg/kg的組合物，以獲得想要的療效。組合物總的每日劑量可由主治醫(yī)師在健全的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)決定。用于任何具體患者或受試者的特定治療有效劑量水平會取決于多種因素，包括被治療的病癥和病癥的嚴(yán)重性；使用的特定化合物的活性；使用的特定組合物；患者或受試者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食；施用時間、施用途徑和使用的特定化合物的排泄速率；治療的持續(xù)時間；與使用的特定化合物組合或同時使用的藥物，和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的其他因素。本文公開的組合物也可以與療法組合使用。也就是說，本發(fā)明公開的組合物可以在一種或多種其他想要的組合物、療法、治療或醫(yī)學(xué)操作的同時、之前或之后使用。所施用的療法的具體組合會由主治醫(yī)師決定，并且會考慮多種治療的兼容性和想要實(shí)現(xiàn)的療效。 應(yīng)當(dāng)明白，組合使用的治療活性劑可以在單一組合物、治療或操作中施用，或者可以單獨(dú)使用。例如，本文公開的組合物可以與一種或多種其他HIV抑制劑組合施用，所述其他 HIV抑制劑包括但不限于，一種或多種核苷/核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)、蛋白酶抑制劑(PI)、融合抑制劑、整合酶抑制劑、趨化因子受體(CXCR4， CCR5)抑制劑和/或羥基脲。核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，包括但不限于阿巴卡韋(ABC;Ziagen )，地達(dá)諾新(雙脫氧肌苷(ddl) ；Videx )，拉米夫定(3TC ;Epivir )，司他夫定(d4T ；ZeritZerit)，扎西他濱(雙脫氧胞苷(ddC) ；Hivid )，齊多夫定(ZDV，之前已知為疊氮胸苷 ((AZT) ；Retrovir )，阿巴卡韋，齊多夫定，和拉米夫定(Trizivir )，齊多夫定和拉米夫定 (Combivir· )，和恩曲他濱(Emtriva )。核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括替諾福韋disoproxil 延胡索酸酯(Viread )。針對HIV的非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括但不限于奈韋拉平 (Viramune )，地拉夫定甲磺酸鹽/酯(Rescriptor )，和依法韋侖(Sustiva )。蛋白酶抑制劑(PI)包括安潑那韋(Agenerase )，沙奎那韋甲磺酸鹽/酯 (FortovaseInvirase ')，利托那韋(Norvir ),印地那韋硫酸酯 / 鹽(Crixivan )，nelfmavir甲磺酸鹽/酯(Viracept ),洛匹那韋和利托那韋(Kaletra ), atazanavir(Reyataz- )，禾口福沙那韋(Lexiva )。 Atazanavir 禾口福沙那韋(Lexiva)是最近被U. S. Food and Drug Administration批準(zhǔn)用于治療HIV-1感染的新的蛋白酶抑制劑， JAL atazanavir(Reyataz ) and emtricitabine (Emtriva ) for HIV infection, Medical Letter on Drugs and Therapeutics,可于www. medletter. com 在線獲得；υ. S. Department of Health and Human Services (2003)。Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-infected Adults and Adolescents ；可于aidsinfo. nih. gov/guidelines 在線獲得。融合/進(jìn)入抑制劑結(jié)合至⑶4+細(xì)胞(一種白細(xì)胞)或輔助受體如CCR5和CXCR4 的外部，或結(jié)合至病毒膜蛋白如gp41和gpl20。融合/進(jìn)入抑制劑阻止病毒和細(xì)胞之間發(fā)生融合，或阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞，因此預(yù)防HIV感染和增殖。融合/進(jìn)入抑制劑包括但不限于， 恩夫韋地(Fuzeon )禾口馬拉維若(maraviroc) (Selzentry ，Pfizer)。整合酶抑制劑阻斷整合酶的作用，阻止HIV-I遺傳物質(zhì)整合進(jìn)宿主DNA中，從而終止病毒復(fù)制。整合酶抑制劑包括但不限于雷特格韋(raltegravir) (Isentress , Merck)； 和埃替拉韋(elvitegravir) (GS 9137，Gilead Sciences)?；蛘呋蛄硗?，本文公開的組合物可以與一種或多種抗感染劑(例如抗生素等)、鎮(zhèn)痛劑或下述其他藥劑組合施用，所述其他藥劑旨在解決通常存在于免疫妥協(xié) (immunocompromis)個體中、但并非由HIV直接引起的一種或多種疾病、病癥或病況的癥狀。實(shí)施例1N36Fd和N28Fd三聚體的設(shè)計源自HIV-I gp41 NHR的N-肽通常被認(rèn)為是弱的HIV-1融合抑制劑，因為游離N-肽趨向于聚集，因此在生理溶液中不能夠折疊成穩(wěn)定的三聚體α-螺旋構(gòu)象。27-元Fd 序歹丨J (SEQ ID NO 29)被用于通過將 Fd 序列與 Ν36 (SEQ ID NO 30)或 N28(SEQ ID NO :31) 的C-端直接融合而不需要任何連接序列來促進(jìn)N-肽N36和擬8 (圖3)。選擇N36用于該研究，因為其能夠與源自gp41 CHR的肽形成高度穩(wěn)定的6-HB。所述肽包含17個氨基酸的序列，所述序列為gp41 NHR和CHR之間的相互作用提供了關(guān)鍵性的疏水袋(圖2，粗體)。 選擇擬8肽是因為與袋-形成序列C-端相鄰的AVERY (aa 582-586)序列，其對gp41 6-HB 形成來說可能是重要的。特別地，在阻斷6-HB形成和抑制HIV-I毒株(包括抗T20和C34 的毒株)感染方面，含有AVERY-結(jié)合基序QIWNNMT (aa 621-627 ；SEQ ID NO 33)(圖2)的 C-肽CP-32 (aa 621-652)和CP-32M比T20更加有效。N28含有17元袋形成序列(N17)加上分別位于N17序歹Ij N-端和C-端的6元IEAQQH(aa 559-564 ；SEQ ID NO :34))序列和5 元AVERY基序(圖幻。對袋-形成序列兩側(cè)添加短側(cè)翼序列可改進(jìn)擬8中高度疏水的袋序列的再折疊和溶解度。設(shè)計的N36Fd和N28Fd肽的全長分別由63和55個氨基酸殘基組成 (圖幻。長于50個氨基酸的肽在技術(shù)上難以合成，但是可以在E. coli中良好地表達(dá)。實(shí)施例2N36Fd和N28Fd的表汰、純化和表征使用Platinum PCR SuperMix 高保真試劑盒 Qnvitrogen，Carlsbad，CA)，用含有 BamHl位點(diǎn)的正向引物和不含限制性位點(diǎn)的反向引物，從pHBX-env/wt質(zhì)粒擴(kuò)增N36和擬8 的DNA片段。通過編碼N-肽(N36或N28)和Fd的最后9個氨基酸的長合成正向引物與其互補(bǔ)體——具有Hioll位點(diǎn)的長反向引物之間的退火，生產(chǎn)Fd片段。然后混合兩種重疊的片段，并用作另一 PCR反應(yīng)的模板，所述另一 PCR反應(yīng)使用BamHl正向引物和具有Bioll位點(diǎn)的、編碼Fd的最后幾個氨基酸的更短反向引物。使用凝膠提取試劑盒01IAGEN，Valencia， CA)純化產(chǎn)物，用 BamHl 和 Xholl 酶(TaKaRa Bio, Madison, WI)消化，并克隆進(jìn) pGEX6p_l 載體01IAGEN)中。通過DNA測序驗證序列。將N36Fd-pGEX6p-l 或 N28Fd-pGEX6p-l 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn) Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen, Gibbstown, NJ)中。將細(xì)胞于37°C下在LB培養(yǎng)基中孵育，直至OD6tltl達(dá)到0.8-1. O。用0.4mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物并于30°C下孵育4小時。然后收集細(xì)胞，并通過在 1% Triton PBS緩沖液中超聲處理使其破碎。將樣品離心后，將上清液上樣進(jìn)GST-結(jié)合柱 (Novagen)中。沖洗柱，然后于 4°C下，在切割緩沖液(50mM Tris-HCl ρΗ7· 0，150mMNaCl， ImM EDTA，ImM 二硫蘇糖醇)中用 PreScission Protease (GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshire,UK)在柱上將結(jié)合的與GST融合的N-Fd肽切割過夜。第二天，通過用切割緩沖液洗滌，將經(jīng)切割的肽從柱上洗脫。使用Amicon Ultra_15離心過濾裝置(Millipore， Billerica, USA)，通過一系列超濾，將所述粗產(chǎn)物中的N36Fd或N28Fd任一與GST進(jìn)一步分離。N36Fd和N28Fd在pH低于3. O的緩沖液中執(zhí)行單體構(gòu)象，這使得它們能夠被收集在 30KD Ultra-15離心過濾裝置的離心管中，而GST被保持在過濾單元中。最后，針對ddH20(pH 7. 0)透析N-Fd肽，并且使用lOKDUltra-15離心過濾裝置將N-Fd肽再折疊成三聚體。通過SDS-PAGE分析經(jīng)純化的N36Fd和N28Fd。簡言之，將5 μ 1/孔的100 μ M N36Fd 或N28Fd與4X SDS樣品緩沖液(Novagen)混合。將樣品煮沸5分鐘或保持在室溫(RT) 下，之后上樣在10-20% iTricine-甘氨酸凝膠(Invitrogen)上。于4°C下以125V恒定電壓，在SDS-PAGE跑膠緩沖液中進(jìn)行電泳。用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)對凝膠染色。在存在2% SDS下煮沸5分鐘后，N36Fd被變性，并在凝膠中顯示對應(yīng)于單體形式的條帶。在室溫下用SDS緩沖液處理的N36Fd顯示對應(yīng)于三聚體形式的一個主要條帶，和具有更低分子大小的大量次要條帶(圖4)。所述結(jié)果顯示，N36Fd的主要部分在RT下的SDS 緩沖液中保持三聚體構(gòu)象。通過煮沸5分鐘處理時，主要的單體條帶和次要的三聚體條帶被釋放，但是在RT下在SDS緩沖液中處理N28Fd時，僅顯示對應(yīng)于三聚體形式的一個條帶 (圖5)。這些結(jié)果顯示，在SDS條件下，作為三聚體的N28Fd比N36Fd更穩(wěn)定。實(shí)施例3N36Fd和N28Fd處于穩(wěn)定的α -螺旋構(gòu)象如先前所述，通過圓二向(CD)色譜分析N36、N36Fd、N28、N28Fd和Fd肽的二級構(gòu)象結(jié)構(gòu)。將所有N-肽稀釋于ddH20 (pH 7.0)中，并將所有C-肽或N-肽和C-肽的混合物稀釋于50mM磷酸鈉和150mMNaCl (PBS, pH 7. 2)中，達(dá)到10 μ M的終濃度。將個體肽及其混合物在37°C水浴中孵育0. 5小時，之后測試。使用5. Onm帶寬，0. Inm分辨率，0. Icm徑長，4. Osec響應(yīng)時間和50nm/min掃描速度，于RT下在Jasco分光旋光計(Model J-715， Jasco he.，Japan)上獲得每種樣品的色譜，并通過減去對應(yīng)于溶劑的背景來校正。通過從N36Fd、N28Fd、N36Fd+C34或N28Fd+C34的色譜中減去游離Fd肽的色譜，計算個體N36Fd 或N28Fd，或N36Fd/C34或N28Fd/C34混合物中N-肽部分的色譜。通過用根據(jù)先前研究針對100%螺旋形成所預(yù)期的數(shù)值(即33，000° cnidmor1)除以222nm處的平均殘基橢圓率 (mean residue ellipticity)，由CD信號計算α-螺旋度。通過以2度的間隔、1. 5分鐘的平衡時間和60秒的平均化時間施加從20°C到98°C的溫度梯度，在222nm下監(jiān)測樣品的熱變性。如先前所述，使用Jasco軟件實(shí)用程序計算熱解折疊躍遷(Tm)值的中點(diǎn)。游離的Fd肽和N-肽顯示幾乎沒有α -螺旋度。出乎意料的是，嵌合體N36Fd和擬8Fd也幾乎不顯示典型的α-螺旋光譜，而是顯示α-螺旋和β-片層構(gòu)象的混合物(圖 6和7)。事實(shí)上，從N36Fd或N28Fd的色譜中減去由β -片層結(jié)構(gòu)組成的游離Fd肽的色譜后，揭示了典型的α -螺旋色譜(圖6和7)。這些結(jié)果表明，N36Fd和擬SFd中的Fd結(jié)構(gòu)域大幅促進(jìn)N-肽折疊成三聚體α-螺旋構(gòu)象，模擬HIV-I gp41的融合中間產(chǎn)物狀態(tài)中的NHR-三聚體的構(gòu)象。N36Fd或N28Fd中N36或擬8部分的α -螺旋度分別為41. 7%和 30. 9%。實(shí)施例4N36Fd和N28Fd與CHR-肽C34形成高度穩(wěn)定的六螺旋束CD色譜被用于研究N36Fd或N28Fd三聚體與C-肽之間的相互作用。當(dāng)N36Fd和 C34的摩爾比為1 1時，N36Fd與C;34相互作用形成復(fù)合物，與N36+C34(71.5% α-螺旋度)相比顯著提高了 α-螺旋度(減去Fd色譜后92.6%)(圖8)。N36Fd三聚體 +C34(80.9°C )的1值比N36+C34(65. 5°C )高15度。值得注意的是，游離的擬8肽不能與 C34形成復(fù)合物，但是與Fd的融合促進(jìn)擬8與C34結(jié)合并折疊成具有46. 3% α -螺旋度和 62. 2°C的Tm值的構(gòu)象(圖9)。這表明基于Fd的NHR-三聚體比游離N-肽更有效地與C-肽相互作用形成穩(wěn)定的6-HB。實(shí)施例5在抑制HIV-I-介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合方面，N36Fd和N28Fd分別比N36和N28有效得多
使用染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗測定N36Fd和N36對HIV-I-誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合的抑制活性。簡言之,用熒光染料 Calcein AM (Molecular Probes, Inc. , Eugene, OR)預(yù)先標(biāo)記 H9/HIV-1iiib細(xì)胞，并在96-孔細(xì)胞培養(yǎng)平板中，于37°C在分級濃度下用測試化合物孵育 30min。然后以10 1的比例對H9/HIV_1IIIB細(xì)胞添加CD4U細(xì)胞，之后于37°C下孵育 2小時。在具有目鏡測微計盤(ey印iece micrometer disc)的倒置熒光顯微鏡(Zeiss, 德國)下，對已融合和未融合的經(jīng)鈣黃綠素標(biāo)記的受HIV-I-感染的細(xì)胞計數(shù)。使用軟件 CalcuSyn計算化合物對細(xì)胞融合的抑制百分比和EC5tl與EC9tl值。如圖10中所示，在抑制HIV-I-誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合方面，N36Fd三聚體的效力是N36的15倍，而N28Fd三聚體的效力是N28的> 138-倍。N^Fd三聚體展示了 21nM的 IC50值，與臨床上使用的肽抗-HIV-I藥物T20 (Enfuvirtide, IC50 = 24nM)同樣有效。作為對照，單獨(dú)的Fd肽顯示在高達(dá)5，OOOnM的濃度下無抑制活性。所述結(jié)果表明，與Fd融合的 N-肽作為有效的HIV-I融合抑制劑發(fā)揮作用。實(shí)施例6在抑制HIV-1X4病毒感染方面，N36Fd和N28Fd分別比N36和N28有效得多如之前所述，測定了 N36Fd和N36對HIV-I復(fù)制的抑制活性。簡言之，在存在或不存在分級濃度的測試化合物時，在含有10% FBS的200 μ IRPMI 1640培養(yǎng)基中用HIV-Iiiib 將1χ104ΜΤ-2感染過夜。然后取出培養(yǎng)物上清液，并添加不含測試化合物的新鮮培養(yǎng)基。在感染后第四天，從每個孔中收集100 μ 1培養(yǎng)物上清液，與等體積的5% Triton X-100混合并針對PM抗原進(jìn)行實(shí)驗，所述PM抗原通過ELISA定量。簡言之，用從具有針對HIV-Iiiib 的高中和效價的HIV-血清陽性供體的血漿制備的HIV免疫球蛋白(HIVIG)涂布聚苯乙烯平板(Immulon IB, Dynex Technology, Chantilly, VA)的孔，于 4°C下在 0. 085M 碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH 9. 6)中過夜，之后用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的0. OlM PBS)洗滌，并用含脫脂奶粉的PBS(Bio-Rad Inc.，Hercules, CA)封閉。向孔中添加病毒裂解物，并于37°C下孵育1小時。充分洗滌后，順序添加抗-pM mAb(183-12H-5C)、用生物素標(biāo)記的抗小鼠IgGl (Santa Cruz Biotech.，Santa Cruz, CA)、抗生物素蛋白鏈菌素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Zymed，S. San Francisco, CA)和底物3,3' ,5,5' _四甲基聯(lián)苯胺(Sigma Chemical Co.)。通過添加 INH2SO4 終止反應(yīng)。在ELISA 讀數(shù)器(Ultra 386, TECAN, Research Triangle Park,NC)中記錄 450nm 處的吸光度。購自 US Biological (Swampscott，ΜΑ)的重組蛋白質(zhì)PM被包括在內(nèi)，用于建立標(biāo)準(zhǔn)劑量應(yīng)答曲線。每種樣品一式三份進(jìn)行測試。如先前所述計算PM生產(chǎn)的抑制百分比。如圖11中所示，N36Fd和擬SFd三聚體均能夠分別以99nM和39nM的IC50值有效抑制HIV-Iiiib復(fù)制。在高達(dá)3，OOOnM的濃度下，N36肽顯示適中的抑制活性(IC50 = 1，033nM)，而Fd和N28肽不顯示抑制活性(圖6A)。N28Fd顯示比N36Fd更高的抗病毒活性。實(shí)施例7在抑制HIV-I R5病毒感染方面，N36Fd和N28Fd分別比N36和N28有效得多為了抑制 M-tropic HIV-1 毒株 Bal (亞型 B，R5)的感染，將 100 μ 1 的 TZM-bl 細(xì)胞(lX105/ml)預(yù)培養(yǎng)過夜，并在存在或不存在測試肽時用Bal以100 TCID50 (50%組織培養(yǎng)物感染性劑量)感染過夜。收集細(xì)胞并在感染后第四天用50 μ 1裂解試劑裂解。根據(jù)制造商的說明使用螢光素酶試劑盒(ftOmega，Madison，WI)和發(fā)光計(Ultra 386)，分析螢光素酶活性。為了抑制原代HIV-I隔離群93IN101 (亞型C，R5)的感染，使用標(biāo)準(zhǔn)密度梯度 (Histopaque-1077, Sigma)離心，從健康供體的血中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。于37°C 下孵育2小時后，收集非粘附細(xì)胞，并以5X 105/ml重懸于含有10% FBS、5 μ g植物凝集素 (PHA)/ml和100U白介素_2/ml的RPMI培養(yǎng)基1640中，之后于37°C下孵育3天。在存在或不存在分級濃度的N-Fd肽時，以0. 01的感染復(fù)數(shù)，用原代HIV-I隔離群感染經(jīng)PHA-刺激的細(xì)胞。在感染后第7天收集上清液，并通過ELISA針對pM抗原進(jìn)行測試。N36Fd和N28Fd三聚體均使用輔助受體CCR5(R5)有效抵抗原代HIV-I隔離群。 N28Fd三聚體以9. 8nM的IC5tl阻斷HIV-IBal (亞型B，R5)的感染(圖12)。N36Fd三聚體具有更低的抵抗Bal的抗病毒活性，其IC5tl為182. 9nM。N36Fd和N28Fd三聚體均展示抵抗 HIV-I 93IN101 (亞型C，R5)感染的低-納摩爾抑制活性。N36Fd三聚體的IC5tl值為1. 36nM， N28Fd三聚體的IC5tl值為1. 27nM(圖13)。與之相比，在這兩種實(shí)驗中T20顯示針對Bal的 3. 4nM的IC5tl值，和針對93IN101的1. 75nM的IC5tl值。這些結(jié)果表明，N36Fd和N28Fd三聚體像T20 —樣，具有針對HIV-I的光譜抗病毒活性，與輔助受體的使用無關(guān)。實(shí)施例8N36Fd和N28Fd三聚體顯示針對T20-抗件變體的高度有效的抗-HIV-1活件HIV-I病毒NL4-3的NHR區(qū)中的突變導(dǎo)致對T20的遺傳抗性。如上文所述，使用 P24實(shí)驗測定N36Fd和N^Fd三聚體對T20-抗性毒株復(fù)制的抑制活性。如表1中所示， T20能夠有效地抑制T20-敏感毒株HIV-1NM_%6(;)N42S (IC50 = 30nM)，但是針對T20-抗性毒株
HIV_1Nl4-3036g)n42t/m:3k (IC5O = 374nM) >HIV~ 1NL4_3(36g)v38e/n42s (IC5o = 1，390nM)禾口 HIV_lNL4_3(:36G)raA/ N42D (IC50 = 2，297nM)則有效性差得多。然而，N36Fd和擬SFd三聚體抵抗T20-抗性和敏感毒株具有類似的高效力(IC5tl = 27 59nM)。表1. N28Fd和N36Fd抵抗T20-抗性HIV-I毒株感染的抑制活性
權(quán)利要求
1.包含三個單體的三聚體多肽藥物組合物，其中每個單體包含具有人免疫缺陷病毒 (HIV)跨膜糖蛋白的N-端七元重復(fù)(NHR或HRl)或C-端七元重復(fù)(CHR或HR2)的氨基酸序列的肽和三聚體化基序。
2.如權(quán)利要求1所述的三聚體多肽藥物組合物，其是通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的。
3.如權(quán)利要求1所述的三聚體多肽藥物組合物，其中所述三聚體化基序是折疊子。
4.如權(quán)利要求1所述的三聚體多肽藥物組合物，其中所述多肽包含N-端七元重復(fù)，并且所述多肽包含SEQ ID NOs. 1-14之一的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的三聚體多肽藥物組合物，其中所述多肽包含SEQID NO. 1的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1所述的三聚體多肽藥物組合物，其中所述多肽包含C-端七元重復(fù)，并且所述多肽包含SEQ ID NOs. 15- 之一的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的三聚體多肽藥物組合物，其中所述多肽包含SEQID NO. 15的氨基酸序列。
8.抑制人免疫缺陷病毒與靶細(xì)胞融合的方法，所述方法包括 施用如權(quán)利要求1所述的三聚體多肽藥物組合物；和抑制所述病毒與所述細(xì)胞的融合。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述方法預(yù)防受試者感染人免疫缺陷病毒。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述方法治療之前感染了人免疫缺陷病毒的患者。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含三個單體的三聚體多肽藥物組合物，其中每個單體包含具有人免疫缺陷病毒(HIV)跨膜糖蛋白的N-端七元重復(fù)(NHR或HR1)或C-端七元重復(fù)(CHR或HR2)的氨基酸序列的多肽和三聚體化基序。
文檔編號A61K38/17GK102307588SQ201080007172
公開日2012年1月4日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月9日
發(fā)明者姜世勃, 潘春恩, 陳曦, 齊志 申請人:紐約血庫公司