專利名稱：組織修復(fù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修復(fù)組織的方法。更具體地，本發(fā)明涉及使用細(xì)胞和可植入的支撐物來修復(fù)組織缺損的方法。
背景技術(shù)：
由于傳統(tǒng)療法的局限以及老齡化的人口，對于組織修復(fù)的新治療方案的需求越來越多。當(dāng)前，基于細(xì)胞的療法代表了組織和器官缺損治療技術(shù)狀況。這些療法包括將前體細(xì)胞，優(yōu)選是干細(xì)胞，引入到缺損部位，從而擴(kuò)增內(nèi)源性細(xì)胞種群以及增加組織再生和修復(fù)率。這些細(xì)胞通常是本質(zhì)上自體的，從需要治療的病人中分離，并在將其返回到病人的缺損部位之前進(jìn)行體外擴(kuò)增。在外植細(xì)胞擴(kuò)增之后，普遍的做法是將細(xì)胞在支撐或支架上再培養(yǎng)4到10天。隨后將細(xì)胞/支架的組合植入到組織的缺損部位。使用與自體細(xì)胞結(jié)合的支架主要出于三個(gè)原因(1)提供一個(gè)模擬細(xì)胞外基質(zhì)，且被認(rèn)為有利于細(xì)胞生長的環(huán)境；(2)促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)的形成；以及C3)為植入后新形成的組織提供機(jī)械強(qiáng)度。不過，現(xiàn)有的方法也有一些問題。首先，眾所周知，在體外長期培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)分化， 這會(huì)降低細(xì)胞在體內(nèi)的增殖以及組織修復(fù)的能力。其次，細(xì)胞體的外培養(yǎng)使得細(xì)胞暴露于可能含有污染顆粒(例如病毒和細(xì)菌)或化學(xué)品的外來物質(zhì)。如果在植入之前沒有被檢測至IJ，這些污染物有可能導(dǎo)致重大疾病和病態(tài)。此外，細(xì)胞成為毒害的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)隨著細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)長增加而增加。最后，由于缺乏營養(yǎng)和氧氣，支架上培養(yǎng)的細(xì)胞從其外表面滲透很少超過 500 μ m。因此，盡管努力促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)的形成，在體外還是不能形成全厚度的組織。因此，在本領(lǐng)域具有尋找以更好的方式在組織修復(fù)中使用細(xì)胞和支架的需求。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)出一種修復(fù)組織的新方法，該方法包括植入前2小時(shí)內(nèi)將細(xì)胞施用于可植入的支撐物。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物中修復(fù)組織的方法，該方法包括如下步驟(a)提供可植入的支撐物和樣品份的細(xì)胞；(b)將所述樣品份的細(xì)胞施用于所述支撐物上，以制備可植入的基質(zhì)；以及(C)在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物后的2小時(shí)內(nèi)， 植入所述基質(zhì)到待修復(fù)的組織內(nèi)。重要的是，在植入前，所述細(xì)胞不與所述可植入的支撐物在體外培養(yǎng)，在植入前所述細(xì)胞僅僅允許有足夠的時(shí)間黏附到可植入的支撐物上。因此，在第二方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物中修復(fù)組織的方法，該方法包括如下步驟(a)提供可植入的支撐物；(b)將樣品份的哺乳動(dòng)物細(xì)胞接種于所述支撐物上， 并允許所述細(xì)胞有足夠的時(shí)間黏附到所述支撐物上而不進(jìn)行體外培養(yǎng)，以制備可植入的基質(zhì)；以及(c)在將所述細(xì)胞接種到所述支撐物上后的2小時(shí)之內(nèi)，植入所述基質(zhì)到待修復(fù)的組織內(nèi)。
應(yīng)該理解的是，需要修復(fù)的組織可以是任何在哺乳動(dòng)物中能找到的組織，包括但不限于上皮、結(jié)締組織或肌肉。在一些實(shí)施方式中，組織是軟骨。類似的，可以理解的是，用于本發(fā)明所述的方法的細(xì)胞可以分離自哺乳動(dòng)物中任何能找到的組織。所述細(xì)胞可以分離自任意的哺乳動(dòng)物，包括但不限于羊、牛、豬、馬、狗、貓或人。在另外的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞分離自人。在另外的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞分離自需要治療的動(dòng)物受試者。所述可植入的支撐物可以是任意類型的用于組織修復(fù)的可植入的支撐物。在某些實(shí)施方式中，所述可植入的支撐物可以包括膜、支架、織物、線狀物或凝膠。在另外的實(shí)施方式中，所述可植入的支撐物是膠原支架。在某些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括使用細(xì)胞密封劑包覆所述可植入的基質(zhì)的步驟。所述細(xì)胞密封劑可以是任何外科組織粘合劑。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞密封劑是纖維蛋白密封劑。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的目的是在所述細(xì)胞黏附到所述支撐物上后盡快將包括可植入的支架和黏附細(xì)胞的基質(zhì)植入，即，在植入之前所述基質(zhì)不在體外培養(yǎng)。因此，可以將所述細(xì)胞在所述可植入的基質(zhì)植入前的不超過約1小時(shí)59分鐘施用于所述支撐物上。例如，可以將所述細(xì)胞在植入前的約5分鐘到約1小時(shí)50分鐘之間；在植入前的約10分鐘到約1小時(shí)40分鐘之間；在植入前的約15分鐘到約1小時(shí)30分鐘之間；在植入前的約20分鐘到約1小時(shí)20分鐘之間；在植入前的約30分鐘到約1小時(shí)10分鐘之間；在植入前的介于約30分鐘到約1小時(shí)分鐘之間；或者在植入前的介于約40分鐘到約50分鐘之間；施用于所述支撐物上。在一些實(shí)施方式中，將所述細(xì)胞在植入前的至少約7分鐘時(shí)，施用于所述支撐物上。在其它實(shí)施方式中，將所述細(xì)胞在植入前的至少約15分鐘時(shí)，施用于所述支撐物上。在另外的實(shí)施方式中，將所述細(xì)胞在植入前的至少約20分鐘時(shí)，施用于所述支撐物上。在另外的實(shí)施方式中，將所述細(xì)胞在植入前的約40分鐘時(shí)，施用于所述支撐物上。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種修復(fù)組織的方法，該方法包括以下步驟 (a)提供膠原支架和樣品份的含有軟骨細(xì)胞的細(xì)胞；(b)將所述膠原支架加熱到35°C到 37°C之間；(c)將所述細(xì)胞施用于加熱后的膠原支架上，以制備可植入的基質(zhì)；(d)使用纖維蛋白密封劑包覆所述的基質(zhì)；以及(e)在將所述細(xì)胞施用于所述膠原支架上后的約40分鐘，植入所述基質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，將所述細(xì)胞施用或接種于所述可植入的支撐物與和植入所生成的基質(zhì)的時(shí)間間隔(小于2小時(shí))短(孵化)的目的是降低通常因延長培養(yǎng)導(dǎo)致的原代細(xì)胞的死亡。因此，在第三方面，本發(fā)明提供了一種增加用于植入的細(xì)胞的活性的方法，該方法包括將樣品份的細(xì)胞施用于可植入的支撐物上，并在施用所述細(xì)胞后的2小時(shí)內(nèi)植入所述支撐物。在一些實(shí)施方式中，植入的細(xì)胞的活性大于90%或大于95%。在另一些實(shí)施方式中，植入的細(xì)胞的活性在植入前的當(dāng)時(shí)大于99%。應(yīng)該理解的是，由于本發(fā)明的細(xì)胞具有高活性，細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的表達(dá)也會(huì)更低。在一些實(shí)施方式中，凋亡標(biāo)志物選自由MMP-I、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、IL-I、c-fos、 c-jun、0ct3/4 和 Sox2 組成的組。
在第四方面，本發(fā)明提供了一種用于修復(fù)組織的試劑盒，該試劑盒包括(a)可植入的支撐物；以及(b)試劑盒組分的使用說明書，其中，該說明書建議在植入前2小時(shí)內(nèi)，將樣品份的細(xì)胞施用于所述支撐物上。在一些實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括細(xì)胞樣品。在其它實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括細(xì)胞密封劑。


圖1 有(深色塊)和沒有(淺色塊)膠原支架時(shí)人類細(xì)胞基因表達(dá)的對比C = ρ < 0. 05)。圖2 在膠原支架上的時(shí)間依賴的細(xì)胞粘附Γ = P < 0. 05)。
具體實(shí)施例方式在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明不局限于特定的示例方法，當(dāng)然可以有變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，此處使用術(shù)語只是出于描述特定實(shí)施方式的目的，而不是為了限定，其僅由所附權(quán)利要求進(jìn)行限定。本文中無論是上文還是下文所引用的所有的出版物、專利和專利申請，在此都通過引用的方式整體引入。但是，引用所提到的出版物是出于描述和公開該出版物所報(bào)道的過程和試劑的目的，其可以與本發(fā)明結(jié)合在一起使用。此處不存在可以被解釋為承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)占先于這些在先發(fā)明所公開的內(nèi)容。除非另有說明，本發(fā)明所使用的方法為本領(lǐng)域傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞生物學(xué)和骨科手術(shù)技術(shù)。這些技術(shù)已經(jīng)記載于文獻(xiàn)中。例如參見，Coligan et al., 1999 “Current protocols in Protein Science，， 卷 I 禾口 II(John Wiley & Sons Inc. ) ；Ross et al. , 1995 "Histology :Text and Atlas，，， 第三 版，(Williams & Wilkins) ；Kruse & Patterson (eds. ) 1977 "Tissue Culture，，(Academic Press)； Canale (ed. ) 2003 “Campbell' s Operative Orthopaedics，，第 10 版· (St. Louis, Mo. MD Consult LLC)；禾口 Alberts et al. 2000 "Molecular Biology of the Cell，，(Garland Science)需要指出的是，除非上下文清楚的指示，本文和所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式 “一”包括復(fù)數(shù)。因此，例如，一種細(xì)胞的描述包括復(fù)數(shù)個(gè)這類細(xì)胞，以及一種可植入的支撐物的描述是指一種或多種可植入的支撐物，等等。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的具有相同的含義。雖然與本文所描述的那些類似或相當(dāng)?shù)娜魏尾牧虾头椒梢杂糜诒景l(fā)明的實(shí)踐或測試，但現(xiàn)在所描述的是優(yōu)選的材料和方法。在最廣泛的意義上，本發(fā)明通常涉及修復(fù)組織的方法。本文所使用的術(shù)語“組織”表示哺乳動(dòng)物細(xì)胞的集合，它們聚集在一起并專門履行特定的功能。這些細(xì)胞可以是相同類型，例如神經(jīng)組織只含有神經(jīng)細(xì)胞，或者許多不同類型，例如結(jié)締組織含有例如成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，以及暫時(shí)性的細(xì)胞類群，例如肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。特別適合于本發(fā)明的方法的組織包括上皮(上皮)組織、結(jié)締組織和肌肉組織。所有這些組織含有具有物種間共有的表型特征的的細(xì)胞。例如，所有哺乳類物種的上皮組織通常含有通過被稱為緊密連接的封閉連接連接在一起的細(xì)胞單層。更重要的是，來自任意哺乳動(dòng)物物種上皮的所有細(xì)胞具有相似的生長特性。結(jié)締組織含有一定數(shù)量所有哺乳動(dòng)物物種共有的細(xì)胞。例如，結(jié)締組織細(xì)胞含有血細(xì)胞(紅細(xì)胞和白細(xì)胞(多型核白細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞))、巨核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞(包括成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、漿細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和破骨細(xì)胞。結(jié)締組織的實(shí)例是肌腱、軟骨和韌帶。骨骼和血液是結(jié)締組織的特定實(shí)例。肌肉組織也含有具有共同的祖先和形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及表型特征的細(xì)胞(纖維細(xì)胞)。因此，本文所使用的術(shù)語“組織”是指任何需要修復(fù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的集合。本文所使用的軟組織通常是指整個(gè)身體中骨骼外圍的結(jié)構(gòu)，包括但不限于軟骨組織、半月板組織、韌帶組織、肌腱組織、椎間盤組織、牙周組織、皮膚組織、血管組織、肌肉組織、筋膜組織、骨膜組織、眼組織、心包組織、肺組織、滑膜組織、神經(jīng)組織、腎組織、骨髓、泌尿生殖組織、腸道組織、肝組織、胰腺組織、脾組織、脂肪組織以及它們的組合。軟組織病情(或缺損或疾病)是一個(gè)包容性的術(shù)語，包括急性和慢性病情、軟組織障礙或疾病。例如，該術(shù)語包括由疾病或外傷或組織未能正常發(fā)育所引起的病情。軟組織病情的實(shí)例包括但不限于疝氣、盆底缺損、撕裂或斷裂的肌腱或韌帶、皮膚傷口(如疤痕、外傷性創(chuàng)傷、缺血性傷口、糖尿病傷口、嚴(yán)重?zé)齻?、皮膚潰瘍(如褥瘡(壓力)潰瘍、靜脈潰瘍和糖尿病潰瘍)，以及例如與皮膚癌的切除相關(guān)的手術(shù)傷口)；血管病情(例如外周動(dòng)脈疾病、腹主動(dòng)脈瘤、頸動(dòng)脈疾病和靜脈疾??；血管缺損、血管發(fā)育不當(dāng))；以及肌肉疾病(如先天性肌?。恢匕Y肌無力；炎性、神經(jīng)性和生肌性肌肉疾?。灰约凹∪馕s癥，例如杜氏月Jl 肉妻縮癥(Ducherme muscular dystrophy)、貝克肌肉妻縮癥(Becker muscular dystrophy)、肌強(qiáng)直性萎縮癥、肢帶肌萎縮癥、面肩肱型肌萎縮癥、先天性肌肉萎縮癥、眼咽肌肉萎縮癥、遠(yuǎn)端肌肉萎縮癥和埃默里-德賴富斯肌肉萎縮癥)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明特別針對軟骨的修復(fù)。術(shù)語“軟骨”是指一種結(jié)締組織，其含有軟骨細(xì)胞或類軟骨的細(xì)胞(具有許多但不是所有的軟骨細(xì)胞特征)和細(xì)胞間物質(zhì)(例如，I，II，IX和XI型膠原)、蛋白聚糖(例如硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、和皮膚素硫酸蛋白聚糖)以及其它蛋白質(zhì)。軟骨包括關(guān)節(jié)和非關(guān)節(jié)軟骨。“關(guān)節(jié)軟骨”也稱為透明軟骨，是指股骨頭、關(guān)節(jié)中覆蓋骨頭的關(guān)節(jié)面的非礦化結(jié)締組織，其作為摩擦減少兩個(gè)相對的骨表面之間的界面。關(guān)節(jié)軟骨允許在關(guān)節(jié)中移動(dòng)而骨頭與骨頭不直接接觸。關(guān)節(jié)軟骨沒有骨化的傾向。軟骨表面從宏觀上看是平滑的和珍珠狀的，而在高功率放大鏡下為細(xì)顆粒狀。關(guān)節(jié)軟骨派生的營養(yǎng)成分部分來自鄰近的滑膜血管，部分是從它所覆蓋的骨頭的血管。關(guān)節(jié)軟骨與II型和IX型膠原蛋白和各種特點(diǎn)的蛋白多糖的存在相關(guān)聯(lián)的，但缺乏X型膠原蛋白，其與軟骨內(nèi)化骨的形成有關(guān)。對于關(guān)節(jié)軟骨微觀結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述參見，例如Aydelotte和Kuettner，Conn. Tiss. Res.，18， ρ· 205(1988) ； Zanetti et al. , J. Cell Biol.，101，ρ· 53 (1985)和 Poole et al.，J.Anat·， 138，p. 13(1984)。“非關(guān)節(jié)軟骨”是指關(guān)節(jié)表面沒有被覆蓋的軟骨，包括纖維軟骨(包括關(guān)節(jié)間的纖維軟骨，纖維軟骨盤，連接纖維軟骨和外周的纖維軟骨)和彈性軟骨。在纖維軟骨中，微聚糖網(wǎng)絡(luò)與突出的膠原束交錯(cuò)，并且軟骨細(xì)胞比在透明軟骨或關(guān)節(jié)軟骨更分散。在暴露于震動(dòng)和頻繁的移動(dòng)，例如膝關(guān)節(jié)半月板中，發(fā)現(xiàn)了關(guān)節(jié)內(nèi)纖維軟骨。這些關(guān)節(jié)的實(shí)例包括但不限于顳下頌關(guān)節(jié)，胸鎖，肩，腕關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)。次級(jí)軟骨(secondary cartilaginous)關(guān)節(jié)通過間盤纖維軟骨形成。這些纖維軟骨盤緊密黏附到相對的兩個(gè)表面，且由同心環(huán)的纖維組織和穿插的軟骨層組成。這種纖維軟骨盤的一個(gè)實(shí)例是脊椎的椎間盤。連接纖維軟骨的是介于這些關(guān)節(jié)骨表面之間的穿插層，該穿插層允許在椎骨和恥骨之間輕微移動(dòng)。圓周軟骨圍繞在一些關(guān)節(jié)腔的周圍，例如髖關(guān)節(jié)的臼和肩胛盂。 本文所使用的術(shù)語“修復(fù)”或語法上的同義字涵蓋修復(fù)哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人類的組織缺損。“修復(fù)”是指形成足以至少部分填補(bǔ)無效的或結(jié)構(gòu)不連續(xù)的組織缺損部位的新組織。修復(fù)并不意味或需要其它過程來完全愈合或治療，即100%有效的恢復(fù)組織缺損到缺損之前的生理/結(jié)構(gòu)/機(jī)械狀態(tài)。 術(shù)語“組織缺損”或“組織缺損部位”是指上皮、結(jié)締或肌肉組織的破壞。組織缺損導(dǎo)致組織在不理想的水平或不理想的條件下運(yùn)行。例如，組織缺損可以是肌腱的部分層或整層被撕裂，或由心肌梗塞導(dǎo)致的局部細(xì)胞死亡。組織缺損可以形成一個(gè)“空隙”，這可以理解為三維的缺損，例如在上皮，結(jié)締或肌肉組織的完整性結(jié)構(gòu)中形成裂口、空腔、孔或其他實(shí)質(zhì)性的破壞。在一些實(shí)施方式中，組織缺損是指沒有能力進(jìn)行內(nèi)源性修復(fù)或自發(fā)性修復(fù)的那些組織。組織缺損可以是由意外事故、疾病和/或手術(shù)操作引起的。例如，軟骨缺損可能是關(guān)節(jié)創(chuàng)傷引起的，例如撕裂的半月板組織移動(dòng)到關(guān)節(jié)中。組織缺損還可以是退化性疾病，如骨關(guān)節(jié)炎，引起的。在最基本的層面上，本發(fā)明涉及在組織缺損部位植入細(xì)胞。這些細(xì)胞擴(kuò)增內(nèi)源性細(xì)胞種群，并增加組織的再生和修復(fù)率。從邏輯上講，由于本發(fā)明涉及任何類型哺乳動(dòng)物的組織修復(fù)，因此所使用的細(xì)胞樣本也可能來自哺乳動(dòng)物受體的任何組織類型。例如，如果含有缺損的組織是軟骨組織， 細(xì)胞樣本將主要含有軟骨細(xì)胞，或者如果缺損的組織是肌腱，則細(xì)胞樣本將主要含有肌腱細(xì)胞。優(yōu)選的，細(xì)胞是具有在需要修復(fù)的組織中分化成多種細(xì)胞類型的能力的未成熟細(xì)胞。在另外的實(shí)施方式中，細(xì)胞是多潛能的或具有多種能力的干細(xì)胞(pluripotent or multipotent stem cell)。在另一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是全能性干細(xì)胞，該全能性干細(xì)胞具有分化成體內(nèi)任意細(xì)胞的能力。本發(fā)明的細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域公知的不同方式從組織中進(jìn)行分離。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可以通過常規(guī)的方法從解剖活體材料中分離。在下面詳細(xì)描述的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是通過酶消化進(jìn)行分離的。在一些實(shí)施方式中，含有所需的細(xì)胞的組織可以分離自任意的哺乳動(dòng)物，包括但不限于羊、牛、豬、馬、狗、貓或人。在另外的實(shí)施方式中，組織分離自人。優(yōu)選的，組織分離自與具有組織缺損同種的哺乳動(dòng)物。在另外的實(shí)施方式中，組織是“自體的”，即，分離自需要治療的受試者的身體。例如，膝蓋中軟骨撕裂的哺乳動(dòng)物可以有從他們的身體上任意軟骨得到的解剖活體，例如股骨髁的上外醫(yī)療方面。所述細(xì)胞可以從作為細(xì)胞來源的解剖活體材料中通過對組織進(jìn)行合適的處理得到。用于處理組織以分離細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，例如參見 Freshney “Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique”第 2 片反，(A. R. Liss Inc.)。例如，組織或器官可以使用機(jī)械破裂和/或使用消化酶或螯合劑處理以降低細(xì)胞的相互作用，從而有可能獲得單個(gè)細(xì)胞的懸浮液。典型的方法將包括機(jī)械破裂、酶處理和螯合劑的組合。在一個(gè)方法中，組織是攪碎的并同時(shí)地或依次地使用任意的多種消化酶單獨(dú)或聯(lián)合處理。對解離細(xì)胞有用的酶的實(shí)例包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶、鏈霉蛋白酶、分散酶，以及類似的。在一些實(shí)施方式中，含有約43nkat/ml至約51nkat/ml活性的膠原酶以及約0. 22nkat/ml至約0. 44nkat/ml活性的木瓜凝乳蛋白酶混合物的水溶液的酶組合物用于解離細(xì)胞，如美國專利No. 5，422，261所描述的。機(jī)械破裂也可以通過，例如使用攪拌機(jī)、篩、勻漿機(jī)、壓力元件(pressure cells) 以及類似的方式來完成所得到的細(xì)胞懸浮液和細(xì)胞簇可以進(jìn)一步分成基本上均一的細(xì)胞類型。這可以通過細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，例如，主動(dòng)篩選的方式(例如克隆擴(kuò)增和篩選特定的細(xì)胞類型)，被動(dòng)篩選(例如裂解不需要的細(xì)胞)，基于在濃度溶液中的特定重力、混合的類群中細(xì)胞的不同粘附特性、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或類似的方式進(jìn)行分離。其它選擇和分離細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，例如參見Freshney”Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique，，第 2 版，(A. R. Liss Inc.)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞一經(jīng)分離立即施用于可植入的支撐物上。因此，分離細(xì)胞的解剖活體過程和在缺損部位植入所分離的細(xì)胞的修復(fù)過程可以在單一手術(shù)中依次進(jìn)行?？蛇x地，在另一些實(shí)施方式中，分離的細(xì)胞在施用于可植入的支撐物之前進(jìn)行短時(shí)間的培養(yǎng)以增加細(xì)胞的數(shù)量。當(dāng)然，取決于細(xì)胞的類型，用于培養(yǎng)細(xì)胞的試劑和方法會(huì)不同。例如，如果細(xì)胞是肌肉細(xì)胞，培養(yǎng)介質(zhì)可以包括具有0.5%雞胚胎提取物和20 (體積/ 體積)％胎牛血清或馬血清的漢姆氏營養(yǎng)混合物(Ham’ s nutrient mixture)F-IO0可選地，如果細(xì)胞是上皮細(xì)胞，培養(yǎng)介質(zhì)可以包括具有約5%胎牛血清的與漢姆氏(Ham’ s)F12 介質(zhì)混合的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle Medium)。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何為不同的細(xì)胞類型選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)。此夕卜，也可以使用不同的介質(zhì)添加劑，包括抗生素、激素、生長因子、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、維生素、礦物質(zhì)以及類似的物質(zhì)。同樣的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道特定細(xì)胞類型的生長需要什么樣的添加劑。細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)長也是不同的。培養(yǎng)的時(shí)間可能取決于所培養(yǎng)細(xì)胞的類型以及所需要的細(xì)胞的數(shù)量，還有后勤方面的因素，例如何時(shí)需要細(xì)胞。但是，本發(fā)明的一個(gè)重要的方面是細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間不能長到足以影響細(xì)胞分化或細(xì)胞表型。優(yōu)選地，分離的細(xì)胞培養(yǎng)不超過約10天。然而，細(xì)胞可以培養(yǎng)約1天到約9天；約2天到約8天；約3天到約7天；約 4天到約6天；或者約5天。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)約4天。細(xì)胞不與任何類型的可植入的支撐物一起培養(yǎng)也是本發(fā)明一個(gè)重要的方面，這會(huì)降低細(xì)胞的分化和改變細(xì)胞表型。術(shù)語“可植入的支撐物”是指任何適用于細(xì)胞植入的具有或不具有黏附性的基質(zhì)或支架。舉例而非限定，所述可植入的支撐物可以是膜、微珠、織物、線狀物或凝膠，和/或它們的混合。所述可植入的支撐物可以由具有植入所需的物理或機(jī)械性能的任何材料制成，例如作為止血屏障。止血屏障阻止附屬的細(xì)胞和組織滲透到缺損治療區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，所述可植入的支撐物由半滲透材料制成，該半滲透材料可以包括交聯(lián)或非交聯(lián)的膠原，優(yōu)選是I型與III型或II型的組合。所述可植入的支撐物還可以包括天然或合成來源獲得的多肽或蛋白質(zhì)，例如透明質(zhì)酸，小腸黏膜下層(SIS)、腹膜、心包膜、聚乳酸和相應(yīng)的酸，血液(即，其是一個(gè)包括液體部分(血漿)和懸浮組分(紅細(xì)胞、 白細(xì)胞、血小板)的循環(huán)組織，或其他可生物吸收的材料。生物可吸收的聚合物，例如彈性蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白，也可以用于本發(fā)明。美國專利No. 20020173806所描述的支撐基質(zhì)或支架材料也可以用于本發(fā)明，通過引用的方式將其整體納入本文。所述可植入的支撐物優(yōu)選起先(即在于待植入的細(xì)胞接觸前)不含有完整細(xì)胞， 并且優(yōu)選在哺乳動(dòng)物內(nèi)能再吸收。所述可植入的支撐物可以有一個(gè)或多個(gè)表面，例如多孔表面、致密表面或者兩者的結(jié)合。可植入的支撐物還可以含有半滲透、不滲透或全滲透的表面。例如在美國專利No. 6，569，172中已經(jīng)描述了具有多孔表面的支撐支架，其通過引用的方式整體納入本文。所述可植入的支撐物可以是自體或異體的。在一些實(shí)施方式中，合適的自體可植入的支撐物是由血液形成的，例如美國專利No. 6，368，298，其由Berretta, et al.于2002 年4月9日提交，其通過引用的方式整體納入本文。合適的可植入的支撐物可以是固體、半固體、凝膠或類似于凝膠的支架，其特點(diǎn)是能夠保持一段時(shí)間的穩(wěn)定形式使得細(xì)胞能夠粘附和/或生長。在美國專利No. 20020173806 中公開了合適的可植入的支撐物的實(shí)例，其通過引用的方式整體納入本文。其它用于肌腱細(xì)胞生長的合適的可植入的支撐物的實(shí)例包括Vitrogen ( — 種含有膠原蛋白的溶液膠化形成的細(xì)胞填充的基質(zhì))，以及Hwang(美國專利申請 No. 20040267362)、Kladaki 等(美國專利申請 No. 20050177249)、Giannetti (美國專利申請No. 20040037812)和Binette等(美國專利申請No. 20040078077)的結(jié)締組織支架；所有這些都通過引用的方式并入本文。所述可植入的支撐物可以切割或成型成任何規(guī)則或不規(guī)則的形狀。在一些實(shí)施方式中，所述可植入的支撐物可以剪切成與撕裂的形狀相對應(yīng)的形狀。所述可植入的支撐物的形狀可以是平面的、圓形和/或圓柱形的。所述可植入的支撐物的形狀還可以被修飾成與所需要修復(fù)的特定缺損的形狀相適應(yīng)。如果所述可植入的支撐物是纖維材料，或者具有纖維的特征，則支撐基質(zhì)可以編織成所期望的形狀?？蛇x地，生物支架可以是凝膠、凝膠類似物或非編織材料。在一些實(shí)施方式中，所述可植入的支撐物含有豬來源的I/III型膠原，例如ACI Matrix 0在另一些實(shí)施方式中，可植入的支撐物含有小腸粘膜下層，例如Restore 。將分離的樣品份的細(xì)胞施用于所述可植入的支撐物，以制備“可植入的基質(zhì)”。與傳統(tǒng)方法不同，本發(fā)明的方法需要在可植入的基質(zhì)使用之前2小時(shí)內(nèi)，將所述樣品份的細(xì)胞施用于所述可植入的支撐物上。正如在其它部分討論過的，傳統(tǒng)方法需要在植入之前將細(xì)胞與可植入的支撐物一起培養(yǎng)幾天。但是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在2小時(shí)內(nèi)就可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞100%黏附到可植入的支撐物上，并且相比于細(xì)胞不存在可植入的支撐物的情況下培養(yǎng)，細(xì)胞與可植入的支撐物，例如膠原支架，一起培養(yǎng)具有更低的活性。因此，本發(fā)明還涉及在細(xì)胞和可植入的支撐物植入之前，通過將用于植入的細(xì)胞與可植入的支撐物接觸小于2小時(shí)以增加用于植入的細(xì)胞活性的方法。測量細(xì)胞類群的活性的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的。例如，可以測量凋亡標(biāo)志物的表達(dá)。本文所用的術(shù)語“凋亡標(biāo)志物”是指當(dāng)細(xì)胞在凋亡時(shí)所表達(dá)的基因或相應(yīng)的產(chǎn)物。因此，高活性的細(xì)胞系相比于低活性的細(xì)胞系會(huì)有更少的凋亡標(biāo)志物的表達(dá)。凋亡標(biāo)志物的實(shí)例包括基質(zhì)金屬蛋白酶(例如MMP-I，MMP-9，MMP-13)、ADAMTS-4、IL_1、c_fos、 c-jun、0ct3/4 禾口 Sox2。其它現(xiàn)有技術(shù)的方法，例如美國專利申請No. 2002/0155096(以下為"US2002/0155096")所公開的那些，描述了在植入之前直接地或迅即地將干細(xì)胞施用于支架上。但是，US2002/0155096所使用的時(shí)間是由于所使用的海藻酸基質(zhì)浸泡在細(xì)胞溶液中的時(shí)間太長會(huì)變?nèi)?實(shí)施例5，第7頁)。相反，本方法需要在植入之前將細(xì)胞應(yīng)用到支撐物周圍至少15-20分鐘使得足夠數(shù)量的細(xì)胞粘附到支撐物上。在植入前的約7分鐘內(nèi)將細(xì)胞施用于支撐物上，可能導(dǎo)致大量的細(xì)胞在植入時(shí)從支撐物上脫落，這可能導(dǎo)致不理想的組織修復(fù)。在植入式基質(zhì)植入之前，基質(zhì)可以用細(xì)胞密封劑包覆。細(xì)胞密封劑可以使得細(xì)胞喂養(yǎng)支架來附著到治療的區(qū)域，例如組織缺損區(qū)域。細(xì)胞密封劑還可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和遷移到缺損區(qū)域(例如參見 Kirilak & Zheng et al. ,2006, Int. J. Mo 1. Med. , 17(4) :551-8, 通過引用的方式納入本文)。細(xì)胞密封劑可以是各種天然的和合成的試劑，包括纖維蛋白密封劑，海洋膠粘劑(marine adhesives)，膠原蛋白織物，明膠海綿，氰基丙烯酸酯衍生物和包括葡聚糖衍生物的葡萄糖聚合物。本發(fā)明所使用的細(xì)胞密封劑隨著所修復(fù)的組織而變化。例如，氰基丙烯酸酯是許多細(xì)菌的抑菌劑，因此常用于牙周和口腔手術(shù)。已經(jīng)確認(rèn)牛白蛋白和戊二醛膠(BioGlue ；CryoLife Inc.，Kennesaw，Georgia)用于急性胸主動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤的手術(shù)修復(fù)中。纖維蛋白密封劑，也指“纖維蛋白膠”或“纖維蛋白組織粘附劑”，含有純化的，病毒滅活的人纖維蛋白原、人凝血酶，有時(shí)有附加組分，例如病毒滅活的人因子XIII 和牛抑肽酶。纖維蛋白密封劑目前用在一些手術(shù)領(lǐng)域，包括心血管手術(shù)、胸外科手術(shù)、神經(jīng)手術(shù)、塑形和整形手術(shù)以及牙科手術(shù)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞密封劑是葡萄糖聚合物和多聚賴氨酸的組合，從而增強(qiáng)了手術(shù)過程中細(xì)胞的附著并減少了流血。一旦組裝，所述可植入的基質(zhì)通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方式固定就位，例如縫合、縫合錨、骨內(nèi)固定器械和骨或生物可降解的聚合物螺絲。在需要接種細(xì)胞的支架來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的非包含缺損的情況下，生物可降解的螺絲可以與纖維蛋白膠組合使用以確保支架附著到缺損上。本發(fā)明實(shí)施方式中所公開的組合物可以是試劑盒的一部分。典型的試劑盒也應(yīng)該包括使用說明書。本發(fā)明將僅僅是通過引用下面的非限定性實(shí)施例來進(jìn)一步描述。然而應(yīng)該理解的是，接下來的實(shí)施例僅僅是示例性的，其不應(yīng)當(dāng)以任何方式限定上文所概括性描述的本發(fā)明。特別的，當(dāng)本發(fā)明的詳細(xì)描述涉及軟骨的修復(fù)時(shí)，其可以清楚的理解本文的發(fā)現(xiàn)不限于軟骨的修復(fù)本身，還包括修復(fù)上文所描述的任何組織。實(shí)施例1采用自體細(xì)胞和可植入的支撐物治療軟骨缺損從關(guān)節(jié)的非負(fù)重區(qū)切除IOOg軟骨片，并放置到無血清營養(yǎng)介質(zhì)中。每一個(gè)解剖活體含有約100到200千個(gè)細(xì)胞，通過專利PCT/AU2007/000362 (題為“Tenocyte CultureMethod”，由Zheng所作，其通過引用的方式整體納入本文)中所描述的方法在體外擴(kuò)增到接近10兆個(gè)細(xì)胞。在獲得可接受的細(xì)胞濃度之后，細(xì)胞被重組到一個(gè)密封的玻璃容器中的患者自身的血清中，并轉(zhuǎn)移到用于植入的區(qū)域。到達(dá)手術(shù)室后，將細(xì)胞重新加熱到37°C并用23號(hào)針注射到支架的表面。所使用的是前文所描述的典型的含有膠原蛋白且具有或不具有聚賴氨酸涂層的支架。在細(xì)胞注射到支架之后，細(xì)胞鋪展到支架上并且在植入前允許不超過2小時(shí)的培養(yǎng)。細(xì)胞鋪展的時(shí)間控制允許細(xì)胞附著，但不會(huì)錨定到支架中，從而在種植細(xì)胞的支架植入之后細(xì)胞能夠迅速的遷移到軟骨缺損區(qū)域。如圖1所示，有(深色塊)和沒有(淺色塊)膠原支架時(shí)人類細(xì)胞生長時(shí)基因表達(dá)的數(shù)量有顯著的差異Γ = P < 0.05)。特別的，細(xì)胞與膠原支架一起生長時(shí)產(chǎn)生較少的 I型和II型膠原和較多的匪 -1、匪 -9、匪卩-13^0六10^-4、11^-1、(；-偽8、(；-如11、0(^3/4和 Sox2，這些是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物。這些結(jié)果顯示細(xì)胞在可植入的支撐物上培養(yǎng)比沒有可植入的支撐物時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞具有更低的活性。圖2顯示，在與支架接觸的7分鐘內(nèi)，大量的細(xì)胞粘附到支架上。在40分鐘內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)100%的細(xì)胞粘附到支架上。在20分鐘時(shí)，90%的細(xì)胞黏附到支架上。因此，這些結(jié)果顯示在植入之前通過將細(xì)胞與可植入的支撐物接觸2小時(shí)內(nèi)就可以實(shí)現(xiàn)高水平的粘附。 然而，這些結(jié)果也表明在植入前細(xì)胞應(yīng)該與可植入的支撐物接觸至少7分鐘以允許足夠數(shù)量的細(xì)胞粘附到支架上。
權(quán)利要求
1.一種修復(fù)組織的方法，該方法包括如下步驟(a)提供可植入的支撐物和樣品份的細(xì)胞；(b)將所述樣品份的細(xì)胞施用于所述支撐物上，以制備可植入的基質(zhì)；以及(c)在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的2小時(shí)內(nèi)，植入所述基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，需要修復(fù)的組織是上皮、結(jié)締組織或肌肉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，需要修復(fù)的組織是結(jié)締組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述結(jié)締組織是選自由軟骨、骨或肌腱組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是自體的或異體的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是軟骨細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞分離自哺乳動(dòng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是選自由羊、牛、豬或人組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是自體的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述可植入的支撐物包括膜、 支架、織物、線狀物或凝膠。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述可植入支撐物包括膠原支^K O
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的5分鐘到約1小時(shí)50分鐘之間植入所述基質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的至少約7分鐘時(shí)植入所述基質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的至少約15分鐘時(shí)植入所述基質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的15分鐘到約1小時(shí)30分鐘之間植入所述基質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的至少約20分鐘時(shí)植入所述基質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的30分鐘到約1小時(shí)10分鐘之間植入所述基質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的約40分鐘時(shí)植入所述基質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，該方法進(jìn)一步包括在植入前使用細(xì)胞密封劑包覆所述基質(zhì)的步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述細(xì)胞密封劑是纖維蛋白密封劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在施用所述細(xì)胞之前，將所述可植入的支撐物加熱到35°C到37°C之間。
23.一種修復(fù)組織的方法，該方法包括如下步驟 (a)提供膠原支架和樣品份的含有軟骨細(xì)胞的細(xì)胞；(b)將所述膠原支架加熱到35°C到37°C之間；(c)將所述細(xì)胞施用于加熱后的膠原支架上，以制備可植入的基質(zhì)；(d)使用纖維蛋白密封劑包覆所述基質(zhì)；以及(e)在將所述細(xì)胞施用于所述膠原支架上后的約40分鐘時(shí)，植入所述基質(zhì)。
24.一種增加用于植入的細(xì)胞的活性的方法，該方法包括將樣品份的所述細(xì)胞施用于可植入的支撐物上，以制備可植入的基質(zhì)；以及在將所述細(xì)胞施用于所述支撐物上后的2 小時(shí)內(nèi)，植入所述基質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中，植入的細(xì)胞具有大于90%的活性。
26.根據(jù)權(quán)利要求M或25所述的方法，其中，植入的細(xì)胞具有大于95%的活性。
27.根據(jù)權(quán)利要求M至沈中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，植入的細(xì)胞具有大于99%的活性。
28.根據(jù)權(quán)利要求M至27中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞具有較低的凋亡標(biāo)志物的表達(dá)。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述凋亡標(biāo)志物選自由MMP-I、MMP-9、MMP-13、 ADAMTS-4、IL-1、c-fos、c_jun、0ct3/4 和 Sox2 組成的組。
30.一種用于修復(fù)組織的試劑盒，該試劑盒包括(a)可植入的支撐物；以及(b)試劑盒組分的使用說明書，其中，該使用說明書建議在植入前2小時(shí)內(nèi)，將樣品份的細(xì)胞施用于所述支撐物上。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中，所述試劑盒進(jìn)一步包括樣品份的細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的試劑盒，其中，所述試劑盒進(jìn)一步包括細(xì)胞密封劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及修復(fù)組織的方法。更具體地，本發(fā)明涉及使用細(xì)胞和可植入的支撐物以修復(fù)組織缺損的方法，其中，在所述細(xì)胞施用于所述支撐物上2小時(shí)內(nèi)，將所述可植入的支撐物和細(xì)胞植入到所述組織缺損中。
文檔編號(hào)A61K35/12GK102481318SQ201080014123
公開日2012年5月30日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者鄭銘豪 申請人:昊圖細(xì)胞私人有限公司