專利名稱：能與人B淋巴細(xì)胞上的mIgE結(jié)合的抗CεmX抗體的制作方法
能與人B淋巴細(xì)胞上的mlgE結(jié)合的抗C ε mX抗體
背景技術(shù)：
IgE在介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)中起到?jīng)Q定性作用，I型超敏反應(yīng)負(fù)責(zé)導(dǎo)致的過敏性疾病，包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎等。過敏性反應(yīng)是免疫系統(tǒng)對無害環(huán)境物質(zhì)的應(yīng)答，所述環(huán)境物質(zhì)例如塵螨、樹木和草的花粉、某些食品和藥物以及蜜蜂和火蟻叮咬。 在這些反應(yīng)中，過敏原與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面IgE的結(jié)合引起IgE交聯(lián)和相關(guān) IgE. Fc受體的聚集，所述IgE. Fc受體為I型IgE. Fc受體或Fc ε RI。該受體聚集隨后激活信號途徑，導(dǎo)致顆粒的胞吐和藥理介質(zhì)的釋放，所述藥理介質(zhì)例如組胺、白三烯、類胰蛋白酶、細(xì)胞因子和趨化因子。那些介質(zhì)從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的釋放導(dǎo)致過敏反應(yīng)的各種病理表現(xiàn)。已經(jīng)開發(fā)出用于治療IgE介導(dǎo)的過敏性疾病的抗IgE的抗體，該抗體與血液和組織液中的游離的IgE和B細(xì)胞上的mlgE結(jié)合，但是不與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的 Fc ε RI所結(jié)合的IgE結(jié)合。利用人源化抗IgE抗體即奧馬珠單抗(商品名Xolair)的治療在多種過敏性病癥中表現(xiàn)出弱化I型超敏性的多重藥理作用?？贵w與IgE在Fc的CH3結(jié)構(gòu)域中的位點(diǎn)高親和力結(jié)合，該位點(diǎn)與Fc ε RI的結(jié)合位點(diǎn)重疊。因此，該療法基于抗體與游離IgE和B淋巴母細(xì)胞和記憶B細(xì)胞上的mlgE的結(jié)合，這導(dǎo)致血液和組織液中總的游離 IgE水平下降。抗IgE與游離的IgE的結(jié)合進(jìn)一步阻止IgE與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面上的 Fc ε RI的結(jié)合。由于未被IgE占據(jù)的Fc ε RI不穩(wěn)定，且隨后內(nèi)化并降解，以抗IgE結(jié)合耗盡游離的IgE也逐漸下調(diào)嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的Fc ε RI0已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抗體療法其它作用的證據(jù)，包括中和細(xì)胞因子活性、弱化總炎性活性和可能通過IgE-抗-IgE免疫復(fù)合物的累積清除過敏原。本發(fā)明的發(fā)明人之一(T.W.Chang)發(fā)現(xiàn)，IgE除了與奧馬珠單抗結(jié)合的位于CH3上的抗原位點(diǎn)之外，被稱為C ε mX的另一個(gè)抗原位點(diǎn)存在于人mlgE上，用于靶向表達(dá)mlgE的 B淋巴細(xì)胞。CemX是位于人膜結(jié)合ε鏈(m ε )的CH4結(jié)構(gòu)域和C末端膜錨定片段之間的 52個(gè)氨基酸的片段。在大多數(shù)所研究的人個(gè)體中，已經(jīng)證明，沒有CemX的m ε (m ε s)占有極小的比例，而具有C ε mX的m ε鏈(m ε )優(yōu)勢表達(dá)。游離、分泌型IgE的ε鏈的mRNA和 mlgE的m ε s和m q的mRNA都來源于ε RNA轉(zhuǎn)錄本的可選剪接。C ε mX的氨基酸和核苷酸序列在整個(gè)蛋白和DNA數(shù)據(jù)庫中是唯一的。因此，CemX為靶向mlgE和表達(dá)mlgE的B細(xì)胞提供了特有的抗原位點(diǎn)。Chang的研究組以前報(bào)道了所開發(fā)的數(shù)種C ε mX特異性小鼠單克隆抗體，包括a20 在內(nèi)，這些抗體能與含有C ε mX片段的重組蛋白和SK0-007細(xì)胞系的細(xì)胞結(jié)合，并且能與 CHO細(xì)胞系的細(xì)胞結(jié)合，所述SK0-007細(xì)胞系是表達(dá)人mlgE的人骨髓瘤來源的細(xì)胞系，所述 CHO細(xì)胞系用對應(yīng)于m q的CH2結(jié)構(gòu)域至細(xì)胞質(zhì)末端的片段(m ε L(CH2_CM) ；CM 細(xì)胞質(zhì))的基因轉(zhuǎn)染。單克隆抗體a20及其所有早期開發(fā)的抗體均被發(fā)現(xiàn)與位于52a. a. C ε mX結(jié)構(gòu)域C 末端的8-a. a.肽區(qū)域、RADWPGPP、殘基#45-52結(jié)合。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及對人mlgE的C ε mX結(jié)構(gòu)域具有特異性并能與人B淋巴細(xì)胞上的mlgE 結(jié)合的抗體的開發(fā)和鑒定。本發(fā)明還涉及這些抗體在治療由IgE介導(dǎo)的過敏性疾病和其他疾病中的應(yīng)用。在研究由Chang的研究組開發(fā)的抗C ε mX單克隆抗體a20的過程中，發(fā)現(xiàn)a20與 m ε L(CH2_CM)基因所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的結(jié)合較好，所述細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞系或NSO細(xì)胞系，不表達(dá)Ig α (CD79a)、Ig3 (CD79b)、CD21、CD19、CD81和其他與B細(xì)胞受體(BCR)相關(guān)的蛋白。 然而，發(fā)現(xiàn)a20與m ε L(CH2_CM)基因所轉(zhuǎn)染的表達(dá)Ig α、Ig β和其他BCR相關(guān)蛋白的細(xì)胞系結(jié)合不良，例如Ramos細(xì)胞系。我們設(shè)想，a20所識(shí)別的位于C ε mX上的抗原表位可能被某些 BCR相關(guān)蛋白封閉。因此，a20單克隆抗體及其嵌合或人源化版本不適于在體內(nèi)用于人類患者中，用于靶向表達(dá)mlgE的B淋巴母細(xì)胞和記憶細(xì)胞的目的。如果肽表位RADWPGPP是用于誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的唯一表位，那么利用以含人C ε mX的蛋白所免疫的小鼠由雜交瘤方法產(chǎn)生的單克隆抗體，對該肽區(qū)域都將是特異性的。然而，如果該表位是優(yōu)勢表位，但不是唯一的免疫原性表位，那么仍可開發(fā)對C ε mX上其他抗原表位具有特異性的單克隆抗體?？赡茉贑 ε mX上存在不能由BCR相關(guān)蛋白封閉的表位，用于抗體結(jié)合。如果是這樣，還可以開發(fā)與B細(xì)胞上的IgE結(jié)合并且可用于靶向這些B細(xì)胞的抗體。在以下的實(shí)施例中，我們成功地表明，盡管RADWPGPP是優(yōu)勢表位，但是其不是 C ε mX上唯一的免疫原性和抗原表位。此外，我們發(fā)現(xiàn)了單克隆抗體、4B12和^H2，其與不在RADWPGPP區(qū)域內(nèi)的抗原表位上的C ε mX結(jié)合。那些單克隆抗體在結(jié)合C ε mX中不與a20 抗體競爭。它們與B細(xì)胞上mlgE的結(jié)合比a20更牢固，并且在導(dǎo)致表達(dá)mlgE的細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞溶解和凋亡中比a20更有效。實(shí)施例表明，諸如4B12和的單克隆抗體能與人B淋巴細(xì)胞上的mlgE結(jié)合， 并且適合用于靶向表達(dá)mlgE的B淋巴母細(xì)胞和記憶B細(xì)胞，用于下調(diào)IgE合成。嵌合或人源化形式的抗體適于用在受IgE介導(dǎo)的過敏性疾病所影響的患者中，所述過敏性疾病例如過敏性哮喘、過敏性鼻炎和特應(yīng)性皮炎。由于已證實(shí)抗IgE對IgE的中和可有效治療寒冷誘發(fā)的蕁麻疹、慢性蕁麻疹、膽堿能性蕁麻疹、慢性鼻竇炎、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增生癥、皮膚肥大細(xì)胞增生癥、過敏性支氣管肺曲霉病、復(fù)發(fā)性先天血管性水腫和間質(zhì)性膀胱炎或嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)的胃腸病癥，因此也可以利用諸如4B12和的抗體治療這些各種疾病。實(shí)施例還提出4B12和所識(shí)別的肽在誘導(dǎo)針對C ε mX和因而針對表達(dá)mlgE 的B細(xì)胞的免疫應(yīng)答中的潛在應(yīng)用。具有相似的抗原特性即具有與抗CemX抗體的結(jié)合活性的肽及其類似物，例如4B12和^H2，可以單獨(dú)使用或與分子構(gòu)建體聯(lián)合使用，所述分子構(gòu)建體還含有能誘導(dǎo)T細(xì)胞輔助的部分。這類構(gòu)建體能誘導(dǎo)針對表達(dá)mlgE的B細(xì)胞的活性免疫，并因此實(shí)現(xiàn)下調(diào)總IgE合成的作用。
實(shí)施例實(shí)施例1 與RADWPGPP之外的抗原位點(diǎn)結(jié)合的新的抗C ε mX單克隆抗體。為了誘導(dǎo)抗C ε mX免疫應(yīng)答，用50 μ g溶解的n_ i^一烷基-β -d_麥芽吡喃糖苷 (UDM ；Anatrace) mlgE. Fcl重組蛋白按照廠商的意見以兩周的間隔皮下免疫BALB/c小鼠兩次，所述mlgE. Fcl重組蛋白在TiterMax Gold佐劑(Sigma-Aldrich)中乳化。我們避免超免疫方案，以便小鼠不會(huì)僅產(chǎn)生針對優(yōu)勢RADWPGPP表位的抗體。用0. ImgUDM溶解的mlgE. FcL重組蛋白在沒有佐劑的情況下腹膜內(nèi)進(jìn)行最后一次加強(qiáng)。融合前一天，將NSO細(xì)胞以 5X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重新接種于新鮮的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中，所述DMEM 培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%熱滅活的胎牛血清(FBS ；Invitrogen)和1 %青霉素-鏈霉素混合物 (100 X Pen-Mr印溶液；Invitrogen)。最后一次加強(qiáng)3天后，收集來自2只免疫小鼠的脾細(xì)胞，并用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次。收集5 X IO7個(gè)NSO細(xì)胞，并用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次。洗滌后，在用移液管吸頭輕輕地不斷攪動(dòng)細(xì)胞的同時(shí)，通過在1分鐘內(nèi)添加Iml預(yù)熱的50%聚乙烯丙三醇1500 (PEG 1500, Roche Applied Science)使脾細(xì)胞與NSO細(xì)胞融合，再次攪動(dòng)細(xì)胞持續(xù)1分鐘，在2分鐘內(nèi)添加2ml預(yù)熱的無血清DMEM，并最后在2分鐘內(nèi)添加8ml無血清DMEM。以200 X g離心10分鐘之后，用600ml HAT培養(yǎng)基[DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充有2%次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷混合物(50 X HAT溶液Jnvitrogen)、10% BM-Condimed H 1 (Roche Applied Science)、10%熱滅活FBS和1 %青霉素-鏈霉素混合物]重懸浮融合的細(xì)胞，并以200 μ 1/孔分布在30個(gè)96孔培養(yǎng)板中。第3天時(shí)，向每孔添加100 μ 1 HAT培養(yǎng)基。在第7天和第10天時(shí)，通過吸去每孔一半體積的培養(yǎng)基，并用HAT培養(yǎng)基替換來更新培養(yǎng)基。在第14天時(shí)，利用雜交瘤上清液通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來篩查與UDM 溶解的mlgE. Fcl或mlgE. Fcs蛋白結(jié)合的抗C ε mX mAb。為了利用ELISA篩查分泌抗C ε mX mAb的雜交瘤，用純化UDM溶解的mlgE. Fcl 或mlgE. Fcs蛋白在0. IM NaCO3(pH 9.6)中以50ng/孔于4°C下過夜包被96孔MaxiSorp 板(Nunc)。將包被的孔用PB S中1 % BSA以200 μ 1/孔室溫封閉1小時(shí)。用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌三次，隨后將100 μ 1雜交瘤上清液添加至孔中。于室溫孵育2小時(shí)。抽吸所有的孔，并用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌六次。將板與HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG抗體(Chemicon)的1 10，000稀釋液一起孵育1小時(shí)(100 μ 1/孔)。然后抽吸所有的孔，并用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌六次。最后，通過50 μ 1/孔的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液(SureBlueTM，KPL)使孔顯影，并通過以50 μ 1/孔添加INHCl來終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上檢測OD45tl處的吸光度。如通過ELISA所測定的，從兩次融合所篩查的> 4000個(gè)雜交瘤克隆中，17個(gè)克隆表現(xiàn)出對UDM 溶解的mlgE. Fcl而不是mlgE. Fcs的特異性。為了研究抗C ε mX mAb對C ε mX的特異性，然后檢測多種C ε mX特異性克隆與3種合成肽的反應(yīng)性，這3種合成肽代表C ε mX由位于殘基#18處的C殘基和位于殘基#39_41 處的CHC片段而分開的3個(gè)連續(xù)片段。具體而言，Pl肽含有m ε的CH4的最后4個(gè)氨基酸殘基和C ε mX的前17個(gè)氨基酸殘基(#1_17)，即GLAGGSAQSQRAPDRVL ；P2肽含有C ε mX的 20個(gè)氨基酸殘基#19-38，即HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR ；P3肽含有C ε mX的末端11個(gè)氨基酸殘基(#42-52)，即GAGRADWPGPP和連續(xù)migis區(qū)域的前4個(gè)氨基酸殘基，即m ε鏈的膜錨定肽的N末端細(xì)胞外區(qū)域。所有的肽均在中央研究院基因組研究中心(臺(tái)灣臺(tái)北)(Genomics Research Cneter,Academia Sinica (Taipei, Taiwan))合成。用濃度為 10mg/ml 的 PBS 使肽復(fù)水。用所有肽在0. IM NaCO3 (pH 9.6)中以500ng/孔在4°C下過夜包被96孔MaxiSorp 板。將包被的孔用PBS中BSA以200 μ 1/孔室溫封閉1小時(shí)。用含0. 05% Tween-20 的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌三次，隨后將100 μ 1 1μ g/ml的抗C ε mX mAb添加至孔中。 于室溫孵育2小時(shí)。抽吸所有的孔，并用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌六次。將板與HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG抗體(Chemicon)的1 10，000稀釋液一起孵育 1小時(shí)(100 μ 1/孔)。用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔將板洗滌六次之后，將 50 μ 1/孔的TMB底物溶液添加入孔中。通過以50 μ 1/孔添加IN HCl來終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上檢測OD45tl處的吸光度。在我們的實(shí)驗(yàn)中所制備的許多C ε mX特異性單克隆抗體中，只有4B12和不與含RADWPGPP的P3肽結(jié)合。4B12與Pl肽反應(yīng)，26H2與P2肽反應(yīng)。所有其他的CemX特異性單克隆抗體均與P3反應(yīng)(

圖1)。因此，毫無疑問，RADWPGPP是優(yōu)勢免疫原性表位。但是它不是唯一的免疫原性表位。實(shí)施例2 :4B12和與表達(dá)mlgE的B細(xì)胞上的mlgE結(jié)合我們進(jìn)一步檢測多種ε mX特異性單克隆抗體與用編碼Hieuai2,)或m Ssfcll2,) 的重組DNA所轉(zhuǎn)染的CHO和Ramos細(xì)胞系的結(jié)合能力。兩個(gè)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系分別產(chǎn)生 mlgE. Fcl或mlgE. Fcs, mlgE . Fcl或mlgE. Fcs兩者都不能與諸如Ig α和Ig β的輔助受體 (coreceptor)形成完整的B細(xì)胞受體，因?yàn)樗鯟HO細(xì)胞不表達(dá)那些蛋白。轉(zhuǎn)染的兩個(gè) Ramos細(xì)胞系分別產(chǎn)生mlgE. Fcl或mlgE. Fcs, mlgE. Fcl或mlgE. Fcs兩者都能與其天然輔助受體形成復(fù)合物。為了研究抗CemX mAb與天然CemX的結(jié)合，將表達(dá)mlgE. Fcl或mlgE. Fcs的CHO或Ramos細(xì)胞以IO7個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重懸浮于FACS緩沖液[PBS、1 % FBS、 0. 疊氮化鈉和2mMEDTA(pH 8. 0)]中。然后將IO6個(gè)細(xì)胞與100 μ 1雜交瘤上清液在冰上孵育30分鐘，隨后用FACS緩沖液洗滌。通過與對鼠IgG具有特異性的FITC標(biāo)記的兔 F(ab’)2片段在(AbD Secrotec)冰上孵育30分鐘來檢測結(jié)合抗體，隨后在分析之前用FACS 緩沖液洗滌兩次。用FACSCanto II流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，并用FCSExpress軟件(De Novo Software)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)所有C ε mX特異性單克隆抗體均不與表達(dá)mlgE. Fcs的CHO和Ramos細(xì)胞結(jié)合。發(fā)現(xiàn)所有C ε mX特異性單克隆抗體均與表達(dá) mlgEL的CHO細(xì)胞結(jié)合。然而，只有4B12和能與表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞結(jié)合，而所有其他C ε mX特異性單克隆抗體都不能與表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞結(jié)合(圖2)。實(shí)施例3 :4B12和針對表達(dá)mlgE的B細(xì)胞誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性為了研究嵌合抗C ε mX mAb的ADCC活性，我們使用外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為靶向表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞。通過在Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)密度梯度上離心從健康供體(Taiwan Blood Service Foundation)的淡黃色層(buffy coat) 純化 PBMC，并冷凍保存在 90% FBS/10% DMSO (Hybri-Max ；Sigma-AIdrich)中。使用之前，使霉素-鏈霉素混合物的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen)中過夜培養(yǎng)。為了識(shí)別與PBMC共培養(yǎng)的靶細(xì)胞，用含2.5μΜ 5-(和-6)-羧基熒光素二乙酸酯，琥珀酰亞胺酯(CFDA，SE; Invitrogen)在0. 1 % BSA/PBS中于37°C下將表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞標(biāo)記10分鐘。 在用含10% FBS的冷RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)洗滌三次之后，將細(xì)胞調(diào)至IO5個(gè)細(xì)胞/ ml。對于效應(yīng)物-靶標(biāo)(E/T)比滴定，將于200 μ 1完全RPMI培養(yǎng)基中的20，000個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞用1 μ g/ml的抗體在37°C下包被30分鐘，然后以50-3. 125的多個(gè)E/T比與等體積的 PBMC混合。對于抗體滴定，將于200 μ 1完全RPMI培養(yǎng)基中的20，000個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞用多種濃度(1000 0. 01ng/ml)的抗體在37°C下調(diào)理30分鐘，然后以25 1的E/T比與PBMC 混合。為了測定抗體非依賴性殺傷，還將標(biāo)記的靶細(xì)胞在不存在抗體的條件下以給定的E/T 比與PBMC —起孵育。在M小時(shí)的孵育結(jié)束時(shí)，用2. 5 μ g/ml的7-氨基放線菌素(7-AAD ； Invitrogen)在冰上對死細(xì)胞染色15分鐘。在Becton Dickinson FACSCanto II流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞。將活的靶細(xì)胞定義為斑點(diǎn)印跡分析上CFSE-陽性/7-AAD-陰性細(xì)胞的百分比。按照以下公式計(jì)算給定E/T比時(shí)的殺傷細(xì)胞的百分比100X [(抗體非依賴性對照中活靶細(xì)胞的樣品中活靶細(xì)胞的％ )/抗體非依賴性對照中活靶細(xì)胞的％ ]。在多個(gè)E/T比時(shí)觀察到c4B12、c26H2和奧馬珠單抗的ADCC活性。在E/T比為50時(shí)，c4B12、c26H2和奧馬珠單抗給出高達(dá)60%的特異性裂解；相反，ca20的活性較低，僅給出10 20%的特異性裂解(圖3A)。而且，當(dāng)c4B12和c26H2的濃度高于0. 01 μ g/ml時(shí)，觀察到顯著的ADCC。在 10 μ g/ml的最大劑量時(shí)，c4B12和c26H2對靶細(xì)胞的特異性裂解范圍為80% -90%，而ca20 給出高達(dá)50%的特異性裂解(圖:3B)。針對CD20的陽性對照利妥昔單抗和奧馬珠單抗在多個(gè)E/T比時(shí)，以劑量響應(yīng)的方式有效誘導(dǎo)ADCC。因此，我們推定，在介導(dǎo)ADCC中，c4B12 和c26H2相對于ca20是更有效的抗C ε mX mAb,并且c4B12和c26H2能有效地招募效應(yīng)細(xì)胞，以在體內(nèi)靶向表達(dá)mlgE的B細(xì)胞。實(shí)施例4 嵌合抗C ε mX mAb誘導(dǎo)表達(dá)膜結(jié)合IgE. Fcl的Ramos細(xì)胞的凋亡為了檢測磷脂酰絲氨酸(PQ暴露，在完全培養(yǎng)基中，將表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞(5X IO5個(gè)細(xì)胞/ml)與指定濃度的嵌合抗CemX mAb、奧馬珠單抗或?qū)φ湛贵w在37°C 下一起孵育1小時(shí)。然后用對人IgG Fc片段具有特異性的山羊F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)以 10 μ g/ml 的濃度處理細(xì)胞，并于 37°C下再孵育 M小時(shí)。通過在室溫下黑暗中于200 μ 1膜聯(lián)蛋白緩沖液(Annexin buffer) [IOmM HEPES/ NaOH(pH 7. 4)、140mM NaCl、5mM CaCl2]中對細(xì)胞染色15分鐘，評價(jià)磷脂酰絲氨酸(PS)暴露的檢測，所述膜聯(lián)蛋白緩沖液含有以1/200稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白 V(BioVision)和 2. 5 μ g/ml 的碘化丙啶(PI，Sigma-Aldrich)。在 FACSCanto II 流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞。將凋亡的細(xì)胞定義為斑點(diǎn)印跡分析上膜聯(lián)蛋白V-陽性/PI-陰性細(xì)胞的百分比。隨著c4B12、c26H2或奧馬珠單抗?jié)舛鹊脑黾樱蠹s80%表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos 細(xì)胞通過凋亡而死亡，同時(shí)在1 μ g/ml時(shí)具有最大誘導(dǎo)，但ca20不是這樣(圖4A)。為了檢測凋亡的細(xì)胞核，將表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞(5 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml)與 1 μ g/ml濃度的嵌合抗C ε mX mAb、奧馬珠單抗或?qū)φ湛贵w在完全培養(yǎng)基中在37°C下一起孵育1小時(shí)。然后用對人IgG Fc片段具有特異性的山羊F(ab’)2片段以10 μ g/ml的終濃度處理細(xì)胞，并于37°C下再孵育48小時(shí)。將5X IO5個(gè)細(xì)胞在冰上黑暗中于0. 5ml的碘化丙啶(PI)/triton 溶液(含 0. 檸檬酸鈉、0. 1% Triton X-100、15 μ g/ml PI 和 100 μ g/ ml RNaseA的PBS ；所有的都來自Sigma—Aldrich)中孵育1小時(shí)。在FACSCanto II流式細(xì)胞儀上測定PI熒光。將完整細(xì)胞核中的DNA含量記錄在線性標(biāo)尺上。將在通道中發(fā)出的熒光低于G0/G1峰的含有亞二倍體DNA的凋亡細(xì)胞核計(jì)算成總?cè)后w的百分比。在c4B12、 c26H2或奧馬珠單抗所處理的表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞中，觀察到具有亞二倍體DNA的細(xì)胞群顯著增加(圖4B)。為了檢測半胱天冬酶3 (caspase 3)和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割，在完全培養(yǎng)基中，將表達(dá)mlgE. Fq的Ramos細(xì)胞(5X IO5個(gè)細(xì)胞/ml)與濃度為1 μ g/ml的嵌合抗C ε mX mAb、奧馬珠單抗或?qū)φ湛贵w在37°C下一起孵育1小時(shí)。然后用對人IgG Fc片段具有特異的山羊F(ab’)2片段以10 μ g/ml的終濃度處理細(xì)胞，并于37°C下再孵育對小時(shí)。用冰冷的PBS洗滌5 X IO6個(gè)細(xì)胞，并重懸浮于100 μ 1冰冷的改良RIPA裂解緩沖液 [20mM Tris (pH 7.4)、150mM NaCl U % Triton-X 100、0· 5 % 脫氧膽酸、0· 1 % 十二燒基硫酸鈉(SDS)、5mM EDTA和蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich)]中。將裂解物于冰上孵育20分鐘。將樣品在4°C下以16000Xg離心20分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml管中，并儲(chǔ)存于-80°C。用DC蛋白測定(Bio-Rad Laboratories)按照廠商的建議對每個(gè)澄清裂解物中的蛋白量進(jìn)行定量。將每個(gè)樣品的總蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜(GE Healthcare)上。從 Cell Signaling Techonology 獲得半胱天冬酶3和PARP的兔多克隆抗體，并以1 500稀釋使用。HRP偶聯(lián)的山羊抗兔 IgG 二抗(Sigma-Aldrich)以 1 10，000 稀釋使用。用 ECL 試劑(ImmobilonTM Western ； Millipore)對膜進(jìn)行顯影。通過用β肌動(dòng)蛋白的抗體(Sigma-Aldrich)探測印跡來核實(shí)加載了等量的蛋白。在用c4B12、c26H2和奧馬珠單抗而不是ca20處理表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos 細(xì)胞M小時(shí)以后，半胱天冬酶3明顯切割成Mr 19-和17-kDa的片段。此外，在c4B12_、 c26H2-和奧馬珠單抗處理的表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞中，利用識(shí)別M^ 116kDa的完整 PARP和Mr 89kDa的切割產(chǎn)物的抗體可檢測到PARP的切割(圖4C)。附圖簡要說明圖1顯示代表C ε mX的連續(xù)片段的3個(gè)合成肽，及多種抗C ε mX mAb與這些肽的反應(yīng)。以粗體顯示CemX結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。圖2顯示多種抗C ε mX mAb與表達(dá)mlgE. Fcl或mlgE. Fcs的CHO或Ramos細(xì)胞系的結(jié)合。圖3A顯示嵌合c4B12和c26H2以多個(gè)E/T比誘導(dǎo)針對表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞誘導(dǎo)的ADCC。圖;3B顯示嵌合c4B12和c26H2以劑量響應(yīng)的方式誘導(dǎo)針對表達(dá)mlgE. Fcl 的fcimos細(xì)胞的ADCC。圖4A顯示嵌合c4B12和c26H2在表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞中所誘導(dǎo)的PS暴露是劑量依賴性的。圖4B顯示在嵌合c4B12和c26H2所處理的表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos細(xì)胞中觀察到凋亡的細(xì)胞核。圖4C顯示在嵌合c4B12和c26H2所處理的表達(dá)mlgE. Fcl的Ramos 細(xì)胞中觀察到半胱天冬酶3和PARP的切割。 圖5顯示親本小鼠4B12的VL和VH、VL和VH的各自所選的人生殖系模板KV2和 HV4以及人源化4B12(hu4B12)的氨基酸序列比對，人源化4B12 (hu4B12)在比對中被標(biāo)記為 “R印Iace (取代)”。該hu4B12與嵌合4B12(c4B12)對C ε mX重組蛋白和表達(dá)mlgE. Fcl的 Ramos細(xì)胞具有相同的結(jié)合親和力。所引用的參考文獻(xiàn)相關(guān)的專利文件US5, 091, 3132/1992 ChangUS5, 254, 67110/1993 ChangUS5, 260, 41611/1993 ChangUS5, 274, 07512/1993 ChangUS5, 292，8673/1994 ChangUS5, 342，9248/1994 ChangUS2009/0010924A1 Wu其他參考文獻(xiàn)Davis FM,Gossett LA,Chang Tff(1991)An epitope on zembrane-bound but notsecreted IgE amplications in isotype-specific regulation(膜結(jié)合型而非分泌型 IgE上的表位同種特異性調(diào)控的含義).Bio/Technology 9 :53-56.Peng C, Davis FM, Sun LK, Liou RS, Kim Yff, Chang Tff (1992)A new isoform of human membrane-bound IgE (人膜結(jié)合型 IgE 的新的同種型)· J Immunol 148:129-136.Chen, H. Y. , Liu, F. Τ. , Hou, C. Μ. H. , Huang, J. S. W. , Sharma, B. B. , and Chang, T. W. (2002)Monoclonal antibodies against C ε mX domain in human membrane-bound IgE and their potential on targeting IgE-expressing B cells (抗月莫結(jié)合型 IgE 白勺 C ε mX結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體及其靶向表達(dá)IgE的B細(xì)胞的潛能).Int. Archives Allergy & Immunol. 128，315-324.
權(quán)利要求
1.C ε mX特異性抗體，能與人B淋巴細(xì)胞上的膜結(jié)合IgE結(jié)合，但是不能與RADWPGPP肽纟口口。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體是小鼠單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體是包含小鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)的嵌合抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體是基本包含小鼠單克隆抗體的高變區(qū)和人抗體的框架區(qū)和恒定區(qū)的人源化單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體是人抗體。
6.權(quán)利要求1所述的Cε mX性特異抗體的片段，能與人B淋巴細(xì)胞上的膜結(jié)合IgE結(jié)合，但是不能與RADWPGPP肽結(jié)合。
7.如權(quán)利要求6所述的抗體的片段，其中所述片段是Fab、F(ab)’ 2或單鏈Fv。
8.用權(quán)利要求1所述的抗體治療IgE介導(dǎo)的疾病的治療方法。
9.如權(quán)利要求8所述的治療方法，其中所述IgE介導(dǎo)的疾病是過敏性哮喘、過敏性鼻炎或特應(yīng)性皮炎。
10.如權(quán)利要求8所述的治療方法，其中所述IgE介導(dǎo)的疾病是寒冷誘發(fā)的蕁麻疹、慢性蕁麻疹、膽堿能性蕁麻疹、慢性鼻竇炎、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增生癥、皮膚肥大細(xì)胞增生癥、過敏性支氣管肺曲霉病、復(fù)發(fā)性先天血管性水腫和間質(zhì)性膀胱炎或嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)的腸胃病癥。
11.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體與GLAGGSAQSQRAPDRVL或具有相似抗原特性的類似物結(jié)合。
12.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體與HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR或具有相似抗原特性的類似物結(jié)合。
13.利用免疫原在患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的治療方法，所述免疫原含有GLAGGSAQSQRAPDRVL 或具有相似抗原特性的類似物。
14.禾O用免疫原在患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的治療方法，所述免疫原含有HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR 或具有相似抗原特性的類似物。
15.利用免疫原在患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的治療方法，所述免疫原含有 GLAGGSAQSQRAPDRVL或具有相似抗原特性的類似物和HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR或具有相似抗原特性的類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及可與人B淋巴細(xì)胞表面所表達(dá)的膜結(jié)合IgE(mIgE)的CεmX結(jié)構(gòu)域有效結(jié)合的抗體的產(chǎn)生和應(yīng)用。提出將位于人膜結(jié)合ε鏈的CH4結(jié)構(gòu)域和C末端膜錨定肽之間的52個(gè)氨基酸殘基的CεmX結(jié)構(gòu)域作為抗原位點(diǎn)，用于免疫靶向表達(dá)mIgE的B細(xì)胞。以前所報(bào)道的與CεmX的C末端的RADWPGPP肽結(jié)合的單克隆抗體，包括a20在內(nèi)，目前據(jù)發(fā)現(xiàn)與人B細(xì)胞上的mIgE的結(jié)合較差。我們發(fā)現(xiàn)，只有對CεmX的某些片段具有特異性的單克隆抗體可與人B細(xì)胞上的mIgE有效結(jié)合，這些片段例如GLAGGSAQSQRAPDRVL和HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR，并因此具有靶向那些B細(xì)胞而用于治療IgE介導(dǎo)的疾病的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/395GK102482351SQ201080009485
公開日2012年5月30日 申請日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者張子文, 費(fèi)迪亞斯·C·吳, 阿爾弗爾·F·洪, 陳君柏 申請人:中央研究院