專利名稱：四氫生物蝶呤作為法布里病的標(biāo)記物和治療劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般來說，本發(fā)明涉及新的生物標(biāo)記物和治療劑領(lǐng)域，更具體地，涉及輔因子四氫生物蝶呤(BH4)作為法布里病(Fabry' s disease)的生物標(biāo)記物和治療劑的用途。
背景技術(shù)：
在不限制本發(fā)明范圍的情況下，結(jié)合四氫生物蝶呤(BH4)在法布里病中的用途來描述本發(fā)明的背景，所述的四氫生物蝶呤(BH4) :(i)作為診斷和該疾病的嚴(yán)重程度的新的生物標(biāo)記物，(ii)作為跟蹤多種療法的代謝糾正，和(iii)作為法布里病的替代療法。第20020052374號美國專利申請(Rabelink等人，2002)描述了至少葉酸或葉酸鹽和四氫生物蝶呤(BH4)或其衍生物通過以下方式來治療或預(yù)防心血管疾病或神經(jīng)系統(tǒng)疾病的用途，所述的用途以適用于影響一氧化氮(NO)水平的藥物制劑的形式通過調(diào)節(jié)一氧化氮合酶(N0Q的活性進(jìn)行，特別是通過減少過氧化物(O2)生成和增強(qiáng)一氧化氮(NO)合成的方式來調(diào)節(jié)一氧化氮合酶(N0Q的活性。第2008075959 號和第 2008075957 號 WIPO 公布(Aerts，2008)公開了能診斷法布里病的致病因子。特別地，基于血漿中致病因子的鑒定，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)溶血神經(jīng)酰胺三己糖苷 (溶血-CTH)作為法布里病的診斷標(biāo)記物和法布里病的改進(jìn)療法有效。第20050197341號美國專利申請(Woolf等人，2005)教導(dǎo)了這樣的方法，即通過給予降低四氫生物蝶呤(BH4)生物活性的組合物治療、減輕或預(yù)防哺乳動物外周神經(jīng)損傷的疼痛或者癥狀或發(fā)展，所述組合物的量足以治療、降低或預(yù)防由于BH4的過度產(chǎn)生而引起的外周神經(jīng)損傷的疼痛或惡化。第4，774，244號美國專利(Curtius等人，1988)教導(dǎo)了 L-赤_5，6，7，8-四氫生物蝶呤、L-墨蝶呤、1’，2' - 二乙酰-5，6，7，8-四氫生物蝶呤和6-甲基_5，6，7，8-四氫蝶呤的使用可以用于帕金森病患者和抑郁癥患者的治療處理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了血液和組織中BH4水平的測定。所測定的水平作為法布里病的嚴(yán)重程度和并發(fā)癥的風(fēng)險的標(biāo)記，并且還作為用于跟蹤法布里病的各種治療的代謝糾正 (metabolic correction)的標(biāo)記。本發(fā)明還描述了 BH4作為法布里病有用的療法的替代。在主要的實施方案中，本發(fā)明是診斷法布里病的方法，所述方法包括以下步驟 (i)從疑似患有法布里病的受試者中收集樣品；(ii)比較疑似患有法布里病的受試者與未患有法布里病的正常受試者的樣品中四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平；和(iii)基于受試者和正常受試者之間的樣品中四氫生物蝶呤 (BH4)、其前體、代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的統(tǒng)計學(xué)上的顯著降低，確定受試者是否患有法布里病。所述用于測定四氫生物蝶呤(BH4)、其前體、代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的樣品是生物流體樣品，并且用于測定四氫生物蝶呤(BH4)、其前體、代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的分析技術(shù)是高壓液相色譜(HPLC)方法。
在本發(fā)明的一個方面，所述相關(guān)的輔因子包括有機(jī)輔因子、含有黃素的輔因子、含有血紅素的輔因子、無機(jī)輔因子、含有金屬離子的輔因子、鐵硫簇或它們的任何組合。在另一個方面，在疑似患有法布里病的受試者中測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體、代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平與正常受試者相比，降低了 20^^30^^40^^50%, 60%、80%、90% 和 100%。本發(fā)明的另一個實施方案涉及監(jiān)測治療干預(yù)對患有法布里病的受試者的療效的方法。所述方法涉及以一次或多次預(yù)定的間隔，給予受試者一種或多種藥物組合物，其中， 所述藥物組合物包含一種或多種抗法布里病的治療劑；從受試者中收集樣品；比較來自疑似的受試者的樣品中與在治療干預(yù)開始之前相同受試者的樣品中四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平；和基于測定的來自治療干預(yù)開始之前和之后的受試者的樣品中四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，確定治療干預(yù)是否有效。從所述的受試者中收集的樣品是生物流體樣品。在相關(guān)的方面，所述方法包括基于測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，終止或繼續(xù)治療干預(yù)的步驟。在再一個方面，所述方法涉及基于在治療干預(yù)開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，改變治療干預(yù)的步驟，其中所述改變包括一種或多種藥物組合物的劑量、頻率或劑量和頻率二者的增加或減少。在一個方面，所述的治療干預(yù)包括酶替代療法、止痛藥療法、透析、器官移植、飲食改變或它們的任何組合。在另一個方面，采用高壓液相色譜(HPLC)方法來確定四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種。在再另一個方面，所述相關(guān)的輔因子包括有機(jī)輔因子、含有黃素的輔因子、含有血紅素的輔因子、無機(jī)輔因子、含有金屬離子的輔因子、鐵硫簇或它們的任何組合。在再一個方面，在接受治療干預(yù)的受試者中測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平大于在所述療法治療開始之前在相同受試者中測定四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平。在本發(fā)明的重要實施方案中描述了治療患病受試者中的法布里病的藥物組合物， 所述的藥物組合物包含溶解、分散或懸浮在水溶劑或非水溶劑中的治療有效量的四氫生物蝶呤(BH4)，其前體、衍生物或鹽中的至少一種，所述的治療有效量足以治療法布里??； 溶解、分散或懸浮在水溶劑或非水溶劑中的一種或多種任選的相關(guān)的輔因子、蛋白質(zhì)、抗體、止痛藥和其他藥學(xué)活性劑；和一種或多種任選的賦形劑、填充劑、稀釋劑、緩釋或控釋劑、膨脹劑、抗粘合劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑或它們的任何組合。在相關(guān)的方面，所述的藥物組合物經(jīng)灌注、經(jīng)皮下、靜脈內(nèi)、腹腔、口腔和肌肉內(nèi)給予。在一個方面，與未服用所述藥物組合物的受試者的樣品相比，所述的藥物組合物增加了在服用所述藥物組合物的受試者的樣品中測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平。在又一個方面，本發(fā)明描述了在一個或多個受試者中治療法布里病的方法，所述方法包括以下步驟(i)鑒定需要抗法布里病治療的一個或多個受試者；和(ii)給予一種或多種藥物組合物，所述藥物組合物治療包含治療有效量的四氫生物蝶呤(BH4)，其前體、衍生物或鹽中的至少一種以及一種或多種相關(guān)的輔因子，所述的治療有效量足以治療法布里病。作為上述實施方案的進(jìn)一步的延伸，所述方法還包括監(jiān)測在給予藥物組合物之后法布里病的進(jìn)展的步驟，其中所述監(jiān)測包括在治療之后測定四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平以及將所測定的水平與治療之前所測定的水平進(jìn)行比較。在相關(guān)的方面，所述方法還包括基于在治療開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，終止或繼續(xù)治療的步驟。在再一個方面，所述方法還包括基于對治療開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤 (BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，改變治療的步驟，其中所述改變包括一種或多種藥物組合物的劑量、頻率或劑量和頻率二者的增加或減少。


為了更完整地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)參考本發(fā)明的詳述以及所附的圖，其中圖IA是HPLC色譜圖，顯示了 BH4的標(biāo)準(zhǔn)溶液中BH4的峰；
圖IB是HPLC色譜圖，顯示了小鼠血漿樣品中BH4的峰；圖2是用WT和KO小鼠血漿樣品的BH4水平的統(tǒng)計分析和散點(diǎn)圖；圖3是用WT和KO小鼠心臟組織樣品的BH4水平的統(tǒng)計分析和散點(diǎn)圖。發(fā)明描述盡管在下文中詳細(xì)討論了制備和應(yīng)用本發(fā)明的不同的實施方案，應(yīng)該認(rèn)識到本發(fā)明提供了多個可實施的發(fā)明構(gòu)思，所述的發(fā)明構(gòu)思可以在大范圍內(nèi)的具體環(huán)境下實施。在此討論的具體實施方案僅僅說明了制備和使用本發(fā)明的具體方式，而不限制本發(fā)明的范圍。為了便于理解本發(fā)明，在下文中定義了多個術(shù)語。在此定義的術(shù)語與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般地理解的意義一致。術(shù)語如“一個”、“一種”以及“該”無意于僅指單個的實體，而是包括可以用于解釋說明的具體例子的大類。該術(shù)語在此用于描述本發(fā)明的具體實施方案，但是其使用不限制本發(fā)明，除非在權(quán)利要求中概述。如本文所使用的，術(shù)語“X連鎖疾病”是指由X染色體上的基因發(fā)生突變而引起的疾病。X連鎖疾病可以是顯性的(例如，Rett綜合征、2型色素失調(diào)癥、艾卡爾迪綜合征、克萊恩費(fèi)爾特綜合征等)或隱性的(例如，血友病A、迪歇納氏肌營養(yǎng)不良(Ducherme muscular dystrophy)、萊-萘二氏綜合征、男性型脫發(fā)、紅綠色盲等)。術(shù)語“鞘糖脂”表示鞘氨基醇或N-?；拾贝嫉暮穷惖难苌?，其中糖殘基通過糖苷鍵與鞘氨基醇的0-1連接。術(shù)語“鞘氨基醇”表示長鏈脂肪族氨基醇。根據(jù)各個烯屬中心(olefinic center)的位置和構(gòu)型對鞘氨基醇的不飽和衍生物進(jìn)行了定義。如本文所使用的術(shù)語“ α -半乳糖苷酶”是指水解糖脂和糖蛋白的末端α -半乳糖部分的糖苷水解酶。如本文所使用的，術(shù)語“酶”一般指催化生物化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。這些 “生物聚合物”包括以酰胺連接的氨基酸并且一般地具有5000或更大的分子量。特定的酶所催化反應(yīng)的化合物一般地稱之為該酶的“底物”。一般來說，已經(jīng)認(rèn)識到的有6類或6種類型的酶(其按照所催化的反應(yīng)的類型進(jìn)行分類)。催化還原/氧化或氧化還原反應(yīng)(redox reaction)的酶一般稱之為ECl (1類酶)氧化還原酶類。催化特定基或基團(tuán)的轉(zhuǎn)移的酶一般稱之為EC2轉(zhuǎn)移酶類。催化水解作用的酶一般稱之為EC3水解酶類。催化特定化學(xué)基團(tuán)的底物的去除或添加的酶一般稱之為EC4裂解酶類。催化異構(gòu)化的酶一般稱之為EC5異構(gòu)酶類。催化底物單元組合或結(jié)合在一起的酶一般稱之為EC6連接酶類。術(shù)語“酶替代療法”(ERT)是指替代受試者或患者中的酶的醫(yī)學(xué)治療，在所述的受試者或患者中特定的酶缺乏或不存在。通常，酶替代療法通過給予患者含有酶的靜脈內(nèi) (IV)輸注液來實現(xiàn)(例如，患有一些溶酶體疾病如戈謝病、法布里病、MRS I、MPS VI和II 型糖原貯積病的患者)。ERT不“治療”潛在的疾病，僅治療癥狀。如本文中所使用的，術(shù)語“生物標(biāo)記物”指體內(nèi)的具體生物化學(xué)物質(zhì)，其具有特定的分子結(jié)構(gòu)，從而使其在診斷和測定疾病的進(jìn)展或者治療的效果中有用。例如，在人的呼吸中所發(fā)現(xiàn)的普通代謝物或者生物標(biāo)記物，以及提供該代謝物的人的相應(yīng)的診斷狀況包括但不限于乙醛(來源乙醇、X-蘇氨酸；診斷醉酒)，丙酮(來源乙酰乙酸鹽；診斷飲食/ 糖尿病)，氨(來源氨基酸的脫氨基作用；診斷尿毒癥及肝臟疾病)，CO (—氧化碳)(來源=CH2Cl2,升高的％ COHb ；診斷室內(nèi)空氣污染)，氯仿(來源鹵化物)，二氯苯(來源鹵化物)；二乙胺(來源膽堿；診斷腸道細(xì)菌過度生長)，H(氫)(來源腸；診斷乳糖不耐受性)，異戊二烯(來源脂肪酸；診斷代謝壓力)，甲硫醇(來源甲硫氨酸；診斷腸道細(xì)菌過度生長)，2- 丁酮(來源脂肪酸；診斷室內(nèi)空氣污染/飲食)，鄰-甲苯胺(來源 癌代謝物；診斷支氣管癌)，戊烷硫化物和硫化物(來源脂質(zhì)過氧化；診斷心肌梗死)， H2S (來源代謝；診斷牙周病/排卵)，MeS (來源代謝；診斷肝硬化)以及Me2S (來源 感染；診斷壞死性潰瘍性齦炎)。術(shù)語四氫生物蝶呤(BH4)或其衍生物是指四氫生物蝶呤的所有天然和非天然的立體異構(gòu)形式、其藥學(xué)相容性鹽以及同分異構(gòu)體和鹽的任意混合物。術(shù)語四氫生物蝶呤還包括四氫生物蝶呤的任何前體，尤其是7，8-二氫生物蝶呤。(6R)-四氫生物蝶呤是天然存在的芳香族氨基酸羥化酶的輔因子并與三種常規(guī)的芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和血清素的合成有關(guān)。其對于一氧化氮合成酶催化的L-精氨酸氧化為L-瓜氨酸和一氧化氮也是必需的。四氫生物蝶呤還與許多其他生物化學(xué)功能有關(guān)。如本文所使用的，術(shù)語“治療(treatment)”或“治療(treating) ”意思是本發(fā)明的化合物的任何給藥并且包括(1)抑制動物疾病，所述的動物患有或者表現(xiàn)出疾病的病理或者癥狀(即，抑制病理和/或癥狀的進(jìn)一步發(fā)展)，或( 緩解動物疾病，所述的動物經(jīng)歷或者表現(xiàn)出疾病的病理或者癥狀(即，逆轉(zhuǎn)病理和/或癥狀的發(fā)展)。如本文所使用的術(shù)語“血漿”是指包括懸浮的紅血細(xì)胞、白血細(xì)胞和血小板的蛋白質(zhì)流體。血漿占總血體積的約55%。血漿是細(xì)胞外流體的血管內(nèi)流體部分。血漿中大部分是水(按體積計為90%)并且包含溶解的蛋白質(zhì)、葡萄糖、凝血因子、礦物離子、激素和二氧化碳(血漿是排泄產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的主要介質(zhì))。如本文所使用的術(shù)語“高效液相色譜”(HPLC)是指在填充了基質(zhì)(3至5微米)的柱子中，在高壓(約500-3500psi)下分子的分離。根據(jù)分子的物理特性，例如分子的大小、 形狀、電荷、疏水性、以及對其他分子的親和性來分離分子。一般來說，將待分離的組分在兩個相之間進(jìn)行分配固定相床和經(jīng)固定床滲出的流動相。不同組分的混合物進(jìn)入色譜過程，并不同組分以不同的速度沖洗通過該系統(tǒng)。隨著該混合物經(jīng)吸附物質(zhì)運(yùn)動，這些不同的遷移速度使得分離進(jìn)行。發(fā)生在樣品經(jīng)過固定床移動過程中的重復(fù)的吸附/解吸附作用決定了所述的速度。分子與固定相的親和性越小，在柱子中花費(fèi)的時間越短。法布里病是由α-半乳糖苷酶A的缺乏而引起的鞘糖脂相關(guān)的X-連鎖疾病。法布里病是發(fā)生全身性血管病、進(jìn)展性腎病、許多心臟并發(fā)癥和缺血性卒中的危險因素。數(shù)十年來，其是沒有良好的生物標(biāo)記物的慢性疾病。本發(fā)明人之前的研究已表明，尤其是在血管壁和血管內(nèi)皮細(xì)胞中非-一氧化氮 (NO)活性種(例如過氧化物)的生成增加，這種增加可能是由于內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS) 的功能障礙。BH4是正常eNOS活性的必需因子。在BH4缺乏的現(xiàn)象中，eNOS由生產(chǎn)NO轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)生氧自由基，所述的氧自由基增加血管中的氧化劑應(yīng)激，引起血管損傷。在心臟中，在慢性壓力負(fù)荷的心臟和小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了 BH4的缺乏，而BH4的補(bǔ)充逆轉(zhuǎn)了相同模型中的心臟異常。酶替代療法是法布里病唯一可利用的特異療法。然而， 該治療的療效有限，尤其是在心臟表現(xiàn)方面并且其不預(yù)防卒中。還沒有對評價疾病的進(jìn)展有用的生物標(biāo)記物或者可以作為用于評價治療干預(yù)的療效的替代標(biāo)記物的生物標(biāo)記物。在本發(fā)明進(jìn)行的研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在GLA(編碼α-半乳糖苷酶A的基因)的完全敲除的法布里病小鼠模型中，血液(減少34%)和心臟(減少48%)中的ΒΗ4顯著地缺乏。利用動物模型檢測血漿和組織中ΒΗ4的分析方法使用清楚描述的小鼠模型來檢測血漿和組織中的BH4(Ref.)。所述的小鼠是美國國家神經(jīng)疾病和中風(fēng)研究院開發(fā)的具有遺傳背景C57/bl6X U9/SVJ的原始群體的后代。使用五月齡雄性小鼠。使用相同遺傳背景的年齡和性別匹配的對照小鼠。原理該分析方法依賴于BH4的反相HPLC分離及電化學(xué)檢測。監(jiān)測在電解還原槽上產(chǎn)生的電流，并且基于具有外標(biāo)的系統(tǒng)的校準(zhǔn)，將該電流用于確定生物樣品中BH4的濃度。儀器HPLC泵和冷卻的自動進(jìn)樣器得自Shimadzu (LC-10AT VP系列，SIL-10A)。 電化學(xué)檢測器、分析池(analytical cell)和調(diào)節(jié)池(conditioning cell)得自ESA(分別是 ESA Coulochem II EC Detector、ESA Model 501 IAAnalytical Cell 禾Π ESA Model 5021Conditioning Cell)。HPLC 柱和保護(hù)柱得自 Phenomenex (分別是 Synergi Hydro-RP 250x 3. Omm 4 μ 禾口 Synergi Hydro-RP4x 3. Omm 4μ)。通過 Shimadzu 軟件Class VP Version 7. 4 來控制 HPLC?；瘜W(xué)品和試劑在本分析中使用的所有化學(xué)品和試劑均購自Sigma/Aldrich Chemical Co·。四氫生物蝶呤(6R) _5，6，7，8-四氫L-生物蝶呤二鹽酸鹽、0. 4M高氯酸、二硫赤蘚糖醇、二乙烯三胺五乙酸(DETAPAC)、三水乙酸鈉、檸檬酸鈉和乙二胺四乙酸(EDTA， 2H20)。運(yùn)行條件將流速設(shè)為0. 5ml/min并且進(jìn)樣體積為5μ 1。將柱保持在環(huán)境室溫下。 色譜運(yùn)行時間為15分鐘。試劑和標(biāo)準(zhǔn)物的制備在1升玻璃容器中，流動相由溶解于800mlMiIli-Q水的 6. 8g乙酸鈉、1. 05g檸檬酸、20mg EDTA和IOOmg二硫赤蘚糖醇組成。將該溶液轉(zhuǎn)移至1000ml 容量瓶中并調(diào)節(jié)體積至1升以制備流動相。將該流動相使用氦氣脫氣10分鐘并且用鋁箔將容器頂部包緊。將溶液轉(zhuǎn)移至HPLC流動相容器中。通過將20mg DTE和20mg DETAPAC溶解于IOml PCA (0. 4M)中，接著超聲處理10 分鐘以完全溶解，從而制備脫蛋白溶液A。通過將20mg DTE和20mg DETAPAC溶解于IOml Milli-Q水中，接著超聲處理10 分鐘以完全溶解，從而制備稀釋溶液B。BH4校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液在使用的每一天新鮮制備。將1 2(V/V)的樣品稀釋液/脫蛋白溶液加入到最終為0J66M PCA(稀釋液A)中。BH4的儲備溶液稀釋如下。將100 μ 1 250 μ M的ΒΗ4加入到900 μ 1的新鮮0. 266Μ PCADTE/DETAPAC溶液中并通過渦流混合均勻 (標(biāo)準(zhǔn)溶液B)。將100 μ 1的標(biāo)準(zhǔn)溶液B加入到900 μ 1的新鮮0. 266Μ PCADTE/DETAPAC中并通過渦流混合均勻。通過將100 μ 1的2. 5 μ M ΒΗ4標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到900 μ 1的新鮮0. 266Μ PCA DTE/DETAPAC中并通過渦流混合均勻來制備(83. 3ηΜ ΒΗ4)的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。將50 μ 1 的250ηΜ標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到100 μ 1的稀釋溶液B中并通過渦流混合均勻。工作標(biāo)準(zhǔn)液可以在4°C下冷藏多達(dá)8小時。血漿樣品的制備利用含有5mg EDTA的結(jié)核菌素注射器，通過心臟穿刺獲得血液，并立即將血液轉(zhuǎn)移到包含ang DTE和ang DETAPAC的收集管中。通過在4°C下，在 8000rpm下離心5分鐘來處理血液從而得到血漿。向50 μ L血漿或工作標(biāo)準(zhǔn)溶液Q50nm)中加入100 μ L脫蛋白溶液A并且通過渦流混合均勻，接著在4°C下，在14800rpm下離心5分鐘。將50 μ L血漿上清液加入到100 μ L的稀釋溶液B中并且通過渦流混合均勻。將5 μ L 的該血漿樣品注射到HPLC系統(tǒng)中。肝臟、腎臟和心臟組織的制備將從一氧化碳窒息處死的小鼠中得到的組織通過放置在干冰上立即冷凍并在-80°C下儲存直至分析時。在分析之日，采用1 5的脫蛋白溶液A稀釋，對該組織進(jìn)行組織勻漿并在4°C下，在14800rpm下離心5分鐘。將100 μ L澄清的上清液去除并加入到100 μ L的樣品稀釋溶液B中并且通過渦流混合均勻，接著注射5 μ L 至HPLC系統(tǒng)中。ΒΗ4濃度的計算以外部83.3ηΜ ΒΗ4標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)系統(tǒng)。為了計算血漿濃度，將讀出的值乘以9從而得到以nmol/L計的最終值。為了計算組織中的濃度，將讀出的值乘以10 從而得到以nmol/L計的值，然后將該值除以1000從而得到以nmol/g計的值。圖IA和圖IB是HPLC色譜圖，顯示了在BH4的標(biāo)準(zhǔn)溶液中BH4的峰和在小鼠血漿樣品中BH4的峰。圖2和圖3顯示了分別用WT和KO小鼠血漿和心臟組織樣品的BH4水平的統(tǒng)計分析和散點(diǎn)圖。預(yù)期的是，本說明書中所討論的任何實施方案可以通過關(guān)于本發(fā)明的任何方法、 試劑盒、試劑或組合物來實施，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物可以用于實現(xiàn)本發(fā)明的方法。要理解的是，本文所述的具體實施方案是通過舉例說明而不是限制本發(fā)明的方法來顯示的。本發(fā)明的主要特征可以在不脫離本發(fā)明范圍的情況下用于各種實施方案中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，或者僅僅利用常規(guī)的實驗?zāi)軌虼_定本文所述具體步驟的許多等同物。這樣的等同物被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)，且被權(quán)利要求所涵蓋。本說明書中提到的所有出版物和專利申請表明了本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有的出版物和專利申請均引入本文作為參考，其引入的程度如同各個獨(dú)立的出版物或?qū)＠暾埦唧w并獨(dú)立地被指明引入作為參考。詞語“一個(a)”或“一種(an)”當(dāng)與權(quán)利要求和/或說明書中的術(shù)語“包含 (comprising)”結(jié)合使用時，可以指“一種”，但其也與“一種或多種”、“至少一種”和“一種或多于一種”的意思相一致。在權(quán)利要求中所使用的術(shù)語“或者”是指“和/或”，除非明確指明僅僅是指替代物，或替代物為相互排斥的，盡管公開內(nèi)容支持僅僅指替代物及“和/或” 的定義。在整個本申請中，術(shù)語“大約”用來說明這樣的值，其包括用來測定所述值的裝置和方法的誤差的固有變化，或者研究受試者之間存在的變化。如在本說明書和權(quán)利要求(或多個權(quán)利要求)中所使用的，詞語“包含 (comprising)” (以及任何形式的“包含”，如“包含(comprise)和包含(comprises)”)， “具有(having)“(以及任何形式的“具有”，如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括 (including)"(以及任何形式的“包括”，如“包括(includes) ”和“包括(include)”)或“含有(containing)” (以及任何形式的“含有”，如“含有(contains) ”和“含有(contain)”) 是包括的或開放式的，且不排除額外的，未述及的元素或方法步驟。本文所使用的術(shù)語“或它們的組合”是指在該術(shù)語之前所列舉項目的全部排列和組合。例如，“A、B、C或它們的組合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一種，并且如果在特定的上下文中順序是重要的，那么還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續(xù)這個例子，明顯包括的是包含一種或多種項目或術(shù)語的重復(fù)的組合，如BB、AAA、MB、BBC、 AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，通常對任何組合中的項目或術(shù)語的數(shù)目沒有限制，除非從上下文中另外是明顯的。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，在不過度的實驗下可以制備和實施本文所公開和要求保護(hù)的全部組合物和/或方法。盡管以經(jīng)以優(yōu)選的實施方案的形式描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯的是，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的情況下，可以改變本文所述的組合物和/或方法以及方法的步驟或方法的步驟的順序。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的所有這樣相似的取代和修飾被認(rèn)為是在所附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思內(nèi)。參考文獻(xiàn)第 20020052374 號美國專利申請Pharmaceutical preparation containing at least folic acid or a folate and tetrahydrobiopterin(bh4)or derivatives thereof used for treating or preventing cardiovascular or neurological disorders by modulating of the activity of nitric oxide synthase (nos).第 2008075959 號 WIPO 公布 diagnostic marker for Fabry disease.第 2008075957 號 WIPO 公布Treatment of Fabry disease.第 20050197341 號美國專利申請Methods for treating pain.第 4，774，M4 號美國專利公布Use of pterin derivatives.
權(quán)利要求
1.一種診斷法布里病的方法，所述方法包括以下步驟 從疑似患有法布里病的受試者中收集樣品；比較疑似患有法布里病的受試者的樣品與未患有法布里病的正常受試者的樣品中四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平；和基于在所述受試者與所述正常受試者之間的樣品中四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的統(tǒng)計學(xué)上的顯著性降低，確定受試者是否患有法布里病。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述樣品是生物流體樣品。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，采用高壓液相色譜(HPLC)技術(shù)來確定所述四氫生物蝶呤(BH4)、其前體、代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述相關(guān)的輔因子包括有機(jī)輔因子、含有黃素的輔因子、含有血紅素的輔因子、無機(jī)輔因子、含有金屬離子的輔因子、鐵硫簇或它們的任何組合。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，與所述正常受試者相比，在所述疑似患有法布里病的受試者中測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平降低了 20%、30%、40%、50%、60%、80%、90%和 100%。
6.一種監(jiān)測治療干預(yù)對患有法布里病的受試者的療效的方法，所述方法包括以下步驟以一個或多個預(yù)定的間隔，給予受試者一種或多種藥物組合物；其中，所述藥物組合物包含一種或多種抗法布里病的治療劑； 從受試者中收集樣品；比較疑似受試者的樣品與在治療干預(yù)開始之前相同受試者的樣品中四氫生物蝶呤 (BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平；和基于在治療干預(yù)開始之前和之后測定的受試者的樣品中四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，確定治療干預(yù)是否有效。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述樣品是生物流體樣品。
8.權(quán)利要求6所述的方法，所述方法還包括基于在治療干預(yù)開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，終止治療干預(yù)的步驟。
9.權(quán)利要求6所述的方法，所述方法還包括基于在治療干預(yù)開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，繼續(xù)治療干預(yù)的步驟。
10.權(quán)利要求6所述的方法，所述方法還包括基于在治療干預(yù)開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，改變治療干預(yù)的步驟，其中所述改變包括一種或多種藥物組合物的劑量、頻率或劑量和頻率二者的增加或減少。
11.權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述治療干預(yù)包括酶替代療法、止痛藥療法、透析、 器官移植、飲食改變或它們的任何組合。
12.權(quán)利要求6所述的方法，其中，采用高壓液相色譜(HPLC)技術(shù)來確定所述四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種。
13.權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述相關(guān)的輔因子包括有機(jī)輔因子、含有黃素的輔因子、含有血紅素的輔因子、無機(jī)輔因子、含有金屬離子的輔因子、鐵硫簇或它們的任何組I=I O
14.權(quán)利要求6所述的方法，其中，在接受治療干預(yù)的受試者中測定的四氫生物蝶呤 (BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平大于在所述療法治療開始之前在相同受試者中測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平。
15.一種治療患病受試者中的法布里病的藥物組合物，所述組合物包含溶解、分散或懸浮在水溶劑或非水溶劑中的治療有效量的四氫生物蝶呤(BH4)，其前體、衍生物或鹽中的至少一種，所述的治療有效量足以治療法布里?。蝗芙?、分散或懸浮在水溶劑或非水溶劑中的一種或多種任選的相關(guān)的輔因子、蛋白質(zhì)、 抗體、止痛藥和其他藥學(xué)活性劑；和一種或多種任選的賦形劑、填充劑、稀釋劑、緩釋或控釋劑、膨脹劑、抗粘合劑、粘合劑、 潤滑劑、防腐劑或它們的任何組合。
16.權(quán)利要求15所述的組合物，其中，所述藥物組合物經(jīng)灌注、經(jīng)皮下、靜脈內(nèi)、腹腔、 口腔和肌肉內(nèi)給予。
17.權(quán)利要求15所述的組合物，其中，與未服用所述藥物組合物的受試者的樣品相比，所述藥物組合物增加了在服用所述藥物組合物的受試者的樣品中測定的四氫生物蝶呤 (BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平。
18.—種在一個或多個受試者中治療法布里病的方法，所述方法包括以下步驟鑒定需要抗法布里病治療的一個或多個受試者；和給予一種或多種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的四氫生物蝶呤(BH4)， 其前體、衍生物或鹽中的至少一種以及一種或多種相關(guān)的輔因子，所述的治療有效量足以治療法布里病。
19.權(quán)利要求18所述的方法，所述方法還包括監(jiān)測在給予藥物組合物之后法布里病的進(jìn)展的步驟，其中所述監(jiān)測包括在治療之后測定四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平以及將所測定的水平與治療之前測定的水平進(jìn)行比較。
20.權(quán)利要求19所述的方法，所述方法還包括基于對治療開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，終止治療的步驟。
21.權(quán)利要求19所述的方法，所述方法還包括基于對治療開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，繼續(xù)治療的步驟。
22.權(quán)利要求19所述的方法，所述方法還包括基于對治療開始之前和之后測定的四氫生物蝶呤(BH4)、其前體或代謝物和相關(guān)的輔因子中的至少一種的水平的比較，改變治療的步驟，其中所述改變包括一種或多種藥物組合物的劑量、頻率或劑量和頻率二者的增加或減少。
全文摘要
本文公開了法布里病患者的代謝狀態(tài)、健康并發(fā)癥的風(fēng)險的血液和組織標(biāo)記物并作為生物標(biāo)記物用于跟蹤動物模型和法布里病患者的治療的療效，所述標(biāo)記物包括四氫生物蝶呤(BH4)、BH4的前體和代謝物，以及其他相關(guān)的輔因子。本發(fā)明還描述了BH4療法作為法布里病的治療選擇的用途，用于預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)法布里病的血管心臟表現(xiàn)和腎臟表現(xiàn)。
文檔編號A61K31/195GK102387803SQ201080016068
公開日2012年3月21日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日
發(fā)明者D·F·摩爾, E·阿寧, R·希夫曼, T·G·博蒂利亞 申請人:貝勒研究院