專利名稱：細(xì)胞粘附抑制劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的癌癥預(yù)防/治療劑、癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及含有新的、調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)的癌癥預(yù)防/治療劑、癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑。另外，本發(fā)明涉及癌癥診斷劑，所述癌癥診斷劑含有可檢測(cè)出上述目標(biāo)蛋白質(zhì)或編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因(多核苷酸)表達(dá)的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及使用上述目標(biāo)蛋白質(zhì)或編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸的、用于癌癥的預(yù)防/治療的物質(zhì)或癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)的篩選方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，伴隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，被稱為“分子靶向藥物”的新型藥物的開(kāi)發(fā)得到發(fā)展，已經(jīng)有一些商品上市。例如，以癌癥為例，現(xiàn)有的抗癌劑主要是以DNA合成或細(xì)胞周期的特定階段作為靶點(diǎn)。這是利用癌細(xì)胞的與正常細(xì)胞相比其增殖更為活躍的性質(zhì)，發(fā)揮對(duì)癌細(xì)胞的特異性毒性。因此，雖然并非癌細(xì)胞、但與癌細(xì)胞具有同等增殖速度的細(xì)胞(例如骨髓中的幼稚造血細(xì)胞、口腔粘膜細(xì)胞、消化道上皮細(xì)胞、毛囊細(xì)胞)等會(huì)由于以往的抗癌劑而受到侵害， 由此發(fā)生骨髓抑制(白細(xì)胞減少、血小板減少)、消化系統(tǒng)障礙、毛發(fā)脫落等副作用。與此相對(duì)，上述的“分子靶向藥物”是以在癌細(xì)胞中特異性(或過(guò)剩地)表達(dá)的分子作為靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)這種分子的選擇性的作用來(lái)發(fā)揮抗癌性。因此，使用分子靶向藥物的癌癥治療與使用現(xiàn)有的抗癌劑相比，具有可以抑制上述副作用發(fā)生的優(yōu)點(diǎn)。作為以分子靶向藥物形式開(kāi)發(fā)新的抗癌劑的措施，對(duì)癌細(xì)胞/癌組織中的基因/ 蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)分析/功能分析是有效的。通過(guò)上述分析，可以判斷特定的治療劑/治療方法的有效性、或探索新的藥物發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)。急性骨髓性白血病(AML)是作為血癌的白血病的一種，是骨髓系統(tǒng)的造血細(xì)胞腫瘤化并喪失分化/成熟能力的疾病。喪失了分化/成熟能力的造血細(xì)胞保持幼稚的形態(tài)， 因此被稱為“胚細(xì)胞”。在AML中，這種胚細(xì)胞蓄積在骨髓內(nèi)，使正常的血細(xì)胞的生產(chǎn)能力降低。結(jié)果，表現(xiàn)出由于紅細(xì)胞不足而引起的貧血/呼吸短促/心慌/臉色蒼白等癥狀，或因血小板不足而引起的牙齦出血、鼻血、消化道出血或吐血、腦出血等癥狀。另外，由于白細(xì)胞的不足而對(duì)感染的免疫力降低，表現(xiàn)出高熱或倦怠等癥狀。根據(jù)1976年提出的FAB (法國(guó)-美國(guó)-英國(guó))分型，AML被定義為胚細(xì)胞在骨髓細(xì)胞中所占的比例為30%或更多的狀態(tài)。另一方面，作為包含染色體或基因突變的新的白血病分型方法，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)表的WHO分型，胚細(xì)胞的比例為20%或更高的狀態(tài)即定義為AML。為了說(shuō)明白血病的發(fā)病機(jī)理，近年來(lái)提出了所謂的“白血病干細(xì)胞”的概念。根據(jù)這一概念，在自我復(fù)制能力顯著增強(qiáng)的造血干細(xì)胞中，極少數(shù)的細(xì)胞發(fā)揮用于供給白血病細(xì)胞的“干細(xì)胞”功能，反復(fù)進(jìn)行自我復(fù)制與定向分化，持續(xù)供給白血病細(xì)胞，由此表現(xiàn)出白血病的病態(tài)。
有報(bào)道指出，AML中的白血病干細(xì)胞經(jīng)由細(xì)胞粘附分子固定在骨髓的骨內(nèi)膜區(qū)域， 從而可以逃過(guò)化學(xué)療法藥物所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，即，獲得對(duì)化學(xué)療法藥物的抗藥性(例如參照非專利文獻(xiàn)1)。在現(xiàn)有技術(shù)中，已知在經(jīng)過(guò)了化學(xué)療法的AML患者中，會(huì)由于微小殘留病變(MRD) 而使病態(tài)復(fù)發(fā)。已經(jīng)明確的是，導(dǎo)致上述復(fù)發(fā)的抗藥性的獲得的原因之一在于，存在于白血病細(xì)胞表面的VLA(極晚抗原，very late antigen) _4參與了與骨髓間質(zhì)細(xì)胞(成骨細(xì)胞) 表面的纖連蛋白的粘附?；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，人們提出了以VLA-4為靶點(diǎn)的AML治療方法/復(fù)發(fā)預(yù)防方法。例如，通過(guò)給予VLA-4特異性抗體(VLA-4中和抗體)來(lái)抑制VLA-4與纖連蛋白的粘附，由此可以進(jìn)行AML的治療/預(yù)防(例如參照非專利文獻(xiàn)2)。VLA-4是由整聯(lián)蛋白家族的α4亞基與β 1亞基構(gòu)成的雜二聚體蛋白，其中的β 1亞基參與了與骨髓的成骨細(xì)胞的粘附。另外，作為小鼠骨髓瘤(白血病)中的反轉(zhuǎn)錄病毒摻入位點(diǎn)，本發(fā)明人對(duì)Evil (同向性病毒整合-1)基因進(jìn)行了鑒定(參照非專利文獻(xiàn)3)。如上所述，Evil基因含有從小鼠白血病的病毒插入位點(diǎn)分離的3099bp基因(參考序列登錄號(hào)NM_007963)，編碼有含有1032個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(Evil蛋白)(參考序列登錄號(hào)NP_031908)。人的同源基因(EVI1基因)含有4873bp基因(參考序列登錄號(hào) ΝΜ_001105077，序列號(hào)1)，編碼有含有1115個(gè)氨基酸(參考序列登錄號(hào)NP_0010985478，序列號(hào)2)的蛋白質(zhì)(EVI1蛋白質(zhì))?？梢源_認(rèn)，Evil蛋白質(zhì)/EVIl蛋白質(zhì)分別主要在小鼠/ 人的造血干細(xì)胞或白血病細(xì)胞的核內(nèi)表達(dá)。這里，關(guān)于EVIl基因與癌癥的關(guān)系，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在人的AML中，由于EVIl基因所位于的3號(hào)染色體長(zhǎng)臂(3q26)上的轉(zhuǎn)位而可見(jiàn)EVIl基因的激活(參照非專利文獻(xiàn)4)。 然后，又明確了 EVIl基因在各種類型細(xì)胞的細(xì)胞增殖/分化中擔(dān)負(fù)著的重要作用，還明確了，EVIl基因也在骨髓的造血干細(xì)胞中表達(dá)并參與造血干細(xì)胞的控制(例如參照非專利文獻(xiàn)5)。本發(fā)明人了解到，所述EVIl基因通過(guò)控制GATA-2基因的表達(dá)來(lái)參與造血干細(xì)胞的增殖(參照非專利文獻(xiàn)6)。另外，近年來(lái)有報(bào)告指出，EVIl基因是造血干細(xì)胞或轉(zhuǎn)化白血病細(xì)胞的增殖中的重要控制因子(參照非專利文獻(xiàn)7)。不過(guò)，尚未提出基于上述認(rèn)識(shí)的關(guān)于AML等癌癥的治療/預(yù)防相關(guān)的具體方法的提案。另外，已知的是，人的AML中約2 3 成中可見(jiàn)EVIl基因激活，上述AML是難治性的，并且復(fù)發(fā)的頻率也高。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 Jshikawa 等，Nature Biotechnology 25，1315-1321 (2007)非專利文獻(xiàn)2 :Matsunaga 等，Nature Medicine 9，1158-1165 (2003)非專利文獻(xiàn)3 :Morishita 等，Cell 54 (6)，831-840 (1988)非專利文獻(xiàn)4 :Morishita 等 A, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 (9), 3937-3941(1992)非專利文獻(xiàn)5 =Phillips 等，Science 288，1635-1640 (2000)非專利文獻(xiàn)6 :Yuasa 等，The EMBO Journal 24，1976-1987 (2005)非專利文獻(xiàn)7 :Goyama 等，Cell Stem Cell 3 (2), 207-220 (2008)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問(wèn)題如上所述，在現(xiàn)有技術(shù)中，提出了以VLA_4( α 4/β 1整聯(lián)蛋白)為靶點(diǎn)的AML的治療法/復(fù)發(fā)預(yù)防方法。但是，尚不了解以EVIl基因或該基因直接編碼的mRNA/蛋白質(zhì)、其它與EVIl基因相關(guān)的基因或該基因編碼的mRNA/蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的AML的治療方法/復(fù)發(fā)預(yù)防方法。從增加更有效且副作用小的治療方法/復(fù)發(fā)預(yù)防方法的變種來(lái)對(duì)醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步作出貢獻(xiàn)的觀點(diǎn)出發(fā)，目前仍盼望能夠開(kāi)發(fā)以VLA-4以外的分子作為靶點(diǎn)的新的分子靶向療法。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用對(duì)與以往不同的目標(biāo)分子的表達(dá)/功能進(jìn)行控制的癌癥的預(yù)防/治療手段，作為癌癥的分子靶向療法的新的措施。本發(fā)明的目的還在于提供一種使用上述目標(biāo)分子來(lái)篩選具有癌癥的預(yù)防/治療活性的物質(zhì)的措施。解決問(wèn)題的措施本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制EVIl基因或 EVIl蛋白質(zhì)的表達(dá)/功能，被抑制的細(xì)胞的細(xì)胞粘附能力降低。同樣還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制現(xiàn)有已知的形成二聚體的整聯(lián)蛋白的構(gòu)成α 6亞基和β 4亞基的各個(gè)蛋白質(zhì)(分別為ITGA6蛋白質(zhì)和ITGB4蛋白質(zhì))的表達(dá)/功能，或抑制編碼所述蛋白質(zhì)的基因(分別為ITGA6基因和ITGB4基因)的表達(dá)/功能，所抑制的細(xì)胞的細(xì)胞粘附能力也降低。這樣，本發(fā)明證明了 EVIl基因/蛋白質(zhì)或ITGA6/ITGB4基因/蛋白質(zhì)可以作為癌癥的預(yù)防/治療癌癥的靶點(diǎn)， 從而完成了本發(fā)明。S卩，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑包含針對(duì)含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑含有反義多核苷酸，所述反義多核苷酸含有與編碼含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列或其一部分。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑包含抑制含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)。這里，上述抑制劑例如用于癌癥的預(yù)防或治療。上述抑制劑在與其它抗癌藥合并使用時(shí)，可以用于提高癌細(xì)胞對(duì)上述抗癌藥的敏感性。上述癌癥可以是白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制方法，所述方法包括抑制含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制方法，所述方法包括抑制編碼含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)和/或活性。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供一種抑制含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制造癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供一種抑制編碼含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)和/ 或活性的物質(zhì)在制造癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供一種抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附的物質(zhì)的篩選方法，所述篩選方法使用含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽。這里，含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽可以以生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)或其部分肽的細(xì)胞的形態(tài)提供。此時(shí)，還可以使用從對(duì)于含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體、 以及含有編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸或其堿基序列的一部分的多核苷酸中選擇的任意一種。另外，上述篩選方法可以用于癌癥的預(yù)防或治療物質(zhì)的篩選。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，作為癌癥的分子靶向療法中的新的方法，可以通過(guò)控制與現(xiàn)有技術(shù)不同的目標(biāo)分子的表達(dá)、功能，來(lái)提供癌癥的預(yù)防/治療措施。另外，根據(jù)本發(fā)明，還可以提供使用了上述目標(biāo)分子的、篩選具有癌癥的預(yù)防/治療活性的物質(zhì)的措施。


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1中的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果的圖.
圖20 (a)是表示培養(yǎng)AMLl(shLuc)的結(jié)果的圖，圖20(b)是表示培養(yǎng)AMLl (shEVIl)的結(jié)果的圖。圖21是表示參考例6中，從NCBI的基因表達(dá)庫(kù)(GEO)中采集人AML患者的骨髓細(xì)胞中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)得到的結(jié)果的圖。圖21 (a)表示ITGA6基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，圖21 (b) 表示ITGB4基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)。圖22是表示參考例7中，從NCBI的基因表達(dá)庫(kù)(GEO)中采集人的各種骨髓/末梢血細(xì)胞中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并對(duì)ITGA6基因的表達(dá)量進(jìn)行比較的結(jié)果的圖。圖M是表示參考例8中的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果的圖。圖25是表示實(shí)施例5中的FACS法測(cè)定結(jié)果的圖表。圖25 (a)表示使用 AMLl (shLuc)細(xì)胞的FACS結(jié)果，圖25 (b)表示使用AMLl (shEVIl)細(xì)胞的FACS結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人首先簡(jiǎn)略介紹一下完成本方式的原委，首先，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制 EVIl基因的表達(dá)，各種人白血病細(xì)胞中的整聯(lián)蛋白的表達(dá)受到抑制，所述胞的細(xì)胞粘附能力降低。具體來(lái)說(shuō)，明確了通過(guò)抑制EVIl基因的表達(dá)，整聯(lián)蛋白的α6亞基和β4亞基的表達(dá)受到抑制。這里，構(gòu)成人整聯(lián)蛋白α 6亞基的蛋白質(zhì)(ITGA6蛋白質(zhì))由含有5680bp的ITGA6 基因(參考序列登錄號(hào)NM_001079818，序列號(hào)3)編碼，含有1091個(gè)氨基酸(參考序列登錄號(hào)NP_001073^6，序列號(hào)4)。小鼠的同源蛋白質(zhì)(Itga6蛋白質(zhì))由含有4205bp的Itga6基因(參考序列登錄號(hào)NM_008397)編碼，含有1073個(gè)氨基酸(參考序列登錄號(hào)NP_032423)。另外，構(gòu)成人整聯(lián)蛋白β 4亞基的蛋白質(zhì)(ITGB4蛋白質(zhì))由含有5695bp的ITGB4 基因(參考序列登錄號(hào)NM_001005619，序列號(hào)5)編碼，含有1805個(gè)氨基酸(參考序列登錄號(hào)NP_001005619，序列號(hào)6)。小鼠的同源蛋白質(zhì)(Itgb4蛋白質(zhì))由含有6160bp的 Itgb4基因(參考序列登錄號(hào)NM_001005608)編碼，含有1802個(gè)氨基酸(參考序列登錄號(hào) ΝΡ_001005608)。本發(fā)明人確認(rèn)，上述ITGA6基因和ITGB4基因在EVIl陽(yáng)性細(xì)胞中特異性地表達(dá)。根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明人提出了 ITGA6基因/蛋白質(zhì)、以及ITGB4基因/蛋白質(zhì)可能與白血病細(xì)胞等癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附能力的發(fā)揮有關(guān)的假說(shuō)。據(jù)此，確認(rèn)了通過(guò)抑制ITGB4 基因的表達(dá)、或利用中和抗體抑制ITGB4蛋白質(zhì)的活性，來(lái)降低人白血病細(xì)胞的細(xì)胞粘附能力，從而驗(yàn)證了上述假說(shuō)。另外，關(guān)于ITGA6基因或ITGA6蛋白質(zhì)，雖未進(jìn)行上述的確認(rèn)試驗(yàn)，但是考慮到ITGA6基因的表達(dá)會(huì)由于EVIl的表達(dá)抑制而與ITGB4基因同樣地受到抑制、以及ITGA6基因在各種細(xì)胞中的表達(dá)特異性與ITGB4基因相同，可以認(rèn)為在ITGA6基因 /蛋白質(zhì)中，得到與上述的ITGB4基因/蛋白質(zhì)同樣的結(jié)果的概率極高。這里，已知在EVIl基因表達(dá)的AML細(xì)胞中，整聯(lián)蛋白的表達(dá)亢進(jìn)。因此，本發(fā)明人鑒于上述認(rèn)識(shí)，提出了整聯(lián)蛋白可能參與了白血病細(xì)胞與骨髓的細(xì)胞粘附能力的發(fā)揮的假說(shuō)。在此基礎(chǔ)上，確認(rèn)了通過(guò)向EVIl陰性細(xì)胞中導(dǎo)入EVIl基因，所述細(xì)胞的細(xì)胞粘附能力升高，此時(shí)ITGA6基因和ITGB4基因的表達(dá)也增加。與此同時(shí)，在使用AML的臨床檢樣的試驗(yàn)中，確認(rèn)了 EVIl基因的表達(dá)與ITGA6基因/ITGB4基因的表達(dá)之間的相關(guān)性，從而驗(yàn)證了上述假說(shuō)。根據(jù)上述幾種認(rèn)識(shí)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。以下詳細(xì)說(shuō)明用于實(shí)施本發(fā)明的方式。本發(fā)明的技術(shù)范圍并不只限定為下述方式。本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)(也稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)是含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4、 或序列號(hào)6表示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是從人或其它溫血?jiǎng)游?例如豚鼠、大鼠、小鼠、雞、兔、豬、綿羊、牛、猴等)的細(xì)胞(例如肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、系膜細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)、巨核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、乳腺細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞、或這些細(xì)胞的前體細(xì)胞、干細(xì)胞或癌細(xì)胞等)或存在這些細(xì)胞的所有組織(例如腦、腦的各部位(例如嗅球、扁桃核、基底核、海馬體、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓、小腦)、脊髓、腦下垂體、胃、胰腺、腎臟、肝臟、生殖腺、甲狀腺、膽囊、 骨髓、副腎、皮膚、肌肉(例如平滑肌、骨骼肌)、肺、消化道(例如大腸、小腸)、血管、心臟、 胸腺、脾臟、頌下腺、末梢血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤(pán)、子宮、骨骼、關(guān)節(jié)、脂肪組織(例如白色脂肪組織、褐色脂肪組織)等)等中分離/純化得到的蛋白質(zhì)。另外，也可以是化學(xué)合成或利用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)而生化合成的蛋白質(zhì)，或者是由導(dǎo)入了核酸的轉(zhuǎn)化體而生產(chǎn)的重組蛋白，其中所述核酸具有編碼上述氨基酸序列的堿基序列。作為與序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列，可以舉出與序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列具有約50%或更高、優(yōu)選地約60%或更高、更優(yōu)選約70%或更高、進(jìn)一步優(yōu)選約80%或更高、特別優(yōu)選約90%或更高、最優(yōu)選約95%或更高的同源性的氨基酸序列等。這里，“同源性”是指采用在所述技術(shù)領(lǐng)域中公知的數(shù)學(xué)算法，將兩個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，最佳的比對(duì)(優(yōu)選地，為了獲得最佳的比對(duì)，所述算法考慮了向序列的一方或雙方導(dǎo)入空位)中的相同的氨基酸和類似氨基酸殘基相對(duì)于重疊的全部氨基酸殘基的比例(％)?！邦愃瓢被帷笔侵肝锢砘瘜W(xué)性質(zhì)類似的氨基酸，例如可以舉出芳族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、 極性氨基酸(GlruAsn)、堿性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、含羥基的氨基酸(kr、Thr)、小支鏈的氨基酸(Gly、Ala、Ser, Thr, Met)等被分類為相同類型的氨基酸。 可以預(yù)見(jiàn)的是，上述的類似氨基酸的置換不會(huì)帶來(lái)蛋白質(zhì)表型的變化(即，為保守性的氨基酸置換)。保守性的氨基酸置換的具體例子在所述技術(shù)領(lǐng)域是周知的，記載于各種文獻(xiàn) (例如參照 Bowie 等著，Science, 247 1306-1310 (1990))。 本說(shuō)明書(shū)中的氨基酸序列的同源性可以使用同源性計(jì)算算法NCBI BLAST (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心堿基局部比對(duì)檢索工具(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool))，按以下的條件(期望值=10 ；允許空位；矩陣=BL0SUM62 ；過(guò)濾=OFF)計(jì)算。用于確定氨基酸序列的同源性的其它算法例如可以舉出Karlin 等著，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5877 (1993)中記載的算法(所述算法包含在NBLAST和XBLAST程序(版本2. 0)中(Altschul等著，Nucleic Acids Res.，25 :3389-3402 (1997))) ,Needleman 等著，J. Mol. Biol.，48 :444-453 (1970)中記載的算法(所述算法包含在GCG軟件包中的GAP程序中)、Myers和Miller，CABI0S，4 11-17(1988)中記載的算法(所述算法包含在CGC序列比對(duì)軟件包的一部分即ALIGN程序 (版本 2.0)中)、Pearson 等著，Proc. Natl. AcacUci. USA，85 :2444-2448(1988)中記載的算法(所述算法包含在GCG軟件包的FASTA程序中)等，它們也可以同樣地優(yōu)選采用。更優(yōu)選地，與序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列是與序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列具有約50%或更高、優(yōu)選約 60%或更高、更優(yōu)選約70%或更高、進(jìn)一步優(yōu)選約80%或更高、特別優(yōu)選約90%或更高、最優(yōu)選約95%或更高的同一性(identity)的氨基酸序列。本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)是含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上同一的氨基酸序列、且與含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的活性例如可以舉出配體結(jié)合活性或信號(hào)信息傳遞作用等。這里，“實(shí)質(zhì)上同質(zhì)”表示它們的性質(zhì)在定性上(例如生理學(xué)上或藥理學(xué)上)同質(zhì)。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性優(yōu)選為同等，而它們的活性程度(例如約0.01 約100倍，優(yōu)選約0. 1 約10 倍，更優(yōu)選0. 5 2倍)、或蛋白質(zhì)的分子量等量的要素可以不同。配體結(jié)合活性或信號(hào)信息傳遞作用等活性的測(cè)定可以按照其本身公知的方法進(jìn)行。例如可以按照在后述的抑制本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)活性的化合物或它的鹽的篩選方法中采用的方法等進(jìn)行。作為本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)，例如也可以包含所謂的突變蛋白，即含有(i)在序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列中的缺失了 1個(gè)或2個(gè)或更多(例如1 50個(gè)左右，優(yōu)選1 30個(gè)左右，更優(yōu)選1 10個(gè)左右，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1 5、4、3或2 個(gè)))氨基酸的氨基酸序列、(ii)在序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列上附加了 1個(gè)或2個(gè)或更多個(gè)(例如1 50個(gè)左右，優(yōu)選1 30個(gè)左右，更優(yōu)選1 10個(gè)左右，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1 5、4、3或2個(gè)))氨基酸的氨基酸序列、(iii)在序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列中插入了 1個(gè)或2個(gè)或更多個(gè)(例如1 50個(gè)左右，優(yōu)選1 30個(gè)左右，更優(yōu)選1 10個(gè)左右，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1 5、4、3或2個(gè)))氨基酸的氨基酸序列、(iv)在序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列中的1個(gè)或2個(gè)或更多個(gè)(例如1 50個(gè)左右，優(yōu)選1 30個(gè)左右，更優(yōu)選1 10個(gè)左右，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè) (1 5、4、3或2個(gè))氨基酸被其它氨基酸置換的氨基酸序列、或(ν)將它們組合而得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)等。如上所述，在對(duì)氨基酸序列進(jìn)行插入、缺失或置換的情況下，其插入、缺失或換的位置沒(méi)有特別限定。作為本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的優(yōu)選例子，例如可以舉出含有序列號(hào)2表示的氨基酸序列的人EVIl (參考序列登錄號(hào)NP_001098M7)或其它哺乳動(dòng)物的同系物(例如 GenBank中以參考序列登錄號(hào)NP_031989登錄的小鼠同系物)、含有序列號(hào)4表示的氨基酸序列的人ITGA6 (參考序列登錄號(hào)NP_001073^6)或其它哺乳動(dòng)物的同系物(例如GenBank 中以參考序列登錄號(hào)NP_03M23登錄的小鼠同系物)、含有序列號(hào)6表示的氨基酸序列的人ITGB4(參考序列登錄號(hào)NP_001005619)或其它哺乳動(dòng)物的同系物(例如GenBank中以參考序列登錄號(hào)NP_001005608登錄的小鼠同系物)等。在本說(shuō)明書(shū)中，按照肽標(biāo)記的慣例，蛋白質(zhì)和肽的左端記載為N末端(氨基末端)， 右端記載為C末端(羧基末端)。以含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)為代表的、本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)可以是C末端為羧基(-C00H)、羧酸鹽基(-C00-)、酰胺基(-CONH2)或酯(-C00R)的任意一種。這里，在C末端為酯(-C00R)的情況下，R例如可以使用甲基、乙基、正丙基、異丙
基、正丁基等Cp6烷基；環(huán)戊基、環(huán)己基等C3_8環(huán)烷基；苯基、α -萘基等C6_12芳基；芐基、苯乙基等苯基-C"烷基或者α -萘基甲基等α -萘基-Cl_2烷基等的C7_14芳烷基、新戊酰氧甲基等。在本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)在C末端以外具有羧基(或羧酸鹽基)的情況下，羧基被酰胺化或酯化了的蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)中。在此情況下的酯例如可以使用上述的C末端的酯等。另外，本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)還可以包含N末端的氨基酸殘基(例如蛋氨酸殘基) 的氨基被保護(hù)基團(tuán)(例如甲酰基、乙?；菴p6烷?；鹊腃h6酰基等)保護(hù)的蛋白質(zhì)、在生物體內(nèi)切斷而生成并且將N末端的谷氨酰胺殘基進(jìn)行了焦谷氨酸化的蛋白質(zhì)、分子內(nèi)的氨基酸支鏈上的取代基(例如_0H、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán) (例如甲?；⒁阴；菴p6烷?；鹊腃h6?；?保護(hù)的蛋白質(zhì)、或糖鏈鍵合了的所謂糖蛋白等復(fù)合蛋白等。作為本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的部分肽，是具有上述本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列的肽，且只要與所述蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上具有同質(zhì)活性即可，可以是任何的肽。這里， “實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的活性”與上述的含義相同。“實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的活性”的測(cè)定可以與上述本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的情形同樣進(jìn)行。例如可以使用具有本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的構(gòu)成氨基酸序列中的至少20個(gè)或更多、優(yōu)選50個(gè)或更多、進(jìn)一步優(yōu)選70個(gè)或更多、更優(yōu)選100個(gè)或更多、最優(yōu)選150個(gè)或更多的氨基酸序列的肽等。另外，在本發(fā)明中使用的部分肽中，氨基酸序列中缺失了 1個(gè)或2個(gè)或更多個(gè)(優(yōu)選1 20個(gè)左右，更優(yōu)選1 10個(gè)左右，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1 5、4、3或2個(gè)))氨基酸、 在氨基酸序列中附加了 1個(gè)或2個(gè)或更多個(gè)(優(yōu)選1 20個(gè)左右，更優(yōu)選1 10個(gè)左右， 進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1 5、4、3或2個(gè)))氨基酸、或在氨基酸序列中插入了 1個(gè)或2個(gè)或更多個(gè)(優(yōu)選1 20個(gè)左右，更優(yōu)選1 10個(gè)左右，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1 5、4、3或2個(gè))) 氨基酸、或氨基酸序列中的1個(gè)或2個(gè)或更多個(gè)(優(yōu)選1 20個(gè)左右，更優(yōu)選1 10個(gè)左右，進(jìn)一步優(yōu)選數(shù)個(gè)(1 5、4、3或2個(gè)))氨基酸被其它氨基酸置換。在本發(fā)明中使用的部分肽中，C末端可以是羧基(-C00H)、羧酸鹽基(-C00-)、酰胺基(-CONH2)或酯(-C00R)的任意一種。這里，在C末端為酯(-C00R)的情況下，作為R可以舉出與關(guān)于本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)的上述同樣的基團(tuán)。在本發(fā)明的部分肽在C末端以外具有羧基(或羧酸基)的情況下，羧基被酰胺化或酯化了的蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明的部分肽中。 此時(shí)的酯例如可以使用與C末端的酯同樣的酯等。另外，在本發(fā)明中使用的部分肽中，與上述本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)同樣地，也包括 N末端的氨基酸殘基(例如蛋氨酸殘基)的氨基被保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)的部分肽、將N末端一側(cè)在生物體內(nèi)切斷而生成的谷氨酰胺殘基進(jìn)行了焦谷氨酸化的部分肽、分子內(nèi)的氨基酸的支鏈上的取代基被適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)所保護(hù)的部分肽、或者是糖鏈鍵合了的所謂糖肽等的復(fù)合
月太等。本發(fā)明中使用的部分肽可以作為制作抗體用的抗原使用。
本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)或其部分肽可以是游離體，也可以是鹽(如無(wú)特別限定， 以下均同樣)。上述鹽可以使用與生理學(xué)可接受的酸(例如無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸)或堿(例如堿金屬鹽)等形成的鹽，尤其優(yōu)選生理學(xué)可接受的酸加成鹽。上述鹽例如可以使用與無(wú)機(jī)酸 (例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，或與有機(jī)酸(例如乙酸、蟻酸、丙酸、富馬酸、馬來(lái)酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸、苯甲酸、甲烷磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)可以從上述人或其它溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞或組織中，利用其本身公知的蛋白質(zhì)的純化方法進(jìn)行純化來(lái)制備。具體來(lái)說(shuō)，例如，在存在表面活性劑的條件下，將哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞勻漿，將所得的組織的粗提取物組分進(jìn)行反相層析、離子交換層析、親和層析等層析等，由此可以制備本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)或其部分肽可以按照公知的肽合成方法來(lái)制造。作為肽的合成法，例如可以是固相合成法、液相合成法的任意一種。即，將可構(gòu)成本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)或其部分肽的部分肽或氨基酸與殘余部分縮合，在產(chǎn)物具有保護(hù)基團(tuán)的情況下脫去保護(hù)基團(tuán)，據(jù)此可以制造目標(biāo)蛋白質(zhì)(肽)。公知的縮合法或保護(hù)基團(tuán)的脫去例如可舉出以下(i) (ν)的方法。(i)M. Bodanszky 禾口 M. A. Ondetti,月太合成(Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York(1966 年)(ii)Schroeder 禾口 Luebke,肽(The Peptide), Academic Press, New York (1965 年)(iii)泉屋信夫等著，肽合成的基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)，丸善(株)(1975年)(iv)矢島治明和榊原俊平，生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1，蛋白質(zhì)化學(xué)IV，205 (1977年)(ν)矢島治明監(jiān)修，續(xù)醫(yī)藥品的開(kāi)發(fā)，第14卷，肽合成，廣川書(shū)店據(jù)此得到的蛋白質(zhì)(肽)可以利用公知的純化方法純化分離。這里，作為純化方法，例如可以舉出溶劑萃取/蒸餾/柱層析/液相層析/重結(jié)晶等。在利用上述方法得到的蛋白質(zhì)(肽)為游離體的情況下，可以按照公知的方法或基于這種的方法來(lái)變換成適當(dāng)?shù)柠}，相反，在蛋白質(zhì)(肽)是以鹽的方式獲得的情況下，可按照公知的方法或基于這種方法來(lái)變換成游離體或其它鹽。在本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)或其部分肽、或者其酰胺化合物的合成中，可以使用通常市售的蛋白質(zhì)合成用樹(shù)脂。上述樹(shù)脂例如可以舉出氯甲基樹(shù)脂、羥基甲基樹(shù)脂、二苯甲基胺樹(shù)脂、氨基甲基樹(shù)脂、4-芐基氧基芐基醇樹(shù)脂、4-甲基二苯甲基胺樹(shù)脂、PAM樹(shù)脂、4-羥基甲基甲基苯基乙酰胺甲基樹(shù)脂、聚丙烯酰胺樹(shù)脂、4-(2’，4’_ 二甲氧基苯基-羥基甲基)苯氧基樹(shù)脂、4-(2’，4’_ 二甲氧基苯基-Fmoc氨基乙基)苯氧基樹(shù)脂等。使用上述樹(shù)脂，按照目標(biāo)蛋白的序列，按照其本身公知的各種縮合方法，使α-氨基和適當(dāng)保護(hù)了支鏈官能基團(tuán)的氨基酸在樹(shù)脂上縮合。反應(yīng)的最后，從樹(shù)脂上切取蛋白質(zhì)或部分肽，同時(shí)除去各種保護(hù)基團(tuán)，進(jìn)一步在高稀釋溶液中實(shí)施分子內(nèi)二硫鍵的形成反應(yīng)，可以取得目標(biāo)蛋白或部分肽或它們的酰胺化合物。關(guān)于上述保護(hù)氨基酸的縮合，可以使用能夠在蛋白質(zhì)合成中使用的各種活化試劑，特別地，可以使用碳二亞胺類。作為碳二亞胺類，可以使用DCC、N，N’ - 二異丙基碳二亞胺、N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺等。在通過(guò)它們進(jìn)行的活化中，可以在添加外消旋化抑制添加劑(例如H0Bt、H00Bt)的同時(shí)，在樹(shù)脂中直接添加保護(hù)氨基酸，或者預(yù)先進(jìn)行保護(hù)氨基酸的活化，制成對(duì)稱酸酐或HOBt酯或HOOBt酯的形式，然后添加到樹(shù)脂中。作為在保護(hù)氨基酸的活化或者與樹(shù)脂的縮合中使用的溶劑，可以從在蛋白質(zhì)縮合反應(yīng)中能夠使用的已知的溶劑中適當(dāng)選擇。例如，可以使用N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺類；二氯甲烷、氯仿等鹵代烴類；三氟乙醇等醇類；二甲基亞砜等亞砜類；吡啶、二氧雜環(huán)乙烷、四氫呋喃等醚類；乙腈、丙腈等腈類；乙酸甲酯、 乙酸乙酯等酯類或它們的適當(dāng)?shù)幕旌衔锏取７磻?yīng)溫度可以從在蛋白質(zhì)鍵形成反應(yīng)中采用的已知的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇，通常為約-20 約50°C的范圍。被活化的氨基酸衍生物通常以 1. 5 4倍過(guò)量地使用。使用茚三酮反應(yīng)進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果，在縮合不充分的情況下，無(wú)需進(jìn)行保護(hù)基團(tuán)的脫去，通過(guò)反復(fù)進(jìn)行縮合反應(yīng)就可以進(jìn)行充分的縮合。在即使反復(fù)進(jìn)行反應(yīng)也未獲得充分的縮合時(shí)，可以使用乙酸酐或乙?；溥?，使未反應(yīng)氨基酸乙?；?，這樣可以不對(duì)之后的反應(yīng)產(chǎn)生影響。對(duì)于不應(yīng)參與原料反應(yīng)的官能基團(tuán)的保護(hù)以及保護(hù)基團(tuán)、以及這些保護(hù)基團(tuán)的脫去、參與反應(yīng)的官能基團(tuán)的活化等，可以從公知的基團(tuán)或公知的措施中適當(dāng)?shù)剡x擇。作為原料的氨基的保護(hù)基團(tuán)例如可以使用Z、Boc、叔戊基氧基羰基、異冰片基氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷基氧基羰基、三氟乙?；?、鄰苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亞磺?；?、二苯基膦基硫酰基、Fmoc等。羧基例如可以通過(guò)烷基酯化(例如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、2-金剛烷基等直鏈狀、支鏈狀或環(huán)狀烷基酯化)、芳烷基酯化(例如芐基酯、4-硝基芐基酯、4-甲氧基芐基酯、4-氯芐基酯、二苯甲基酯化)、苯酰甲基酯化、芐氧基羰基酰胼化、叔丁氧基羰基酰胼化、三苯甲基酰胼化等來(lái)保護(hù)。絲氨酸的羥基例如可以通過(guò)酯化或醚化來(lái)保護(hù)。適合酯化的基團(tuán)例如可以使用 乙?；鹊图?jí)(Ch6)烷?；⒈郊柞；确减；?；芐氧基羰基、乙氧基羰基等由碳酸衍生的基團(tuán)等。另外，適合醚化的基團(tuán)例如為芐基、四氫吡喃基、叔丁基等。酪氨酸的酚式羥基的保護(hù)基團(tuán)例如可以使用Bzl、Cl2-Bzl、2_硝基芐基、Br-Z、叔
丁基等。組氨酸的咪唑的保護(hù)基團(tuán)例如可以使用Tos、4_甲氧基-2，3，6_三甲基苯磺酰基、 DNP、芐氧基甲基、Bum、Boc JrtJmoc 等。保護(hù)基團(tuán)的去除(脫去)方法例如可以采用在Pd黑或Pd碳等催化劑的存在的條件下，在氫氣流中進(jìn)行接觸還原；或可以通過(guò)無(wú)水氟化氫、甲烷磺酸、三氟甲烷磺酸、三氟乙酸或它們的混合液等進(jìn)行酸處理；或進(jìn)行二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等的堿處理； 還可以在液氨中通過(guò)鈉進(jìn)行還原等。上述利用酸處理的脫去反應(yīng)通常在約-20°C 約40°C 的溫度下進(jìn)行；在酸處理中，例如添加茴香醚、苯酚、硫代茴香醚、間甲酚、對(duì)甲酚、二甲硫、 1，4_ 丁烷二硫醇、1，2_乙烷二硫醇等的陽(yáng)離子捕獲劑是有效的。另外，作為組氨酸的咪唑保護(hù)基團(tuán)使用的2，4-二硝基苯基可以通過(guò)硫苯酚處理來(lái)去除，作為色氨酸的吲哚保護(hù)基團(tuán)使用的甲?；梢酝ㄟ^(guò)在上述1，2_乙烷二硫醇、1，4_ 丁烷二硫醇等存在的條件下的酸處理來(lái)脫保護(hù)，除此之外還可以通過(guò)稀氫氧化鈉溶液、稀氨水等的堿處理來(lái)去除。原料的羧基的活化產(chǎn)物例如可以使用對(duì)應(yīng)的酸酐、迭氮化物、活性酯(與醇(例如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲基醇、對(duì)硝基苯酚、Η0ΝΒ、Ν-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、HOBt)形成的酯)等。原料的氨基的活化產(chǎn)物例如可以使用對(duì)應(yīng)的磷酸酰胺等。作為獲得蛋白質(zhì)或部分肽的酰胺化合物的其它方法，例如可以是首先將羧基末端的氨基酸的α-羧基進(jìn)行酰胺化來(lái)保護(hù)，然后在氨基一側(cè)將肽(蛋白質(zhì))鏈延長(zhǎng)至所需的鏈長(zhǎng)，然后制造只去除了所述肽鏈的N末端的α-氨基的保護(hù)基團(tuán)的蛋白質(zhì)或部分肽、以及只除去了 C末端的羧基保護(hù)基團(tuán)的蛋白質(zhì)或部分肽，使這些蛋白質(zhì)或肽在上述混合溶劑中縮合。具體的縮合反應(yīng)與上述相同。將通過(guò)縮合得到的保護(hù)蛋白質(zhì)或肽純化，然后按照上述方法去除所有的保護(hù)基團(tuán)，可以得到所需的粗蛋白質(zhì)或肽。所述粗蛋白質(zhì)或肽可以采用已知的各種純化手段純化，并將主要組分冷凍干燥，從而可以獲得所需的蛋白質(zhì)或肽的酰胺化合物。為了獲得蛋白質(zhì)或肽的酯化物，例如可以將羧基末端的氨基酸的α-羧基與期望的醇類縮合，制成氨基酸酯，然后與蛋白質(zhì)或肽的酰胺化合物同樣地，獲得期望的蛋白質(zhì)或肽的酯化物。本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的部分肽可以通過(guò)用適當(dāng)?shù)碾拿盖袛啾景l(fā)明使用的蛋白質(zhì)來(lái)制造。另外，本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)或其部分肽可以通過(guò)培養(yǎng)含有編碼所述蛋白質(zhì)或其部分肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)化物，從所得的培養(yǎng)物中分離純化所述蛋白質(zhì)或其部分肽來(lái)制備。編碼本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)或其部分肽的多核苷酸可以是DNA也可以是RNA，或者可以是DNA/ RNA嵌合物。優(yōu)選為DNA。另外，所述多核苷酸可以是雙鏈，也可以是單鏈。在雙鏈的情況下，可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA、或DNA:RNA的雜合物。在單鏈的情況下，可以是有義鏈(即編碼鏈)，也可以是反義鏈(即非編碼鏈)。作為編碼本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)或其部分肽的多核苷酸，可以舉出基因組DNA、基因組DNA文庫(kù)、來(lái)自哺乳動(dòng)物(例如人、牛、猴、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓、豚鼠、大鼠、小鼠、兔、 倉(cāng)鼠等)的所有細(xì)胞(例如肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、系膜細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)、巨核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、乳腺細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞、或這些細(xì)胞的前體細(xì)胞、 干細(xì)胞或癌細(xì)胞等)或存在這些細(xì)胞的所有組織(例如腦、腦的各部位(例如嗅球、扁桃核、基底核、海馬體、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓、小腦)、脊髓、腦下垂體、胃、胰腺、腎臟、 肝臟、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、副腎、皮膚、肺、消化道(例如大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾臟、頌下腺、末梢血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤(pán)、子宮、骨骼、關(guān)節(jié)、脂肪組織(例如褐色脂肪組織、白色脂肪組織)、骨骼肌等)的cDNA、合成DNA等。編碼本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)或其部分肽的基因組DNA和cDNA可以是分別將由上述細(xì)胞/組織制備的基因組DNA組分和總RNA或mRNA組分作為模板，通過(guò)使用聚合酶鏈反應(yīng)(以下也稱為“PCR法”)和反轉(zhuǎn)錄酶的RT-PCR法來(lái)直接擴(kuò)增。或者，編碼本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)或其部分肽的基因組DNA和cDNA 可以通過(guò)集落或噬菌體雜交法或者PCR法等，分別由基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)中克隆， 其中，所述基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)是將由上述細(xì)胞/組織制備的基因組DNA和總RNA 或mRNA的片段插入到適當(dāng)?shù)妮d體中制備的。文庫(kù)中使用的載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、 噬粒等的任意一種。
編碼本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的DNA可以是含有與例如包含序列號(hào)1、序列號(hào)3、或序列號(hào)5表示的堿基序列的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，并編碼與含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、或序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA。作為可以與序列號(hào)1、序列號(hào)3、或序列號(hào)5表示的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的 DNA，例如可使用含有與序列號(hào)1、序列號(hào)3、或序列號(hào)5表示的堿基序列具有約50%或更高、 優(yōu)選約60%或更高、更優(yōu)選約70%或更高、進(jìn)一步優(yōu)選約80%或更高、特別優(yōu)選約90%或更高、最優(yōu)選約95%或更高的同源性(homology)的堿基序列的DNA。本說(shuō)明書(shū)中的堿基序列的同源性例如可以使用同源性計(jì)算算法NCBI BLAST (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心堿基局部比對(duì)檢索工具(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool))，按以下的條件(期望值=10 ；允許空位；過(guò)濾=ON ；匹配打分=1 錯(cuò)配打分=-3)計(jì)算。用于確定堿基序列的同源性的其它算法同樣優(yōu)選地例舉上述的氨基酸序列的同源性計(jì)算算法。雜交可以按照其本身公知的方法或基于它的方法、例如分子克隆第2版 (Molecular Cloning 2nd ed. (J\ Sambrook 等著，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)) 等進(jìn)行。在使用市售的文庫(kù)的情況下，可以按照所附使用說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行。更優(yōu)選按照嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件進(jìn)行。雜交的條件是指例如鈉濃度約19 約40mM、優(yōu)選約19 約20mM，溫度為約50 約70°C、優(yōu)選約60 約65°C的條件。特別地，優(yōu)選鈉鹽濃度約19mM、溫度為約65°C的情形。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)適當(dāng)改變雜交溶液的鹽濃度、雜交反應(yīng)的溫度、探針濃度、探針的長(zhǎng)度、錯(cuò)配數(shù)目、雜交反應(yīng)時(shí)間、洗滌液的鹽濃度、洗滌溫度等，來(lái)容易地調(diào)節(jié)期望的嚴(yán)謹(jǐn)性。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的DNA可以舉出含有序列號(hào)1表示的堿基序列的DNA(參考序列登錄號(hào)NM_001105077)或其它哺乳動(dòng)物的同系物(例如GenBank 中以參考序列登錄號(hào)NM_007963登錄的小鼠同系物)、含有序列號(hào)3表示的堿基序列的 DNA(參考序列登錄號(hào)NM_001079818)或其它哺乳動(dòng)物的同系物(例如GenBank中以參考序列登錄號(hào)NM_008397登錄的小鼠同系物)、含有序列號(hào)5表示的堿基序列的DNA (參考序列登錄號(hào)NM_001005619)或其它哺乳動(dòng)物的同系物(例如GenBank中以參考序列登錄號(hào) ΝΜ_001005608登錄的小鼠同系物)等。編碼本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的部分肽的多核苷酸(例如DNA)可以是含有編碼上述本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的部分肽的堿基序列的任何多核苷酸。另外，還可以是基因組 DNA、基因組DNA文庫(kù)、來(lái)自上述細(xì)胞/組織的cDNA、來(lái)自上述細(xì)胞/組織的cDNA文庫(kù)、合成 DNA的任意一種。作為編碼本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的部分肽的DNA，例如可以使用含有序列號(hào)1、序列號(hào)3、或序列號(hào)5表示的堿基序列的部分堿基序列、或者與含有序列號(hào)1、序列號(hào)3、或序列號(hào)5表示的堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下雜交的堿基序列，且編碼與本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)具有實(shí)質(zhì)上同質(zhì)的活性的肽的DNA?？梢耘c序列號(hào)1、序列號(hào)3、或序列號(hào)5表示的堿基序列雜交的DNA與上述含義相同。雜交的方法和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件可以與上述相同樣。作為編碼本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)及其部分肽(以下，在編碼它們的DNA的克隆和表達(dá)的說(shuō)明中，可以將它們簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)的DNA的克隆手段，可以使用合成DNA引物，通過(guò)PCR法擴(kuò)增，其中所述合成DNA引物具有編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的堿基序列的一部分；或者可以通過(guò)使嵌入到適當(dāng)?shù)妮d體中的DNA與使用編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的一部分或全部區(qū)域的DNA片段或合成DNA進(jìn)行標(biāo)記的DNA雜交來(lái)選別。雜交的方法例如可以按照分子克隆第 2 版(Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook 等著，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989))中記載的方法等進(jìn)行。在使用市售的文庫(kù)的情況下，可以按照所附的使用說(shuō)明書(shū)記載的方法進(jìn)行。DNA的堿基序列的變換可以使用PCR、公知的試劑盒、例如Mutan TM-super Express Km(寶酒造(株))、Mutan TM-K (寶酒造(株))等，按照 0DA-LAPCR 法、Gapped duplex法、Kunkel法等其本身公知的方法或基于它們的方法進(jìn)行。所克隆的編碼蛋白質(zhì)的DNA可以根據(jù)目的，直接或根據(jù)期望用限制酶消化、或附加接頭來(lái)使用。所述DNA可以在其5’末端一側(cè)具有作為翻譯起始密碼子的ATG，并在3’末端一側(cè)具有作為翻譯終止密碼子的TAA、TGA或TAG。這些翻譯起始密碼子或翻譯終止密碼子可以使用適當(dāng)?shù)暮铣蒁NA連接物進(jìn)行附加。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)載體例如可以通過(guò)從編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA中切取作為目標(biāo)的DNA片段，將所述DNA片段與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中的啟動(dòng)子下游連接來(lái)制造。作為載體，可以使用來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、 來(lái)自枯草桿菌的的質(zhì)粒(例如PUB110、pTP5、pC194)、來(lái)自酵母菌的質(zhì)粒(例如pSH19、 PSH15), λ噬菌體等的噬菌體、反轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、桿狀病毒等動(dòng)物病毒等，除此之外還可以使用 pAl-ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo 等。本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子只要是與基因表達(dá)中使用的宿主對(duì)應(yīng)的、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子即可，可以使任何啟動(dòng)子。例如，在使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主的情況下，可以舉出SRa啟動(dòng)子、 SV40啟動(dòng)子、LTR啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、HSV-TK啟動(dòng)子等。其中，優(yōu)選使用CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子、SRa啟動(dòng)子等。在宿主為埃希氏桿菌屬菌的情況下，優(yōu)選trp啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、λ PL啟動(dòng)子、Ipp啟動(dòng)子、Τ7啟動(dòng)子等；在宿主為芽孢桿菌屬菌的情況下，優(yōu)選SPOl啟動(dòng)子、SP02啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等； 在宿主為酵母菌的情況下，優(yōu)選PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子等。在宿主為昆蟲(chóng)細(xì)胞的情況下，優(yōu)選多角體蛋白啟動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子等。在表達(dá)載體中，除以上之外，還可以根據(jù)需要使用含有增強(qiáng)子、剪接信號(hào)、polyA附加信號(hào)、選擇標(biāo)志、SV40復(fù)制起始點(diǎn)(以下也稱為“SV40ori”)等的載體。作為選擇標(biāo)志， 例如可以舉出二氫葉酸還原酶(以下稱為“dhfr”)基因(甲氨喋呤(MTX)抗性)、氨芐青霉素抗性基因(以下稱為“Ampr”)、新霉素抗性基因(以下也稱為“Neor”，G418抗性)等。 特別地，在使用dhfr基因缺損中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞、使用dhfr基因作為選擇標(biāo)志的情況下，可以通過(guò)不含有胸苷的培養(yǎng)基來(lái)選擇目標(biāo)基因。另外，還可以根據(jù)需要將與宿主適合的信號(hào)序列附加在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N末端一側(cè)。在宿主為埃希氏桿菌屬菌的情況下，可以利用WioA信號(hào)序列、OmpA信號(hào)序列等；在宿主為芽孢桿菌屬菌的情況下，可以利用α-淀粉酶信號(hào)序列、枯草芽孢桿菌素信號(hào)序列等； 在宿主為酵母菌的情況下，可以利用MFa信號(hào)序列、SUC2信號(hào)序列等；在宿主為動(dòng)物細(xì)胞的情況下，可以利用胰島素信號(hào)序列、α -干擾素信號(hào)序列、抗體分子信號(hào)序列等。使用如上構(gòu)建的、含有編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA的載體，可以制造轉(zhuǎn)化體。作為宿主，例如可以使用埃希氏桿菌屬菌、芽孢桿菌屬菌、酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、昆蟲(chóng)、動(dòng)物細(xì)胞等。作為埃希氏桿菌屬菌的具體例子，例如可以使用大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)K12 · DHl (Proc.Natl. Acad. Sci. USA,60, 160(1968)) 、 JM103 (Nucleic Acids Research,9，309 (1981))、JA221(Journal of Molecular Biology,120，517 (1978))、 HBlOl(Journal of Molecular Biology，41，459 (1969))、C600 (Genetics，39，440(1954))寸。作為芽孢桿菌屬菌，例如可以使用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) MI114 (Gene,24,255 (1983)),207-21 (Journal of Biochemistry,95,87(1984))等。作為酵母菌，例如可以使用啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、 AH22R-、NA87-11A、DKD_5D、20B_12、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913、NCYC2036、畢赤酵母(Pichia pastoris)KM71 等。作為昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如，在病毒為AcNPV的情況下，可以使用來(lái)自甘藍(lán)夜蛾幼蟲(chóng)的株化細(xì)胞(草地貪夜蛾細(xì)胞(Spodoptera frugiperda cell)，Sf細(xì)胞)、來(lái)自粉紋夜蛾 (Trichoplusiani)的中腸的MGl細(xì)胞、來(lái)自粉紋夜蛾的卵的High FiveTM細(xì)胞、來(lái)自甘藍(lán)夜蛾的細(xì)胞或來(lái)自鹽澤燈蛾^stigmena acrea)的細(xì)胞等。在病毒為BmNPV的情況下，可以使用來(lái)自蠶的株化細(xì)胞(家蠶N細(xì)胞(Bombyx mori N細(xì)胞)，BmN細(xì)胞)等。所述Sf細(xì)胞例如可以使用Sf9細(xì)胞(ATCC CRL1711)、Sf21細(xì)胞(以上記載于Vaughn, J. L.等著，In Vivo, 13,213-217(1977))等。作為昆蟲(chóng)，例如可以使用蠶的幼蟲(chóng)等(Maeda等著，Nature，315卷，592 (1985))。作為動(dòng)物細(xì)胞，例如可以使用猴細(xì)胞C0S-1、C0S-3、C0S_7、Vero、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(以下也稱為“CH0細(xì)胞”)、dhfr基因缺損CHO細(xì)胞(以下也稱為CHO(dhfr-)細(xì)胞)、小鼠L細(xì)胞、小鼠AtT-20、小鼠骨髓瘤細(xì)胞、小鼠ATDC5細(xì)胞、大鼠GH3、人FL細(xì)胞、人293細(xì)胞、人HeLa細(xì)胞等。為了轉(zhuǎn)化埃希氏桿菌屬菌，例如可以按照Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69， 2110(1972)或 Gene，17，107 (1982)等記載的方法進(jìn)行。為了轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬菌，例如可以按照Mol. Gen. Genet.，168，111 (1979)等記載的方法進(jìn)行。為了轉(zhuǎn)化酵母菌，例如可以按照Meth. Enzymol.，194，182-187 (1991)、以及 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75，1929 (1978)等記載的方法進(jìn)行。為了轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)細(xì)胞或昆蟲(chóng)，例如可以按照Bio/Technology，6，47-55 (1988)等記載的方法進(jìn)行。為了轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞，例如可以按照《細(xì)胞工學(xué)別冊(cè)8新細(xì)胞工學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》， 263-267 (1995)(秀潤(rùn)社發(fā)行)、以及Virology, 52，456 (1973)中記載的方法進(jìn)行。這樣，可以得到用含有編碼蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化體。在培養(yǎng)宿主為埃希氏桿菌屬、枯草桿菌屬菌的轉(zhuǎn)化體時(shí)，在培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基是適合的，其中可以含有所述轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)發(fā)育所必需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)物等。作為碳源，例如可以舉出葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、以及蔗糖等；作為氮源，例如可以舉出銨鹽類、硝酸鹽類、玉米漿、胨、酪蛋白、肉提取物、大豆粕、以及馬鈴薯提取液等無(wú)機(jī)或有機(jī)物質(zhì)；作為無(wú)機(jī)物，例如可以舉出氯化鈣、磷酸二氫鈉、以及氯化鎂等。另外，還可以添加酵母提取物、維生素類、以及生長(zhǎng)因子等。培養(yǎng)基的PH優(yōu)選為約5 約8。作為培養(yǎng)埃希氏桿菌屬菌時(shí)的培養(yǎng)基，例如優(yōu)選葡萄糖、含有水解酪蛋白氨基酸的 M9 培養(yǎng)基(Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1972)。其中，為了根據(jù)需要使啟動(dòng)子高效率發(fā)揮作用，可以加入諸如3 β -吲哚丙烯酸等的試劑。在宿主為埃希氏桿菌屬菌的情況下，培養(yǎng)通常在約15 約43°C下進(jìn)行約3 約 24小時(shí)，可以根據(jù)需要進(jìn)行通氣或攪拌。在宿主為芽孢桿菌屬菌的情況下，培養(yǎng)通常在約30 約40°C下進(jìn)行約6 約M 小時(shí)，可以根據(jù)需要進(jìn)行通氣或攪拌。在培養(yǎng)宿主為酵母的轉(zhuǎn)化體時(shí)，作為培養(yǎng)基，例如可以舉出BurW10Ider最小培養(yǎng)基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,4505 (1980))或含有0. 5%水解酪蛋白氨基酸的SD培養(yǎng)基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)) 培養(yǎng)基的 pH 優(yōu)選調(diào)節(jié)為約 5 約 8。培養(yǎng)通常在約20 約35°C下進(jìn)行約M 約72小時(shí)，可以根據(jù)需要進(jìn)行通氣或攪拌。在培養(yǎng)宿主為昆蟲(chóng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體時(shí)，作為培養(yǎng)基，可以使用在Grace’ s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基(Nature，195，788 (1962))中適當(dāng)加入滅活的10%牛血清等添加物所得的培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基的PH優(yōu)選調(diào)節(jié)為約6. 2 約6. 4。培養(yǎng)通常在約27°C下進(jìn)行約3 約5天，可以根據(jù)需要進(jìn)行通氣(例如5% CO2)或攪拌。在培養(yǎng)宿主為動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體時(shí)，作為培養(yǎng)基，例如可以使用含有約5 約 20% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基(Science，122,501 (1952))、DMEM 培養(yǎng)基(Virology,8, 396(1959))、RPMI 1640 培養(yǎng)基(J. Am. Med. Assoc.，199，519 (1967))、199 培養(yǎng)基(Proc. Soc. Biol. Med.，73，1(1950))等。pH優(yōu)選約6 約8。培養(yǎng)通常在約30 約40°C下進(jìn)行約15 約60小時(shí)，可以根據(jù)需要進(jìn)行通氣或攪拌。如上所述，可以在轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜或細(xì)胞外生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)。從上述培養(yǎng)物中分離純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)例如可以按照以下方法進(jìn)行。在從培養(yǎng)菌體或細(xì)胞中提取本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，可以適合采用在培養(yǎng)后用公知的方法收集菌體或細(xì)胞并將其懸浮于適當(dāng)?shù)木彌_液中，利用超聲波、溶菌酶和/或冷凍融解等破壞菌體和細(xì)胞，然后利用離心或過(guò)濾獲得蛋白質(zhì)的粗提取液的方法等。在緩沖液中可以含有尿素或鹽酸胍等蛋白質(zhì)改性劑、或Triton X-100TM等表面活性劑。蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液中時(shí)，可以在培養(yǎng)結(jié)束后，按照其本身的公知方法將菌體或細(xì)胞與上清分離并收集上清。關(guān)于如此得到的培養(yǎng)上清或提取液中所含的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的純化，可將其本身公知的分離/純化方法適當(dāng)?shù)亟M合進(jìn)行。這些自身公知的分離、純化方法可以采用鹽析或溶劑沉淀法等利用溶解度的方法；透析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法以及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法等主要利用分子量之差的方法；離子交換層析等利用電荷差的方法；親和層析等利用特異性的親和性的方法；反相高效液相層析等利用疏水性之差的方法；等電位點(diǎn)電泳法等利用等電位點(diǎn)之差的方法等。在如此得到的本發(fā)明的蛋白質(zhì)以游離體的形式獲得的情況下，可以按照其本身公知的方法或基于它的方法來(lái)變換成鹽；相反，在以鹽的形式獲得的情況下，可以按照其本身公知的方法或與基于它的方法來(lái)變換成游離體或其它的鹽。
通過(guò)在純化前或純化后使適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)改性酶發(fā)生作用，可以對(duì)重組體所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)任意加入修飾，也可以部分地區(qū)除多肽。作為蛋白改性酶，例如可以使用胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、精氨酸內(nèi)肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。如此生成的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的存在可以通過(guò)使用特異性抗體的酶聯(lián)免疫測(cè)定或蛋白質(zhì)印跡等來(lái)測(cè)定。另外，本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)或其部分肽可以以編碼所述蛋白質(zhì)或部分肽的DNA 所對(duì)應(yīng)的RNA為模板，使用含有兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、小麥胚芽溶胞產(chǎn)物、大腸桿菌溶菌產(chǎn)物等無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)，通過(guò)體外翻譯來(lái)合成?；蛘?，還可以進(jìn)一步使用含有RNA聚合酶的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，以編碼鈣調(diào)蛋白及其部分肽的DNA為模板進(jìn)行合成。無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄/)翻譯系統(tǒng)可以使用市售商品，還可以按照其本身已知的方法來(lái)制備，具體來(lái)說(shuō)，大腸桿菌提取液可以按照I^ratt J.M.等著，“Transcription and TranIation", Hames B. D.和 Higgins S.J.編著，IRL Press, Oxford 179-209 (1984)記載的方法制備。作為市售的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，來(lái)自大腸桿菌的可以舉出E. coli S30提取系統(tǒng)(extract system) (Promega 制造)或 RTS 500 快速翻譯系統(tǒng)(Rapid Tranlation System) (Roche 制造)等； 來(lái)自兔網(wǎng)織紅細(xì)胞的可以舉出兔網(wǎng)織細(xì)胞溶胞產(chǎn)物系統(tǒng)(Rabbit Reticulocyte Lysate Ssystem) (Promega制造)等；而來(lái)自小麥胚芽的可以舉出PR0TEI0S ΤΜ(Τ0Υ0Β0制造) 等。其中，優(yōu)選使用小麥胚芽溶胞產(chǎn)物。作為小麥胚芽溶胞產(chǎn)物的制作方法，例如可以采用 Johnston F. B.等著，Nature，179，160-161 (1957)或Erickson A. H.等著，Meth. Enzymol.， 96,38-50(1996)等記載的方法。作為用于蛋白質(zhì)合成的系統(tǒng)或裝置，可以舉出間歇法(如上述的ft~att，J. Μ.等著(1984))、或者將氨基酸、能量源等連續(xù)地供給反應(yīng)系統(tǒng)的連續(xù)式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng) (Spirin A. S.等著，Science，242，1162-1164 (1988))、透析法(木川等著，第 21 屆日本分子生物學(xué)會(huì)，WID6)、或重層法(PR0TEI0S TM小麥培養(yǎng)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成核心試劑盒使用說(shuō)明書(shū)Τ0Υ0Β0制造)等。另外，還可以使用如下方法等根據(jù)需要向合成反應(yīng)系統(tǒng)供給模板 RNA、氨基酸、能量源等，根據(jù)需要排出合成產(chǎn)物或分解產(chǎn)物(日本特開(kāi)2000-333673)。針對(duì)本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體(以下也稱為“本發(fā)明的抗體”)只要是可以識(shí)別本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體即可，可以是多克隆抗體、單克隆抗體的任意一種?？贵w的同型沒(méi)有特別限定，優(yōu)選IgG、IgM或IgA，特別優(yōu)選IgG。本發(fā)明的抗體只要至少具有用于特異性識(shí)別目標(biāo)抗原并結(jié)合的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 即可，沒(méi)有特別限定；除完全抗體分子之外，例如可以是用？油1油，1(油，)2等片段、8沖1 scFv-Fc、微抗體(minibody)、雙特異抗體(diabody)等基因工程制作的共軛分子或它們的用聚乙二醇(PEG)等具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用的分子等改良了的衍生物等。本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)或其部分肽(以下在抗體的說(shuō)明中將它們簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)的抗體可以按照其本身公知的抗體或抗血清的制造方法制造。以下對(duì)本發(fā)明的抗體的免疫原制備法、以及所述抗體的制造方法進(jìn)行說(shuō)明。(1)抗原的制備為了制備本發(fā)明的抗體而使用的抗原可以使用上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽、 或具有1種或2種或更多種的與其相同的抗原決定基的(合成)肽等的任意一種(以下將它們簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的抗原”)。
如上所述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽例如可以利用如下方法制造(a)使用公知的方法或基于該方法的方法，從人、猴、大鼠、小鼠、雞等溫血?jiǎng)游锏慕M織或細(xì)胞中制備； (b)按照使用肽合成器等的公知的肽合成方法進(jìn)行化學(xué)合成；(c)對(duì)含有編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)；或者(d)以編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽的核酸為模板，使用無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)進(jìn)行生化合成。(a)在由溫血?jiǎng)游锏慕M織或細(xì)胞制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)的情況下，可以在將所述組織或細(xì)胞勻漿后，直接使用粗組分(例如膜組分、可溶性組分)作為抗原?；蛘哂盟?、表面活性劑或醇等進(jìn)行提取，將鹽析、透析、凝膠過(guò)濾、反相色譜、離子交換層析、親和層析等層析法組合來(lái)對(duì)所得的提取液進(jìn)行純化分離。可以將所得的本發(fā)明的蛋白質(zhì)直接用作免疫原， 也可以通過(guò)使用肽酶等的有限酶解來(lái)制備部分肽，并將其作為免疫原。(b)在化學(xué)制備本發(fā)明的抗原的情況下，所述合成肽例如可以使用采用上述(a) 的方法，使用利用天然材料純化了的、與本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有相同結(jié)構(gòu)的合成肽，具體來(lái)說(shuō)，可以使用的肽等是含有1種或2種或更多種與所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中含有3個(gè)以上、優(yōu)選6個(gè)以上的氨基酸的任意位置的氨基酸序列為相同的氨基酸序列的肽。(c)在使用含有DNA的轉(zhuǎn)化體制造本發(fā)明的抗原的情況下，所述DNA可以按照公知的克隆方法(例如分子克隆第2版(Molecular Cloning 2nd ed.) (J. Sambrook等著，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)中記載的方法等)制作。作為所述克隆方法，可以舉出以下的方法(1)使用根據(jù)編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因序列而設(shè)計(jì)的DNA探針，利用雜交法， 從cDNA文庫(kù)中分離編碼所述抗原的DNA;或者(2)使用根據(jù)編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因序列而設(shè)計(jì)的DNA引物，以cDNA為模板，利用PCR法制備編碼所述抗原的DNA，將所述DNA插入到與宿主適合的表達(dá)載體中等?？梢岳盟霰磉_(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，將所得的轉(zhuǎn)化體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，據(jù)此來(lái)獲得期望的抗原。(d)在利用無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)的情況下，可以舉出以下方法等以插入了編碼按照與上述(c)同樣的方法制備的抗原的DNA的表達(dá)載體為模板(例如為所述DNA在 T7、SP6啟動(dòng)子等控制下的表達(dá)載體等)，使用含有與所述啟動(dòng)子適合的RNA聚合酶和底物(NTP)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液來(lái)合成mRNA，然后以所述mRNA為模板，使用公知的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng) (例如大腸桿菌、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、小麥胚芽等的提取液)進(jìn)行翻譯反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)鹽濃度等，使轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和翻譯反應(yīng)在同一反應(yīng)液中一并進(jìn)行。作為免疫原，可以使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)的完全分子或具有其部分氨基酸序列的肽。作為部分氨基酸序列，例如可以舉出含有3個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列，優(yōu)選含有4個(gè)或更多個(gè)、更優(yōu)選5個(gè)或更多個(gè)、最優(yōu)選6個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列?；蛘撸鳛樗霭被嵝蛄?，例如可以舉出含有20個(gè)或更少個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列，優(yōu)選含有18個(gè)或更少個(gè)、更優(yōu)選15個(gè)或更少個(gè)、最優(yōu)選12個(gè)或更少個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列。這些氨基酸殘基的一部分(例如1個(gè) 數(shù)個(gè))可以被可取代的基團(tuán)(例如Cys殘基、羥基等)取代。作為免疫原使用的肽具有含1個(gè) 數(shù)個(gè)上述部分氨基酸序列的氨基酸序列。或者，可以將表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的溫血?jiǎng)游锛?xì)胞本身直接作為本發(fā)明的抗原使用。作為溫血?jiǎng)游锛?xì)胞，可以使用上述(a)項(xiàng)所述的天然細(xì)胞、或由上述(c)項(xiàng)所述的方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞等。作為轉(zhuǎn)化中使用的宿主，只要是從人、猴、大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、雞等采集的細(xì)胞即可，可以是任何細(xì)胞,優(yōu)選使用 HEK293、C0S7、CHO-KU NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、 SP2/0、P3U1、B16或P388等。表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的天然溫血?jiǎng)游锛?xì)胞或轉(zhuǎn)化的溫血?jiǎng)游锛?xì)胞可以以懸浮于在組織培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基(例如RPMI1640)或緩沖液(例如Hanks緩沖鹽類溶液，HBSS)的狀態(tài)下注射到免疫動(dòng)物中。免疫方法只要是可以促進(jìn)抗體生成的方法即可，可以是任何方法，優(yōu)選使用靜脈內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、肌肉注射或皮下注射等。本發(fā)明的抗原只要具有免疫原性即可，可以將不溶物質(zhì)直接免疫，但在使用分子內(nèi)只具有1個(gè) 數(shù)個(gè)抗原決定基的低分子量(例如分子量約為3，000或更低)的抗原(即本發(fā)明的蛋白質(zhì)的部分肽)的情況下，這些抗原通常是免疫原性低的半抗原分子，因此可以以與適當(dāng)?shù)膿?dān)體(carrier)結(jié)合或吸附的復(fù)合物的形式進(jìn)行免疫。作為擔(dān)體，可以使用天然或合成的高分子。天然高分子例如可使用牛、兔、人等哺乳動(dòng)物的血清白蛋白、或例如牛、兔等哺乳動(dòng)物的甲狀腺球蛋白、例如雞的卵清白蛋白、例如牛、兔、人、綿羊等哺乳動(dòng)物的血紅球蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)等。作為合成高分子，例如可以舉出聚氨基酸類、聚苯乙烯類、聚丙烯酸類、聚乙烯基類、聚丙烯類等的聚合物或共聚物等各種膠乳等。所述擔(dān)體與半抗原的混合比例只要是可以高效率地生產(chǎn)與擔(dān)體結(jié)合或吸附的抗原所對(duì)應(yīng)的抗體即可，可以將任何抗原或擔(dān)體以任何比例結(jié)合或吸附，可以使用在通常制造半抗原的抗體時(shí)常用的上述天然或合成高分子擔(dān)體，使其按照重量比為相對(duì)于半抗原 0.1-100的比例結(jié)合或吸附。另外，半抗原與載體的偶聯(lián)可以使用各種縮合劑。例如可以根據(jù)情況使用將酪氨酸、組胺酸、色氨酸交聯(lián)的雙重氮化聯(lián)苯胺等的重氮化合物；將氨基之間交聯(lián)的戊二醛等二醛化合物；甲苯-2，4-二異氰酸酯等二異氰酸酯化合物；將硫醇基之間交聯(lián)的N，N’ -鄰苯二馬來(lái)酰亞胺等二馬來(lái)酰亞胺化合物；將氨基與硫醇基交聯(lián)的馬來(lái)酰亞胺活性酯化合物； 將氨基與羧基交聯(lián)的碳二酰亞胺化合物等。另外，在將氨基之間進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，通過(guò)使具有二硫吡啶基的活性酯試劑(例如3-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺基(SPDP)等)與一個(gè)氨基反應(yīng)后進(jìn)行還原，由此導(dǎo)入硫醇基，然后通過(guò)馬來(lái)酰亞胺活性酯試劑將馬來(lái)酰亞胺基導(dǎo)入另一個(gè)氨基，可以使兩者都發(fā)生反應(yīng)。(2)單克隆抗體的制備(a)單克隆抗體生成細(xì)胞的制備關(guān)于本發(fā)明的抗原，可以將其本身單獨(dú)或者與載體、稀釋劑一起，通過(guò)腹腔注入、 靜脈注入、皮下注射、皮內(nèi)注射等的給予方法給予到溫血?jiǎng)游锏哪軌蛏煽贵w的部位。在給予時(shí)，為了提高抗體生成能力，可以給予完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。給予通常是每 1 6周進(jìn)行1次，共進(jìn)行2 10次左右。作為所使用的溫血?jiǎng)游?，例如可以舉出猴、兔、 狗、豚鼠、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、綿羊、山羊、驢、以及雞。為了避免抗Ig抗體生成的問(wèn)題，優(yōu)選使用與給予對(duì)象相同的哺乳動(dòng)物，不過(guò)，在單克隆抗體制備中通常優(yōu)選使用小鼠和大鼠。由于對(duì)人的人工免疫致敏存在倫理上的困難，因此在本發(fā)明的抗體以人作為給予對(duì)象的情況下，優(yōu)選(i)對(duì)按照后述方法制備的人抗體生成動(dòng)物(例如小鼠)進(jìn)行免疫來(lái)獲得人抗體；( )按照后述方法制作嵌合抗體、人源化抗體或完全人抗體；或者(iii)將體外免疫法和利用病毒的細(xì)胞無(wú)限增殖化、人-人(或小鼠)雜交瘤制作技術(shù)、噬菌體展示法等組合來(lái)獲得人抗體。另外，體外免疫法由于具有在通常的免疫中能夠獲得抗體生成得到抑制的抗原的抗體的可能性，或可以以ng-μ g級(jí)的抗原量獲得抗體、且免疫在幾天內(nèi)即可結(jié)束等，因此作為獲得不穩(wěn)定且難以大量制作的抗原的抗體的方法，在制備來(lái)自非人動(dòng)物的抗體時(shí)優(yōu)選使用。作為在體外免疫法中使用的動(dòng)物細(xì)胞，可以舉出從人和上述溫血?jiǎng)游?優(yōu)選小鼠、大鼠)的末梢血、脾臟、淋巴結(jié)等中分離的淋巴細(xì)胞，優(yōu)選B淋巴細(xì)胞等。例如，在小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞的情況下，可以從4 12周齡左右的動(dòng)物中摘除脾臟、分離脾細(xì)胞，并用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(例如Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640培養(yǎng)基、Ham F12培養(yǎng)基等)洗滌，然后在添加了含有抗原的胎牛血清(FCS，5-20%左右)的培養(yǎng)基中懸浮，采用 4 10天左右的CO2孵育等進(jìn)行培養(yǎng)。作為抗原濃度，例如可以舉出0.05 5yg，但并不限于此。優(yōu)選按照常規(guī)方法制備同一系統(tǒng)的動(dòng)物(優(yōu)選1 2周齡左右)的胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清并添加到培養(yǎng)基中。在人細(xì)胞的體外免疫中，難以獲得胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清，因此優(yōu)選將IL-2、IL-4、 IL-5、IL-6等幾種細(xì)胞因子和根據(jù)需要使用的佐劑物質(zhì)(例如胞壁酰二肽等)與抗原一起添加到培養(yǎng)基中進(jìn)行免疫致敏。在制備單克隆抗體時(shí)，從免疫了抗原的溫血?jiǎng)游?例如小鼠、大鼠)或動(dòng)物細(xì)胞 (例如人、小鼠、大鼠)中選擇確認(rèn)了抗體滴度升高的個(gè)體或細(xì)胞集團(tuán)，在最終免疫的2 5天后采集脾臟或淋巴結(jié)、或者在體外免疫后培養(yǎng)4 10天，然后回收細(xì)胞并分離抗體生成細(xì)胞，并將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而可以制備生產(chǎn)抗體的雜交瘤。血清中的抗體滴度的測(cè)定例如可以在標(biāo)記化抗原與抗血清反應(yīng)后，通過(guò)測(cè)定與抗體結(jié)合的標(biāo)記試劑的活性來(lái)進(jìn)行。骨髓瘤細(xì)胞只要是能夠生產(chǎn)可分泌大量抗體的雜交瘤的細(xì)胞即可，沒(méi)有特別限定，優(yōu)選自身不生產(chǎn)或分泌抗體的，更優(yōu)選細(xì)胞融合效率高的骨髓瘤細(xì)胞。為了容易地進(jìn)行雜交瘤選擇，優(yōu)選使用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)敏感性細(xì)胞株。例如，作為小鼠骨髓瘤細(xì)胞可以舉出NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等，作為大鼠骨髓瘤細(xì)胞可以舉出R210. RCY3、 Y3-Agl. 2. 3 等，作為人骨髓瘤細(xì)胞可以舉出 SK0-007、GM1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、 UC729-6 等。融合操作可以按照已知的方法、例如K6hler和Milstein的方法(Nature，256， 495(1975))實(shí)施。作為融合促進(jìn)劑，可以舉出聚乙二醇(PEG)或仙臺(tái)病毒等，優(yōu)選使用PEG 等。對(duì)PEG的分子量沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為低毒性且粘性比較低的PEG1000 PEG6000。作為PEG濃度，例如可以舉出10 80%左右，優(yōu)選30 50%左右。作為PEG的稀釋用溶液， 可以使用無(wú)血清培養(yǎng)基(例如RPMI1640)、含5 20%左右的血清的完全培養(yǎng)基、磷酸緩沖生理鹽水(PBS)、三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液)等各種緩沖液。還可以根據(jù)需要添加DMSO(例如10 20%左右)。融合液的pH例如可以舉出4 10左右，優(yōu)選6 8左右ο抗體生成細(xì)胞(脾細(xì)胞)數(shù)目與骨髓細(xì)胞數(shù)目的優(yōu)選比例通常為1 1 20 1 左右，通過(guò)通常在20 40°C、優(yōu)選30 37°C下、通常進(jìn)行1 10分鐘的孵育(例如(X)2孵育)，可以實(shí)施高效率的細(xì)胞融合。抗體生成細(xì)胞株還可以通過(guò)使抗體生成細(xì)胞感染可轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的病毒而使所述細(xì)胞無(wú)限增殖化來(lái)獲得。上述病毒例如可以舉出Epstein-Barr(EB)病毒等。作為傳染性單核細(xì)胞增多癥的無(wú)癥狀感染，大多數(shù)的人都有感染過(guò)這種病毒的經(jīng)驗(yàn)，因此已具有免疫力，但在使用通常的EB病毒的情況下也會(huì)生成病毒顆粒，因此應(yīng)當(dāng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)募兓?。作為沒(méi)有病毒混入可能性的EB系統(tǒng)，還優(yōu)選使用保持有使B淋巴細(xì)胞無(wú)限增殖化的能力、但病毒顆粒復(fù)制能力缺損的重組EB病毒(例如由潛伏感染狀態(tài)向溶解感染狀態(tài)轉(zhuǎn)移的開(kāi)關(guān)基因的缺損等)。來(lái)自絨猴的B95-8細(xì)胞分泌EB病毒，因此，如果使用它的培養(yǎng)上清，可以容易地轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞。將所述細(xì)胞在例如添加了血清和青霉素/鏈霉素(P/S)的培養(yǎng)基(例如 RPMI1640)或添加了細(xì)胞生長(zhǎng)因子的血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后通過(guò)過(guò)濾或離心等將培養(yǎng)上清分離，使生成抗體的B淋巴細(xì)胞以適當(dāng)?shù)臐舛?例如約IO7細(xì)胞/mL)懸浮于其中，在通常20 40°C、優(yōu)選30 37°C下進(jìn)行通常0. 5 2小時(shí)左右的孵育，由此可以獲得抗體生成B細(xì)胞株。在人的抗體生成細(xì)胞是以混合淋巴細(xì)胞的形式提供的情況下，大部分的人具有對(duì)EB病毒感染細(xì)胞顯示傷害性的T淋巴細(xì)胞，因此為了提高轉(zhuǎn)化頻率，優(yōu)選利用綿羊紅細(xì)胞等和形成E玫瑰花結(jié)來(lái)預(yù)先除去T淋巴細(xì)胞。另外，還可以將結(jié)合了可溶性抗原的綿羊紅細(xì)胞與抗體生成B淋巴細(xì)胞混合，使用Percoll等的密度梯度來(lái)分離玫瑰花結(jié)，由此可以選別對(duì)目標(biāo)抗原具有特異性的淋巴細(xì)胞。另外，添加極過(guò)量的抗原則抗原特異性的B淋巴細(xì)胞被覆蓋，在表面無(wú)法呈遞IgG，因此，如果與結(jié)合了抗IgG抗體的綿羊紅細(xì)胞混合，則只有抗原非特異性的B淋巴細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)。因此，通過(guò)使用Percoll等的密度梯度來(lái)收集玫瑰花結(jié)非形成層，可以選別抗原特異性的B淋巴細(xì)胞。在通過(guò)轉(zhuǎn)化獲得了無(wú)限增殖能力的人抗體分泌細(xì)胞中，為了使抗體分泌能力穩(wěn)定持續(xù)，可以反復(fù)與小鼠或人的骨髓瘤細(xì)胞融合。骨髓瘤細(xì)胞可以使用與上述同樣的骨髓瘤細(xì)胞。雜交瘤的篩選、育種通常是添加HAT((次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)，在含有5 20% FCS的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基(例如RPMI1640)或添加了生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。次黃嘌呤、氨基蝶呤、以及胸苷的濃度例如可以分別舉出約0. ImM、約0.4μΜ和約 0.016mM等。人-小鼠雜交瘤的選擇可以采用烏本苷抗性。人細(xì)胞株與小鼠細(xì)胞株相比，對(duì)烏本苷的敏感性高，因此通過(guò)以10_7 IO3M左右添加到培養(yǎng)基中，可以排除未融合的人細(xì)胞。在雜交瘤的選擇中，優(yōu)選使用飼養(yǎng)細(xì)胞或某種細(xì)胞培養(yǎng)上清。作為飼養(yǎng)細(xì)胞，可以使用幫助雜交瘤的出現(xiàn)但其自身死亡的存活期間有限的不同系統(tǒng)的細(xì)胞種類、以及對(duì)可以大量產(chǎn)生對(duì)雜交瘤的出現(xiàn)有用的生長(zhǎng)因子的細(xì)胞照射放射線等來(lái)使其增殖能力降低的細(xì)胞等。例如，作為小鼠的飼養(yǎng)細(xì)胞，可以舉出脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血液、胸腺細(xì)胞等，作為人的飼養(yǎng)細(xì)胞可以舉出末梢血單核細(xì)胞等。作為細(xì)胞培養(yǎng)上清例如可以舉出上述各種細(xì)胞的初代培養(yǎng)上清或各種株化細(xì)胞的培養(yǎng)上清。雜交瘤可以通過(guò)將抗原進(jìn)行熒光標(biāo)記并與融合細(xì)胞反應(yīng)、然后使用熒光激活性細(xì)胞分離器(FACS)將與抗原結(jié)合的細(xì)胞分離來(lái)選擇。在這種情況下，可以直接選擇生成目標(biāo)抗原的抗體的雜交瘤，因此可以大大降低克隆的勞動(dòng)強(qiáng)度。生成目標(biāo)抗原的單克隆抗體的雜交瘤克隆可以采用各種方法。氨基蝶呤由于會(huì)抑制很多細(xì)胞功能，因此優(yōu)選盡早從培養(yǎng)基中去除。在采用小鼠或大鼠的情況下，幾乎所有的骨髓瘤細(xì)胞都會(huì)在10 14天以內(nèi)死亡，因此可以在融合2周后除去氨基蝶呤。然而，對(duì)于人雜交瘤，通常在融合后可以在添加了氨基蝶呤的培養(yǎng)基中維持4 6周左右。次黃嘌呤、胸苷優(yōu)選在去除氨基蝶呤后1周或更長(zhǎng)時(shí)間以后除去。即，在采用小鼠細(xì)胞的情況下，例如在融合7 10天后進(jìn)行添加了次黃嘌呤和胸苷(HT)的完全培養(yǎng)基(例如添加10% FCS的RPMI1640)的添加或更換。在融合后8 14天左右，出現(xiàn)可以目視觀察到的克隆。如果克隆的直徑達(dá)到Imm左右，則可以測(cè)定培養(yǎng)上清中的抗體量。抗體量的測(cè)定例如可以按照以下的方法等進(jìn)行向直接或與擔(dān)體一起吸附有目標(biāo)抗原或其衍生物或其部分肽(包含作為抗原決定基使用的部分氨基酸序列)的固相(例如微量滴定板)中添加雜交瘤培養(yǎng)上清，接著，加入用放射性物質(zhì)(例如125I、131I、3H、14C)、酶 (例如β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、蘋(píng)果酸脫氫酶)、熒光物質(zhì) (例如熒光胺、熒光素異硫氰酸酯)、發(fā)光物質(zhì)(例如發(fā)光氨、發(fā)光氨衍生物、熒光素、光澤精 (Lucigenin))等標(biāo)記的抗免疫球蛋白(IgG)抗體(使用與原有抗體生成細(xì)胞的來(lái)源動(dòng)物為同一種動(dòng)物來(lái)源的IgG的抗體)或蛋白酶Α，檢測(cè)與固相結(jié)合的目標(biāo)抗原(抗原決定基) 的抗體的方法；或在吸附有抗IgG抗體或蛋白酶A的固相中添加雜交瘤培養(yǎng)上清，加入用與上述同樣的標(biāo)記試劑標(biāo)記的目標(biāo)抗原或其衍生物或其部分肽，檢測(cè)與固相結(jié)合的目標(biāo)抗原 (抗原決定基)的抗體的方法。作為克隆方法，通常采用極限稀釋法，也可以采取使用軟瓊脂的克隆或使用FACS 的克隆(如上所述)。極限稀釋法克隆例如可以按以下步驟進(jìn)行，但并不限于此。如上所述那樣測(cè)定抗體量并選擇陽(yáng)性滴定孔。選擇適當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)細(xì)胞并添加到 96孔板上。由抗體陽(yáng)性孔中吸取細(xì)胞，在完全培養(yǎng)基(例如添加了
RMPI1640)中懸浮，使細(xì)胞密度為30個(gè)細(xì)胞/mL，在添加了飼養(yǎng)細(xì)胞的孔板中加入0. ImL (3 個(gè)細(xì)胞/孔)，將殘余的細(xì)胞懸浮液稀釋為10個(gè)細(xì)胞/mL，同樣地接種于其它的孔中(1個(gè)細(xì)胞/孔)，進(jìn)一步將殘余細(xì)胞懸浮液稀釋為3個(gè)細(xì)胞/mL并接種于其它的孔中(0. 3個(gè)細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)2 3周左右，直至目視可見(jiàn)的克隆出現(xiàn)為止，測(cè)定抗體量/選擇陽(yáng)性孔， 再次克隆。在人細(xì)胞的情況下，克隆比較困難，因此可以制作10個(gè)細(xì)胞/孔的板，通常通過(guò) 2次亞克隆就可以獲得單克隆抗體生成雜交瘤，為了確認(rèn)其穩(wěn)定性，優(yōu)選進(jìn)一步在幾個(gè)月內(nèi)定期地進(jìn)行再克隆。雜交瘤可在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。體外的培養(yǎng)法是將上述得到的單克隆抗體生成雜交瘤保持細(xì)胞密度為例如IO5 IO6個(gè)細(xì)胞/mL左右，同時(shí)緩慢降低FCS濃度，并從孔板慢慢進(jìn)行等比例放大的方法。作為體內(nèi)的培養(yǎng)方法，例如可以舉出對(duì)于腹腔內(nèi)注射了礦物油而誘導(dǎo)了漿細(xì)胞瘤(MOPC)的小鼠(與雜交瘤的母株具有組織適應(yīng)性的小鼠)，在5-10天后，向腹腔內(nèi)注射 IO6 IO7個(gè)細(xì)胞左右的雜交瘤，在2 5周后在麻醉下采集腹水。(b)單克隆抗體的純化單克隆抗體的分離純化可按照其本身公知的方法、例如免疫球蛋白的分離純化法 (例如鹽析法、醇沉淀法、等電位點(diǎn)沉淀法、電泳法、利用離子交換體(例如DEAE、QEAE)的脫吸附法、超離心法、凝膠過(guò)濾法、利用抗原結(jié)合固相或A蛋白或G蛋白等活性吸附劑只采集抗體將結(jié)合解離來(lái)獲得抗體的特異性純化法等)進(jìn)行。如此，將雜交瘤在溫血?jiǎng)游锏纳矬w內(nèi)或生物體外培養(yǎng)，從其體液或培養(yǎng)物中采集抗體，由此可以制造單克隆抗體。在將本發(fā)明的抗體用于癌癥的預(yù)防/治療的情況下，所述抗體必須具有抗腫瘤活性，因此必須對(duì)所得的單克隆抗體的抗腫瘤活性的程度進(jìn)行調(diào)查?？鼓[瘤活性可以通過(guò)在抗體的存在下和非存在下對(duì)癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞粘附、誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡等進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體用作以人為給予對(duì)象的藥物。因此，本發(fā)明的抗體(優(yōu)選為單克隆抗體)為降低了在給予人的情況下顯示抗原性的危險(xiǎn)性的抗體(具體來(lái)說(shuō)，是完全人抗體、人源化抗體、小鼠-人嵌合抗體等)，特別優(yōu)選完全人抗體。人源化抗體和嵌合抗體可以按照后述的方法，通過(guò)基因工程制備。另外，完全人抗體也可以通過(guò)上述人-人(或小鼠)雜交瘤來(lái)制備；為了穩(wěn)定且低成本地提供大量抗體，優(yōu)選使用后述的生成人抗體的動(dòng)物(例如小鼠)或噬菌體展示法來(lái)制備。(i)嵌合抗體的制備在本說(shuō)明書(shū)中，“嵌合抗體”是指H鏈和L鏈的可變區(qū)域(Vh和的序列來(lái)自某種哺乳動(dòng)物種類，而恒定區(qū)域(C1^nq)的序列來(lái)自其它哺乳動(dòng)物種類的抗體?？勺儏^(qū)域的序列例如優(yōu)選來(lái)自小鼠等可容易地制作雜交瘤的動(dòng)物種類，恒定區(qū)域的序列優(yōu)選來(lái)自作為給予對(duì)象的哺乳動(dòng)物種類。作為嵌合抗體的制作方法，例如可以舉出美國(guó)專利第6，331，415號(hào)說(shuō)明書(shū)中記載的方法或?qū)⑵湟徊糠诌M(jìn)行變化得到的方法等。具體來(lái)說(shuō)，首先，按照常規(guī)方法，從上述得到的單克隆抗體生成雜交瘤(例如小鼠-小鼠雜交瘤)中制備mRNA或總RNA，并合成cDNA。 接著，以所述cDNA為模板，使用適當(dāng)?shù)囊?例如有義引物采用含有編碼Vh和\的各N末端序列的堿基序列的寡DNA，反義引物采用含有與編碼Ch和Q的N末端序列的堿基序列雜交的寡DNA (例如參照Bio/Technology, 9 :88-89,1991))，并按照常規(guī)方法，利用PCR將編碼Vh和&的DNA擴(kuò)增/純化。利用同樣的方法，通過(guò)RT-PCR法從由其它哺乳動(dòng)物(例如人)的淋巴細(xì)胞等制備的RNA中將編碼Ch和Q的DNA擴(kuò)增/純化。使用常規(guī)方法分別將 Vh與CH、Vl與Q連接，將所得的嵌合H鏈DNA和嵌合L鏈DNA分別插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體 (例如含有在CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞等中具有轉(zhuǎn)化活性的啟動(dòng)子(例如CMV 啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子等)的載體等)中。編碼雙鏈的DNA可以插入到不同載體中，也可以串聯(lián)地插入到同一載體中。用所得的嵌合H鏈和嵌合L鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。作為宿主細(xì)胞，除動(dòng)物細(xì)胞、例如上述小鼠骨髓瘤細(xì)胞之外，還可以舉出中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、 來(lái)自猴的C0S-7細(xì)胞、Vero細(xì)胞、來(lái)自大鼠的GHS細(xì)胞等。在轉(zhuǎn)化中，可以采用可適合動(dòng)物細(xì)胞的任何方法，優(yōu)選地可以舉出電穿孔法等。在適合宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定期間后回收上清，按照與上述同樣的方法純化，由此可以分離嵌合單克隆抗體。或者，使用牛、山羊、雞等確立了轉(zhuǎn)基因技術(shù)、且使用作為家畜(家禽)已經(jīng)積累了大量繁殖技術(shù)的動(dòng)物的生殖系列細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，按照常規(guī)方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，據(jù)此可以容易且大量地從所得動(dòng)物的乳汁或卵中獲得嵌合單克隆抗體。另外，也可以使用玉米、水稻、小麥、大豆、煙草等確立了轉(zhuǎn)基因技術(shù)、且作為主要作物而大量栽培的植物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，采用對(duì)原生質(zhì)體的微注射或電穿孔、對(duì)完整細(xì)胞的基因槍法或Ti載體法等來(lái)制備轉(zhuǎn)基因植物，并從所得的種子或葉等中大量地獲得嵌合單克隆抗體。如果將所得的嵌合單克隆抗體用木瓜蛋白酶分解，則可以得到Fab，而如果用胃蛋白酶分解，則可以得到F(ab，)2。將編碼小鼠V1^Pt的DNA經(jīng)由適當(dāng)?shù)慕宇^、例如編碼含有1 40個(gè)氨基酸、優(yōu)選3 30個(gè)氨基酸、更優(yōu)選5 20個(gè)氨基酸的肽(例Ber-(Gly)1Jn或[(Gly)m-Ser]n(m ^ 0 10的整數(shù)，η為1 5的整數(shù))等)的DNA連接，可以制成scFv ；進(jìn)一步地，也可以將編碼C03的DNA經(jīng)由適當(dāng)?shù)慕宇^連接來(lái)制成微抗體(minibody)，或?qū)⒕幋aCh全長(zhǎng)的DNA經(jīng)由適當(dāng)?shù)慕宇^連接來(lái)制成scFv-Fc。編碼上述在基因工程學(xué)上改良(共軛)了的抗體分子的 DNA通過(guò)在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的控制下，可以在大腸桿菌或酵母等微生物中表達(dá)，從而可以大量生產(chǎn)抗體分子。如果將編碼小鼠V1^P \的DNA串聯(lián)插入1個(gè)啟動(dòng)子的下游并導(dǎo)入大腸桿菌，則由于單順?lè)醋拥幕虮磉_(dá)而形成被稱為Fv的二聚體。另外，如果使用分子建模，將Vh和八的FR中的適當(dāng)?shù)陌被嶂脫Q為Cys，則通過(guò)兩鏈的分子間二硫鍵而形成被稱為dsFv的二聚體。(ii)人源化抗體在本說(shuō)明書(shū)中，“人源化抗體”是指存在于可變區(qū)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以外的所有區(qū)域(即，恒定區(qū)域和可變區(qū)域中的支架區(qū)(FR))的序列來(lái)自人，而只有CDR的序列來(lái)自其它哺乳動(dòng)物種類的抗體。作為其它哺乳動(dòng)物種類，例如優(yōu)選小鼠等可以容易地制作雜交瘤的動(dòng)物種類。作為人源化抗體的制備方法，例如可舉出美國(guó)專利第5，225，539號(hào)、第5，585，089 號(hào)、第5，693，761號(hào)和第5，693，762號(hào)的方法或?qū)⑺鼈儾糠指淖兒蟮玫降姆椒ǖ?。具體來(lái)說(shuō)，與上述嵌合抗體的情形同樣地，將編碼來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物種類(例如小鼠)的 Vh和Vl的DNA分離后，按照常規(guī)方法，使用自動(dòng)DNA測(cè)序儀(例如Applied Biosystems 制造等)進(jìn)行測(cè)序，使用公知的抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)(例如參照Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(Kabat等著， "Sequences of Proteins of Immunological Interest，，，US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH 編，第 5 版，1991)等)對(duì)得到的堿基序列或由其推定的氨基酸序列進(jìn)行分析，確定兩鏈的CDR和FR。設(shè)計(jì)將編碼具有與所確定的FR 序列類似的FR序列的人抗體的L鏈和H鏈的堿基序列(例人κ型L鏈亞群I和人H鏈亞群II或III (參照Kabat等著，1991 (如上所述)))的CDR編碼區(qū)用編碼所確定的不同種類CDR的堿基序列置換而得到的堿基序列，將所述堿基序列分成20 40個(gè)堿基左右的片段，進(jìn)一步將與所述堿基序列互補(bǔ)的序列以與上述片段相互重疊的方式分成20 40個(gè)堿基左右的片段。使用DNA合成儀合成各個(gè)片段，按照常規(guī)方法將它們雜交、連接，由此可以構(gòu)建編碼具有來(lái)自人的FR和來(lái)自其它哺乳動(dòng)物種類的CDR的Vh和\的DNA。為了更迅速且高效率地將來(lái)自其它哺乳動(dòng)物種類CDR移植到來(lái)自人的Vh和\上，優(yōu)選采用利用PCR法誘發(fā)位點(diǎn)專一性突變。上述方法例如可以舉出日本特開(kāi)平5-227970號(hào)公報(bào)中記載的逐次 CDR移植法等。按照與上述嵌合抗體同樣的方法，將如此得到的編碼Vh和\的DNA分別與編碼來(lái)自人的C0和Q的DNA連接并導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，由此可以得到生產(chǎn)人源化抗體的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物。人源化抗體也與嵌合抗體同樣，可以采用基因工程的方法，改變?yōu)镾CFV、SCFV-FC、 微抗體、dSFv、Fv等，而通過(guò)使用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，也可以在大腸桿菌或酵母等微生物中生產(chǎn)。人源化抗體制作技術(shù)例如也可應(yīng)用于制備優(yōu)選地可以給予尚未確立雜交瘤制備技術(shù)的其它的動(dòng)物種類的單克隆抗體。例如可以舉出牛、豬、綿羊、山羊、雞等作為家畜(家禽)廣泛繁殖的動(dòng)物、或者狗或貓等寵物動(dòng)物等作為對(duì)象。
(iii)使用生成人抗體的動(dòng)物制備完全人抗體向敲除(KO) 了內(nèi)源性免疫球蛋白(Ig)基因的非人溫血?jiǎng)游镏袑?dǎo)入功能性的人Ig 基因，并利用抗原對(duì)其免疫，則可以代替所述來(lái)自動(dòng)物的抗體而生成人抗體。因此，如果像小鼠等那樣確立了雜交瘤制作技術(shù)的動(dòng)物，則可以按照與以往的小鼠單克隆抗體制備相同的方法獲得完全人單克隆抗體。首先，已經(jīng)有若干種使用采用通常的轉(zhuǎn)基因(Tg)技術(shù)導(dǎo)入了人Ig的H鏈和L鏈的小基因的小鼠與使用通常的KO技術(shù)使內(nèi)源性小鼠Ig基因失活了的小鼠進(jìn)行交配而得到的生成人抗體的小鼠(參照Immunol. Today, 17,391-397(1996))而制備的人單克隆抗體已經(jīng)處于臨床階段，但到目前為止尚未見(jiàn)到生產(chǎn)抗人Ig人抗體(HAHA) 的報(bào)道。后來(lái)，Abgenix公司(商品名XenoMouse (參照 Nat. Genet.，15，146-156(1997)； 美國(guó)專利第5，939，598號(hào)等))或Medarex公司(商品名Hu_Mab Mouse (參照Nat. Biotechnol.，14，845-851 (1996)；美國(guó)專利第5，545, 806號(hào)等))使用酵母人工染色體(YAC)載體制備了導(dǎo)入了更大的人Ig基因的Tg小鼠，得到了可以生成組成成分 (repertory)豐富的人抗體。但是，在人Ig基因中，例如在H鏈的情況下，是通過(guò)將約80 種V片段、約30種D片段和6種J片段進(jìn)行各種組合得到的VDZ外顯子來(lái)編碼抗原結(jié)合部位而實(shí)現(xiàn)其多樣性的，因此在其全長(zhǎng)方面，H鏈達(dá)到約1.5Mb (14號(hào)染色體)，κ L鏈達(dá)到約 2MM2號(hào)染色體)，入1^鏈達(dá)到約11&(22號(hào)染色體)。為了將與人的同樣多樣的抗體組成成分在其它動(dòng)物種類中再現(xiàn)，人們希望導(dǎo)入各個(gè)Ig基因的全長(zhǎng)，但可以插入到現(xiàn)有的基因?qū)胼d體(質(zhì)粒、粘粒、BAC、YAC等)中的DNA通常為數(shù)1Λ 數(shù)百1Λ，在現(xiàn)有的將克隆了的 DNA注入到受精卵中的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)中，難以導(dǎo)入全長(zhǎng)。Tomizuka 等人(Nat. Genet.，16，133-143 (1997))將擔(dān)載有 Ig 基因的人染色體的自然片段(hCF)導(dǎo)入小鼠(染色體導(dǎo)入(TC)小鼠)，制備了具有全長(zhǎng)的人Ig基因的小鼠。 即，首先，用紡錘絲形成抑制劑(例如秋水仙酰胺)，將含有用例如試劑抗性標(biāo)志等標(biāo)記了含有H鏈基因的14號(hào)染色體和含有κ L鏈基因的2號(hào)染色體的人染色體的人-小鼠雜交瘤細(xì)胞處理48小時(shí)左右，制備1條 多條染色體或其片段被核膜包覆的微細(xì)胞，利用微核融合法向小鼠ES細(xì)胞中導(dǎo)入染色體。使用含有試劑的培養(yǎng)基，選擇保持有人Ig基因的染色體或其片段的雜交瘤ES細(xì)胞，按照與通常制備KO小鼠時(shí)同樣的方法顯微注入到小鼠胚胎中。 以涂布顏色為指標(biāo)等，從所得的嵌合小鼠中選擇生殖系列嵌合物，建立傳遞人14號(hào)染色體片段的TC小鼠系統(tǒng)(TC(hCF14))和傳遞人2號(hào)染色體片段的TC小鼠系統(tǒng)(TC(hCF2))。按照常規(guī)方法制備敲除(KO) 了內(nèi)源性H鏈基因和KL鏈基因的小鼠(KO(IgH) ^P KO(IgK)), 將這4個(gè)系統(tǒng)的交配反復(fù)進(jìn)行，由此可以建立具有所有四種遺傳變異的小鼠系統(tǒng)(雙TC/ K0)。如果對(duì)上述制備的雙TC/K0小鼠采用與制備通常的小鼠單克隆抗體時(shí)同樣的方法，則可以制備生成抗原特異性的人單克隆抗體的雜交瘤。但是，含有KL鏈基因的hCF2 在小鼠細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，因此雜交瘤的取得效率比通常的小鼠的情形低。另一方面，上述的Hu-Mab小鼠含有κ L鏈基因的約50 %，但具有可變區(qū)域決定簇成倍增加的結(jié)構(gòu)，因此顯示與含有全長(zhǎng)時(shí)同等的κ鏈的多樣性(而H鏈基因只含有約 10%，因此H鏈的多樣性低，對(duì)抗原的響應(yīng)性不足)，且是利用YAC載體(IgK-YAC)插入到小鼠染色體中的，因此在小鼠細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地保持。禾U用這一優(yōu)點(diǎn)，使TC(hCF14)小鼠與Hu-Mab小鼠交配，制作可以穩(wěn)定地保持hCF14和Ig κ -YAC的小鼠(商品名=KM小鼠)，由此可以得到與通常的小鼠同等的雜交瘤取得效率和抗體與抗原的親和性。另外，為了更完全地再現(xiàn)人的多樣的抗體組成成分，可以制備進(jìn)一步導(dǎo)入了 XL 鏈基因的生成人抗體的動(dòng)物。所述動(dòng)物可以這樣獲得按照與上述同樣的方法制備導(dǎo)入了擔(dān)載有λ L鏈基因的人22號(hào)染色體或其片段的TC小鼠(TC(hCF22))，并使其與上述雙TC/ KO小鼠或KM小鼠交配；或者例如構(gòu)建含有H鏈基因座和λ L鏈基因座的人類人工染色體 (HAC)，并導(dǎo)入到小鼠細(xì)胞中(Nat. Biotechnol.，18，1086-1090 (2000))。在本發(fā)明的抗體用作藥物的情況下，優(yōu)選為單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。 在本發(fā)明的抗體為多克隆抗體的情況下，不需要利用雜交瘤，因此，可以使用雖然未建立雜交瘤制作技術(shù)但已建立轉(zhuǎn)基因技術(shù)的動(dòng)物種類、優(yōu)選牛等偶蹄動(dòng)物，并按照與上述同樣的方法制備生成抗體的動(dòng)物，這樣就可以以低價(jià)格制造更大量的人抗體(例如參照Nat. Biotechnol.，20，889-894 (2002))。所得的人多克隆抗體可以通過(guò)采集生成人抗體的動(dòng)物的血液、腹水、乳汁、或卵等、優(yōu)選為乳汁或卵，并結(jié)合與上述同樣的純化技術(shù)來(lái)純化。(iv)使用噬菌體展示人抗體文庫(kù)制備完全人抗體制備完全人抗體的另一個(gè)途徑是采用噬菌體展示的方法。這種方法存在在CDR以外導(dǎo)入因PCR產(chǎn)生的突變的情況，因此，雖然在臨床階段有少數(shù)的生成HAHA的報(bào)道，但另一方面它具有以下優(yōu)點(diǎn)沒(méi)有來(lái)自宿主動(dòng)物的不同種間的病毒感染的危險(xiǎn)性，或者抗體的特異性是無(wú)限的(對(duì)于禁止克隆或糖鏈等的抗體也可以容易地制備)。噬菌體展示人抗體文庫(kù)的制作方法例如可以例舉如下，但并不限于此。所使用的噬菌體沒(méi)有特別限定，優(yōu)選使用通常纖維狀的噬菌體(Ff噬菌體)。作為在噬菌體表面展示外源蛋白質(zhì)的方法，可以舉出以與g3p、g6p g9p的衣殼蛋白質(zhì)的任意一種融合的融合蛋白質(zhì)的形式在所述衣殼蛋白質(zhì)上表達(dá)/展示的方法，常用的是在g3p或 g8p的N末端一側(cè)融合的方法。作為噬菌體展示載體，可以舉出1)以在噬菌體基因組的衣殼蛋白質(zhì)基因上融合了外源基因的形式導(dǎo)入，作為將在噬菌體表面上展示的衣殼蛋白質(zhì)與全部外源蛋白質(zhì)融合的融合蛋白質(zhì)來(lái)形式展示；此外還有2、將編碼融合蛋白質(zhì)的基因與野生型衣殼蛋白質(zhì)基因分別插入，同時(shí)地表達(dá)融合蛋白質(zhì)和野生型衣殼蛋白質(zhì)；或幻使具有野生型衣殼蛋白質(zhì)基因的輔助噬菌體感染大腸桿菌，所述大腸桿菌具有包含編碼融合蛋白質(zhì)的基因的噬菌粒載體，生成使融合蛋白質(zhì)與野生型衣殼蛋白質(zhì)同時(shí)表達(dá)的噬菌體顆粒等，但在1)的情況下，如果融合較大的外源蛋白質(zhì)則會(huì)喪失感染能力，因此，為了制作抗體文庫(kù)，可以采用2)或3)的類型。具體的載體可例舉Holt 等人(Curr· Opin. Biotechnol.，11,45-449(2000))所記載的載體。例如pCESl (參照J(rèn). Biol. Chem.，274，18218-18230 (1999))是在1個(gè)乳糖啟動(dòng)子的控制下，在g3p的信號(hào)肽的下游配置編碼κ L鏈恒定區(qū)域的DNA、在g3p信號(hào)肽的下游配置編碼CH3的DNA、以及經(jīng)由His-tag、c-myc tag、琥珀終止密碼子(TAG)來(lái)配置g3p編碼序列而成的Fab表達(dá)型噬菌粒載體。如果導(dǎo)入到具有琥珀突變的大腸桿菌中，則在g3p衣殼蛋白質(zhì)上展示Fab，但如果用不具有琥珀突變的HB2151株等表達(dá)，則會(huì)生成可溶性Fab抗體。作為scFv表達(dá)型噬菌粒載體，例如可以使用pHENl (J. Mol. Biol.，222，581-597 (1991))寸。另一方面，作為輔助噬菌體，例如可以舉出M13_K07、VCSM13等。
另外，作為其它的噬菌體展示載體，還可舉出被設(shè)計(jì)為在抗體基因的3’末端和衣殼蛋白質(zhì)基因的5’末端分別連接含有編碼半胱氨酸的密碼子的序列，將兩個(gè)基因同時(shí)地分別(而不是以融合蛋白的形式)表達(dá)，并經(jīng)由所導(dǎo)入的半胱氨酸殘基之間的S-S鍵而在噬菌體表面的衣殼蛋白質(zhì)上展示抗體(Morphosys公司的CysDisplay TM技術(shù))的載體。作為人抗體文庫(kù)的種類，可以舉出初始/非免疫(non-immunized)文庫(kù)、合成文庫(kù)、以及免疫文庫(kù)等。初始/非免疫文庫(kù)是利用RT-PCR法取得正常人所保有的VH和VL基因，將它們隨機(jī)地克隆在上述噬菌體展示載體上而得到的文庫(kù)。通常，來(lái)自正常人的末梢血、骨髓、扁桃腺等淋巴細(xì)胞的mRNA等作為模板使用。為了消除病史等的V基因的偏好性，只擴(kuò)增來(lái)自未因抗原致敏而發(fā)生類別轉(zhuǎn)換的IgM的mRNA，將其特別地稱為初始文庫(kù)。代表的初始文庫(kù)可以舉出 CAT 公司的文庫(kù)(參照 J. Mol. Biol.，222，581-597 (1991) ；Nat. Biotechnol.， 14，309-314 (1996) )、MRC 公司的文庫(kù)(參照 Annu. Rev. Immunol.，12，433-455 (1994))、 Dyax 公司的文庫(kù)(參照 J. Biol. Chem.，1999 (如上所述)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14， 7969-7974(2000))等。合成文庫(kù)是選擇人B細(xì)胞內(nèi)的功能性特定抗體基因，將V基因片段的例如CDR3等的抗原結(jié)合區(qū)域的部分用適當(dāng)長(zhǎng)度的編碼隨機(jī)的氨基酸序列的DNA置換來(lái)制成文庫(kù)。最初是利用生產(chǎn)功能性的scFv或Fab的VH和VL基因的組合來(lái)構(gòu)建文庫(kù)，因此抗體的表達(dá)效率或穩(wěn)定性優(yōu)良。作為代表的合成文庫(kù)，可以舉出M0rph0SyS公司的HuCAL文庫(kù)(參照 J. Mol. Biol.，296，57-86 (2000))、BioInvent 公司的文庫(kù)(參照 Nat. Biotechnol.， 18,852(2000))、Crucell 公司的文庫(kù)(參照 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3938 (1995)； J. Immunol. Methods, 272, 219-233 (2003))等。免疫(immunized)文庫(kù)是與上述非免疫文庫(kù)的情形同樣地，由從癌癥、自身免疫疾病、感染癥等患者或接受了疫苗接種的人等血液中對(duì)目標(biāo)抗原的抗體滴度升高了的人中采集的淋巴細(xì)胞、或者通過(guò)上述體外免疫法人工免疫了目標(biāo)抗原的人淋巴細(xì)胞等中制備 mRNA，利用RT-PCR法擴(kuò)增V1^Pt基因，并制成文庫(kù)。由于目標(biāo)抗體基因在最初就包含在文庫(kù)中，因此從較小型的文庫(kù)中也可以獲得目標(biāo)抗體。文庫(kù)的多樣性越大越好，但在現(xiàn)實(shí)中，考慮到以下淘選操作可能涉及的噬菌體數(shù) (1011 1013個(gè)噬菌體)和通常的淘選操作中的克隆的分離和擴(kuò)增所必須的噬菌體數(shù) (100 1，000個(gè)噬菌體/克隆)，IO8-IO11個(gè)克隆程度是適當(dāng)?shù)?，在約IO8個(gè)克隆的文庫(kù)中， 通?？梢院Y選具有10_9量級(jí)的Kd值的抗體。將針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體通過(guò)噬菌體展示法進(jìn)行篩選的步驟稱作淘選。具體來(lái)說(shuō)， 例如，將固定有抗原的載體與噬菌體文庫(kù)接觸，洗滌除去非結(jié)合噬菌體，然后從抗體中洗脫結(jié)合的噬菌體，感染大腸桿菌并使所述噬菌體增殖，將上述一系列的操作反復(fù)進(jìn)行3 5次左右，由此可以使展示抗原特異性抗體的噬菌體濃縮。作為固定有抗原的擔(dān)體，可以舉出 通常的抗原抗體反應(yīng)或親和層析中使用的各種擔(dān)體，例如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等不溶性多糖類，聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅等的合成樹(shù)脂，或者含有玻璃、金屬等的微量板、管、膜、 柱、珠等，還可以進(jìn)一步舉出表面等離子體共振(SPR)的傳感芯片等。抗原固定也可以使用物理性吸附，通常還可以使用使蛋白質(zhì)或酶等不溶解、固定時(shí)使用的化學(xué)結(jié)合的方法。例如，優(yōu)選使用生物素_(鏈霉)抗生物素蛋白系統(tǒng)等。在作為目標(biāo)抗原的內(nèi)源性配體為肽等小分子的情況下，必須特別注意作為抗原決定基使用的部分不會(huì)由于與擔(dān)體的結(jié)合而被覆蓋。為了非結(jié)合噬菌體的洗滌，可以依次使用BSA溶液等的封閉液(1 2次)、含有吐溫等表面活性劑的PBS(3 5次)等。也有報(bào)道稱可以優(yōu)選使用檸檬酸緩沖液(pH5)等。為了特異性噬菌體的洗脫，通常使用酸(例如0. IM鹽酸等)，也可以通過(guò)特異性蛋白酶的切斷(例如可以向抗體基因與衣殼蛋白質(zhì)基因的連接部位導(dǎo)入編碼胰蛋白酶切位點(diǎn)的基因序列。在此情況下，在洗脫的噬菌體表面上展示野生型衣殼蛋白質(zhì)，因此，即使全部衣殼蛋白質(zhì)均以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)，也可以對(duì)大腸桿菌感染/增殖)或可溶性抗原導(dǎo)致的競(jìng)爭(zhēng)性洗脫、或者S-S鍵的還原(例如，在上述的CysDisplay TM中，在淘選后，通過(guò)使用適當(dāng)?shù)倪€原劑使抗體與衣殼蛋白質(zhì)解離，可以回收抗原特異性的噬菌體)進(jìn)行洗脫。在用酸洗脫的情況下，可以用Tris等中和，然后使洗脫的噬菌體感染大腸桿菌，并培養(yǎng)后利用常規(guī)的方法回收噬菌體。如果通過(guò)淘選來(lái)濃縮展示抗原特異性抗體的噬菌體，則在使它們感染大腸桿菌以后接種于板上來(lái)進(jìn)行克隆。再次回收噬菌體，利用上述抗體滴度測(cè)定方法(例如ELISA、 RIA, FIA等)或利用FACS或SPR的測(cè)定，可以確認(rèn)抗原結(jié)合活性。在從展示所選擇的抗原特異性抗體的噬菌體克隆中分離/純化抗體時(shí)，例如，在使用向抗體基因和衣殼蛋白質(zhì)基因的連接部位導(dǎo)入了琥珀終止密碼子的載體作為噬菌體展示載體的情況下，如果使所述噬菌體感染不具有琥珀突變的大腸桿菌(例如HB2151株)， 則生成可溶性抗體分子并分泌于周質(zhì)或培養(yǎng)基中，因此，可以將細(xì)胞壁用溶菌酶等溶解并回收胞外組分，采用與上述同樣的純化技術(shù)進(jìn)行。如果導(dǎo)入His-tag或c-myc tag，則可以使用IMAC或抗c-myc抗體柱等，容易地進(jìn)行純化。另外，在淘選時(shí)利用特異性蛋白酶切斷的情況下，如果使所述蛋白酶發(fā)生作用，則抗體分子從噬菌體表面分離，因此，可以通過(guò)實(shí)施同樣的純化操作來(lái)純化目標(biāo)抗體。使用生成人抗體的動(dòng)物和噬菌體展示人抗體文庫(kù)而進(jìn)行的完全人抗體制備技術(shù)也可以應(yīng)用于制備其它動(dòng)物種類的單克隆抗體。例如牛、豬、綿羊、山羊、雞等作為家畜(家禽)較多繁殖的動(dòng)物或狗或貓等寵物動(dòng)物等可以作為對(duì)象。在非人類的動(dòng)物中，目標(biāo)抗原人工免疫的倫理問(wèn)題少，因此免疫文庫(kù)的利用更為有效。(3)多克隆抗體的制備本發(fā)明的多克隆抗體可以按照其本身公知的方法或基于它的方法制備。例如，制造免疫抗原(蛋白質(zhì)或肽抗原)本身、或者其與載體蛋白的復(fù)合物，與上述單克隆抗體的制造方法同樣地對(duì)溫血?jiǎng)游镞M(jìn)行免疫，由所述免疫動(dòng)物中采集本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體含有物， 并通過(guò)進(jìn)行抗體的分離純化來(lái)制備。關(guān)于用于免疫溫血?jiǎng)游锏拿庖呖乖c載體蛋白質(zhì)的復(fù)合物，載體蛋白質(zhì)的種類以及載體蛋白質(zhì)與半抗原的混合比只要可以高效地獲得與載體蛋白交聯(lián)并免疫的抗體即可， 可以以任何比例使任何物質(zhì)交聯(lián)，例如可以采用以下的方法按照重量比，對(duì)于1份半抗原，將牛血清白蛋白或牛甲狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白等以約0. 1 約20、優(yōu)選約1 約5的比例進(jìn)行偶聯(lián)。另外，半抗原與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)可以使用各種縮合劑，可使用戊二醛或碳二酰亞胺、馬來(lái)酰亞胺活性酯、硫醇基、含有二硫吡啶基的活性酯試劑等。將縮合產(chǎn)物本身或者與擔(dān)體、稀釋劑一起給予溫血?jiǎng)游镏锌缮煽贵w的部位。在給予時(shí)，為了提高抗體生成能力，可以給予完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。給予通常是每約1 約6周給予1次，共給予約2 約10次左右。多克隆抗體可以從用上述方法免疫了的溫血?jiǎng)游锏难?、腹水等中、?yōu)選從血液中采集?？寡逯械亩嗫寺】贵w滴度的測(cè)定可以與上述抗血清中抗體滴度的測(cè)定同樣地進(jìn)行。多克隆抗體的分離純化可以按照與上述單克隆抗體的分離純化同樣的免疫球蛋白的分離純化方法進(jìn)行。含有與目標(biāo)多核苷酸的目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸、S卩、可以與目標(biāo)多核苷酸雜交的多核苷酸可以稱為關(guān)于所述目標(biāo)多核苷酸為“反義”。作為具有與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸(例如DNA(以下，在反義多核苷酸的說(shuō)明中，將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA稱為“本發(fā)明的DNA”))的堿基序列互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列或其一部分的反義多核苷酸，只要是含有與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸(例如 DNA)的堿基序列互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列或其一部分并具有可抑制所述多核苷酸的表達(dá)的作用的即可，可以使任何反義多核苷酸。與本發(fā)明的DNA實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列例如是關(guān)于與本發(fā)明的DNA互補(bǔ)的堿基序列(即，本發(fā)明的DNA的互補(bǔ)鏈)中的堿基序列相重疊的區(qū)域具有約70%或更高、優(yōu)選約 80%或更高、更優(yōu)選約90%或更高、最優(yōu)選約95%或更高的同源性(homology)的堿基序列。這里，“同源性與上述的本發(fā)明的DNA的情形相同。特別地，在本發(fā)明的DNA的互補(bǔ)鏈的全部堿基酸序列中，(a)在面向于抑制翻譯的反義多核苷酸的情況下，適合采用與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的N末端部位的部分堿基序列(例如起始密碼子附近的堿基序列等)的互補(bǔ)鏈具有約70%或更高、優(yōu)選約80%或更高、更優(yōu)選約90%或更高、最優(yōu)選約95%或更高的同源性的反義多核苷酸；(b)在面向于利用foiaseH的RNA分解的反義多核苷酸的情況下，適合采用與含有內(nèi)含子的本發(fā)明的DNA的全部堿基序列的互補(bǔ)鏈具有約70%或更高、優(yōu)選約 80%或更高、更優(yōu)選約90%或更高、最優(yōu)選約95%或更高的同源性的反義多核苷酸。具體來(lái)說(shuō)，可以舉出含有與序列號(hào)1、序列號(hào)3、或序列號(hào)5表示的堿基序列互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列或其一部分的反義多核苷酸，優(yōu)選含有例如與序列號(hào)1、序列號(hào)3、 或序列號(hào)5表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列或其一部分的反義多核苷酸等。具有與本發(fā)明的DNA的堿基序列互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列或其一部分的反義多核苷酸(以下稱為“本發(fā)明的反義多核苷酸”)可以基于克隆的或確定的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的堿基序列信息來(lái)設(shè)計(jì)/合成。所述的反義多核苷酸可以抑制編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因(以下也簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的基因”)的復(fù)制或表達(dá)。即，本發(fā)明的反義多核苷酸可以與由本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)錄的RNA(mRNA或初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)雜交，可以抑制mRNA的合成(加工)或功能(翻譯為蛋白質(zhì))，或經(jīng)由與本發(fā)明的基因相關(guān)的RNA的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)/控制本發(fā)明的基因的表達(dá)。與本發(fā)明的基因相關(guān)的RNA的選擇的序列互補(bǔ)的多核苷酸、以及可以與本發(fā)明的基因相關(guān)的RNA特異性雜交的多核苷酸可以用于在生物體內(nèi)和生物體外調(diào)節(jié)/控制本發(fā)明的基因的表達(dá)，還可以用于疾病等的治療或診斷。本發(fā)明的反義多核苷酸的目標(biāo)區(qū)域只要是可以通過(guò)反義多核苷酸的雜交、結(jié)果可以對(duì)翻譯成本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行抑制的即可，其長(zhǎng)度沒(méi)有特別限定，可以是編碼所述蛋白質(zhì)的mRNA全部序列，也可以是部分序列，短的可以舉出約10個(gè)堿基左右，長(zhǎng)的可以舉出mRNA或初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的全部序列?？紤]到合成的容易程度或抗原性的問(wèn)題，優(yōu)選含有約 10 約40個(gè)堿基、特別是約15 約30個(gè)堿基的寡核苷酸，但并不限于此。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的基因的5’端發(fā)夾環(huán)、5’末端6-堿基對(duì)重復(fù)、5’末端非翻譯區(qū)、翻譯起始密碼子、蛋白質(zhì)編碼區(qū)、ORF翻譯終止密碼子、3’末端非翻譯區(qū)、3’末端回文區(qū)或3’末端發(fā)夾環(huán)等均可以作為反義多核苷酸的優(yōu)選目標(biāo)區(qū)域來(lái)選擇，但本發(fā)明的基因內(nèi)的任何區(qū)域均可作為對(duì)象來(lái)選擇。例如，可以將所述基因的內(nèi)含子部分作為目標(biāo)區(qū)域。另外，本發(fā)明的反義多核苷酸不僅可以與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的mRNA或初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交、對(duì)翻譯成蛋白質(zhì)進(jìn)行抑制，還可以與雙鏈DNA形式的本發(fā)明的基因結(jié)合而形成三鏈體，抑制RNA的轉(zhuǎn)錄?；蛘?，形成DNA: RNA雜合體，誘導(dǎo)foiaseH的分解。為了防止因核酸酶等水解酶造成的分解，構(gòu)成反義多核苷酸的各核苷酸的磷酸殘基(磷酸酯)例如可以被硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等的化學(xué)改性磷酸殘基置換。另外，各個(gè)核苷酸的糖(脫氧核糖)可以被2’-0_甲基化等的化學(xué)改性糖結(jié)構(gòu)置換，堿基部分(嘧啶、嘌呤)也可以進(jìn)行化學(xué)改性，只要是能夠與具有序列號(hào)1、序列號(hào)3、或序列號(hào)5表示的堿基序列的DNA雜交即可，可以是任何反義多核苷酸。反義多核苷酸可以舉出含有2-脫氧-D-核糖的多核苷酸、含有D-核糖的多核苷酸、作為嘌呤或嘧啶堿基的N-葡糖苷噁的其它類型的多核苷酸、具有非核苷酸骨架的其它聚合物(例如市售的蛋白質(zhì)核酸以及合成序列特異性的核酸聚合物)或含有特殊鍵的其它聚合物(所述聚合物含有可以在DNA或RNA中見(jiàn)到的、具有允許堿基配對(duì)或堿基附著的配置的核苷酸)等。它們可以是雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA、DNAiRNA雜合體， 還可以是非改性多核苷酸(或非改性寡核苷酸)；附加了公知的改性的，例如具有本領(lǐng)域已知的標(biāo)記的、帶帽的、甲基化的、將1個(gè)或更多個(gè)天然核苷酸用類似物置換了的；進(jìn)行了分子內(nèi)核苷酸改性的，例如具有非離子鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、亞磷酰胺、氨基甲酸酯等)的；具有帶電荷的鍵或含硫鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的；例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴氨酸等)或糖(例如單糖等) 等具有支鏈基的；具有嵌入化合物(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的；含有螯合化合物(例如金屬、具放射活性的金屬、硼、氧化性的金屬等)的；含有烷基化劑的；具有改性了的鍵的(例如α成苷異構(gòu)物型的核酸等)。這里，“核苷”、“核苷酸”和“核酸”不僅含有嘌呤和嘧啶堿基，也可以含有改性了的其它雜環(huán)型堿基。上述的改性物可以含有甲基化了的嘌呤和嘧啶、 ?；说泥堰屎袜奏?、或其它雜環(huán)。在改性了的核苷以及改性了的核苷酸中，糖部分也可以被改性，例如1個(gè)或更多個(gè)羥基可以被鹵素或脂族基團(tuán)等置換，或變換為醚、胺等官能基團(tuán)。本發(fā)明的反義多核苷酸為RNA、DNA或改性了的核酸(RNA、DNA)。作為改性了的核酸的具體例，可以舉出核酸的硫衍生物、硫代磷酸酯衍生物、對(duì)于聚核苷酰胺或寡核苷酰胺的分解為抵抗性的核酸等。本發(fā)明的反義多核苷酸例如可如下設(shè)計(jì)。即，使細(xì)胞內(nèi)的反義多核苷酸更穩(wěn)定，使反義多核苷酸的細(xì)胞滲透性提高，使其對(duì)作為目標(biāo)的有義鏈的親和性更大，并且，在有毒性的情況下使反義多核苷酸的毒性更小。上述改性已有很多報(bào)道，例如 Pharm Tech Japan, 8, 247 頁(yè)或 395 頁(yè)(1992)、Antisense Research and Applications, CRC Press (1993)等。本發(fā)明的反義多核苷酸可以加入變異、或可以以像脂質(zhì)體、微球體等那樣的特殊形態(tài)供給，其中可以含有改性的糖、堿基、鍵；或可以通過(guò)基因治療來(lái)應(yīng)用、以附加的形態(tài)提供。作為在上述的附加形態(tài)中采用的材料，可以舉出發(fā)揮中和磷酸基骨架的電荷的作用的聚賴氨酸那樣的聚陽(yáng)離子體；可以提高與細(xì)胞膜的相互作用、或使核酸的攝取增大的脂質(zhì) (例如磷脂、膽留醇等)等的疏水性物質(zhì)。作為在附加時(shí)優(yōu)選的脂質(zhì)，可以舉出膽留醇或其衍生物(例如氯甲酸膽留醇酯、膽酸等)。這些物質(zhì)可以附著于核酸的3’末端或5’末端， 可以經(jīng)由堿基、糖、分子內(nèi)核苷鍵付著。作為其它的基團(tuán)，可以舉出利用在核酸的3’末端或 5’末端特異性地配置的帽用基團(tuán)來(lái)抑制因外切核酸酶、RNase等核酸酶導(dǎo)致的分解的物質(zhì)。 作為上述帽用基團(tuán)，可以舉出以聚乙二醇、四甘醇等二醇為代表的、本領(lǐng)域已知的羥基的保護(hù)基團(tuán)，但并不限于此。可以將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA或初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在編碼區(qū)內(nèi)部(在初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的情況下，包含內(nèi)含子部分)可以特異性地切斷的核酶也包含在本發(fā)明的反義多核苷酸中?！昂嗣浮笔侵妇哂星袛嗪怂岬拿富钚缘腞NA，最近已經(jīng)證實(shí)，具有這種酶活性部位的堿基序列的寡DNA也同樣具有核酸切斷活性，因此，在本說(shuō)明書(shū)中，只要具有序列特異性的核酸切斷活性即可，DNA也可以包含在“核酶”的概念中。作為核酶最常用的有可以在類病毒或擬病毒等感染性RNA中出現(xiàn)的自剪接RNA，已知為錘頭型或發(fā)夾型等。錘頭型是以約40個(gè)堿基左右發(fā)揮酶活性，通過(guò)使與錘頭結(jié)構(gòu)的部分相鄰的兩端的數(shù)個(gè)堿基的每個(gè)(合計(jì)約10 個(gè)堿基左右)與mRNA的期望切斷部位為互補(bǔ)的序列，可以只特異性地切斷目標(biāo)mRNA。這種類型的核酶只是以RNA作為底物，因此還具有不攻擊基因組DNA的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的mRNA本身為雙鏈結(jié)構(gòu)的情況下，通過(guò)使用將可以與RNA解旋酶特異性地結(jié)合的、來(lái)自病毒核酸的RNA基序進(jìn)行連接的復(fù)合核酶，可以使目標(biāo)序列為單鏈(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10)，5572-5577 (2001))。另外，在以含有編碼所述核酶的DNA的表達(dá)載體的形式使用核酶的情況下，為了促進(jìn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物向細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)，可以進(jìn)一步連接使tRNA發(fā)生了變異的序列，制成復(fù)合核酶(Nucleic Acids Res. , 29 (13), 2780-2788 (2001)) 在本說(shuō)明書(shū)中，含有與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的mRNA或初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的編碼區(qū)內(nèi)部分序列(在初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的情況下，包含內(nèi)含子部分)互補(bǔ)的寡RNA及其互補(bǔ)鏈的雙鏈RNA、 即所謂的siRNA也被定義為包含在本發(fā)明的反義多核苷酸中。如果將短的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)則與所述RNA互補(bǔ)的mRNA被分解的、所謂的RNA干擾(RNAi)的現(xiàn)象以往在線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、植物等中已知，從明確了這種現(xiàn)象在動(dòng)物細(xì)胞中也廣泛發(fā)生以來(lái)(Nature，411(6836)， 494-498(2001))，其作為核酶的替代技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。SiRNA可以基于作為目標(biāo)mRNA 的堿基序列信息，使用市售的軟件(例如RNAi Designer ；Invitrogen)來(lái)適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)。本發(fā)明的反義寡核苷酸和核酶可以根據(jù)本發(fā)明的基因的cDNA序列或基因組DNA 序列來(lái)確定mRNA或初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的目標(biāo)序列，并使用市售的DNA/RNA自動(dòng)合成儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司、貝克曼公司等制造)，通過(guò)合成與其互補(bǔ)的序列來(lái)制備?？梢岳肈NA/RNA自動(dòng)合成儀分別合成有義鏈和反義鏈，在適當(dāng)?shù)耐嘶鹁彌_液中、在約90 約95°C下進(jìn)行約1 分鐘左右的變性，然后在約30 約70°C下退火約1 約8小時(shí)來(lái)制備SiRNA。另外，將互補(bǔ)的寡核苷酸鏈以交替重疊的方式合成，并將它們退火，然后用連接酶連接，從而可以制備更長(zhǎng)的雙鏈多核苷酸。或者，可以以這樣的方式設(shè)計(jì)siRNA 作為經(jīng)由適當(dāng)長(zhǎng)度(例如約3 約10個(gè)堿基)的接頭將有義鏈和反義鏈連接起來(lái)的RNA(shRNA)來(lái)合成，并利用要導(dǎo)入的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的dicer酶等進(jìn)行加工。另外，還可以制備為編碼有義鏈和反義鏈的DNA處于不同的TO或Hl等Pol III系啟動(dòng)子分別控制下的表達(dá)載體、或編碼經(jīng)由接頭將上述有義鏈和反義鏈連接而成的RNA鏈的DNA處于Pol III系啟動(dòng)子控制下的表達(dá)載體，并在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而形成siRNA。本發(fā)明的反義多核苷酸的抑制活性可以使用導(dǎo)入了本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)化體、生物體內(nèi)或生物體外的本發(fā)明的基因表達(dá)系統(tǒng)、或者生物體內(nèi)或生體外的本發(fā)明的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)進(jìn)行研究。以下，對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽(以下可以簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)、編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA(以下可以簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的DNA”)、上述本發(fā)明的抗體、 上述本發(fā)明的反義多核苷酸的用途進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的蛋白質(zhì)在癌組織中的表達(dá)增加，因此可以用作疾病標(biāo)志。即，可以用作癌組織的早期診斷、癥狀的重癥度的判定、疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)的標(biāo)志。另外，關(guān)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)伍￥11、幾6六6、幾684)，通過(guò)抑制其表達(dá)和/或活性，可以抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附。因此，含有本發(fā)明的反義多核苷酸、本發(fā)明的抗體、或抑制上述蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)(例如低分子化合物)的藥物可以用作癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，因而可以用作癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等)的預(yù)防/治療藥物(優(yōu)選作為造血系統(tǒng)腫瘤的預(yù)防/治療藥物，更優(yōu)選作為急性骨髓性白血病(AML)的預(yù)防/治療藥物)。另外，作為其它的實(shí)施方式，在將上述藥物與所述藥物以外的抗癌藥物結(jié)合使用時(shí)，也可作為用于使癌細(xì)胞對(duì)上述抗癌藥物的敏感性提高的藥劑(藥物敏感性提高劑)使用。在本說(shuō)明書(shū)中，“癌細(xì)胞”是以包含未來(lái)朝癌化方向發(fā)展的細(xì)胞的概念來(lái)使用。如后述實(shí)施例中所記載的那樣，本發(fā)明人在人造血干細(xì)胞和人白血病細(xì)胞中對(duì) ITGA6基因/蛋白質(zhì)以及ITGB4基因/蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行比較后，證實(shí)了這些基因/蛋白質(zhì)在造血干細(xì)胞中不表達(dá)，而只在白血病細(xì)胞中高度表達(dá)。因此，本發(fā)明中，特別地以 ITGA6(蛋白質(zhì)=序列號(hào)4，基因=序列號(hào)3)和ITGB4(蛋白質(zhì)=序列號(hào)6，基因=序列號(hào)5) 為目標(biāo)，這從也可以得到降低副作用的效果出發(fā)來(lái)考慮是更為優(yōu)選的。這在以下的關(guān)于本發(fā)明的抗體或本發(fā)明的反義多核苷酸的方式中也同樣。本發(fā)明的抗體(中和抗體)可以中和本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性。因此，本發(fā)明的抗體(中和抗體)可以用作癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑、癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤等)的預(yù)防/治療藥物(優(yōu)選用作造血系統(tǒng)腫瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等)的預(yù)防/治療藥物(優(yōu)選用作造血系統(tǒng)腫瘤的預(yù)防/治療藥物，更優(yōu)選用作急性骨髓性白血病(AML)的預(yù)防/治療藥)。另外，作為其它實(shí)施方式，本發(fā)明的抗體(中和抗體)在與所述抗體以外的抗癌藥物結(jié)合使用時(shí)，也可作為用于使癌細(xì)胞對(duì)上述抗癌藥的敏感性提高的藥劑(藥物敏感性提高劑)使用。在本發(fā)明中，“中和”被定義為包括抗體依賴性細(xì)胞毒活性(ADCC活性)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性(CDC活性)、癌細(xì)胞增殖信號(hào)的抑制(狹義的中和活性)、編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)等(并不限于這些)的概念。
含有本發(fā)明的抗體的上述疾病預(yù)防/治療藥物、細(xì)胞粘附抑制劑、試劑敏感性提高劑是低毒性的，可以直接制成液體制劑、或制成適當(dāng)劑型的藥物組合物，對(duì)人或哺乳動(dòng)物 (例如大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴等)口服或非口服(例如血管內(nèi)給予、皮下給予、肌肉內(nèi)給予等)給予。本發(fā)明的抗體可以是給予其本身，或制成適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物來(lái)給予。給予中使用的藥物組合物可以含有本發(fā)明的抗體及其鹽和藥理學(xué)可接受的擔(dān)體、稀釋劑或賦型劑。上述藥物組合物可以以適合口服或非口服給予的劑型提供。作為用于非口服給予的組合物，例如可以使用注射劑、栓劑等，注射劑可以包含靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、輸液注射劑等劑型。上述注射劑可以按照公知的方法制備。作為注射劑的制備方法，例如可以通過(guò)將上述本發(fā)明的抗體或其鹽溶解、 懸浮或乳化于通常用于注射劑的無(wú)菌的水性液或油性液中來(lái)制備。注射用的水性液例如可以使用生理鹽水、葡萄糖或含有其它輔助藥物的等滲液等，可以與適當(dāng)?shù)娜芙庵鷦⒗绱?例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如聚山梨醇80、 HC0-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物))等合并使用。作為油性液，例如可以使用芝麻油、大豆油等，可以合并使用苯甲酸芐基酯、芐基醇等作為溶解助劑。所制備的注射液優(yōu)選填充于適當(dāng)?shù)陌碴称恐?。用于直腸給予的栓劑可以通過(guò)將上述抗體或其鹽與通常的栓劑基質(zhì)混合來(lái)制備。作為用于口服給予的組合物，可以舉出固體或液體的劑型，具體來(lái)說(shuō)，可以舉出片劑(包含糖衣片、薄膜衣片)、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑(包含軟膠囊劑)、糖漿劑、乳劑、 混懸劑等。上述組合物可以按照公知的方法制造，可以含有制劑領(lǐng)域中通常使用的擔(dān)體、稀釋劑或賦型劑。片劑用的擔(dān)體、賦型劑例如可以使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂。上述的非口服用或口服用藥物組合物優(yōu)選制備成適合活性成分的給予量的單位給藥劑型。作為上述單位給藥劑型，例如可以舉出片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑(安瓿瓶)、 栓劑。作為抗體的含量，優(yōu)選每單位給藥劑型通常含有5 500mg、尤其是在注射劑中含有 5 lOOmg、在其它劑型中含有10 250mg的上述抗體。含有本發(fā)明的抗體的上述制劑的給予量根據(jù)給予對(duì)象、對(duì)象疾病、癥狀、給予途徑等而不同，例如，在用于成人乳腺癌的治療/預(yù)防的情況下合適的是，1次量通常是0.01 20mg/kg體重左右、優(yōu)選0. 1 10mg/kg體重左右、進(jìn)一步優(yōu)選0. 1 5mg/kg體重左右，以 1天1 5次左右、優(yōu)選1天1 3次左右通過(guò)靜脈注射給予本發(fā)明的抗體；在其它非口服給予和口服給予的情況下，也可以參考上述的量給予。在癥狀特別嚴(yán)重的情況下，可以根據(jù)其癥狀增量。本發(fā)明的抗體可以以其本身或適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物的形式給予。上述給予中使用的藥物組合物含有上述抗體或其鹽和藥理學(xué)可接受的擔(dān)體、稀釋劑或賦型劑。所述組合物以適合口服或非口服給予(例如血管內(nèi)注射、皮下注射等)的劑型提供。另外，只要與上述抗體的配合不會(huì)發(fā)生不優(yōu)選的相互作用，上述各組合物就可以含有其它的活性成分。另外，本發(fā)明的抗體可以進(jìn)一步與其它試劑、例如烷基化劑(例如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺等)、代謝拮抗劑(例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗癌性抗生素(例如絲裂霉素、 阿霉素等)、來(lái)自植物的抗癌藥(例如長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、泰素等)、順鉬、卡鉬、依托泊甙、伊立替康等合并使用。本發(fā)明的抗體和上述試劑可以是同時(shí)或在不同的時(shí)間給予患者。在上述方式中，本發(fā)明的抗體可以發(fā)揮用于使癌細(xì)胞對(duì)上述藥物的敏感性提高的藥劑(藥物敏感性提高劑)的功能。不過(guò)，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不只限定為發(fā)揮上述功能。(2)含有反義多核苷酸的藥物本發(fā)明的反義多核苷酸可與本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)性結(jié)合、抑制所述基因的表達(dá)，并且是低毒性的，可以抑制生物體內(nèi)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的基因的功能或作用，抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附。因此，本發(fā)明的反義多核苷酸可以作為癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑、癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等)的預(yù)防/治療藥物(優(yōu)選用作造血系統(tǒng)腫瘤的預(yù)防/治療藥物，更優(yōu)選用作急性骨髓性白血病(AML)的預(yù)防/治療藥物)使用。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的反義多核苷酸在與所述反義多核苷酸以外的抗癌藥合并使用時(shí)，可以作為使癌細(xì)胞對(duì)上述抗癌藥的敏感性提高的藥劑(藥物敏感性提高劑)使用。使用本發(fā)明的反義多核苷酸作為上述預(yù)防/治療藥、細(xì)胞粘附抑制劑、藥物敏感性提高劑等的情況下，可以按照其本身公知的方法制成制劑并給予。另外，例如，可以將上述反義多核苷酸單獨(dú)地或在插入到反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體等的適當(dāng)?shù)妮d體中后，按照常規(guī)方法對(duì)人或哺乳動(dòng)物(例如大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴等)進(jìn)行口服或非口服給予。所述反義多核苷酸可以直接地、 或者為了促進(jìn)攝取而與助劑等生理學(xué)可接受的擔(dān)體一起制成制劑，通過(guò)基因槍或水凝膠導(dǎo)管等導(dǎo)管給予?；蛘?，也可以制成氣溶膠，以吸入劑的形式局部給予氣管內(nèi)。另外，為了改善體內(nèi)藥代動(dòng)力、延長(zhǎng)半衰期、改善細(xì)胞內(nèi)的攝入效率，可以將上述反義多核苷酸單獨(dú)地或與脂質(zhì)體等擔(dān)體一起制成制劑(注射劑)，給予靜脈、皮下等。所述反義多核苷酸的給予量根據(jù)對(duì)象疾病、給予對(duì)象、給予途徑等而有差異，例如，在為了治療乳腺癌而給予本發(fā)明的反義多核苷酸的情況下，對(duì)于一般的成人(體重 60kg)，每天給予約0. 1 約IOOmg的所述反義多核苷酸。含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的堿基序列或其一部分的多核苷酸(也稱為“本發(fā)明的有義多核苷酸”)以及本發(fā)明的反義多核苷酸可以作為用于調(diào)查組織或細(xì)胞中的本發(fā)明的基因表達(dá)狀況的診斷用核苷酸探針(或引物)使用。(3)針對(duì)疾病的藥物候選化合物的篩選本發(fā)明的蛋白質(zhì)在癌組織中表達(dá)亢進(jìn)，并且，如果抑制EVI1、ITGA6、或ITGB4蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性，則可以抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附。因此，抑制EVI1、ITGA6、或ITGB4蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的化合物或其鹽可以作為癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑、癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、 卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等)的預(yù)防/治療藥物(優(yōu)選作為造血系統(tǒng)腫瘤的預(yù)防/治療藥物、更優(yōu)選作為急性骨髓性白血病(AML)的預(yù)防/治療藥物)使用。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)(EVI1、ITGA6和ITGB4)可以作為用于篩選抑制所述蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的化合物或其鹽的試劑使用。S卩，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供一種使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)、篩選抑制所述蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的化合物或其鹽的方法。在篩選抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性的化合物或其鹽的情況下，所述篩選方法大致分為(a-Ι)在被檢物質(zhì)的存在下和非存在下，對(duì)所分離出的本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性進(jìn)行比較的方法；和(a-2)在被檢物質(zhì)的存在下和非存在下，培養(yǎng)具有生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞，對(duì)兩種條件下本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行比較的方法。在上述(a-Ι)的篩選方法中使用的本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以采用上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽的制造方法，來(lái)進(jìn)行分離、純化。在上述(a-2)的篩選方法中使用的具有生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞只要是生來(lái)就表達(dá)所述能力的人或其它溫血?jiǎng)游锛?xì)胞或含有所述細(xì)胞的生物體試樣(例如血液、組織、器官等)即可，沒(méi)有特別限定，例如可以舉出人乳腺癌細(xì)胞株MCF7、T47D等。在來(lái)自非人動(dòng)物的血液、組織、器官等的情況下，可以從活體中將它們分離并培養(yǎng)，或者對(duì)活體給予被驗(yàn)物質(zhì)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后將它們從活體試樣中分離。作為具有生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞，可以例舉出上述通過(guò)基因工程方法制作的各種轉(zhuǎn)化體。作為宿主，例如優(yōu)選使用C0S7細(xì)胞、CHO細(xì)胞、HEK293細(xì)胞等的動(dòng)物細(xì)胞。作為被驗(yàn)物質(zhì)，例如可以舉出蛋白質(zhì)、肽、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、 細(xì)胞提取液、植物提取液、動(dòng)物組織提取液等，這些物質(zhì)可以是新型物質(zhì)，也可以是公知的。在上述(a-Ι)的篩選方法中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性測(cè)定例如可以如下進(jìn)行將 (i)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或(ii)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和被驗(yàn)物質(zhì)與通過(guò)本發(fā)明的蛋白質(zhì)激活細(xì)胞粘附的溫血?jiǎng)游锛?xì)胞接觸，測(cè)定所述細(xì)胞的細(xì)胞粘附的程度。另外，在上述(a-幻的篩選方法中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性測(cè)定可以通過(guò)測(cè)定所述具有生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞的細(xì)胞粘附來(lái)進(jìn)行。在以細(xì)胞粘附的程度為指標(biāo)的情況下，可以將細(xì)胞懸浮于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基或緩沖液中，添加(或者不添加)被驗(yàn)物質(zhì)，進(jìn)一步加入氧化應(yīng)激物(例如添加H2O2)等的刺激，通常在約20 40°C、優(yōu)選約30 37°C下孵育約6 72小時(shí)，然后測(cè)定編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)率。細(xì)胞粘附例如可以通過(guò)檢測(cè)被驗(yàn)物質(zhì)存在下/非存在下的細(xì)胞數(shù)來(lái)進(jìn)行調(diào)查。具體來(lái)說(shuō)，例如可以測(cè)定PBS洗滌后的殘留細(xì)胞數(shù)，對(duì)細(xì)胞粘附程度進(jìn)行比較。例如，在上述(a-Ι)的篩選方法中，在被驗(yàn)物質(zhì)存在下本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性與被驗(yàn)物質(zhì)非存在下的活性相比抑制了約20%或更高、優(yōu)選30%或更高、更優(yōu)選約50%或更高的情況下，可以選擇所述被驗(yàn)物質(zhì)作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性抑制物質(zhì)。如上所述，抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)(EVI1、ITGA6和ITGB4蛋白質(zhì))的表達(dá)的物質(zhì)對(duì)于抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附、因而對(duì)于癌癥的預(yù)防/治療是有效的。S卩，根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供一種篩選癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)、癌癥的預(yù)防/治療物質(zhì)的方法，所述方法是在被驗(yàn)物質(zhì)的存在下和非存在下，對(duì)具有生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞中的所述蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行比較。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)量可以使用可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交的多核苷酸(即，含有編碼上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)的堿基序列或其一部分的多核苷酸(本發(fā)明的有義多核苷酸)、或本發(fā)明的反義多核苷酸)，通過(guò)檢測(cè)其mRNA，以轉(zhuǎn)錄水平來(lái)測(cè)定。或者，所述表達(dá)量可以使用上述本發(fā)明的抗體，通過(guò)檢測(cè)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，以翻譯水平來(lái)測(cè)定。因此，更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供(b)癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)、癌癥的預(yù)防/治療物質(zhì)的篩選方法，所述方法是在被驗(yàn)物質(zhì)存在下和非存在下，培養(yǎng)具有生成本發(fā)明蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞，使用本發(fā)明的有義或反義多核苷酸，對(duì)兩種條件下的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA的量進(jìn)行測(cè)定/比較。(c)癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制物質(zhì)、癌癥的預(yù)防/治療物質(zhì)的篩選方法，所述方法是在被驗(yàn)物質(zhì)存在下和非存在下，培養(yǎng)具有生成本發(fā)明蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞，使用本發(fā)明的抗體，對(duì)兩種條件下的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA的量進(jìn)行測(cè)定/比較。在上述(b)和(C)的篩選方法中，具有生成本發(fā)明蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞優(yōu)選使用與在上述(a_2)的篩選方法中使用的相同的細(xì)胞。例如，關(guān)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的mRNA量或蛋白質(zhì)量的測(cè)定，具體地可以如下進(jìn)行。(i)對(duì)正?；蚣膊∧Ｐ头侨藴匮?jiǎng)游?例如小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗、 猴、雞等)給予藥物(例如TNF- α、IL-1、!^s、抗癌藥劑)或物理化學(xué)應(yīng)激(例如UV、活性氧、缺血等)等，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，獲得血液、或特定的器官(例如腦、肝臟、腎臟等)、或由器官分離出的組織或細(xì)胞。對(duì)于所得細(xì)胞中所含的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的mRNA，例如可以按照常規(guī)方法，由細(xì)胞等中提取mRNA，采用例如RT-PCR法等方法定量，或者通過(guò)其本身公知的RNA印跡分析進(jìn)行定量。本發(fā)明的蛋白質(zhì)量可以采用蛋白質(zhì)印跡分析或以下詳述的各種免疫測(cè)定法進(jìn)行定量。(ii)按照上述方法，制作導(dǎo)入了編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體，并與上述(i)同樣地對(duì)所述轉(zhuǎn)化體中所含的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或編碼所述蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行定量、 分析。使本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生變化的物質(zhì)的篩選可以通過(guò)以下進(jìn)行(i)在對(duì)正?；蚣膊∧Ｐ头侨藴匮?jiǎng)游锝o予藥物或物理化學(xué)應(yīng)激等的一定時(shí)間之前(30分鐘前 M小時(shí)前，優(yōu)選30分鐘前 12小時(shí)前，更優(yōu)選1小時(shí)前 6小時(shí)前)或一定時(shí)間之后(30分鐘后 3天后，優(yōu)選1小時(shí)后 2天后，更優(yōu)選1小時(shí)后 M小時(shí)后)、 或在給予藥物或物理化學(xué)應(yīng)激的同時(shí)給予被驗(yàn)物質(zhì)并從給予后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間之后(30分鐘后 3天后，優(yōu)選1小時(shí)后 2天后，更優(yōu)選1小時(shí)后 M小時(shí)后)，對(duì)從所述動(dòng)物中分離出的細(xì)胞中所含的、編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA量、或本發(fā)明的蛋白質(zhì)量進(jìn)行定量、分析; 或(ii)在按照常規(guī)方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體時(shí)，在培養(yǎng)基中添加被驗(yàn)物質(zhì)，在培養(yǎng)一定時(shí)間后(1天后 7天后，優(yōu)選1天后 3天后，更優(yōu)選2天后 3天后)，對(duì)所述轉(zhuǎn)化體中所含的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的mRNA量或本發(fā)明的蛋白質(zhì)量進(jìn)行定量、分析。作為被驗(yàn)物質(zhì)，可以舉出肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物等，它們可以是新型物質(zhì)，也可以是公知的物質(zhì)。在上述(c)的篩選方法中，關(guān)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)量的測(cè)定，具體地例如可以舉出以下的方法等(i)使本發(fā)明的抗體與試樣液和標(biāo)記的本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)與所述抗體結(jié)合的、標(biāo)記了的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，對(duì)試樣液中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量； 或(ii)將試樣液和不溶解于擔(dān)體上的本發(fā)明的抗體以及標(biāo)記了的另一個(gè)本發(fā)明的抗體同時(shí)或連續(xù)地反應(yīng)，然后，通過(guò)測(cè)定不溶于載體上的標(biāo)記試劑的量(活性)，對(duì)試樣液中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。在上述(ii)的定量法中，優(yōu)選2種抗體來(lái)識(shí)別本發(fā)明的蛋白質(zhì)的不同部分。例如， 如果一種抗體是識(shí)別本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N末端部位的抗體，則可以使用與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的C末端部位反應(yīng)的抗體作為另一種抗體。作為在使用標(biāo)記物的測(cè)定方法中所使用的標(biāo)記試劑，例如可以使用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。作為放射性同位素，例如可以使用[125I]、[131I]、[3H]、[14C] 等。作為上述的酶，優(yōu)選穩(wěn)定、比活性大的酶，例如可以使用半乳糖苷酶、葡糖苷酶、 堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、蘋(píng)果酸脫氫酶等。作為熒光物質(zhì)，例如可以使用熒光胺、熒光素異硫氰酸酯等。作為發(fā)光物質(zhì)例如可使用發(fā)光氨、發(fā)光氨衍生物、熒光素、光澤精(Lucigenin) 等。另外，為了抗體或抗原與標(biāo)記試劑的結(jié)合，可以使用生物素_(鏈霉)抗生物素類。作為試樣液，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)局部存在于細(xì)胞內(nèi)的情況下，可以使用在將細(xì)胞懸浮于適當(dāng)?shù)木彌_液后，通過(guò)超聲波處理或冷凍融解等破壞細(xì)胞而得到的細(xì)胞破碎液；而在本發(fā)明的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外的情況下，可以使用細(xì)胞培養(yǎng)上清。根據(jù)需要，可以從破碎液或培養(yǎng)上清中分離/純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行定量。在可以檢測(cè)出標(biāo)記試劑的范圍內(nèi)，還可以使用完整細(xì)胞作為試樣。使用本發(fā)明的抗體的本發(fā)明的蛋白質(zhì)定量方法沒(méi)有特別限定，只要是通過(guò)化學(xué)或物理手段檢測(cè)試樣液中與抗原量對(duì)應(yīng)的抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合物的量，通過(guò)使用含有已知量抗原的標(biāo)準(zhǔn)液制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算上述量的測(cè)定法即可，可以采用任何測(cè)定方法。例如優(yōu)選使用比濁法、競(jìng)爭(zhēng)法、免疫法和夾層法。在靈敏度、特異性方面，優(yōu)選使用例如后述的夾層法。在抗原或抗體不溶時(shí)，可以采用物理吸附，還可以采用通常使蛋白質(zhì)或酶等不溶/ 固定時(shí)所使用的化學(xué)鍵。作為擔(dān)體，可以舉出瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等的不溶性多糖類、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅等的合成樹(shù)脂、或玻璃等。在夾層法中，使試樣液與不溶的本發(fā)明的抗體反應(yīng)(1次反應(yīng))，進(jìn)一步使標(biāo)記了的另外的本發(fā)明的抗體反應(yīng)O次反應(yīng))，然后，通過(guò)測(cè)定不溶的擔(dān)體上標(biāo)記試劑的量或活性，可以對(duì)試樣液中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。1次反應(yīng)和2次反應(yīng)可以以相反的順序進(jìn)行，還可以同時(shí)進(jìn)行，也可以將時(shí)間錯(cuò)開(kāi)進(jìn)行。標(biāo)記試劑和不溶的方法可以參照上述的這些方法。在夾層法的免疫測(cè)定法中，固相化抗體或標(biāo)記化抗體中使用的抗體不必是1種，為了提高測(cè)定靈敏度等，可以使用2種或更多種抗體的混合物。本發(fā)明的抗體也可以在夾層法以外的測(cè)定系統(tǒng)、例如競(jìng)爭(zhēng)法、免疫法或比濁法等中使用。
在競(jìng)爭(zhēng)法中，使試樣液中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)和標(biāo)記了的本發(fā)明的蛋白質(zhì)與抗體競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，然后將未反應(yīng)的標(biāo)記抗原(F)、和與抗體結(jié)合了的標(biāo)記抗原(B)分離(B/F分離)，通過(guò)測(cè)定B、F的任意一種的標(biāo)記量，可以對(duì)試樣液中本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。在本反應(yīng)方法中，可以采用以下的方法液相法，使用可溶性抗體作為抗體，使用聚乙二醇或上述抗體(1次抗體)的2次抗體等進(jìn)行B/F分離；以及固相化法，使用固相化抗體作為1次抗體(直接法)，或者1次抗體使用可溶性的，2次抗體使用固相化抗體(間接法)。在免疫法中，使試樣液中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)與固相的本發(fā)明的蛋白質(zhì)與一定量的標(biāo)記化抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，然后將固相和液相分離，或使試樣液中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)與過(guò)量的標(biāo)記化抗體反應(yīng)，接著，加入固相的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，使未反應(yīng)的標(biāo)記化抗體與固相結(jié)合，然后將固相和液相分離。接著，測(cè)定任意相的標(biāo)記量，對(duì)試樣液中的抗原量進(jìn)行定量。另外，在比濁法中，測(cè)定凝膠內(nèi)或溶液中的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的不溶性沉淀物的量。在試樣液中本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量很少并只得到少量的沉淀物的情況下，也可優(yōu)選采用利用激光散射的激光比濁法等。在將每一種免疫學(xué)的測(cè)定方法用于本發(fā)明的定量方法時(shí)，不需要特別的條件、操作等的設(shè)定。在每一種方法中，只要在常規(guī)條件、操作方法的基礎(chǔ)上加入本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)考慮，即可以構(gòu)建本發(fā)明的蛋白質(zhì)測(cè)定系統(tǒng)。這些常規(guī)技術(shù)手段的詳細(xì)內(nèi)容可參照概述、現(xiàn)
有著作等。例如可參照入江寬編著的《放射免疫測(cè)定》(，夕才4 A 7 7 7七(講談社， 1974年發(fā)行)、入江寬編著的《放射免疫測(cè)定續(xù)編》(続，7才^ A 7 7 ^七^(guò) )(講談社， 1979年發(fā)行)、石川榮治等人編著《酶免疫測(cè)定法》(酵素免疫測(cè)定法)(醫(yī)學(xué)書(shū)院，1975年發(fā)行)、石川榮治等人編著《酶免疫測(cè)定法》(酵素免疫測(cè)定法)(第2版)(醫(yī)學(xué)書(shū)院，1982 年發(fā)行)、石川榮治等人編著《酶免疫測(cè)定法》(酵素免疫測(cè)定法)(第3版)(醫(yī)學(xué)書(shū)院， 1987 年發(fā)行)、“Methods in ENZYM0L0GY"Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同上書(shū) Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同上書(shū) Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同上書(shū) Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D-Selected Immunoassays))> 同上書(shū) Vol. 92(Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同上書(shū) Vol. 121(Immunochemical Techniques (Part I Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上由學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)發(fā)行)等。如上所述，通過(guò)使用本發(fā)明的抗體，可以靈敏度良好地對(duì)細(xì)胞中本發(fā)明的蛋白質(zhì)
的生產(chǎn)量進(jìn)行定量。例如，在上述(b)和(C)的篩選方法中，在被驗(yàn)物質(zhì)存在下本發(fā)明的蛋白質(zhì)(EVI1、 ITGA6和ITGB4)的表達(dá)量(mRNA量或蛋白質(zhì)量)與被驗(yàn)物質(zhì)非存在下的情形相比抑制約 20%或更高、優(yōu)選約30%或更高、更優(yōu)選約50%或更高的情況下，可以選擇所述被驗(yàn)物質(zhì)作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)抑制物質(zhì)。本發(fā)明的篩選用試劑盒含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽(以下可簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是采用上述的任何方法方法進(jìn)行分離/純化所得，也可以如上所述，以生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞(溫血?jiǎng)游锛?xì)胞)的形式提供。為了測(cè)定生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)量，本發(fā)明的篩選用試劑盒可以進(jìn)一步含有上述本發(fā)明的抗體、或本發(fā)明的有義或反義多核苷酸。所述篩選用試劑盒除上述之外，可以任意含有反應(yīng)緩沖液、封閉液、洗滌用緩沖液、標(biāo)記試劑、標(biāo)記檢測(cè)試劑等。使用本發(fā)明的篩選方法或篩選用試劑盒得到的、本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)和/或活性抑制物質(zhì)(可以是游離體，也可以是鹽的形式)作為癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑、癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等) 的預(yù)防/治療藥物(優(yōu)選作為造血系統(tǒng)腫瘤的預(yù)防/治療藥物，更優(yōu)選作為急性骨髓性白血病(AML)的預(yù)防/治療藥物)，作為低毒性且安全的藥物的有用的。在將采用本發(fā)明的篩選方法或篩選用試劑盒得到的化合物或其鹽用作上述預(yù)防/ 治療藥物的情況下，可以按照常規(guī)方法制成制劑。例如，作為用于口服給予的組合物，可以舉出固體或液體的劑型，具體來(lái)說(shuō)，可以舉出片劑(包含糖衣片、薄膜衣片)、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑(包含軟膠囊劑)、糖漿劑、 乳劑、混懸劑等。所述組合物可按照本身公知的方法制造，可以含有制劑領(lǐng)域中通常使用的擔(dān)體、稀釋劑或賦型劑。例如，作為片劑用的擔(dān)體、賦型劑，可以使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂
酸鎂等。作為用于非口服給予的組合物，例如可以使用注射劑、栓劑等，注射劑包含靜脈注射齊IJ、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、輸液注射劑、關(guān)節(jié)內(nèi)注射劑等的劑型。所述的注射劑可以按照本身公知的方法，例如通過(guò)將上述化合物或其鹽溶解、懸浮或乳化于通常用于注射劑的無(wú)菌的水性液或油性液中來(lái)制備。作為注射用的水性液，例如可以使用生理鹽水、葡萄糖或含有其它輔助藥物的等滲液等，可以與適當(dāng)?shù)娜芙庵鷦?、例如?例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如聚山梨醇80、HC0_50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物))等合并使用。作為油性液，例如可以使用芝麻油、 大豆油等，可以合并使用苯甲酸芐基酯、芐基醇等作為溶解助劑。所制備的注射液通常填充于適當(dāng)?shù)陌碴称恐小Ｓ糜谥蹦c給予的栓劑可以通過(guò)將上述化合物或其鹽與通常的栓劑基質(zhì)混合來(lái)制備。上述的口服用或非口服用藥物組合物優(yōu)選制備成適合活性成分的給予量的單位給藥劑型。上述單位給藥劑型例如可舉出片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑(安瓿瓶)、栓劑等。 優(yōu)選每單位給藥劑型通常含有5 500mg、尤其是注射劑中含有5 lOOmg、其它劑型中含有10 250mg的上述抗體。只要與上述化合物的配合不會(huì)發(fā)生不優(yōu)選的相互作用，上述各組合物可以含有其它的活性成分。另外，如上所述得到的制劑安全且毒性低，因此可以對(duì)例如人或溫血?jiǎng)游?例如小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、牛、馬、雞、貓、狗、猴、黑猩猩等)口服或非口服給予。所述化合物或其鹽的給予量根據(jù)其作用、對(duì)象疾病、給予對(duì)象、給予途徑等而有差異，例如，為了治療乳腺癌而口服給予本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)和/或活性抑制物質(zhì)時(shí)，通常對(duì)于成人(體重60kg)，每天可以給予約0. 1 約lOOmg、優(yōu)選約1. O 約50mg、更優(yōu)選約 1. O 約20mg的所述化合物或其鹽。在非口服給予的情況下，所述抑制物質(zhì)的1次給予量根據(jù)給予對(duì)象、對(duì)象疾病等而不同，例如在以治療乳腺癌為目的將本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)和/或活性抑制物質(zhì)以注射劑的形式給予通常成人(體重60kg)的情況下，優(yōu)選每天將約 0. 01 約30mg、優(yōu)選約0. 1 約20mg、更優(yōu)選約0. 1 約IOmg的所述化合物或其鹽通過(guò)注射給予癌變部位。在其它動(dòng)物的情況下，也可以按照體重60kg的量進(jìn)行換算來(lái)給予。(4)癌癥的診斷試劑本發(fā)明的抗體可以特異性地識(shí)別本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，所述抗體可以用于被驗(yàn)液中的本發(fā)明蛋白質(zhì)的定量等。因此，在使用上述本發(fā)明的抗體篩選本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)抑制物質(zhì)的方法，通過(guò)使用由被驗(yàn)溫血?jiǎng)游锊杉纳矬w試樣(例如血液、血漿、尿、活檢等)來(lái)代替具有生成本發(fā)明蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞，實(shí)施免疫測(cè)定，則可以調(diào)查所述動(dòng)物體內(nèi)的本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)程度，繼而可以用于癌癥的診斷。作為免疫測(cè)定的結(jié)果，當(dāng)檢測(cè)出所述試樣中本發(fā)明的蛋白質(zhì)增加時(shí)，可以診斷為發(fā)生了癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、 前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(特別是AML)等)，或?qū)?lái)發(fā)病的可能性高。同樣地，通過(guò)將上述本發(fā)明的有義或反義多核苷酸用作探針或引物，可以檢測(cè)人或其它溫血?jiǎng)游?例如大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、兔、綿羊、山羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴、黑猩猩、雞等)的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或mRNA的異常(基因異常)。因此，所述多核苷酸可以作為例如所述DNA的擴(kuò)增或mRNA的表達(dá)過(guò)多等的基因診斷試劑、特別是癌癥的診斷試劑。編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸或?qū)?yīng)的反義多核苷酸只要具有作為探針或引物所必須的長(zhǎng)度(例如約15個(gè)堿基或更多)即可，沒(méi)有特別限定。使用本發(fā)明的有義或反義多核苷酸進(jìn)行的上述基因診斷例如可以通過(guò)其本身公知的Northern雜交法、定量RT-PCR法、PCR-SSCP法、等位基因特異性PCR法、PCR-SSOP法、 DGGE法、Rnase保護(hù)法、PCR-RFLP法等實(shí)施。例如，對(duì)于從被驗(yàn)的溫血?jiǎng)游锏募?xì)胞提取的RNA組分，通過(guò)Northern雜交法或定量RT-PCR法進(jìn)行診斷，在檢測(cè)出本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)增加的情況下，可以診斷為發(fā)生了癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(特別是AML)等)，或?qū)?lái)發(fā)病的可能性高。(5)含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的藥物本發(fā)明的蛋白質(zhì)在癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，因此為了激活癌癥患者的免疫系統(tǒng)，可以使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為癌癥疫苗。例如，可以優(yōu)選采用所謂的過(guò)繼免疫療法等，S卩，在本發(fā)明蛋白質(zhì)的存在下，培養(yǎng)強(qiáng)力的抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)狀細(xì)胞)，使其吞噬所述蛋白質(zhì)后，然后再次返回患者體內(nèi)。 返回體內(nèi)的樹(shù)狀細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)、激活癌癥抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，可以殺滅癌細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白質(zhì)例如可以作為用于癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、 食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(特別是AML)等)的預(yù)防或治療的疫苗制劑，安全地給予哺乳動(dòng)物(例如人、猴、小鼠、大鼠、兔、豬)。所述疫苗制劑通常含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)和生理學(xué)可接受的擔(dān)體。作為擔(dān)體，例如可以舉出水、鹽水(包含生理鹽水)、緩沖液(例如磷酸緩沖液)、醇(例如乙醇)等液體的擔(dān)體。疫苗制劑可以按照常規(guī)的疫苗制劑的制造方法制備。通常，本發(fā)明的蛋白質(zhì)溶解或懸浮于生理學(xué)可接受的擔(dān)體中。另外，還可以分別制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)和生理學(xué)可接受的擔(dān)體，在使用時(shí)將它們混合使用。在疫苗制劑中，除了本發(fā)明的蛋白質(zhì)和生理學(xué)可接受的擔(dān)體之外，還可以配合佐劑(例如氫氧化鋁凝膠、血清白蛋白等)、防腐劑(例如硫柳汞等)、止痛劑(例如葡萄糖、 芐基醇等)等。另外，為了促進(jìn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的抗體的生成，例如可以進(jìn)一步配合細(xì)胞因子(例如白細(xì)胞介素-2等的白細(xì)胞介素類、干擾素-Y等的干擾素類等)。在作為疫苗制劑使用時(shí)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以作為活性體使用；為了提高抗原性， 可以使所述蛋白質(zhì)改性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的改性通常通過(guò)加熱處理、蛋白質(zhì)改性劑(例如甲醛、鹽酸胍、尿素)的處理來(lái)進(jìn)行。所得的疫苗制劑的毒性低，通常作為注射劑，例如可以給予皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)，還可以局部給予癌細(xì)胞塊或其附近。本發(fā)明蛋白質(zhì)的給予量根據(jù)例如對(duì)象疾病、給予對(duì)象、給予途徑等而不同，例如將本發(fā)明的蛋白質(zhì)以注射劑的形式皮下給予罹患癌癥的成人(體重60kg)時(shí)，每次通常為 0. 1 300mg左右，優(yōu)選100 300mg左右。疫苗制劑的給予次數(shù)可以是1次，擔(dān)為了提高抗體生產(chǎn)量，可以以約2周 約6個(gè)月的間隔，給予所述疫苗制劑2 4次。(6) DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物本發(fā)明提供具有外源性的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA(以下也稱為“本發(fā)明的外源性DNA”)或其變異DNA(也稱為“本發(fā)明的外源性變異DNA”)的非人哺乳動(dòng)物。S卩，根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方式，可以提供(1)具有本發(fā)明的外源性DNA或其變異DNA的非人哺乳動(dòng)物；(2)如第(1)項(xiàng)所記載的動(dòng)物，其中，非人哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物；(3)如第⑵項(xiàng)所記載的動(dòng)物，其中，嚙齒動(dòng)物是小鼠或大鼠；以及(4)重組載體，其含有本發(fā)明的外源性DNA或其變異DNA并可以在哺乳動(dòng)物中表達(dá)。具有本發(fā)明的外源性DNA或其變異DNA的非人哺乳動(dòng)物(以下可稱為“本發(fā)明的 DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物”)可如下制備對(duì)于未受精卵、受精卵、精子及其含有原始細(xì)胞的胚母細(xì)胞等，優(yōu)選在非人哺乳動(dòng)物發(fā)育中的胚胎發(fā)生階段(更優(yōu)選在單細(xì)胞或受精卵細(xì)胞的階段、 且通常為8細(xì)胞期以前)，采用磷酸鈣法、電脈沖法、脂轉(zhuǎn)染法、凝聚法、微注射法、基因槍法、DEAE-葡聚糖法等將作為目標(biāo)的DNA轉(zhuǎn)移。通過(guò)所述DNA轉(zhuǎn)移方法，可以將作為目標(biāo)的本發(fā)明的外源性DNA體細(xì)胞、活體的器官、組織細(xì)胞等轉(zhuǎn)移，可以用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)等，進(jìn)而，通過(guò)其本身公知的細(xì)胞融合法，可以將細(xì)胞與上述胚母細(xì)胞融合，制備本發(fā)明的 DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物。作為非人哺乳動(dòng)物，例如可以使用牛、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、豚鼠、倉(cāng)鼠、小鼠、 大鼠等。其中，從病態(tài)動(dòng)物模型體系的制作方面考慮，優(yōu)選個(gè)體發(fā)生和生物周期比較短、繁殖容易的嚙齒動(dòng)物，尤其是小鼠(例如作為純系有C57BL/6系統(tǒng)、DBA2系統(tǒng)等，作為雜交系有B6C3F1系統(tǒng)、BDFl系統(tǒng)、B6D2F1系統(tǒng)、BALB/c系統(tǒng)、ICR系統(tǒng)等)或大鼠(例如Wistar、 SD等)等。
作為可以在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的重組載體的“哺乳動(dòng)物”，可以舉出上述的非人哺乳動(dòng)物之外的人等。本發(fā)明的外源性DNA是指并不是非人哺乳動(dòng)物原本具有的本發(fā)明的DNA，而是從哺乳動(dòng)物中分離/提取的本發(fā)明的DNA。本發(fā)明的變異DNA是指在原本的本發(fā)明的DNA的堿基序列中發(fā)生了變異(例如突變等)的DNA，具體來(lái)說(shuō)，可以使用發(fā)生了堿基的附加、缺失、與其它堿基置換等的DNA等，還包含異常DNA。所述異常DNA是指表達(dá)異常的本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，例如，可以使抑制正常的本發(fā)明蛋白質(zhì)功能的蛋白質(zhì)表達(dá)的DNA。本發(fā)明的外源性DNA可以來(lái)自與對(duì)象動(dòng)物同種或異種的任何的哺乳動(dòng)物。在將本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移至對(duì)象動(dòng)物時(shí)，制成與可以使所述DNA在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子下游結(jié)合的DNA構(gòu)建物，這通常是有利的。例如，在轉(zhuǎn)移本發(fā)明的人DNA的情況下，可以將在可表達(dá)來(lái)自與其同源性高、具有本發(fā)明的DNA的各種哺乳動(dòng)物(例如兔、狗、貓、豚鼠、倉(cāng)鼠、大鼠、 小鼠等)的DNA的各種啟動(dòng)子下游結(jié)合有本發(fā)明的人DNA的DNA結(jié)構(gòu)(例如載體等)微注射到對(duì)象哺乳動(dòng)物的受精卵、例如小鼠受精卵中，來(lái)制備高度表達(dá)本發(fā)明的DNA的DNA轉(zhuǎn)移哺乳動(dòng)物。作為本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，可以使用來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒、來(lái)自枯草桿菌的質(zhì)粒、來(lái)自酵母的質(zhì)粒、λ噬菌體等的噬菌體、莫洛尼式白血病病毒等的反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒或桿狀病毒等動(dòng)物病毒等。其中，優(yōu)選使用來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒、來(lái)自枯草桿菌的質(zhì)?；騺?lái)自酵母的質(zhì)粒等。作為上述進(jìn)行DNA表達(dá)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，例如可以使用(i)來(lái)自病毒(例如猿猴病毒、巨細(xì)胞病毒、莫洛尼式白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等)的DNA的啟動(dòng)子；(ii)來(lái)自各種哺乳動(dòng)物(人、兔、狗、貓、豚鼠、倉(cāng)鼠、大鼠、小鼠等)的啟動(dòng)子，例如白蛋白、胰島素II、尿溶蛋白II、彈性蛋白酶、紅細(xì)胞生成素、內(nèi)皮縮血管肽、肌肉肌酸激酶、膠質(zhì)纖維性酸性蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、來(lái)自血小板的生長(zhǎng)因子β、角蛋白Kl、KlO 和Κ14、膠原I型和II型、依賴環(huán)AMP的蛋白激酶β I亞基、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白、抗酒石酸堿性磷酸酶、心房利尿鈉因子、內(nèi)皮細(xì)胞受體酪氨酸激酶(通常簡(jiǎn)稱為“Tie2”)、鈉鉀腺苷3 磷酸酶(Na，K-ATPase)、神經(jīng)絲輕鏈、金屬硫蛋白I和IIA、金屬蛋白酶1組織抑制劑、MHC I類抗原(H-2L)、H-ras、腎素、多巴胺羥化酶、甲狀腺過(guò)氧化物酶(ΤΡ0)、肽鏈延長(zhǎng)因子 la (EF-1 α ), β肌動(dòng)蛋白、α和β肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈1和2、髓鞘質(zhì)基礎(chǔ)蛋白、 甲狀腺球蛋白、Thy-Ι、免疫球蛋白、H鏈可變部位(VNP)、血清淀粉樣蛋白P成分、肌紅蛋白、 肌鈣蛋白C、平滑肌α疫苗、前腦啡肽原Α、前血管升壓素等的啟動(dòng)子等。其中，優(yōu)選可以在全身高度地表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、人肽鏈延長(zhǎng)因子la (EF-Ia)的啟動(dòng)子、人和雞β 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。在DNA轉(zhuǎn)移哺乳動(dòng)物中，優(yōu)選上述載體具有使目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄終止的序列(通常稱為“終止子”)，例如可以使用來(lái)自病毒和來(lái)自各種哺乳動(dòng)物的各個(gè)DNA序列，優(yōu)選使用猿猴病毒的SV40終止子等。除此之外，為了進(jìn)一步高度地表達(dá)作為目標(biāo)的外源性DNA，可以根據(jù)目的，將各個(gè) DNA的剪接信號(hào)、增強(qiáng)子區(qū)、真核DNA的內(nèi)含子的一部分等與啟動(dòng)子區(qū)的5’上游、啟動(dòng)子區(qū)與翻譯區(qū)之間或者翻譯區(qū)的3’下游連接。正常的本發(fā)明蛋白質(zhì)的翻譯區(qū)可以作為來(lái)自人或各種哺乳動(dòng)物(例如兔、狗、貓、 豚鼠、倉(cāng)鼠、大鼠、小鼠等)的肝臟、腎臟、甲狀腺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的DNA以及市售的各種基因組DNA文庫(kù)的基因組DNA的全部或一部分來(lái)獲得，或者利用公知的方法，以來(lái)自肝臟、腎臟、甲狀腺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的RNA制備的互補(bǔ)DNA為原料來(lái)獲得。對(duì)于外源性的異常DNA， 可以制成利用點(diǎn)突變誘發(fā)法而使由上述細(xì)胞或組織得到的正常蛋白質(zhì)的翻譯區(qū)變異了的翻譯區(qū)。所述翻譯區(qū)可以通過(guò)常規(guī)基因工程的方法制成，S卩，以可以在轉(zhuǎn)移動(dòng)物中表達(dá)的 DNA構(gòu)建物的形式，與上述啟動(dòng)子的下游以及根據(jù)期望與轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的上游連接。受精卵細(xì)胞階段的本發(fā)明的外源性DNA的轉(zhuǎn)移可以以存在于對(duì)象哺乳動(dòng)物的所有胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中的方式來(lái)保證。在DNA轉(zhuǎn)移后的培育動(dòng)物的胚母細(xì)胞中存在本發(fā)明的外源性DNA是指培育動(dòng)物的后代全部在其所有胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中保有本發(fā)明的外源性DNA。繼承了本發(fā)明的外源性DNA的所述種類的動(dòng)物的后代也會(huì)在其所有胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中具有本發(fā)明的外源性DNA。通過(guò)確認(rèn)轉(zhuǎn)移了本發(fā)明的外源性正常DNA的非人哺乳動(dòng)物可以通過(guò)交配來(lái)穩(wěn)定地保持外源性DNA，保有所述DNA的動(dòng)物可以在通常的培育環(huán)境下繼代培育。受精卵細(xì)胞階段的本發(fā)明外源性DNA的轉(zhuǎn)移可以以過(guò)量存在于對(duì)象哺乳動(dòng)物的所有胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中的方式來(lái)保證。在DNA轉(zhuǎn)移后的培育動(dòng)物的胚母細(xì)胞中過(guò)量存在本發(fā)明的外源性DNA是指培育動(dòng)物的后代全部在其所有胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中過(guò)量地具有本發(fā)明的外源性DNA。繼承了本發(fā)明的外源性DNA的所述種類的動(dòng)物的后代也會(huì)在其所有胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中過(guò)量地具有本發(fā)明的外源性DNA。獲得在同源染色體的兩方具有導(dǎo)入DNA的純合體動(dòng)物，通過(guò)使這樣的雌雄動(dòng)物交配，可以以使所有的后代都過(guò)量地具有所述DNA的方式來(lái)繁殖繼代。在具有本發(fā)明的正常DNA的非人哺乳動(dòng)物中，本發(fā)明的正常DNA高度地表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性正常DNA的功能，最終使得本發(fā)明蛋白質(zhì)機(jī)能亢進(jìn)癥發(fā)病，可以作為這種病態(tài)的模型動(dòng)物利用。例如，使用本發(fā)明的正常DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物，可以了解本發(fā)明蛋白質(zhì)機(jī)能亢進(jìn)癥或本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的病態(tài)機(jī)理，以及進(jìn)行這些疾病的治療方法的研究。轉(zhuǎn)移有本發(fā)明的外源性正常DNA的哺乳動(dòng)物具有游離的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的增加癥狀，因此可以用于對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的預(yù)防/治療藥物、例如癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(特別是AML)等)的預(yù)防/治療藥物的篩選試驗(yàn)。另一方面，對(duì)于具有本發(fā)明的外源性異常DNA的非人哺乳動(dòng)物，通過(guò)確認(rèn)可以通過(guò)交配來(lái)穩(wěn)定地保有外源性DNA，可以在通常的飼養(yǎng)環(huán)境下繼代飼養(yǎng)來(lái)作為保有這種DNA 的動(dòng)物。另外，還可以將作為目標(biāo)的外源DNA摻入上述的質(zhì)粒中，作為原料使用。與啟動(dòng)子形成的DNA構(gòu)建物可以按照常規(guī)基因工程方法制備。在受精卵細(xì)胞階段，本發(fā)明的異常DNA 的轉(zhuǎn)移可以以存在于對(duì)象哺乳動(dòng)物的所有胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中的方式保證。在DNA轉(zhuǎn)移后培育動(dòng)物的胚母細(xì)胞存在本發(fā)明的異常DNA是指培育動(dòng)物的后代全部在其所有的胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中具有本發(fā)明的異常DNA。繼承了本發(fā)明的外源性DNA的這種動(dòng)物的后代在其所有胚母細(xì)胞和體細(xì)胞中具有本發(fā)明的異常DNA。獲得在同源染色體的兩方具有導(dǎo)入DNA 的純合體動(dòng)物并使這樣的雌雄動(dòng)物交配，可以以全部的后代都具有這種DNA的方式來(lái)繁殖繼代。具有本發(fā)明的異常DNA的非人哺乳動(dòng)物高度地表達(dá)本發(fā)明的異常DNA，通過(guò)抑制內(nèi)源性的正常DNA的功能，最終形成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能鈍化型不敏感癥，可以作為這種病態(tài)模型動(dòng)物利用。例如，使用本發(fā)明異常DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物，可以了解本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能鈍化性不敏感癥的病態(tài)機(jī)理的以及進(jìn)行這種疾病治療方法的研究。另外，作為具體的利用可能性，本發(fā)明的異常DNA高度表達(dá)動(dòng)物可以作為了解本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能鈍化型不敏感癥中，本發(fā)明的異常蛋白質(zhì)對(duì)正常蛋白質(zhì)的功能抑制 (顯性負(fù)作用)的模型。轉(zhuǎn)移有本發(fā)明的外源異常DNA的哺乳動(dòng)物可以用作對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能鈍化型不敏感癥的預(yù)防/治療藥，例如癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、 胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(特別是AML)等)的預(yù)防/治療藥物的篩選試驗(yàn)。另外，上述2種本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物及其它利用可能性例如可以考慮；(i)作為組織培養(yǎng)中的細(xì)胞源使用；(ii)通過(guò)直接對(duì)本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物組織中的DNA或RNA進(jìn)行分析、或?qū)NA 所表達(dá)的肽組織進(jìn)行分析而進(jìn)行的、對(duì)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異性地表達(dá)或激活的肽的相關(guān)性的分析；(iii)利用標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)培養(yǎng)具有DNA的組織的細(xì)胞并使用它們來(lái)進(jìn)行的來(lái)自通常難以培養(yǎng)的組織的細(xì)胞的功能的研究；(iv)通過(guò)使用上述(iii)的細(xì)胞進(jìn)行的諸如提高細(xì)胞的功能這樣的藥物的篩選； 以及(ν)進(jìn)行本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)的分離純化及其抗體制備等。另外，使用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物，可以進(jìn)一步研究包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)功能鈍化型不敏感癥等在內(nèi)的、與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的臨床癥狀，還可以得到與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病模型的各器官的更詳細(xì)的病理學(xué)認(rèn)識(shí)，可以對(duì)新的治療方法的開(kāi)發(fā)、 進(jìn)一步對(duì)這種疾病導(dǎo)致的繼發(fā)性疾病的研究和治療做出貢獻(xiàn)。另外，在從本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物取出各器官并細(xì)細(xì)切碎后，可以利用胰蛋白酶等的蛋白質(zhì)分解酶，來(lái)獲得游離的DNA轉(zhuǎn)移細(xì)胞、對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，或進(jìn)行其培養(yǎng)細(xì)胞的系統(tǒng)化。另外，可以對(duì)生成本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞的確定、與細(xì)胞粘附等的相關(guān)性、或它們的信號(hào)傳遞機(jī)制、它們的異常等進(jìn)行研究，作為用于了解本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其作用的有效的研究材料。另外，為了使用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物，進(jìn)行包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)功能鈍化型不敏感癥在內(nèi)的、與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的治療藥的開(kāi)發(fā)，使用上述檢查方法和定量法等，可以提供這種疾病治療藥物的有效、迅速的篩選方法。使用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移動(dòng)物或本發(fā)明的外源性DNA表達(dá)載體，可以研究、開(kāi)發(fā)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病的DNA治療方法。(7)敲除動(dòng)物
本發(fā)明提供本發(fā)明的DNA發(fā)生了鈍化的非人哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞和本發(fā)明的DNA 表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物。即，根據(jù)本發(fā)明，提供(1)非人哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，其中，本發(fā)明的DNA發(fā)生了鈍化；(2)如第⑴項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中，所述DNA通過(guò)導(dǎo)入報(bào)道基因(例如來(lái)自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因)而被鈍化；(3)如第(1)項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中，所述胚胎干細(xì)胞具有新霉素抗性；(4)如第(1)項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中，非人哺乳動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物；(5)如第(4)項(xiàng)記載的胚胎干細(xì)胞，其中，嚙齒動(dòng)物為小鼠；(6) DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物，其中，所述本發(fā)明的DNA被鈍化；(7)如第(6)項(xiàng)記載的非人哺乳動(dòng)物，其中，所述DNA通過(guò)導(dǎo)入報(bào)道基因(例如來(lái)自大腸桿菌的半乳糖苷酶基因)而被鈍化，所述報(bào)道基因可以在本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)；(8)如第(6)記載的非人哺乳動(dòng)物，其中，非人哺乳動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物；(9)如第⑶項(xiàng)記載的非人哺乳動(dòng)物，其中，嚙齒動(dòng)物為小鼠；以及(10)對(duì)如第(7)項(xiàng)記載的動(dòng)物給予試驗(yàn)化合物并檢測(cè)報(bào)道基因的表達(dá)的、促進(jìn)本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子的活性的化合物或其鹽的篩選方法。本發(fā)明的DNA發(fā)生了鈍化的非人哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞是指，通過(guò)對(duì)所述非人哺乳動(dòng)物所具有的本發(fā)明的DNA時(shí)實(shí)施人工變異來(lái)抑制DNA的表達(dá)能力、或者通過(guò)使所述DNA 所編碼的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性實(shí)質(zhì)性地喪失使DNA實(shí)質(zhì)上不具有表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的能力(以下也稱為“本發(fā)明的敲除DNA”)的非人哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞(以下也稱為 “ES細(xì)胞”)。作為非人哺乳動(dòng)物，可以使用上述同樣的材料。作為對(duì)本發(fā)明的DNA實(shí)施人工變異的方法，例如可以通過(guò)基因工程的手段，刪除所述DNA序列的一部分或全部，插入或置換為其它DNA來(lái)進(jìn)行。利用這些變異，例如通過(guò)使密碼子的閱讀框偏移、破壞啟動(dòng)子或外顯子的功能，可以制備本發(fā)明的敲除DNA。作為本發(fā)明的DNA發(fā)生了鈍化的非人哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞(以下也稱為“本發(fā)明的DNA鈍化ES細(xì)胞”或“本發(fā)明的敲除ES細(xì)胞”)的具體例子，例如可以如下獲得將以分離作為目標(biāo)的、非人哺乳動(dòng)物所具有的本發(fā)明的DNA、在其外顯子部分插入以新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因?yàn)榇淼乃幬锟剐曰颉⒒蛞訧acZ ( β -半乳糖苷酶基因)、cat (氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)為代表的報(bào)道基因等來(lái)破壞外顯子的功能、或者在外顯子之間的內(nèi)含子部分插入使基因轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列(例如polyA附加信號(hào)等)以無(wú)法合成完全的mRNA、 從而將基因破壞的方式構(gòu)建的DNA序列的DNA鏈(以下也稱為“目標(biāo)載體”)例如通過(guò)同源重組法導(dǎo)入所述動(dòng)物的染色體中，對(duì)于所得ES細(xì)胞，通過(guò)以本發(fā)明的DNA上或其鄰近的DNA 序列為探針進(jìn)行DNA雜交分析、或以目標(biāo)載體上的DNA序列和在目標(biāo)載體的制備中使用的本發(fā)明的DNA以外鄰近區(qū)域的DNA序列為引物，進(jìn)行PCR法分析，通過(guò)選別本發(fā)明的敲除ES 細(xì)胞來(lái)獲得。另外，通過(guò)同源重組法等使本發(fā)明的DNA鈍化的原來(lái)的ES細(xì)胞可以使用例如上述的已經(jīng)建立的ES細(xì)胞，還可以是按照公知的Evans和Kaufma的方法新建立的。例如，在目前通常使用的小鼠ES細(xì)胞的情況下，由于免疫學(xué)背景尚不清楚，因此，為了取得可替代所述細(xì)胞的純系、免疫學(xué)遺傳背景明確的ES細(xì)胞等，例如利用C57BL/6小鼠或通過(guò)DBA/2雜交而改善了 C57BL/6的采卵數(shù)少的問(wèn)題的BDFl小鼠(C57BL/6與DBA/2的Fl)而建立的細(xì)胞系等也可以良好地使用。BDFl小鼠的采卵數(shù)多，且卵健康，并且具有C57BL/6小鼠的背景，因此，在使用這種BDFl小鼠得到的ES細(xì)胞制作病態(tài)模型小鼠時(shí)，通過(guò)與C57BL/6小鼠回交，可以使其遺傳背景取代為C57BL/6小鼠，在這方面有利于應(yīng)用。另外，在建立ES細(xì)胞的情況下，通常使用受精后第3. 5天的胚泡，除此之外，采集 8細(xì)胞期胚胎并培養(yǎng)至胚泡來(lái)使用可以高效率地獲得大量的初期胚胎。另外，雌雄ES細(xì)胞均可以使用，但通常雄ES細(xì)胞適合制備種系嵌合體。另外，為了減少繁雜的培養(yǎng)勞動(dòng)，優(yōu)選盡早進(jìn)行雌雄判別。作為ES細(xì)胞雌雄的判定方法，作為一個(gè)例子例如可以舉出利用PCR法擴(kuò)增并檢測(cè) Y染色體上的性別決定區(qū)的基因的檢測(cè)方法?，F(xiàn)有的核型分析需要約106個(gè)細(xì)胞，而如果采用上述的方法，用1個(gè)集落左右的ES細(xì)胞數(shù)(約50個(gè))即可完成，因此，可以通過(guò)雌雄判別進(jìn)行培養(yǎng)初期的ES細(xì)胞的初次選擇，可以盡早地選定雄細(xì)胞，由此可以大幅削減培養(yǎng)初期的工作量。另外，第二次選擇例如可以通過(guò)利用G顯帶法的染色體數(shù)的確認(rèn)等來(lái)執(zhí)行。優(yōu)選所得ES細(xì)胞的染色體數(shù)為正常數(shù)的100%，但在建立時(shí)由于物理操作等的關(guān)系困難的情況下，優(yōu)選在敲除了 ES細(xì)胞的基因后在正常細(xì)胞(例如在小鼠的情況下染色體數(shù)為2n = 40 的細(xì)胞)上再次克隆。通常，上述得到的胚胎干細(xì)胞株的增殖性很好，但容易喪失個(gè)體發(fā)生的能力，因此需要小心地進(jìn)行繼代培養(yǎng)。例如，可以通過(guò)以下的方法培養(yǎng)在諸如STO成纖維細(xì)胞這樣的適當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)細(xì)胞上、在LIF(1 10000U/ml)存在下、在二氧化碳?xì)馀囵B(yǎng)器內(nèi)(優(yōu)選5% 二氧化碳?xì)狻?5%空氣或5%氧、5%二氧化碳?xì)狻?0%空氣)、在約37°C下培養(yǎng)等方法進(jìn)行培養(yǎng)；在繼代時(shí)，例如，可以采取通過(guò)胰蛋白酶/EDTA溶液(通常0. 001 0.5%胰蛋白酶 /0. l-5mM EDTA、優(yōu)選約0. 胰蛋白酶/ImM EDTA)處理來(lái)進(jìn)行單細(xì)胞化，在新準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞上接種的方法等。上述繼代通常每1 3天進(jìn)行，此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞觀察，在觀察到形態(tài)異常的細(xì)胞的情況下最好放棄所述培養(yǎng)細(xì)胞。ES細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)臈l件下單層培養(yǎng)至高密度，或者懸浮培養(yǎng)至形成細(xì)胞團(tuán)塊， 由此可以分化成顳頂肌、內(nèi)臟肌、心肌等各種類型的細(xì)胞(M. J. Evans和M. H. Kaufman, Nature.，第四2 卷，54 頁(yè)，1981 年；G. R. Martin.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.第 78 卷， 7634 頁(yè)，1981 年；Τ. C. Doetschman 等諸，夕 Y — f A ·才 7. ·工 > 7.· 'J 才口夕一 · 7 > F ·工夕7">」>>夕義.毛義7才口夕一，第87卷，27頁(yè)，1985年)，使本發(fā)明的ES細(xì)胞分化得到的本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的細(xì)胞在體外本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞生物學(xué)研究中有用。本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物通過(guò)按照公知的方法測(cè)定所述動(dòng)物的 mRNA量，間接地對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行比較，可以與正常動(dòng)物進(jìn)行區(qū)別。作為所述非人哺乳動(dòng)物，可以使用與上述同樣的材料。本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物例如通過(guò)將如上所述制備的目標(biāo)載體導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠卵細(xì)胞中，通過(guò)導(dǎo)入，目標(biāo)載體的本發(fā)明的DNA被鈍化了的DNA 序列通過(guò)基因同源重組而與小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠卵細(xì)胞染色體上的本發(fā)明的DNA交換而發(fā)生同源重組，由此可以敲除本發(fā)明的DNA。敲除了本發(fā)明的DNA的細(xì)胞可以通過(guò)DNA雜交分析和PCR法分析來(lái)進(jìn)行判定，其中，DNA雜交分析是以本發(fā)明的DNA上或其附近的DNA序列作為探針，PCR法分析是以目標(biāo)載體上的DNA序列、和目標(biāo)載體上使用的來(lái)自小鼠的本發(fā)明的DNA以外的附近區(qū)域的DNA 序列作為引物。在使用非人哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的情況下，通過(guò)基因同源重組，克隆本發(fā)明的DNA被鈍化了的細(xì)胞株，將所述細(xì)胞注入適當(dāng)時(shí)期、例如8細(xì)胞期的非人哺乳動(dòng)物胚或胚泡，將制成的嵌合胚胎移植到假孕的所述非人哺乳動(dòng)物的子宮。培育的動(dòng)物是由具有正常的本發(fā)明的DNA座的細(xì)胞和具有人工變異的本發(fā)明的DNA座的細(xì)胞兩者構(gòu)成的嵌合體動(dòng)物。在所述嵌合體動(dòng)物的生殖細(xì)胞的一部分具有變異的本發(fā)明的DNA座的情況下，例如通過(guò)毛色(二一卜力，一)的判定等，可以由上述嵌合體個(gè)體與正常個(gè)體交配得到的個(gè)體群得到所有的組織是由具有實(shí)施了人工變異的本發(fā)明的DNA座的細(xì)胞構(gòu)成的個(gè)體。上述得到的個(gè)體通常是本發(fā)明的蛋白質(zhì)異源表達(dá)不完全的個(gè)體，使本發(fā)明的蛋白質(zhì)的異源表達(dá)不完全的個(gè)體之間進(jìn)行交配，可以由它們的后代獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)的同源表達(dá)不完全的個(gè)體。在使用卵細(xì)胞的情況下，例如通過(guò)微注射法向卵細(xì)胞核內(nèi)注入DNA溶液，可以獲得在染色體內(nèi)導(dǎo)入了目標(biāo)載體的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，與這些轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物相比， 由于基因同源重組而在本發(fā)明的DNA座上具有突變的動(dòng)物可以通過(guò)選擇來(lái)獲得。如上所述，對(duì)于敲除了本發(fā)明的DNA的個(gè)體，可以確認(rèn)通過(guò)交配得到的動(dòng)物個(gè)體的所述DNA也被敲除，并可以在通常的飼養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)繼代。另外，種系的取得和保持可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。即，通過(guò)使保有所述鈍化DNA的雌雄動(dòng)物交配，可以獲得在同源染色體的雙方都具有所述鈍化DNA的純合體動(dòng)物。對(duì)于所得的純合體動(dòng)物，相對(duì)于母本動(dòng)物，通過(guò)以正常個(gè)體為1、純合體為多個(gè)的狀態(tài)進(jìn)行飼養(yǎng)，可以高效率地獲得。通過(guò)雜合體動(dòng)物的雌雄交配，可以使具有所述鈍化DNA的純合體以及雜合體動(dòng)物繁殖繼代。本發(fā)明的DNA被鈍化的非人哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞在培育本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物方面非常有用。另外，本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物是使由本發(fā)明的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的各種生物活性缺失，因此，可以制成以本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性鈍化為原因的疾病模型，因此，可以用于這些疾病原因的探究以及治療方法的研究。(9a)對(duì)于起因于本發(fā)明DNA缺失或損傷等的疾病具有治療/預(yù)防效果的化合物的篩選方法本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物可以用于對(duì)于起因于本發(fā)明的DNA缺失或損傷等的疾病具有治療/預(yù)防效果的化合物的篩選。S卩，本發(fā)明提供一種對(duì)本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物給予試驗(yàn)化合物，并觀察/測(cè)定該動(dòng)物的變化、對(duì)于起因于本發(fā)明的DNA缺失或損傷等的疾病(例如癌癥等)具有治療/預(yù)防效果的化合物或其鹽的篩選方法。作為所述篩選方法中使用的本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物，可以舉出與上述同樣的材料。
作為試驗(yàn)化合物，例如可以舉出肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動(dòng)物組織提取液、血漿等，它們可以是新的化合物，也可以是公知的化合物。具體來(lái)說(shuō)，將本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物用試驗(yàn)化合物進(jìn)行處理， 與未處理的對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行比較，以所述動(dòng)物的各器官、組織、疾病的癥狀等的變化為指標(biāo)， 可以對(duì)試驗(yàn)化合物的治療/預(yù)防效果進(jìn)行試驗(yàn)。作為利用試驗(yàn)化合物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處理的方法，例如可以采用口服給予、靜脈注射等，結(jié)合試驗(yàn)動(dòng)物的癥狀、試驗(yàn)化合物的性質(zhì)等適當(dāng)?shù)剡x擇。另外，試驗(yàn)化合物的給予量可以結(jié)合給予方法、試驗(yàn)化合物的性質(zhì)等適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，在篩選對(duì)于癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤等)具有治療/預(yù)防效果的化合物的情況下，對(duì)本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物給予試驗(yàn)化合物，在上述組織中，隨著時(shí)間的推移而觀察與試驗(yàn)化合物非給予組的癌癥發(fā)病程度的不同或癌癥治愈程度的不同。在所述篩選方法中，在對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物給予試驗(yàn)化合物的情況下，如果所述試驗(yàn)動(dòng)物的上述疾病癥狀改善了約10%或更高、優(yōu)選約30%或更高、更優(yōu)選約50%或更高，則可以選擇所述試驗(yàn)化合物作為對(duì)上述疾病具有治療/預(yù)防效果的化合物。采用所述篩選方法得到的化合物是選自上述試驗(yàn)化合物的化合物，對(duì)于由于本發(fā)明蛋白質(zhì)的缺失或損傷等引起的疾病具有治療/預(yù)防效果，因此，可以作為對(duì)所述疾病較為安全、低毒性的預(yù)防/治療藥等的藥物使用。另外，由上述篩選得到的化合物所衍生的化合物也同樣可以使用。所述篩選方法所得的化合物可以形成鹽，所述化合物的鹽可以使用與生理學(xué)可接受的酸(例如無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸等)或堿(例如堿金屬等)等形成的鹽，尤其優(yōu)選生理學(xué)可接受的酸加成鹽。上述鹽例如可以使用與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸等)形成的鹽、或與有機(jī)酸(例如乙酸、蟻酸、丙酸、富馬酸、馬來(lái)酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、 草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等)形成的鹽等。含有由所述篩選方法得到的化合物或其鹽的藥物可以與上述的含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)的藥物同樣地制造。上述得到的制劑安全、毒性低，因此可以給予例如人或哺乳動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)。所述化合物或其鹽的給予量根據(jù)對(duì)象疾病、給予對(duì)象、給予途徑等而有差異，例如，在口服給予所述化合物的情況下，通常對(duì)成人(體重按照60kg計(jì)算)乳腺癌患者，每天給予約0. 1 約lOOmg、優(yōu)選約1. O 約50mg、更優(yōu)選約1. O 約20mg的所述化合物。在非口服給予的情況下，所述化合物的1次給予量根據(jù)給予對(duì)象、對(duì)象疾病等而不同，例如， 將所述化合物以注射劑的形式給予通常的成人(體重按照60kg計(jì)算)乳腺癌患者時(shí)，優(yōu)選每天通過(guò)靜脈注射給予約0. 01 約30mg、優(yōu)選約0. 1 約20mg、更優(yōu)選約0. 1 約IOmg 的所述化合物。在其它動(dòng)物的情況下，可以給予按體重60kg換算的量。(9b)促進(jìn)或抑制本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子活性的化合物的篩選方法本發(fā)明可以提供一種對(duì)本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物給予試驗(yàn)化合物并檢測(cè)報(bào)道基因的、表達(dá)促進(jìn)或抑制本發(fā)明的DNA啟動(dòng)子活性的化合物或其鹽的篩選方法。在述篩選方法中，作為本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物，可以使用在上述的本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物中、本發(fā)明的DNA通過(guò)導(dǎo)入報(bào)道基因進(jìn)行鈍化、所述報(bào)道基因可以在本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的材料。作為試驗(yàn)化合物，可以舉出與上述同樣的化合物。作為報(bào)道基因，可以使用與上述同樣的報(bào)道基因，優(yōu)選半乳糖苷酶基因 (IacZ)、可溶性堿性磷酸酶基因或熒光素酶基因等。在將本發(fā)明的DNA用報(bào)道基因置換了的本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物中，報(bào)道基因在本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子支配下存在，因此，通過(guò)追蹤報(bào)道基因所編碼的物質(zhì)的表達(dá)，可以檢測(cè)啟動(dòng)子的活性。例如，在將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域的一部分用來(lái)自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(IacZ)置換的情況下，在原本表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的組織中，半乳糖苷酶代替本發(fā)明的蛋白質(zhì)而表達(dá)。因此，例如，使用諸如5-溴-4-氯-3-昭丨哚基- β -吡喃半乳糖苷(X-gal)這樣的以半乳糖苷酶為底物的試劑進(jìn)行染色，由此可以簡(jiǎn)便地觀察本發(fā)明的蛋白質(zhì)在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的表達(dá)狀態(tài)。具體來(lái)說(shuō)，可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)缺失的小鼠或其組織切片用戊二醛等固定，用磷酸緩沖生理鹽液(PBQ洗滌，然后用含有X-gal的染色液、在室溫或37°C附近反應(yīng)約30分鐘至1小時(shí)，然后將組織標(biāo)本用ImM EDTA/PBS溶液洗滌，使 β-半乳糖苷酶反應(yīng)停止，觀察呈色。另外，還可以按照常規(guī)方法，檢測(cè)編碼IacZ的mRNA。采用上述篩選方法得到的化合物或其鹽是選自上述的試驗(yàn)化合物的化合物，是促進(jìn)或抑制本發(fā)明的DNA啟動(dòng)子活性的化合物。由所述篩選方法得到的化合物可以形成鹽，所述化合物的鹽可以使用與生理學(xué)可接受的酸(例如無(wú)機(jī)酸等)或堿基(例如堿金屬等)等形成的鹽，尤其優(yōu)選生理學(xué)可接受的酸加成鹽。上述鹽例如可以使用與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸等)形成的鹽、或與有機(jī)酸(例如乙酸、蟻酸、丙酸、富馬酸、馬來(lái)酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸、 苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等)形成的鹽等。抑制本發(fā)明的DNA啟動(dòng)子活性的化合物或其鹽可以抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)， 或抑制所述蛋白質(zhì)的功能，因此，可以用作例如癌癥(例如大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、 胰腺癌、腦腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤(特別是AML)等)的預(yù)防/治療藥物。另外，由上述篩選得到的化合物所衍生的化合物也可以同樣地使用。含有由所述篩選方法得到的化合物或其鹽的藥物可以與含有上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其鹽的藥物同樣地制造。上述得到的制劑安全、毒性低，因此可以給予例如人或哺乳動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)。所述化合物或其鹽的給予量根據(jù)對(duì)象疾病、給予對(duì)象、給予途徑等而有差異，例如，在口服給予抑制本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子活性的該化合物的情況下，通常對(duì)于成人(體重按照60kg計(jì)算)乳腺癌患者，每天給予約0. 1 約lOOmg、優(yōu)選約1. O 約50mg、更優(yōu)選約 1. O 約20mg的所述化合物。在非口服給予的情況下，所述化合物的1次給予量根據(jù)給予對(duì)象、對(duì)象疾病等而不同，例如，將抑制本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子活性的所述化合物以注射劑的形式給予通常的成人(體重按照60kg計(jì)算)乳腺癌患者時(shí)，優(yōu)選每天通過(guò)靜脈注射給予約0. 01 約30mg、優(yōu)選約0. 1 約20mg、更優(yōu)選約0. 1 約IOmg的所述化合物。在其它動(dòng)物的情況下，可以給予按體重60kg換算的量。這樣，本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的非人哺乳動(dòng)物在篩選促進(jìn)或抑制本發(fā)明的DNA 的啟動(dòng)子活性的化合物或其鹽上極為有用，對(duì)于起因于本發(fā)明的DNA表達(dá)不完全的各種疾病的原因探究或預(yù)防/治療藥物的開(kāi)發(fā)有很大貢獻(xiàn)。如果使用含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)啟動(dòng)子區(qū)域的DNA，在其下游連接編碼各種蛋白質(zhì)的基因，并將其注入動(dòng)物的卵細(xì)胞中而制成所謂的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(基因移植動(dòng)物)，則可以特異性地合成所述蛋白質(zhì)，研究在所述生物體中的作用。另外，如果將適當(dāng)?shù)膱?bào)道基因與上述啟動(dòng)子部分連接，建立表達(dá)所述基因的細(xì)胞株，則可以作為具有特異性地促進(jìn)或抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)本身在體內(nèi)的生產(chǎn)能力的作用的低分子化合物研究系統(tǒng)來(lái)使用。在本說(shuō)明書(shū)中，在以簡(jiǎn)略符號(hào)表示堿基或氨基酸等的情況下，是基于IUPAC-IUB 生物化學(xué)命名委員會(huì)制定的簡(jiǎn)略符號(hào)或本領(lǐng)域的常用簡(jiǎn)略符號(hào)。在氨基酸具有光學(xué)異構(gòu)體的情況下，如無(wú)特別明示，表示L體。本說(shuō)明書(shū)的序列表的序列號(hào)表示以下的序列。[序列號(hào)1]表示編碼EVI1的DNA (⑶S)的堿基序列。[序列號(hào)2]表示編碼EVI1的氨基酸序列。[序列號(hào)3]表示編碼ITGA6的DNA (⑶S)的堿基序列。[序列號(hào)4]表示編碼ITGA6的氨基酸序列。[序列號(hào)5]表示編碼ITGB4的DNA(CDS)的堿基序列。[序列號(hào)6]表示編碼ITGB4的氨基酸序列。[序列號(hào)7]表示與序列號(hào)8 —起形成shEVIl的RNA序列。[序列號(hào)8]表示與序列號(hào)7 —起形成shEVI 1的RNA序列。[序列號(hào)9]表示人EVIl基因擴(kuò)增中使用的正向引物的堿基序列。[序列號(hào)10]表示人EVIl基因擴(kuò)增中使用的反轉(zhuǎn)引物的堿基序列。[序列號(hào)11]表示人β-肌動(dòng)蛋白基因擴(kuò)增中使用的正向引物的堿基序列。[序列號(hào)I2]
表示人肌動(dòng)蛋白基因擴(kuò)增中使用的反轉(zhuǎn)引物的堿基序列。[序列號(hào)I3]表示與序列號(hào)14 一起形成shEVIl的RNA序列。[序列號(hào)14]表示與序列號(hào)13 —起形成shEVIl的RNA序列。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例和參考例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不受其限定。在以下的例子中使用的細(xì)胞株中，U937、Κ562、ΗΝΤ34、HL60、293T、MC3T3購(gòu)自獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所的細(xì)胞庫(kù)。另外，MOLMl購(gòu)自株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所。另外，AMLl由加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校(UCSD)提供。其中，關(guān)于冊(cè)37、1(562、!1附34、160、 M0LM1、AML1，在添加了 10%胎牛血清(FCS)(日冷株式會(huì)社制造)的RPMI1640 (189-02025， 和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制造)進(jìn)行了培養(yǎng)。關(guān)于MC3T3，在添加了 10%胎牛血清(FCS)(日冷株式會(huì)社制造)的aMEM(12561，hvitrogen公司制造)中進(jìn)行了培養(yǎng)。關(guān)于^3T，在 DMEM/10% FCS中進(jìn)行了培養(yǎng)。實(shí)施例1-1 因EVIl基因的shRNA導(dǎo)入導(dǎo)致的AMLl細(xì)胞株中的整聯(lián)基因的表達(dá)抑制(抑制EVIl表達(dá)的AMLl細(xì)胞的建立)通過(guò)對(duì)來(lái)自人急性骨髓性白血病(AML)的AMLl細(xì)胞株轉(zhuǎn)染shEVIl，建立抑制 EVIl表達(dá)的AMLl細(xì)胞株(以下也稱為‘11^1(81^￥11)”)，其中，shEVIl是具有切斷EVIl 基因的mRNA的活性的短發(fā)夾RNA(shRNA)。具體來(lái)說(shuō)，首先，在RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-hGreen (Clontech 公司制造)的 PSIREN-RetroQ-ZsGreen 載體的 BamHl-EcoRl 位點(diǎn)插入 shEVIl (有義鏈GAUCUCUCUAAGGC UGAACUAGCA⑶CAAGAGACUGCUAGUUCAGCCUUAGAUUUUUUG(序列號(hào) 7)、反義鏈AAUUCAAMAAUCUA AGGCUGAACUAGCAGUCUCUUGAACUGCUAGUUCAGCCUUAGAGA (序列號(hào)幻，Oncogene, 2006 Jun 15; 25(25) :3565-75中公開(kāi))，制備shEVIl反轉(zhuǎn)錄病毒載體。接著，使用Hylimax脂質(zhì)體試劑 (同仁科學(xué)研究所制造)，向細(xì)胞株導(dǎo)入10 μ g的所述shEVIl反轉(zhuǎn)錄病毒載體、以及 IOyg的plOAl包裝載體(Clontech公司制造)，制成含有shEVIl的反轉(zhuǎn)錄病毒。使所得的反轉(zhuǎn)錄病毒感染IO5個(gè)AMLl細(xì)胞，建立AMLl (shEVIl)。另外，作為對(duì)照細(xì)胞，建立按照同樣地方法轉(zhuǎn)染的、附屬于RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen(Clontech公司制造)的對(duì)照載體(shLuc)(以下也稱為"AML1 (shLuc)，，)。(抑制整聯(lián)表達(dá)的確認(rèn))通過(guò)離心，分別回收將上述建立的AMLl (shEVIl)和AMLl (shLuc)的細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)所得的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，然后添加ImL的TRIZOL(注冊(cè)商標(biāo))anvitrogen公司制造)。 接著，添加500 μ L氯仿，以15000rpm離心15分鐘，然后將上層轉(zhuǎn)移至另外的試管中，添加500 μ L的2-丙醇，以15000rpm離心10分鐘，并使用80%的乙醇洗滌。將所得的RNA 溶解于不含RNase的水中，用分光光度計(jì)、以波長(zhǎng)260nm測(cè)定RNA量，然后使用反轉(zhuǎn)錄酶 (superscripts (Invitrogen 公司制造))，將 1 μ g 的所述 RNA 變換為 cDNA。以所得的各個(gè)cDNA作為模板，將其通過(guò)PCR法擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)基因的表達(dá)量。具體來(lái)說(shuō)，使用TaKaRa Extaq(寶生物工程公司制造)作為聚合酶，PCR裝置使用PCR Thermal Cycler DICE (寶生物工程公司制造)。另外，在利用PCR的擴(kuò)增前，通過(guò) β-肌動(dòng)蛋白對(duì)各個(gè)cDNA進(jìn)行補(bǔ)正。在PCR時(shí)使用的引物的堿基序列如下所示(AEVIl)正向CGAAAGCGAGAATGATCTCC(序列號(hào) 9)反轉(zhuǎn)GGAAGACGTAGTGCTGAACA(序列號(hào)10)(人β-肌動(dòng)蛋白)正向AAGAGATGGCCACGGCTGCT(序列號(hào) 11)反轉(zhuǎn)TCCTTCTGCATCCTGTCGGC(序列號(hào) 12)(整聯(lián)家族)Journal of Biomedical Science Q005) 12 :803-813 中公開(kāi)的材料。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖1所示。如圖1所示，在AMLl (shEVIl)中，與 AMLl(shLuc)相比，EVIl基因的表達(dá)受到抑制。這可以認(rèn)為是由于shEVIl的添加導(dǎo)致RNA 干擾(RNAi)的作用所致。另外，如圖1所示，在AMLl (shEVIl)中，與AMLl (shLuc)比較，含有ITGA6基因和ITGB4基因的各種整聯(lián)家族的基因表達(dá)受到抑制。進(jìn)一步可知，鈣粘著蛋白家族的1種——VE鈣粘著蛋白基因的表達(dá)也受到抑制。這可能是由于EVIl基因的表達(dá)受到抑制所導(dǎo)致。另外，將既未給予shLuc也未給予shEVIl的AMLl細(xì)胞作為對(duì)照加入，對(duì)于AMLl (shEVIl)，進(jìn)行一式三份的試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。如圖2所示，與上述同樣， AMLl (shEVIl)中可見(jiàn)EVIl基因的表達(dá)抑制，和與其相伴的各種整聯(lián)家族和VE鈣粘著蛋白的基因表達(dá)的抑制。實(shí)施例1-2 由EVIl基因的shRNA給予而導(dǎo)致的AMLl細(xì)胞株的細(xì)胞粘附能力的降低對(duì)于上述建立的AMLl (shEVIl)(三份)和AMLl (shLuc)，評(píng)價(jià)其細(xì)胞粘附能力。具體來(lái)說(shuō)，分別向96孔板的各孔中加入100μ L用RPMI1640/10% FCS稀釋為40 倍的生長(zhǎng)因子降低基質(zhì)膠(BD Biosciences公司制造)，在4°C下孵育6小時(shí)，然后用PBS 洗滌2次。分別向各孔中加入10000個(gè)/100 μ L上述的細(xì)胞。在37°C下孵育2小時(shí)，然后用PBS洗滌3次。然后，向各孔中分別加入90μ L的RPMI1640/10% FCSUOyL的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8 (同仁科學(xué)研究所制造)，在37°C下孵育30分鐘，然后使用分光光度計(jì)，以波長(zhǎng) 450nm進(jìn)行測(cè)定。圖3是表示上述細(xì)胞粘附測(cè)定結(jié)果的圖。如圖3所示可知，AMLl (shEVIl)的細(xì)胞粘附能力(粘附細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比)比AMLl (shLuc)下降約31 60%。由此，本發(fā)明者建立了 EVIl基因或其所編碼的蛋白質(zhì)、各種整聯(lián)家族的基因或它們所編碼的蛋白質(zhì)可能參與了急性骨髓性白血病細(xì)胞的細(xì)胞粘附能力的發(fā)揮的假說(shuō)。參考例1 各種細(xì)胞間的整聯(lián)蛋白家族基因表達(dá)的比較準(zhǔn)備將來(lái)自人的HL60細(xì)胞株、來(lái)自人的U937細(xì)胞株、以及來(lái)自人的K562細(xì)胞株穩(wěn)定培養(yǎng)所得的細(xì)胞株，作為不表達(dá)EVIl基因的細(xì)胞株。另一方面，準(zhǔn)備將來(lái)自人急性骨髓性白血病的AMLl細(xì)胞株(如上所述)、來(lái)自人的M0LM1細(xì)胞株、以及來(lái)自人的HNT34細(xì)胞株穩(wěn)定培養(yǎng)所得的細(xì)胞株，作為表達(dá)EVIl基因的細(xì)胞株。對(duì)于這些細(xì)胞株，按照與上述實(shí)施例1-1同樣的方法，確認(rèn)EVIl基因和各種整聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖4所示。如圖4所示可知，在EVIl陽(yáng)性的細(xì)胞株 (AMLUM0LM1和HNT34)中，ITGA6基因和ITGB4基因特異性地表達(dá)?；谏鲜鼋Y(jié)果，本發(fā)明人提出了這樣的假說(shuō)除EVIl基因之外，整聯(lián)蛋白家族的特別是ITGA6基因和ITGB4基因以及它們所編碼的蛋白質(zhì)可能參與了急性骨髓性白血病的細(xì)胞粘附能力的表達(dá)。實(shí)施例2-1 因shEVIl導(dǎo)入導(dǎo)致的HNT34細(xì)胞株中的整聯(lián)蛋白基因的表達(dá)抑制使用基因?qū)胂到y(tǒng)Nucleofector (Amaxa Biosystems公司制造)，對(duì)來(lái)自人的 HNT34細(xì)胞株導(dǎo)入在上述實(shí)施例1-1中使用的shEVI 1，建立抑制EVIl表達(dá)的HNT34細(xì)胞株 (以下也稱為“HNT34(shEVIl) ”)。同樣地，作為對(duì)照細(xì)胞，建立導(dǎo)入shLuc的細(xì)胞株(以下也稱為“HNT34(shLuc) ”)。對(duì)于這些細(xì)胞株，按照與上述實(shí)施例1同樣的方法，確認(rèn)EVIl 基因和各種整聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，通過(guò)NucIeofector向HNT34細(xì)胞株導(dǎo)入shEVI 1，與上述實(shí)施例1-1或?qū)嵤├?-2同樣地，可以確認(rèn)EVIl基因或各種整聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)受到抑制。實(shí)施例2-2 因EVIl基因的shRNA給予導(dǎo)致HNT34細(xì)胞株的細(xì)胞粘附能力的降低對(duì)于上述建立的HNT34 (shEVIl)和HNT34 (shLuc)，按照與上述實(shí)施例1_2同樣的方法評(píng)價(jià)其細(xì)胞粘附能力。圖6是表示上述細(xì)胞粘附測(cè)定結(jié)果的圖。如圖6所示可知，HNT34(shEVIl)的細(xì)胞粘附能力(粘附細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比)相對(duì)于HNT34(ShLuc)降低約76%。如上所述， 在HNT34細(xì)胞株中得到了與上述實(shí)施例1-2同樣的結(jié)果。參考例2 因EVI1基因的shRNA給予導(dǎo)致的對(duì)HNT34細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力的影響對(duì)于上述建立的HNT34(shEVIl)和HNT34(shLuc)評(píng)價(jià)了其細(xì)胞增殖能力。具體來(lái)說(shuō)，分別向96孔板的各孔中加入1000個(gè)/100 μ L用RPMI1640/10% FCS稀釋了的細(xì)胞。在37°C下孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，然后分別加入10 μ L的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(同仁科學(xué)研究所制造)，在37°C下孵育30分鐘，然后用分光光度計(jì)、以波長(zhǎng)450nm進(jìn)行測(cè)定。圖7是表示上述的細(xì)胞增殖測(cè)定結(jié)果的圖。如圖7所示，在對(duì)照細(xì)胞株 HNT34(shLuc)和抑制EVIl表達(dá)的細(xì)胞株HNT34(shEVIl)之間，細(xì)胞增殖能力未見(jiàn)顯著差異。由此可以認(rèn)為EVIl基因未參與細(xì)胞的增殖。實(shí)施例3-1 因ITGB4基因的shRNA給予所導(dǎo)致的AMLl細(xì)胞株的細(xì)胞粘附能力的降低按照與上述實(shí)施例2-1同樣的方法，通過(guò)對(duì)AMLl細(xì)胞株轉(zhuǎn)染具有切斷ITGB4基因的mRNA的活性的shRNA(以下也稱為“shITGB4”)，建立抑制ITGB4表達(dá)的AMLl細(xì)胞株(以下也稱為“AML1 (shITGB4) ”)。所用的shITGB4的堿基序列如下所示。有義鏈GAUCUCCGAGUUGC⑶GGGGUGUGUCUUCAAGAGAGACACACUCCGUGCAGCUCUUUUUG( 序列號(hào)1 反義鏈AAUUCAAAAAGAGCUGCACGGAGUGUGUCUCUCUUGAAGACACACCCCACGCAACUCGGA( 序列號(hào)14)對(duì)照細(xì)胞使用在上述實(shí)施例1-1中建立的AMLl (shLuc)。
對(duì)于上述建立的AMLl (shITGB4)和AMLl (shLuc)，按照與上述實(shí)施例1_2同樣的方法評(píng)價(jià)其細(xì)胞粘附能力。圖8是表示上述的細(xì)胞粘附測(cè)定結(jié)果的圖。如圖8所示可知，AMLl (shITGB4)的細(xì)胞粘附能力(粘附細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比)相對(duì)于AMLl (shLuc)降低至幾乎為零。由上述結(jié)果證實(shí)了 ITGB4基因參與了急性骨髓性白血病細(xì)胞中的細(xì)胞粘附能力的發(fā)揮的假說(shuō)。按照與上述實(shí)施例1-1同樣的方法確認(rèn)AMLl (shITGB4)中的ITGB4基因的表達(dá)。 結(jié)果，如圖9的PCR-瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果所示，在AMLl (shITGB4)中，與AMLl (shLuc)相比， ITGB4基因的表達(dá)受到了抑制。實(shí)施例3-2 因β4整聯(lián)蛋白中和抗體所導(dǎo)致的AMLl細(xì)胞株的細(xì)胞粘附能力的降低對(duì)來(lái)自人的AMLl細(xì)胞株給予β 4整聯(lián)蛋白中和抗體，評(píng)價(jià)對(duì)所述細(xì)胞株的細(xì)胞粘附能力的影響。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)10000個(gè)/100 μ L細(xì)胞加入β 4整聯(lián)蛋白克隆ASC3抗體(默克密理博公司制造，ΜΑΒ2058)作為中和抗體，使終濃度為20μ g/mL，在4°C下孵育30分鐘，然后用 RPMI1640/10% FCS洗滌。接著，用100 μ L的RPMI1640/10% FCS使其懸浮，加入到涂敷有 Matrigel (注冊(cè)商標(biāo))的96孔板的孔中，在37°C下孵育2小時(shí)，然后用PBS洗滌3次。分別加入90μ L的RPMI1640/10% FCSUOyL的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8 (同仁科學(xué)研究所制造)，在 37°C下孵育30分鐘，然后使用分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定。對(duì)照是使用給予抗FLAG M2抗體或抗β 1整聯(lián)蛋白抗體、以此代替日4整聯(lián)蛋白克隆六503抗體的細(xì)胞株。圖10是表示上述的細(xì)胞粘附測(cè)定結(jié)果的圖。如圖10所示，AMLl細(xì)胞的細(xì)胞粘附能力(粘附細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比)相對(duì)于抗FLAG M2給予組和抗β 1整聯(lián)蛋白抗體給予組分別降低約90%和約94%。由上述結(jié)果證實(shí)了這樣的假說(shuō)ITGB4蛋白質(zhì)參與了急性骨髓性白血病細(xì)胞的細(xì)胞粘附能力的發(fā)揮。參考例3-1 因EVIl基因的導(dǎo)入所導(dǎo)致的U937細(xì)胞株中的整聯(lián)蛋白基因表達(dá)的
、-、rt-
幾進(jìn) 向不表達(dá)EVI1基因的U937細(xì)胞株中導(dǎo)入EVI1基因，研究各種整聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)是否增加。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)將EVIl基因?qū)險(xiǎn)937細(xì)胞，建立表達(dá)EVIl基因的U937細(xì)胞(以下也稱為“冊(cè)37伍￥11)”)，研究所述冊(cè)37伍￥11)中的各種整聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)。對(duì)照使用導(dǎo)入了 GFP基因的U937細(xì)胞(以下也稱為“U937 (GFP) ”)。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖11所示。如圖11所示可知，通過(guò)向EVIl陰性的U937 細(xì)胞株導(dǎo)入EVIl基因，ITGA6基因、ITGB3基因、和ITGB4基因的表達(dá)亢進(jìn)。參考例3-2 因EVIl基因的導(dǎo)入而導(dǎo)致的U937細(xì)胞株的細(xì)胞粘附能能力的提高對(duì)于U937細(xì)胞株、以及上述建立的對(duì)照U937(GFP)以及導(dǎo)入EVIl的細(xì)胞株 U937 (FLAG-EVI1)，按照與上述實(shí)施例2_1同樣的方法，評(píng)價(jià)EVIl基因的導(dǎo)入對(duì)細(xì)胞粘附能力的影響。圖12是表示上述的細(xì)胞粘附測(cè)定結(jié)果的圖。如圖12所示可知，U937(FLAG_EVI1) 的細(xì)胞粘附能力(粘附細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比)相對(duì)于U937細(xì)胞株和U937 (GFP)分別提高至約2. 3倍和約3. 0倍。由此顯示，EVIl基因的表達(dá)經(jīng)由整聯(lián)蛋白的表達(dá)，參與了細(xì)胞粘附能力的提高。參考例3-3 因EVIl基因的導(dǎo)入造成的對(duì)U937細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力的影響對(duì)于U937細(xì)胞株、以及上述建立的對(duì)照U937(GFP)和導(dǎo)入了 EVIl的細(xì)胞株 U937 (FLAG-EVI1)，按照與上述參考例2同樣的方法，評(píng)價(jià)EVIl基因的導(dǎo)入對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。圖13是表示上述細(xì)胞增殖測(cè)定結(jié)果的圖。如圖13所示，在作為對(duì)照細(xì)胞株U937 細(xì)胞株以及U937 (GFP)與EVIl表達(dá)亢進(jìn)細(xì)胞株U937(FLAG-EVI1)之間，細(xì)胞增殖能力未見(jiàn)顯著差異。由此可以認(rèn)為，EVIl基因未參與細(xì)胞的增殖的可能性高。參考例4-1 各種細(xì)胞株的EVIl基因以及ITGA6基因和ITGB4基因表達(dá)的相關(guān)性準(zhǔn)備U937、K562、KG1、HEL、HL-60、K052、THP-1、FKH-1、K051、NH、以及 0IH-1 作為完全或幾乎不表達(dá)EVI1基因的細(xì)胞株。另一方面，準(zhǔn)備AML-I、HNT-;34、Kasumi 3和M0LM-1EVI1 基因作為高度表達(dá)EVIl基因的細(xì)胞株。對(duì)于上述準(zhǔn)備的各種細(xì)胞株，確認(rèn)了 EVIl基因和各整聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖14所示。如圖14所示，在高度表達(dá)EVIl基因的細(xì)胞株(AMLl、HNT34、kasumi3、M0LMl)中，可見(jiàn)ITGA6基因和ITGB4基因雙方的表達(dá)，顯示它們之間存在相關(guān)性。參考例4-2 臨床檢體的EVIl基因以及ITGA6基因和ITGB4基因表達(dá)的相關(guān)性準(zhǔn)備3個(gè)檢樣的不表達(dá)EVIl基因的急性骨髓性白血病(AML)細(xì)胞、4個(gè)檢樣的作為高度表達(dá)EVIl基因的AML的一種的t (3 ；7)的AML細(xì)胞、以及3個(gè)檢樣的作為同樣地高度表達(dá)EVI1基因的AML的一種的3q21 q26綜合征的AML細(xì)胞，作為臨床檢體。另外，一并地準(zhǔn)備了不表達(dá)EVIl基因的骨髓(BM)細(xì)胞、以及高度表達(dá)EVIl基因的CD34陽(yáng)性細(xì)胞作為細(xì)胞株對(duì)照。對(duì)于上述準(zhǔn)備的檢樣和細(xì)胞株對(duì)照，確認(rèn)了 EVIl基因和各整聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖15所示。如圖15所示，在高度表達(dá)EVIl基因的臨床檢體檢樣中，可以發(fā)現(xiàn)ITGA6基因和ITGB4基因雙方的表達(dá)的傾向，顯示它們之間存在相關(guān)性。參考例4-3 使用DNA微陣列的各種細(xì)胞株的ITGA6基因和ITGB4基因表達(dá)的確認(rèn)(圖16)準(zhǔn)備了HEL、HL60、K052、THP-I、FKH-I、K051、NH、0IH-1 作為不表達(dá) EVIl 基因的細(xì)胞株。另一方面，準(zhǔn)備了 AML1、HNT34、MOLMU Kasumi3作為高度表達(dá)EVIl基因的細(xì)胞株。 對(duì)于這些細(xì)胞株，按照昂飛公司(Affymetrix)制造的基因芯片(Gene-chip)手冊(cè)，通過(guò)DNA 微陣列檢測(cè)ITGA6基因和ITGB4基因的表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，首先由各個(gè)細(xì)胞制成cDNA，通過(guò)One-cycle目標(biāo)標(biāo)記試劑盒(昂飛公司制造)進(jìn)行生物素標(biāo)記的cRNA的合成。接著，將制成的30 μ L的cRNA(15 μ g)在94°C下反應(yīng)35分鐘而片段化，并添加到雜交溶液(300yL)中。然后進(jìn)行99°C下5分鐘、和45°C 下5分鐘的反應(yīng)，離心，將上清與人基因組基因芯片(U133A)雜交。在洗滌后，通過(guò)基因芯片掃描儀(gene-chip scanner)(昂飛公司制造)進(jìn)行掃描，進(jìn)行數(shù)據(jù)的數(shù)值化。另外，在進(jìn)行數(shù)據(jù)的數(shù)值化時(shí)，使用β肌動(dòng)蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行補(bǔ)正。
上述的DNA微陣列的結(jié)果如圖16所示。如圖16所示可以確認(rèn)，在表達(dá)EVIl基因的細(xì)胞群中，ITGA6基因和ITGB4基因高表達(dá)，顯示出它們之間存在相關(guān)性。參考例4-4 使用DNA微陣列的臨床檢體的ITGA6基因和ITGB4基因表達(dá)的確認(rèn) (圖 17)準(zhǔn)備了 10個(gè)檢樣的不表達(dá)EVIl基因的急性骨髓性白血病(AML)細(xì)胞、12個(gè)檢樣的高度表達(dá)EVIl基因的AML細(xì)胞，作為臨床檢體。對(duì)于上述準(zhǔn)備的檢樣和細(xì)胞株對(duì)照，按照與上述參考例4-3同樣的方法，通過(guò)DNA 微陣列確認(rèn)ITGA6基因和ITGB4基因的表達(dá)。上述DNA微陣列的結(jié)果如圖17所示。如圖17所示，在高表達(dá)EVIl基因的臨床檢體中，檢測(cè)出ITGA6基因和ITGB4基因的表達(dá)亢進(jìn)，顯示它們之間存在相關(guān)性。參考例5 =AMLl細(xì)胞株的細(xì)胞粘附與藥物(VP16、Ara-C)抗性研究了成骨細(xì)胞的存在對(duì)于來(lái)自人急性骨髓性白血病(AML)的AMLl細(xì)胞株的藥物抗性的影響。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)生成水溶性甲臜的WST法，對(duì)于培養(yǎng)基中存在和不存在成骨細(xì)胞的情形，評(píng)價(jià)在作為依托泊苷系抗癌藥的一種的VP16 (5 μ M)的存在下的AMLl細(xì)胞株的存活能力。另外，如果在培養(yǎng)基中存在成骨細(xì)胞，則AMLl細(xì)胞株經(jīng)由成骨細(xì)胞固定在培養(yǎng)皿上。另一方面，如果在培養(yǎng)基中不存在成骨細(xì)胞，則AMLl細(xì)胞株以懸浮狀態(tài)增殖而不固定在培養(yǎng)皿上。圖18是表示上述WST法的藥物抗性測(cè)定結(jié)果的圖。如圖18所示，在VP16存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，如果培養(yǎng)基中存在成骨細(xì)胞，與不存在時(shí)相比較，可知AMLl細(xì)胞株的存活率顯著提高。換言之，顯示AMLl細(xì)胞株在獲得對(duì)VP16的藥物抗性時(shí)，成骨細(xì)胞的存在(即， 細(xì)胞粘附)是必要的。研究使用作為分化誘導(dǎo)型抗癌藥的一種的Ara-C來(lái)代替VP16作為抗癌藥物的情況下，成骨細(xì)胞的存在對(duì)AMLl細(xì)胞株的藥物抗性的影響。具體來(lái)說(shuō)，使用Ara-C(l μ g/mL) 代替VP16作為抗癌藥物，除此之外，按照與上述同樣的方法，進(jìn)行WST法的藥物抗性測(cè)定。圖19是表示上述WST法的藥物抗性測(cè)定結(jié)果的圖。如圖19所示，即使在Ara-C 存在下進(jìn)行培養(yǎng)，如果培養(yǎng)基中存在成骨細(xì)胞，則與不存在時(shí)的情形相比較，可知AMLl細(xì)胞株的存活率顯著提高。換言之，顯示AMLl細(xì)胞株在獲得對(duì)Ara-C的藥物抗性時(shí)，成骨細(xì)胞的存在(即，細(xì)胞粘附)是必要的。實(shí)施例4 因ShEVIl的RNA干擾作用而導(dǎo)致的成骨細(xì)胞介質(zhì)性藥物抗性的消失在上述的參考例5 (在Ara-C存在下)中，分別使用上述建立的AMLl (shEVIl)細(xì)胞和AMLl (shLuc)細(xì)胞代替AMLl細(xì)胞株，按照同樣的方法進(jìn)行WST法的藥物抗性測(cè)定。圖20表示上述WST法的藥物抗性測(cè)定結(jié)果的圖。圖20(a)是表示培養(yǎng) AMLl(shLuc)的結(jié)果的圖，圖20(b)是表示培養(yǎng)AMLl (shEVIl)的結(jié)果的圖。根據(jù)圖20(a)、 (b)所示的結(jié)果可知，在AMLl (shLuc)中，與參考例5同樣地，由于成骨細(xì)胞的存在，可以獲得對(duì)Ara-C的藥物抗性(圖20(a))，而與此相對(duì)地，在AMLl (shEVIl)中，所述藥物抗性消失。這可以認(rèn)為是由于在AMLl (shEVIl)中，被視為白血病的病因基因的EVIl基因的表達(dá)由于shEVIl的RNA干擾作用而受到抑制，結(jié)果，經(jīng)由成骨細(xì)胞的細(xì)胞粘附受到抑制。上述結(jié)果顯示，如本實(shí)施例那樣的、含有與EVIl基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的反義多核苷酸發(fā)揮細(xì)胞粘附抑制劑的作用，在降低癌細(xì)胞的藥物抗性方面是有用的。參考例6 =AML患者的整聯(lián)蛋白基因的表達(dá)從美國(guó)國(guó)家生物工程信息中心(NCBI)的基因表達(dá)庫(kù)(GEO)收集了 55例人AML患者骨髓細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)分為AML治愈組(30例)和AML復(fù)發(fā)組(25例)， 并通過(guò)不對(duì)應(yīng)的t檢驗(yàn)，在各組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)ITGA6基因和ITGB4基因的表達(dá)量是否有
顯著差異。圖21是收集的表達(dá)量數(shù)據(jù)的圖。圖21 (a)表示ITGA6基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，圖21 (b) 表示ITGB4基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)。由圖21所示的結(jié)果可知，在復(fù)發(fā)組中，ITGA6基因的表達(dá)量明顯地多。參考例7 人骨髓/末梢血細(xì)胞的整聯(lián)蛋白基因的表達(dá)從NCBI基因表達(dá)庫(kù)(GEO)中收集了 30例(15種X 2)人的各種骨髓/末梢血細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。對(duì)這些數(shù)據(jù)中的ITGA6基因和ITGB4基因的各個(gè)的表達(dá)量進(jìn)行了比較。圖22和圖23是收集的表達(dá)量數(shù)據(jù)的圖。圖22表示ITGA6基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，圖 23表示ITGB4基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)。由圖22和圖23所示的結(jié)果可知，ITGA6基因和ITGB4 基因在CD34陽(yáng)性的造血干細(xì)胞中的表達(dá)量低。由此，本發(fā)明的細(xì)胞粘附抑制劑不作用于正常的造血干細(xì)胞，而只對(duì)AML細(xì)胞發(fā)生特異性作用，有望抑制在骨髓內(nèi)的粘附。參考例8 人⑶34陽(yáng)性細(xì)胞/白血病細(xì)胞的整聯(lián)蛋白基因的表達(dá)根據(jù)上述參考例7所示的結(jié)果，對(duì)來(lái)自人臍帶血的⑶34陽(yáng)性細(xì)胞(造血干細(xì)胞) 和AMLl細(xì)胞的整聯(lián)蛋白家族基因的表達(dá)進(jìn)行了比較。這里，關(guān)于⑶34陽(yáng)性細(xì)胞(也稱為 “CD34+”)，從人臍帶血中分離，并使用Methoculture (STEMCELL公司制造)作為培養(yǎng)基進(jìn)行了培養(yǎng)。關(guān)于整聯(lián)蛋白基因表達(dá)量的比較，按照與上述實(shí)施例1-1同樣的PCR法進(jìn)行。本參考例中的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖M所示。另外，如上所述，圖M中的U937 和K562是來(lái)自人的EVIl非表達(dá)細(xì)胞株，HNT34是來(lái)自人的EVIl表達(dá)細(xì)胞株。如圖M所示，可以確認(rèn)CD34陽(yáng)性細(xì)胞(造血干細(xì)胞)中的ITGB4基因表達(dá)量低，上述結(jié)果是與上述參考例7的結(jié)果整合得出的。實(shí)施例5 =AMLl細(xì)胞在AMLl細(xì)胞移植NOG小鼠大腿骨中的聚集將上述建立的AMLl(ShEVIl)細(xì)胞移植到NOG小鼠(注冊(cè)商標(biāo))中，研究了 AMLl(ShEVIl)細(xì)胞在移植后的小鼠大腿骨中的聚集。這里，NOG小鼠是適合人化模型小鼠制作的重度免疫缺陷小鼠，可以由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所獲得。具體來(lái)說(shuō)，由靜脈向NOG小鼠分別注入600萬(wàn)個(gè)AMLl (shLuc)細(xì)胞和 AMLl(ShEVIl)細(xì)胞，1個(gè)月后回收大腿骨骨髓。通過(guò)FACS制成橫軸為熒光強(qiáng)度的圖，分析熒光強(qiáng)度低(更接近于0的峰)至熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞以怎樣的程度存在。圖25是FACS法測(cè)定結(jié)果的圖。圖25(a)表示使用AMLl (shLuc)細(xì)胞的FACS結(jié)果， 圖25(b)表示使用AMLl (shEVIl)細(xì)胞的FACS結(jié)果。如圖25所示可知，AMLl (shEVIl)細(xì)胞的存在率(9. 5% )比AMLl (shLuc)細(xì)胞(33% )的情況低。這可以認(rèn)為，在AMLl (shEVIl) 細(xì)胞中，EVIl基因的表達(dá)由于shEVIl的RNA干擾作用而受到抑制，結(jié)果，ITGA6/B4的表達(dá)低下，在小鼠大腿骨骨髓上的成活率低。由所述結(jié)果顯示，如本實(shí)施例中的、含有與EVIl基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的反義多核苷酸發(fā)揮細(xì)胞粘附抑制劑的作用，對(duì)于防止白血病細(xì)胞在骨髓的聚集是有用的。
本申請(qǐng)基于2009年2月24日提出的日本國(guó)專利申請(qǐng)第2009-041204號(hào)，其公開(kāi)的內(nèi)容通過(guò)參照而整體地弓I用到本說(shuō)明書(shū)中。
權(quán)利要求
1.一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑包含對(duì)于具有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體。
2.一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑包含反義多核苷酸，所述反義多核苷酸含有與編碼含有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列或其一部分。
3.一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑包含對(duì)于具有與序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體。
4.一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑包含反義多核苷酸，所述反義多核苷酸含有與編碼含有與序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列或其一部分。
5.一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑包含抑制含有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)。
6.一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述抑制劑包含抑制含有與序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的抑制劑，所述抑制劑用于癌癥的預(yù)防或治療。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的抑制劑，所述抑制劑在與其它抗癌劑合并使用時(shí)， 用于提高癌細(xì)胞對(duì)所述抗癌劑的敏感性。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其中，癌癥為白血病。
10.如權(quán)利要求9所述的抑制劑，其中，所述白血病為急性骨髓性白血病。
11.一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附的抑制方法，所述抑制方法包括抑制含有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性。
12.—種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附的抑制方法，所述抑制方法包括抑制編碼含有與序列號(hào)2 所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)和/或活性。
13.—種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附的抑制方法，所述抑制方法包括抑制含有與序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性。
14.一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附的抑制方法，所述抑制方法包括抑制編碼含有與序列號(hào)4 或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)和/或活性。
15.如權(quán)利要求11 14中任一項(xiàng)所述的抑制方法，所述抑制方法用于癌癥的預(yù)防或治療。
16.一種抑制含有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制造癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑中的應(yīng)用。
17.—種抑制含有與序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制造癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑中的應(yīng)用。
18.—種抑制編碼含有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制造癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑中的應(yīng)用。
19.一種抑制編碼含有與序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制造癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑中的應(yīng)用。
20.如權(quán)利要求16 19中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)胞粘附抑制劑用于癌癥的預(yù)防或治療。
21.—種抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附的物質(zhì)的篩選方法，所述篩選方法使用含有與序列號(hào) 2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽。
22.如權(quán)利要求21所述的篩選方法，其中，含有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽是以生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)或其部分肽的細(xì)胞的形態(tài)提供的。
23.如權(quán)利要求22所述的篩選方法，所述篩選方法還使用從對(duì)于含有與序列號(hào)2所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體、以及含有編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸或其堿基序列的一部分的多核苷酸中選擇的任意一種。
24.一種抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附的物質(zhì)的篩選方法，所述篩選方法使用含有與序列號(hào) 4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽。
25.如權(quán)利要求M所述的篩選方法，其中，含有與序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽是以生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)或其部分肽的細(xì)胞的形態(tài)提供的。
26.如權(quán)利要求25所述的篩選方法，所述篩選方法還使用從對(duì)于與序列號(hào)4或序列號(hào) 6所示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體、以及含有編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸或其堿基序列的一部分的多核苷酸中選擇的任意一種。
27.如權(quán)利要求21 沈中任一項(xiàng)所述的篩選方法，所述篩選方法用于預(yù)防或治療癌癥的物質(zhì)的篩選。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)控制與現(xiàn)有的不同的目標(biāo)分子的表達(dá)/功能來(lái)提供癌癥的預(yù)防/治療手段，以此作為癌癥的分子靶向療法的新的方法。另外，本發(fā)明還提供使用上述目標(biāo)分子來(lái)篩選具有癌癥的預(yù)防/治療活性的物質(zhì)的手段。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑包括對(duì)于含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6表示的堿基序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列的蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑含有反義多核苷酸，所述反義多核苷酸包括與編碼含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的堿基序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列或其一部分。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式提供一種癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑，所述癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附抑制劑包括抑制含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)6所示的堿基序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61P35/02GK102333543SQ20108000914
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者山川哲生, 森下和廣 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人宮崎大學(xué)