專利名稱：用pa-card預(yù)防和/或治療癌癥的組合物和方法
用PA-CARD預(yù)防和/或治療癌癥的組合物和方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求在美國(guó)法典第35篇第119款(35U. S. C. § § 119)和美國(guó)法典第35篇第120款(35U. S.C. § § 120)下的對(duì)2009年2月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/1M，236 號(hào)和2009年5月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/179，435號(hào)的優(yōu)先權(quán)；并且是2008年12 月15日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第12/314,703號(hào)的部分連續(xù)案；并且是2006年8月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第11/508，173號(hào)的部分連續(xù)案；并且是2005年10月6日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第11Λ44，105號(hào)的部分連續(xù)案；并且是2006年7月19日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第 11/488，695號(hào)的部分連續(xù)案。這些申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用完全并入本文。背景白血病是骨髓和血液的惡性癌癥。白血病的特征為異常血細(xì)胞不受控制的積聚， 導(dǎo)致正常血細(xì)胞功能的抑制，并且在許多情況下導(dǎo)致死亡。據(jù)估計(jì)在2008年白血病侵襲美國(guó)大約44，270新人口。白血病是男性第五大最常見的癌癥死因和女性第六大最常見的癌癥死因。白血病在20歲以下兒童中引起的死亡比任何其他癌癥都多(“Cancer facts and figures 2008 (癌癥的事實(shí)和數(shù)字 2008)/'Atlanta :American Cancer Society (2008) ；Xie Y等人，Cancer 97 :2229-35(2003)).某些白血病類型極其難治-例如，急性前髓細(xì)胞白血病(APL)是一種罕見但通常致命的疾病，在這種疾病中只有30%的患者響應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法。許多當(dāng)前的治療方式在某種程度上是有效的，但由于缺乏針對(duì)癌細(xì)胞的特異性而具有顯著有害的副作用。開發(fā)靶特異性療法的努力被伊馬替尼的成功極大地激勵(lì)，伊馬替尼是稱為Gleevec 的高效藥物。Gleevec 特異性抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶。慢性髓細(xì)胞樣白血病(CML)中的染色體易位導(dǎo)致Bcr-Abl酪氨酸激酶的組成性活化，進(jìn)而導(dǎo)致促進(jìn)癌癥生長(zhǎng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的活化。視黃酸是參與細(xì)胞分化的激素，它與三氧化二砷(As203) 結(jié)合是APL的治療選擇。然而，耐受性的形成是靶向單攻擊點(diǎn)(如激酶)的藥物伴隨的主要問(wèn)題，在所述單攻擊點(diǎn)，藥物的構(gòu)象特異性結(jié)合可被改變。白血病患者耐受性的情況增多將臨床醫(yī)師引至訴諸常規(guī)的藥物組合療法實(shí)踐，從而組合腫瘤特異性藥物以產(chǎn)生藥物活性的協(xié)同作用，以允許使用較小劑量的非特異性藥物，并尋找其他的有效治療。發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用細(xì)胞毒性肽來(lái)殺傷癌癥且尤其是白血病和/或卵巢癌的組合物和方法。本發(fā)明的一個(gè)方面是能夠殺傷癌細(xì)胞的分離肽，該分離肽包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域。該分離肽可來(lái)源于細(xì)菌，且特別是銅綠假單胞菌(I^eudomonas aeruginosa)。在一些實(shí)施方案中，分離肽是Pa-CARD。在其他實(shí)施方案中，分離肽包括SEQ ID N0:27或由SEQ ID NO :27組成。在一些實(shí)施方案中，分離肽能夠殺傷白血病、纖維肉瘤、 卵巢癌和/或乳腺癌的細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，分離肽被化學(xué)修飾以延長(zhǎng)或優(yōu)化其在血流中的半衰期。本發(fā)明還涉及通過(guò)使癌細(xì)胞與一種或多種蛋白接觸來(lái)殺傷癌細(xì)胞的方法，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組能夠殺傷癌細(xì)胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域的分離肽、Laz, HS-Azu和hu-H8。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞選自由以下組成的組白血病細(xì)胞、纖維肉瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞。這種方法還可包括使所述細(xì)胞與能夠殺傷癌細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞毒劑接觸。這些細(xì)胞毒劑可以為，但不限于順鉬、 Gleevec 、視黃酸、5'-氮雜-2'-脫氧胞苷和三氧化二砷。在具體的實(shí)施方案中，所述方法包括使癌細(xì)胞與順鉬接觸。在另一實(shí)施方案中，癌細(xì)胞在與所述一種或多種蛋白大約相同的時(shí)間同所述一種或多種細(xì)胞毒劑接觸。本發(fā)明還涉及包括向患有癌癥的哺乳動(dòng)物患者施用一種或多種蛋白的方法，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組能夠殺傷癌細(xì)胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域的分離肽、Laz, HS-Azu和Azu-H8。在一些實(shí)施方案中，癌癥選自由以下組成的組 白血病、纖維肉瘤、卵巢癌和乳腺癌。在又一實(shí)施方案中，還可以向患者施用能夠殺傷癌細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞毒劑。這些細(xì)胞毒劑可以包括，但不限于順鉬、Gleevec 、視黃酸、 5'-氮雜-2'-脫氧胞苷和三氧化二砷。在又一個(gè)實(shí)施方案中，向患者施用的另外的細(xì)胞毒劑是順鉬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種細(xì)胞毒劑在與所述一種或多種蛋白大約相同的時(shí)間施用。本發(fā)明還涉及如下一種方法所述方法包括通過(guò)使白血病細(xì)胞與天青蛋白 (azurin)和包含Laz的H. 8區(qū)的肽接觸來(lái)殺傷白血病細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，白血病細(xì)胞與天青蛋白和包含Laz的H. 8區(qū)的肽同時(shí)或大致同時(shí)接觸。本發(fā)明還涉及包括向患有白血病的哺乳動(dòng)物患者施用天青蛋白和包含Laz的H. 8 區(qū)的肽的方法。在又一實(shí)施方案中，所述天青蛋白和所述包含Laz的H. 8區(qū)的肽同時(shí)或大致同時(shí)向所述患者施用。本發(fā)明還涉及包括通過(guò)使白血病細(xì)胞與一種或多種蛋白接觸來(lái)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞中的細(xì)胞分化的方法，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、 hu-H. 8和能夠殺傷癌細(xì)胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域的分離肽。本發(fā)明還涉及包括通過(guò)使癌細(xì)胞與一種或多種蛋白接觸來(lái)選擇性進(jìn)入癌細(xì)胞的方法，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、Azu-H. 8和能夠殺傷癌細(xì)胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域的分離肽；其中所述癌細(xì)胞選自由白血病細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞組成的組。本發(fā)明還涉及包括通過(guò)使癌細(xì)胞與一種或多種蛋白接觸來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期停滯的方法，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、 hu-H. 8和能夠殺傷癌細(xì)胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域的分離肽。所述癌細(xì)胞可以選自由以下組成的組白血病細(xì)胞、纖維肉瘤細(xì)胞、乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，所述蛋白增加細(xì)胞中的Weel蛋白水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白引起磷酸化的AKT-kr-473的消耗(d印letion)。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白既提高所述細(xì)胞中的Wfeel蛋白水平又引起磷酸化的AKT-kr-473的消耗。本發(fā)明還涉及如下一種方法所述方法包括通過(guò)使癌細(xì)胞與能夠殺傷癌細(xì)胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域的分離肽接觸而通過(guò)胱天蛋白酶3的活化誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的凋亡。在又一實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞。本發(fā)明還涉及如下一種方法所述方法包括通過(guò)使癌細(xì)胞與能夠殺傷癌細(xì)胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域的分離肽接觸而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因的表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，其中癌細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞。本發(fā)明還涉及編碼能夠殺傷癌細(xì)胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域的分離肽的表達(dá)載體。在具體實(shí)施方案中，表達(dá)載體編碼Pa-CARD。本發(fā)明還涉及包含如下分離肽的藥物組合物所述分離肽能夠殺傷癌細(xì)胞，包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域。在又一實(shí)施方案中，藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包括選自由以下組成的組的蛋白天青蛋白 (Azurin)、Laz、H. 8-Azu和Azu-H. 8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物還包含能夠殺傷癌細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞毒劑。在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含適于靜脈內(nèi)注射的藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及包括向患有白血病的患者施用治療有效量的本發(fā)明公開的一種或多種藥物組合物的方法。在又一實(shí)施方案中，所述藥物組合物以選自由以下組成的組的方式向患者施用靜脈內(nèi)、局部(topically)、皮下、肌內(nèi)、口服和進(jìn)入腫瘤內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是編碼本文所公開的一種或多種分離肽的核酸分子。本發(fā)明的另一方面是包含本文所述的一種或多種藥物組合物的藥盒。序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO :1是編碼淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) Iaz基因的基因組 DNA 編碼序歹丨J, Genbank 登錄號(hào) Y00530 (ctggcaggct tgacgcttcgatacgctctg tttcggtcag
gctggtcccgaaaccggaaaaaccgccgaaaac caataccctgcatttgagtaaggctgcgctggagagtttcggttcggcggcggcaaagttggaaaaacggcatcccgaattggcggaggcattggcaaacttggttagaaggcatggcgcataaaatgtatacgggaatttgtgtaaacatccgttaatattaagaagtaaaggataatgggtctaatactaaagaaataggttcggggtaaaattgccccttttaaagtaaacgattgtaaacttgcagacaggctttgatttcaaatgaaatttgtagcaaaatgccgccccgaaacatctgtttgtgcaacgcggcggaatctttttcaaggttttgttaatggcggttgcactttgatttctgtaaaaccgaatattattttatcgattggagatttaccatgaaagcttatctggctctgatttctgccgccgttatcggtttggctgcctgctctcaagaaCCtgCCgCgCctgctgccgaggcaactcctgctgctgaagcacccgcttccgaagcgcctgccgccgaagctgctcctgcagatgctgccgaagcccctgctgccggcaattgtgcggcaactgtcgaatccaacgacaatatgcagttcaacaccaaagacatccaagtcagcaaagcatgtaaagagtttaccatcactctgaaacataccggtacgcaacccaaagccagcatgggtcacaaccttgtgattgccaaagctgaagacatggacggcgtatttaaagacggcgtaggtgctgccgataccgactatgtcaaacctgacgatgcgcgcgttgttgcccacaccaaactgatcggcggcggcgaagagtcttccctgactctggatcctgccaaattggctgacggcgactacaaatttgcctgcactttcccgggtcacggtgctttgatgaacggcaaagtgactttggtcgattaatccgcttaaagtctcaaaagacggacagcctgctttgtgcaggctgttttattataaaatg
actgcttgaa aagtgccccg ttgagaacga aaacatgaat ccgtttgaaa)。 SEQ ID NO :2是編碼銅綠假單胞菌天青蛋白基因的基因組DNA編碼序列 (ctttttcatg cagcggatcg ctcgcgcatc acttcagggtcagggtgccc ttcatcagcgcggagtggcc cgggaaggtg cagaagaaca tgtactgctc gccttccttc agcttggaga cgtcgaaggtcaccgagtcc ttctcgcccg agccgatcag cttggtgtgg gcgatgacac ggctgtcgtc gggcttcaggtaatccttgt ccaggccgga agccatgccg tcggtgacca cgccctgcat gtcggcggcg gtgctcagtacccagttgtggcccatgacg ttcttcggca ggttgccggg gtgggacagg ttgacggtga actgcttgcagctcttgtcg acggtgatgg cattggtgtt gaactgcatc tggtcgttac cctggatgtc caccgagcactcggcagcca gcagtggcgc actgagcagg gacagcaggg ataccgcagc gagtttacgtagcatggagc agcctcctag gcaggttggg cgatgaatcc tgaaagagca gactgcccgatcgggcaccg)。SEQ ID NO 3是編碼淋病奈瑟氏球菌Iaz基因的H. 8區(qū)域的基因組DNA編碼序列 (tgctctcaag aacctgccgc gcctgctgcc gaggcaactc ctgccggtgaagcacccgct tccgaagcgc ctgccgccga agctgctcct gcagatgctg ccgaagcccc tgctgcc)。SEQ ID NO :4是PCR擴(kuò)增淋病奈瑟氏球菌的Laz編碼基因(Iaz)的正向引物 (ccggaattcc ggcagggatg ttgtaaatat ccg)。SEQ ID NO :5是PCR擴(kuò)增淋病奈瑟氏球菌的Laz編碼基因(Iaz)的反向引物 (ggggtaccgc cgtggcBggc atacagcatt tcaatcgg)。SEQ ID NO 6 是 PCR 擴(kuò)增 pUC18_laz 的 3. Ikb 片段的正向引物(ggcagcaggg gcttcggcag catctgc)。SEQ ID NO :7 是 PCR 擴(kuò)增 pUC18_laz 的 3. Ikb 片段的反向引物(ctgcaggtcg actctagagg atcccg)。SEQ ID NO 8 是 PCR 擴(kuò)增 pUC19_paz 的 0. 4kb 片段的正向引物(gccgagtgct cggtggacat ccagg)。SEQ ID NO 9 是 PCR 擴(kuò)增 pUC19_paz 的 0. 4kb 片段的反向引物(tactcgagtc acttcagggt cagggtg)。SEQ ID NO 10 是 PCR 擴(kuò)增 pUC19_paz 的 3. 3kb 片段的正向引物(cttcagggtc agggtgccct tcatc)。SEQ ID NO 11 是 PCR 擴(kuò)增 pUC19_paz 的 3. 3kb 片段的反向引物(ctgcaggtcg actctagagg atcccg)。SEQ ID NO 12 是 PCR 擴(kuò)增 pUC18_laz 的 0. 13kb 片段的正向引物(tgctctcaag aacctgccgc gcctgc)。SEQ ID NO 13 是 PCR 擴(kuò)增 pUC18_laz 的 0. 13kb 片段的反向引物(taggatcctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgc)。SEQ ID NO 14是PCR擴(kuò)增來(lái)自pGEX-5X_3的GST編碼基因的正向引物 (cgagctcatg tcccctatac taggttattg g)。SEQ ID NO 15是PCR擴(kuò)增來(lái)自pGEX_5X_3的GST編碼基因的反向引物 (cccaagcttt caggggatcc cacgaccttc gatcagatcc)。SEQ ID NO 16是PCR擴(kuò)增來(lái)自pUC18_laz的Iaz的信號(hào)肽和H. 8編碼區(qū)的正向弓丨物(ggaattcata tgaaagctta tctggc)。SEQ ID NO 17是PCR擴(kuò)增來(lái)自pUC18_laz的Iaz的信號(hào)肽和H. 8編碼區(qū)的反向弓丨物(ccggaattcg gcagcagggg cttcggc)。SEQ ID NO :18是PCR擴(kuò)增來(lái)自pUC18_laz的H. 8編碼區(qū)的正向引物(cgggatcccc tgctctcaag aacctgccgc gee)。SEQ ID NO 19是PCR擴(kuò)增來(lái)自pUC18_laz的H. 8編碼區(qū)的反向引物(cggaattctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgcag g) 0
SEQ ID NO 20是PCR擴(kuò)增來(lái)自pGEX-5X-3_H. 8的GST-H. 8融合區(qū)的正向引物 (cgagctcatg tcccctatac taggttattg g)。SEQ ID NO 21是PCR擴(kuò)增來(lái)自pGEX-5X-3_H. 8的GST-H. 8融合區(qū)的反向引物 (ccgctcgagt caggcagcag gggcttcggc ag)。SEQ ID NO 22是淋病奈瑟氏球菌菌株F62 Laz蛋白的氨基酸序列，Genbank登錄號(hào)Y00530(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu AlaThr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro AlaAsp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser AsnAsp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp lie GIn Val Ser Lys Ala Cys Lys GluPhe Thr lie Thr Leu Lys His Thr Gly Thr GIn Pro Lys Ala Ser Met Gly HisAsn Leu Val lie Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly ValGly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala HisThr Lys Leu lie Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Lai Asp Pro Ala LysLeu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala LeuMet
Asn GlyLysVal Thr Leu Val Asp)。
SEQID NO 是銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu CysSerValAsplie GlnGlyAsn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala lie ThrValAspLysSerCysLys GlnPheThr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn LeuPro Lys AsnValMetGlyHisAsn TrpValLeu Ser Thr Ala Ala Asp Met GlnGly Val Val Thr AspGlyMetAlaSerGly LeuAspLys Asp Tyr Leu Lys ProAsp Asp Ser Arg Val lie AlaHisThrLysLeulie GlySerGly Glu Lys AspSer Val Thr Phe Asp Val Ser Lys LeuLysGluGlyGluGln TyrMetPhe PheCys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met LysGlyThrLeuThr
Leu Lys)。SEQ ID NO :24是來(lái)自淋病奈瑟氏球菌F62 Laz蛋白的H. 8區(qū)域的氨基酸序列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala GlyGlu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala AlaGlu Ala Pro Ala Ala)。SEQ ID NO :25 是五肽基序的氨基酸序列(Ala Ala Glu Ala Pro)。SEQ ID NO 是銅綠假單胞菌精氨酸脫亞胺酶(ADI)的氨基酸序列(Met Ser Thr Glu Lys Thr Lys Leu Gly Val His Ser Glu Ala Gly Lys Leu ArgLys Val Met Val Cys Ser Pro Gly Leu Ala His Gln Arg Leu Thr Pro Ser AsnCys Asp Glu Leu Leu Phe Asp Asp Val lie Trp Val Asn Gln Ala Lys Arg AspHis Phe Asp Phe Val Thr Lys Met Arg Glu Arg Gly lie Asp Val Leu Glu MetHis Asn Leu Leu Thr Glu Thr lie Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp lie LeuAsp Arg Lys lie Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu ArgSer Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu lie Gly GlyVal Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn lie Leu Lys Met TyrArg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr GlnPhe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp lie Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro MetTyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala lie Tyr Lys PheHis Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu lie Trp Tyr Gly Asp Pro Asp LysAsp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asp Val Met Pro lie Gly Asn GlyVal Val Leu lie Gly Met Gly Glu ArgSer Ser Arg Gln Ala lie Gly Gln Val AlaGln Ser Leu Phe Ala Lys Gly Ala Ala Glu Arg Val lie Val Ala Gly Leu ProLys Ser Arg Ala Ala Met His Leu Asp Thr Val Phe Ser Phe Cys Asp Arg AspLeu lie Val Pro Phe Ser Leu Arg Pro Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Gly Met Asn IleArg Arg Glu Glu Lys Thr Phe Leu Glu Val Val Ala Glu Ser Leu Gly Leu LysLys Leu Arg Val Val Glu Thr Gly Gly Asn Ser Phe Ala Ala Glu Arg Glu GlnTrp Asp Asp Gly Asn Asn Val Val Cys Leu Glu Pro Gly Val Val Val GlyTyr Asp Arg Asn Thr Tyr Thr Asn Thr Leu Leu Arg Lys Ala Gly Val Glu ValIle Thr lie Ser Ala Ser Glu Leu Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly His Cys Met ThrCys Pro lie Val Arg Asp Pro lie Asp Tyr)。SEQ ID NO :27是銅綠假單胞菌ADI的CARD區(qū)，殘基75-225的氨基酸序列(Leu Leu Thr Glu Thr lie Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp lie LeuAsp Arg Lys lie Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu ArgSer Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu lie Gly GlyVal Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn lie Leu Lys Met TyrArg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr GlnPhe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp lie Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro MetTyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala lie Tyr Lys PheHis Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu lie Trp Tyr Gly Asp Pro Asp LysAsp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly)。SEQ ID NO 是PCR擴(kuò)增銅綠假單胞菌ADI基因的CARD基序的正向引物的核苷酸序列(ATGCAC AATC TGCTGACCGAGACCATCCAG)。SEQ ID NO : 是PCR擴(kuò)增銅綠假單胞菌ADI基因的CARD基序的反向引物的核苷酸序列(CAGGTCGAGG AGCCGTGGTC CTTGTC)。附圖簡(jiǎn)述

圖1.圖1描繪了來(lái)自淋病奈瑟氏球菌的Iaz㈧和來(lái)自銅綠假單胞菌的paz (B) 的示意圖。用于在大腸桿菌中克隆和過(guò)高表達(dá)的銅綠假單胞菌天青蛋白基因由天青蛋白基因本身(Paz)和決定其周質(zhì)位置的信號(hào)肽(psp)序列組成(B)。將Iaz的H. 8區(qū)域符合讀框地克隆在包括奈瑟氏球菌信號(hào)序列nsp的paz基因的5'端(C) (pUC18_H. 8-paz)或paz 基因的3'端(D) (pUC19-paz-H. 8)。用于制備這些構(gòu)建體的詳細(xì)程序在實(shí)施例1中給出。 naz，在Iaz基因中存在的淋病奈瑟氏球菌的天青蛋白樣序列；nsp，奈瑟氏球菌信號(hào)肽序列。在兩種情況下的信號(hào)肽序列被切掉以產(chǎn)生成熟的I^az (周質(zhì))和Laz (表面暴露的)蛋白。(E)，Laz、Paz和融合蛋白的SDS-PAGE。H. 8融合蛋白諸如Laz、H. 8_Paz或Paz-H. 8 (均大約17kDa)的異常遷移之前已對(duì)脂化的(lapidated)包含H. 8的蛋白指出(Cannon，Clin. Microbiol. Rev. 2 :S1_S4 (1989) ；Fisette,等人，J. Biol. Chem. 278 :46252-46260 (2003))。圖2.圖2描繪了顯示H. 8-Paz融合蛋白對(duì)各種癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性程度的圖。㈧ 合成的H. 8肽、Paz, Laz以及在Paz (Paz-H. 8)的羧基末端和Paz (H. 8-Paz)的氨基末端的 H. 8融合物對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-2^細(xì)胞的細(xì)胞毒性。用三種不同濃度(10μΜ、20μΜ和 40 μ Μ)的蛋白處理細(xì)胞6、12和對(duì)小時(shí)。進(jìn)行MTT測(cè)定來(lái)測(cè)量活細(xì)胞的程度以說(shuō)明細(xì)胞毒性(細(xì)胞死亡百分比)。為了計(jì)算細(xì)胞毒性百分比，將未處理的有活力的細(xì)胞的值視為 100%，并且在I^Z、Laz和H. 8融合蛋白處理的樣品中確定有活力的細(xì)胞的數(shù)目。然后從死細(xì)胞的數(shù)目確定細(xì)胞毒性的程度(％ )。(B)H. 8肽、Paz, Paz-H. 8、H. 8-Paz和Laz對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。所有的處理?xiàng)l件與以上(A)相似。圖3.圖3描繪了各種熒光標(biāo)記的天青蛋白相關(guān)蛋白進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-2^細(xì)胞和乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞中。(A)軛合于Alexa fluor 568的 H. 8 肽、Paz、Paz-H. 8、H. 8-Paz 和Laz (各20 μ Μ)與LN-2^細(xì)胞在蓋玻片上在37°C孵育30min，之后拍攝圖像。(B)如通過(guò)共聚焦顯微鏡所觀察到的且根據(jù)對(duì)于(A)所述的，各種軛合于Alexa fluo:r 568的蛋白內(nèi)化到MCF-7細(xì)胞中。(C)通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到Laz的內(nèi)化。將各種濃度ΟμΜ、4μΜ、 8μΜ和16μΜ)的熒光標(biāo)記的Laz與LN-2^細(xì)胞在37°C孵育30min。細(xì)胞核用DAPI (4， 6- 二脒基-2-苯基吲哚)標(biāo)記為藍(lán)色。(D)將軛合于Alexa fluor 568的Laz (10 μ M)在 37°C與LN-2^細(xì)胞孵育多個(gè)時(shí)段(5min、10min、20min和30min)。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)化。(E)將軛合于Alexa fluor 568的Paz (10 μ M)與LN-2^細(xì)胞在蓋玻片上在37°C孵育不同的時(shí)間，之后拍攝圖像。在(E)中檢測(cè)到非常少的可測(cè)量的熒光。圖4.圖4描繪了指示在圖3A-D的共聚焦顯微鏡圖像中發(fā)現(xiàn)的熒光定量的柱狀圖。(A)在圖3A的圖像中的熒光定量。通過(guò)使用人如^^!^·^^^ 進(jìn)行天青蛋白的熒光定量。誤差棒代表單一樣品的三種不同細(xì)胞中的熒光的標(biāo)準(zhǔn)差。(B)在圖:3B的圖像中的熒光定量。如在圖4A中那樣進(jìn)行定量。(C)在圖3C的圖像中的熒光定量。如在圖4A中那樣進(jìn)行定量。(D)在圖3D的圖像中的熒光定量。如在圖4A中那樣進(jìn)行定量。圖5.圖5分別描繪了細(xì)胞中標(biāo)記的融合蛋白的攝取和細(xì)胞毒性的圖像和照片。用 H. 8-GST融合蛋白聯(lián)合處理促進(jìn)Alexa fluor 568標(biāo)記的Paz在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-2^細(xì)胞中的攝取。將未標(biāo)記的 20 μ M(A)H. 8、⑶GST、(C)GST-H. 8、(D)H. 8-GST, (E)PBS 緩沖液和 20 μ M軛合于Alexa flUOT 568的Paz與LN-2^細(xì)胞在37°C孵育30min。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)化。(F)合成的H. 8肽、GST和GST-H. 8/H. 8-GST融合衍生物在有或沒(méi)有Paz的情況下的細(xì)胞毒性。將大約5X 103LN-2^細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中并在有20 μ M Paz (+Paz) 或沒(méi)有20 μ M Paz (-Paz)的情況下用各20 μ M的H. 8肽、GST和GST-H. 8、H. 8-GST或相同體積的PBS緩沖液處理M小時(shí)。圖6.圖 6 描繪了以軛合于IRdye 800CW (LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska)的I^az、H. 8-Paz和Laz注射的小鼠的腦的圖像。(A)來(lái)自活小鼠的腦圖像。在活的裸鼠中向腹膜內(nèi)注射軛合于IRdyelOOCW的500 μ g Paz,H. 8-Paz和Laz。在M小
時(shí)后，處死小鼠，取出腦，并用LI-C0ROdyssey 紅外成像系統(tǒng)檢測(cè)和測(cè)量熒光。(B)按(A) 中那樣處理的裸鼠腦的中腦喙(rostral mesencephalon)區(qū)圖像。平行地切割小鼠腦并拍攝圖像。圖7.圖8描繪了 H.8_Gst融合蛋白在大腸桿菌中的定位的SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡和共聚焦圖像。(A)用0. ImM IPTG在37°C培養(yǎng)具有克隆的gst、H. S-gst或gst-H.8基因的大腸桿菌BL21(DE!3)細(xì)胞。細(xì)胞沉淀(cell pellet)用PBS洗滌兩次，并且對(duì)全細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE?？捡R斯亮藍(lán)染色用于檢測(cè)蛋白。(B).重復(fù)以上步驟，但這次全細(xì)胞裂解物和周質(zhì)空間內(nèi)容物被分別分離，進(jìn)行SDS-PAGE(20yg蛋白)，并且通過(guò)用抗GST抗體的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)GST或GST-H. 8融合蛋白來(lái)確定這些蛋白的總濃度和周質(zhì)濃度。(C).用0.4mM IPTG在37°C培養(yǎng)具有克隆的gst、H. S-gst或gst_H. 8基因的大腸桿菌菌株BL21 (DE)細(xì)胞(表幻。將各Iml的這些細(xì)菌培養(yǎng)物離心并收集得到的細(xì)菌沉淀。在用PBS洗滌兩次后，施加Iml包含抗GST抗體的FBS-PBS (1 2000)。將細(xì)胞懸浮液孵育1小時(shí)，然后用PBS洗滌兩次。將細(xì)菌細(xì)胞與FBS-PBS中的FITC軛合的抗兔IgG孵育30min。為了除去未結(jié)合的抗體，再次洗滌細(xì)胞，然后用乙醇在冰上固定。在共聚焦顯微鏡(X100物鏡)下觀察用DAPI (賦予藍(lán)色染色)處理的大腸桿菌樣品，并且還對(duì)單個(gè)細(xì)胞拍照。(D)將帶有pUC19-paz (銅綠假單胞菌天青蛋白)、pUC19-laz (奈瑟氏球菌)、pUC18_H. 8-paz或 pUC18-paz-H. 8的大腸桿菌細(xì)胞在存在0. ImM IPTG的情況下于37°C培養(yǎng)過(guò)夜。將0. 5ml 這種培養(yǎng)物離心，并且將得到的細(xì)菌沉淀用預(yù)冷的PBS洗滌兩次。施加Iml的FBS-PBS 中的抗天青蛋白抗體(1 500)，并且在冰上孵育1小時(shí)。在用PBS洗滌兩次后，施加FITC 軛合的抗兔抗體，在冰上孵育30min，用PBS洗滌兩次，并且用冷乙醇固定。通過(guò)共聚焦顯微鏡(X 100物鏡)觀察細(xì)菌樣品。圖8.圖8描繪了顯示如MTT測(cè)定所確定的細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖。(A和B)通過(guò)對(duì)用10 μ M的Laz、天青蛋白(Azu)、H8_Azu和Azu_H8或作為陽(yáng)性對(duì)照的5 μ M DAC處理的 HL60 (A)和Κ562(Β)細(xì)胞在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后進(jìn)行MTT測(cè)定，來(lái)確定細(xì)胞的細(xì)胞毒性。(C)用低濃度3· 75ηΜ、37· 5ηΜ、75ηΜ、2· 5 μ Μ、5 μ M 及 10 μ M 的 Laz、Azu、H8_Azu、 iVzu-H8或作為陽(yáng)性對(duì)照的5μΜ DAC處理的Κ562細(xì)胞。(D)通過(guò)對(duì)用不同濃度1 μ Μ、 2· 5 μ Μ、5 μ M 和 10 μ M 的 Laz、Azu、H8-Azu、Azu-H8 或 5 μ M DAC 處理的 HL60 細(xì)胞進(jìn)行 MTT 測(cè)定確定的細(xì)胞的細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)代表一式三份進(jìn)行的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)誤)。所有值與對(duì)照具有顯著差異(P < 0. 05)。圖9.圖9描繪了在HL60細(xì)胞和Κ562細(xì)胞中由Laz和天青蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的熒光顯微圖像。如通過(guò)熒光顯微術(shù)所顯示的，Laz誘導(dǎo)了 HL60細(xì)胞和Κ562細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。(A)和(B)代表未處理的HL60細(xì)胞和Κ562細(xì)胞。用10 μ M Laz處理48小時(shí)的HL60細(xì)胞(C)或Κ562細(xì)胞(D)經(jīng)歷分化，分化是與后面的細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)的過(guò)程。箭頭指出分化的肉芽腫細(xì)胞。即使細(xì)胞毒性很高，在用10 μ M天青蛋白處理48小時(shí)的HL60 細(xì)胞(E)或Κ562細(xì)胞(F)中看見較少的形態(tài)學(xué)改變。圖10.圖10描繪了顯示Laz和天青蛋白選擇性進(jìn)入HL60細(xì)胞和Κ562細(xì)胞的來(lái)自共聚焦顯微鏡的圖像。組圖1 天青蛋白和Laz在以10 μ M濃度孵育1小時(shí)后都沒(méi)有進(jìn)入外周血單核細(xì)胞(Α和B)。天青蛋白在1小時(shí)孵育后進(jìn)入Κ562細(xì)胞(D)，Laz也如此(C)。 天青蛋白在1小時(shí)孵育后進(jìn)入HL60細(xì)胞(F)，Laz也如此(E)。組圖2 與對(duì)照K562細(xì)胞比較，Azu-H8, H8-Azu像Laz —樣進(jìn)入這些K562細(xì)胞。圖11.圖11描繪了在不存在和存在天青蛋白、Laz和DAC的情況下細(xì)胞周期進(jìn)程的圖示。K562細(xì)胞用10 μ M Laz、天青蛋白和5μ M DAC處理48小時(shí)，固定，染色并按之前所述分析DNA含量。圖12.圖12描繪了免疫印跡的圖像。該圖提供了經(jīng)由在Laz和Pa-CARD處理的 Κ562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞中在胞質(zhì)和細(xì)胞核提取物中的蛋白的免疫印跡對(duì)AKT的磷酸化狀態(tài) (AKT-P-Ser473)和Weel蛋白水平的分析。顯示了比較用10 μ M的Laz或10 μ M的Pa-CARD 處理48小時(shí)后的HL60細(xì)胞和Κ562細(xì)胞(相比于未處理的細(xì)胞對(duì)照)的W^eel和磷-AKT 絲氨酸473的水平的胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。圖13.圖13描繪了來(lái)自具有針對(duì)白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的銅綠假單胞菌ADI
12的CARD結(jié)構(gòu)域的示意圖。(A)CARD結(jié)構(gòu)域存在于I^a-ADI和Ma-ADI中，但在胍基修飾的超家族酶的其他成員如DDAH和AGAT中不存在，如從基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)中所示。CARD結(jié)構(gòu)域代表哺乳動(dòng)物胱天蛋白酶-9的CARD結(jié)構(gòu)域。DDAH，二甲基精氨酸二甲氨基水解酶；AGAT， 精氨酸甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶。鏈和α-螺旋分別顯示為箭頭和窄條。羅馬數(shù)字I到V是五個(gè)β β α β亞基。鉗部分(α-螺旋模塊)見于I^a-ADI和精氨酸支原體(M. argnini) ADI (Ma-ADI)中，它與形成胱天蛋白酶_9蛋白分子的CARD結(jié)構(gòu)域的六個(gè)α -螺旋模塊具有結(jié)構(gòu)同源性。N，N端；C，C端。(B)來(lái)自銅綠假單胞菌的純化的46kDa ADI和17kDa CARD 蛋白的SDS-PAGE凝膠遷移。(C)I^a-ADI和Pa-CARD對(duì)纖維肉瘤細(xì)胞(HT-1080)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和白血病(HL60)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。將細(xì)胞與10 μ M I^a-ADI或I^a-CARD孵育 48小時(shí)，之后通過(guò)MTT測(cè)定確定細(xì)胞活力。圖14.圖14描繪了顯示來(lái)自精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)和銅綠假單胞菌的精氨酸脫亞胺酶(ADI)的結(jié)構(gòu)特征的圖像。(A)突出兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的銅綠假單胞菌 ADI (1RXX_A)的帶圖(MolMol程序)。(B)在本文圖13A中顯示的圖像拷貝。(C)顯示如所述的銅綠假單胞菌ADI (Pa-ADI)的總體折疊和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的示意圖。圖15.圖15描繪了顯示I^a-ADI和Pa-CARD的純化和精氨酸脫亞胺酶的酶促活性的凝膠圖像和圖。(A)來(lái)自銅綠假單胞菌的純化的ADI和CARD蛋白的SDS-PAGE凝膠遷移。
(B)純化的Pa-ADI和Pa-CARD在37°C和pH7. 2的ADI活性動(dòng)力學(xué)。在490nm測(cè)量了酶反應(yīng)產(chǎn)物瓜氨酸。沒(méi)有檢測(cè)到I^a-CARD的精氨酸脫亞胺酶的酶促活性。圖16.圖16描繪了顯示I^a-CARD具有比I3a-ADI更高的抗一系列癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖。(A)將纖維肉瘤細(xì)胞(HT-1080)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和卵巢癌細(xì)胞(SK0V-3)與 20 μ M Pa-ADI或Pa-CARD孵育48小時(shí)，之后通過(guò)MTT測(cè)定來(lái)確定細(xì)胞活力。從一式三份培養(yǎng)物的3個(gè)實(shí)驗(yàn)確定每孔活力細(xì)胞的數(shù)目平均值(士標(biāo)準(zhǔn)誤)。所有值與對(duì)照具有顯著差異(P < 0. 05)。(B)作為時(shí)間(24,48和72小時(shí))的函數(shù)的由Pa-CARD顯示的針對(duì)卵巢癌 SK0V-3細(xì)胞的劑量依賴性細(xì)胞毒性。(C)對(duì)I^a-ADI進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。按A中所述從一式三份培養(yǎng)物的3個(gè)實(shí)驗(yàn)確定每孔活力細(xì)胞的數(shù)目平均值(士標(biāo)準(zhǔn)誤)。圖17.圖17描繪了顯示I^-CARD、天青蛋白和順自在卵巢癌SK0V-3細(xì)胞中的比較細(xì)胞毒性效應(yīng)的圖。(A)將均為20 μ M的I3a-ADI、Pa-CARD、天青蛋白和順鉬與SK0V-3細(xì)胞或正常卵巢H0SE6-3細(xì)胞孵育48小時(shí)，之后通過(guò)MTT測(cè)定來(lái)確定細(xì)胞活力。(B)與針對(duì) SK0V-3細(xì)胞的個(gè)體處理相比，Pa-CARD顯示與順鉬的某種加性效應(yīng)。圖18.圖18描繪了顯示Pa-CARD通過(guò)胱天蛋白酶活化在SK0V-3細(xì)胞中但未在 H0SE6-3細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的照片。TUNEL測(cè)定用于檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)的DNA鏈破裂，這種檢測(cè)是通過(guò)使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)熒光素試劑盒(in situ Cell Death Detection Fluorescein kit, Roche)測(cè)量熒光素標(biāo)記的dUTP的加入而實(shí)現(xiàn)的。使SK0V-3細(xì)胞和H0SE6-3細(xì)胞生長(zhǎng)在 8 孔 LabiTek 腔式載玻片(Lab Tek chamber slide)中并且與 10 μ M 的 Pa-CARD、Pa-ADI 和天青蛋白孵育48小時(shí)。將沒(méi)有處理或用BSA處理的陰性對(duì)照也進(jìn)行平行培養(yǎng)(底部箭頭)。用DAPI將細(xì)胞的細(xì)胞核染成藍(lán)色。顯示了在綠色(A)和藍(lán)色(B)通道以及疊加圖像
(C)(青色)下觀察到的細(xì)胞。圖19.圖19描繪了顯示胱天蛋白酶被Pa-CARD活化的圖。通過(guò)購(gòu)自Promega的 Caspase-GloTM 3/7測(cè)定試劑盒來(lái)測(cè)量胱天蛋白酶活性。I3a-ADI和I3a-CARD以兩種不同的濃度使用以評(píng)估劑量響應(yīng)效應(yīng)。將胱天蛋白酶活性的提高表示為相比于沒(méi)有藥物處理的對(duì)照的倍增。實(shí)施方案的詳細(xì)描述定義除非具體描述為“單個(gè)細(xì)胞”，否則如本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”包括該術(shù)語(yǔ)的單數(shù)或復(fù)數(shù)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性肽”表示對(duì)癌細(xì)胞且特別是對(duì)白血病細(xì)胞但不對(duì)正常細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒性的本發(fā)明的肽。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。 這些術(shù)語(yǔ)適用于如下氨基酸聚合物其中一種或多種氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)的天然存在的氨基酸的人造化學(xué)類似物。這些術(shù)語(yǔ)還適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和 “蛋白”也包括修飾，所述修飾包括但不限于糖基化、脂質(zhì)附著(lipid attachment)、硫酸化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥基化和ADP-核糖基化。應(yīng)理解多肽不總是完全線性的。例如， 多肽可以因?yàn)榉核鼗种?，并且它們可以是環(huán)狀的(有或沒(méi)有分支)，一般是因?yàn)榉g后事件，包括天然加工事件和通過(guò)人的操作帶來(lái)的并非天然發(fā)生的事件。環(huán)狀的、分支的以及分支環(huán)狀的多肽可通過(guò)非翻譯天然過(guò)程且也可通過(guò)完全合成方法來(lái)合成。合成肽是沒(méi)有細(xì)胞組分的幫助而制備的肽。制備肽的合成方法是本領(lǐng)域公知的并且是商業(yè)上可獲得的。此外，本發(fā)明涵蓋了本發(fā)明的蛋白的含有甲硫氨酸和甲硫氨酸較少(methionine-less)的氨基端變體的使用。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“病癥”包括在解剖學(xué)和生理學(xué)上偏離正常，這種偏離構(gòu)成活的動(dòng)物或其部分之一的正常狀態(tài)的損害，這種損害破壞或改變身體功能的表現(xiàn)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抑制細(xì)胞生長(zhǎng)”表示細(xì)胞分裂和/或細(xì)胞擴(kuò)增的減慢或停止。 該術(shù)語(yǔ)還包括細(xì)胞發(fā)育的抑制或細(xì)胞死亡的增加。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“患有”包括目前顯示病癥的癥狀、具有甚至沒(méi)有觀察到的癥狀的病癥、在從病癥的恢復(fù)中以及從病癥恢復(fù)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括防止、降低、停止或逆轉(zhuǎn)病癥或與正在治療的病癥相關(guān)的癥狀的進(jìn)展或嚴(yán)重度。這樣，術(shù)語(yǔ)“治療”適當(dāng)時(shí)包括醫(yī)療性、治療性和/或預(yù)防性給藥。治療還可以包括防止或減輕病癥如惡化前病變或癌癥的形成?！爸委熡行Я俊笔怯行Х乐埂⒔档?、停止或逆轉(zhuǎn)受治療者正在治療的特定病癥的現(xiàn)有癥狀的發(fā)展或者部分或完全地緩解受治療者正在治療的特定病癥的現(xiàn)有癥狀的量。治療有效量的確定完全是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本純的”當(dāng)用于修飾本發(fā)明的蛋白或其他細(xì)胞產(chǎn)物時(shí)是指， 例如，從生長(zhǎng)培養(yǎng)基或細(xì)胞內(nèi)容物中分離的、處于基本上不含或不摻雜其他蛋白和/或活性抑制化合物的形式的蛋白。術(shù)語(yǔ)“基本純的”是指按干重計(jì)至少約75%的分離部分或至少“75%基本純的”的量的系數(shù)。更具體地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“基本純的”是指具有按干重計(jì)至少約 85%活性化合物的化合物，或指至少“85%基本純的”化合物。最具體地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“基本純的”是指具有按干重計(jì)至少約95%的活性化合物的化合物，或指至少“95%基本純的”化合物。術(shù)語(yǔ)“基本純的”還可以用于修飾本發(fā)明的合成制備的蛋白或化合物，其中，例如，合成蛋白與合成反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)物分離。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥物級(jí)”當(dāng)指本發(fā)明的肽或化合物時(shí)是基本上或?qū)嵸|(zhì)上與通常伴隨以天然態(tài)發(fā)現(xiàn)的材料的組分分離的肽或化合物，所述組分包括合成試劑和副產(chǎn)物， 以及是基本上或?qū)嵸|(zhì)上與損害其用作藥物的組分分離的肽或化合物。例如，“藥物級(jí)”肽可與任何致癌物分離。在一些情況下，“藥物級(jí)”可由預(yù)定的施用方法修飾，如“靜脈內(nèi)藥物級(jí)”，以限定基本上或?qū)嵸|(zhì)上與將使得組合物不適于靜脈內(nèi)施用至患者的任何物質(zhì)分離的肽或化合物。例如，“靜脈內(nèi)藥物級(jí)”肽可與去污劑如SDS和抗細(xì)菌劑如疊氮化物分離。短語(yǔ)“分離的”、“純化的”或“生物純”是指基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含通常伴隨以天然態(tài)發(fā)現(xiàn)的材料的組分的材料。因此，依據(jù)本發(fā)明的分離肽優(yōu)選地不包含通常與原位環(huán)境中的肽相關(guān)的材料。“分離的”區(qū)域是指如下區(qū)域不包括該區(qū)域所來(lái)源的多肽的整個(gè)序列的區(qū)域?！胺蛛x的”核酸、蛋白或其相應(yīng)片段已基本上從其體內(nèi)環(huán)境中移出以便它可被技術(shù)人員操作，諸如但不限于核苷酸測(cè)序、限制酶切消化、定點(diǎn)誘變，和亞克隆到核酸片段的表達(dá)載體中，以及獲得基本純的數(shù)量的蛋白或蛋白片段。如本文所用的關(guān)于肽的術(shù)語(yǔ)“變體”是指與野生型多肽相比有氨基酸被取代、缺失或插入的氨基酸序列變體。變體可以是野生型肽的截短物?！叭笔А笔且粋€(gè)或多個(gè)氨基酸從野生型蛋白中去除，而“截短”是一個(gè)或多個(gè)氨基酸從一個(gè)或多個(gè)野生型蛋白末端去除。因此，變體肽可通過(guò)操作編碼多肽的基因來(lái)制備。變體可通過(guò)改變多肽的基本組成或特征但不改變其至少某些根本活性來(lái)制備。例如，奈瑟氏球菌肽或I^a-CARD肽的“變體”可以是保留殺傷白血病細(xì)胞的能力的突變的奈瑟氏球菌肽或I^a-CARD肽。在一些情況下，用非天然氨基酸如ε _(3，5-二硝基苯甲酰基)-Lys殘基合成變體肽(Ghadiri & Fernholz, J.Am. Chem. Soc, 112 :9633-9635 (1990))。在一些買施方案中，變體與野生型肽相比有不超過(guò)20、 19、18、17或16個(gè)氨基酸被取代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，變體與野生型肽相比有不超過(guò)15、14、13、12或11個(gè)氨基酸被取代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，變體與野生型肽相比有不超過(guò)10、9、8或7個(gè)氨基酸被取代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，變體與野生型肽相比有不超過(guò)6個(gè)氨基酸被取代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，變體與野生型肽相比有不超過(guò)5個(gè)或4個(gè)氨基酸被取代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，變體與野生型肽相比有不超過(guò)3個(gè)、2個(gè)或1個(gè)氨基酸被取代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，使用在美國(guó)專利申請(qǐng)系列第12/389，120號(hào)中描述的技術(shù)和方法創(chuàng)建變體，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”表示包括任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸殘基的氨基酸部分，即，包括由一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)碳原子(通常為一個(gè)(α) 碳原子)直接連接的至少一個(gè)羧基和至少一個(gè)氨基殘基的任何部分。術(shù)語(yǔ)“殘基”與“氨基酸”同義。如本文所用的關(guān)于肽的術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指衍生自主題肽的肽。衍生包括肽的化學(xué)修飾以使得該肽仍保留其根本活性中的一些活性。例如，奈瑟氏球菌肽或I3a-CARD肽的 “衍生物”可以是保留其殺傷白血病和/或卵巢癌細(xì)胞的能力的化學(xué)修飾的奈瑟氏球菌肽或 Pa-CARD肽。感興趣的化學(xué)修飾包括但不限于肽的酰胺化、乙?；?、硫酸化、聚乙二醇(PEG) 修飾、磷酸化或糖基化。此外，衍生肽可以是多肽或其片段與化合物的融合物，所述化合物諸如但不限于另一種肽、藥物分子或其他治療劑或藥劑或可檢測(cè)探針。在一些實(shí)施方案中， 使用在美國(guó)專利申請(qǐng)系列第12/389，120號(hào)中描述的技術(shù)和方法創(chuàng)建衍生物，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列同一性百分比(％ ) ”被定義為當(dāng)多肽與候選序列比對(duì)時(shí)多肽中的氨基酸殘基與候選序列中的氨基酸殘基相同的百分比。為了確定氨基酸同一性百分比，比對(duì)序列，并且如果必要，引入空位來(lái)實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分比；保守性取代不被認(rèn)為是序列同一性的一部分。確定同一性百分比的氨基酸序列比對(duì)步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通?？晒_獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR) 軟件用于比對(duì)肽序列。在具體的實(shí)施方案中，使用Blastp(可從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中
(National Center for Biotechnology Information), Bethesda MD )，i^M 白勺@ 省參數(shù)為長(zhǎng)復(fù)雜度濾波器(long complexity filter)、期望值(expect) 10、字長(zhǎng)(word size) 3、存在(existence) 11 禾口延伸(extension) 1。當(dāng)比對(duì)氨基酸序列時(shí)，給定氨基酸序列A對(duì)給定氨基酸序列B、與給定氨基酸序列 B、或針對(duì)給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(能夠可替代地被表達(dá)為具有或包含對(duì)給定氨基酸序列B、與給定氨基酸序列B、或針對(duì)給定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性百分比的給定氨基酸序列A)可計(jì)算為氨基酸序列同一性％= X/Y * 100其中X是根據(jù)A與B的序列比對(duì)程序或算法比對(duì)而評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，和Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)。如果氨基酸序列A的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列B的長(zhǎng)度，那么A對(duì)B的氨基酸序列同一性百分比不等于B對(duì)A的氨基酸序列同一性百分比。當(dāng)將較長(zhǎng)序列與較短序列比較時(shí)，較短的序列是“B”序列。例如，當(dāng)將截短的肽與相應(yīng)的野生型肽進(jìn)行比較時(shí)，截短的肽是“B”序列。概況本發(fā)明提供了包含對(duì)癌細(xì)胞而不是正常細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)的細(xì)菌肽以及這些肽的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等同物的組合物，以及防止哺乳動(dòng)物形成癌癥、治療哺乳動(dòng)物癌癥和殺傷哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞的方法。具體地說(shuō)，本文公開的組合物和方法可用于防止、治療和/ 或殺傷白血病和/或卵巢癌。已顯示，許多銅氧還蛋白(cupredoxin)、特別是銅綠假單胞菌天青蛋白及其截短物具有在體內(nèi)和體外優(yōu)先進(jìn)入并殺傷許多類型的哺乳動(dòng)物實(shí)體癌細(xì)胞的能力(Yamada等人，Cell. Biol. 7 :1418-1431 (2005) ；Hiraoka 等人，PNAS 101 :6427-6432(2004) ；Hiraoka 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 338 1284-1290 (2005)) 還參見美國(guó)專利第 7，491，394 號(hào)、7，381，701號(hào)和7，084，105號(hào)，以及美國(guó)專利申請(qǐng)系列第11/488,693號(hào)、11/950，165 號(hào)、11/854，654號(hào)和12/338,480號(hào)，它們的公開內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。天青蛋白樣基因存在于許多淋球菌和腦膜炎雙球菌如淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌 (N. meningitidis)中(Gotschlich & Seiff, FEMS Microbiol. Lett. 43 :253-255(1987)； Kawula，等人，Mol. Microbiol. 1 :179-185 (1987))。天青蛋白由許多病原菌產(chǎn)生，并且在這些基因中存在顯著的序列同源性(Yamada，等人，Cell. Microbiol. 7 1418-1431 (2005))。一種稱為“H. 8”的蛋白表位在病原奈瑟氏球菌屬物種中是保守的，并且通過(guò)結(jié)合指定的H. 8的單克隆抗體來(lái)檢測(cè)。這種不同的淋球菌基因Iaz編碼與H. 8單克隆抗體交叉反應(yīng)的蛋白(Hayashi & Wu，J. Bioenerg. Biomembr. 22 :451-471 (1990))。Laz是包含由細(xì)菌酶信號(hào)肽酶II識(shí)別的信號(hào)肽脂蛋白共有序列的淋球菌外表面蛋白，該信號(hào)肽酶II加工該信號(hào)肽脂蛋白共有序列導(dǎo)致脂肪酸和甘油的半胱氨酸殘基的N 端?；?Hayashi & Wu，同前；Yamada，等人，Cell. Microbiol. 7 :1418-1431 (2005))。Laz 脂蛋白，大約17kDa，包括H. 8區(qū)，該H. 8區(qū)是N端包含基序Ala_Ala_Glu_Ala-Pro (AAEAP (SEQ ID N0:25))的不完美的五肽重復(fù)序列的39氨基酸區(qū)域(Gotschlich & kiff，同前； Kawula,等人，同前；Woods 等人，Mol. Microbiiol. 3 :43-48 (1989))。除此之外在 Laz 中的這種39氨基酸N端區(qū)域是與銅綠假單胞菌天青蛋白高度同源的127個(gè)氨基酸區(qū)域。(Cannon， Clin. Microbiol. Rev. 2 :S1_S4 (1989)) Laz參與針對(duì)氧化應(yīng)激和銅毒性的防御并提高在活體夕卜的原代人夕卜宮頸上皮測(cè)定(ex vivo primary human ectocervical epithelial assay)中的存活率(Wu，等人，Infect. Immun. 73 :8444-8448 (2005)) 現(xiàn)在已知來(lái)自淋病奈瑟氏球菌和其他奈瑟氏球菌屬物種的天青蛋白樣蛋白Laz 蛋白能夠特異性進(jìn)入并殺傷腦癌細(xì)胞如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞以及其他腫瘤。見實(shí)施例2和實(shí)施例7。此外，現(xiàn)在已知Laz蛋白的H. 8區(qū)當(dāng)融合至銅綠假單胞菌天青蛋白的N端或C端時(shí)能夠賦予銅綠假單胞菌天青蛋白進(jìn)入并殺傷成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的能力。見實(shí)施例2和實(shí)施例3?，F(xiàn)在還已知H. 8區(qū)不必與共施用的蛋白如天青蛋白物理地連接來(lái)賦予該蛋白進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的能力。見實(shí)施例5。相比于單獨(dú)的天青蛋白，H. 8和融合至GST的N 端的H. 8均增加物理上未連接的天青蛋白進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，然而融合至GST的C端的H. 8無(wú)效。此外，H. 8和融合至GST的N端的H. 8當(dāng)與天青蛋白共施用時(shí)均增強(qiáng)天青蛋白對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。見實(shí)施例5。還考慮可用這種AAEAP(SEQ ID NO 25) 重復(fù)單元設(shè)計(jì)殺傷白血病細(xì)胞的肽。天青蛋白和Iaz已知在癌癥進(jìn)展途徑中靶向多個(gè)步驟，如通過(guò)復(fù)合物形成和p53 的穩(wěn)定誘導(dǎo)凋亡、抑制凋亡以及抑制由受體酪氨酸激酶如EphB2/肝配蛋白B2所介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，從而使形成抗性的機(jī)會(huì)降到最小。參見，例如美國(guó)專利第7，381，701號(hào)，通過(guò)引用將其公開內(nèi)容整體并入本文。天青蛋白和Laz已知在黑色素瘤或乳腺癌細(xì)胞中相比于正常細(xì)胞具有進(jìn)入特異性。出人意料地，除了對(duì)實(shí)體型癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性外，天青蛋白和Laz蛋白也對(duì)液體傳播癌癥(liquid-borne cancer)如白血病有效，如通過(guò)本文給出的實(shí)施例所顯示的。這些實(shí)施例顯示天青蛋白和Laz能夠各自進(jìn)入白血病細(xì)胞系并且在其中具有細(xì)胞毒效應(yīng)。此外，如在實(shí)施例9和實(shí)施例11中所討論且在圖8-11中所顯示的，Laz對(duì)白血病細(xì)胞系發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)，而對(duì)正常的外周血單核細(xì)胞(PBMC)幾乎沒(méi)有效應(yīng)，在正常的外周血單核細(xì)胞它們具有有限的進(jìn)入。這些細(xì)菌蛋白在白血病細(xì)胞中具有進(jìn)入特異性，但在正常的PBMC中沒(méi)有(圖10，組圖1)。除了天青蛋白和Laz以外，門冬酰胺酶和精氨酸脫亞胺酶(ADI)已顯示具有針對(duì)實(shí)體瘤的活性，所述實(shí)體瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌等等，并且也已報(bào)道來(lái)自精氨酸支原體的ADI (Ma-ADI)抑制人白血病細(xì)胞的增殖(Yamada T等人，Proc Natl Acad Sci USA2002 ；99 :14098-103 ；Punj V 等人，Oncogene 23 :2367-78(2004) ；Ni Y 等人,Cancer Lett. 261 :1-11(2008) ；Fialho AM,Chakrabarty AM,Anticancer Drug Discov 2 :224-34(2007) ；Ensor CM 等人，Cancer Res 62 :5443-50(2002) ；Yoon CY 等人，Int. J Cancer 120 :897-905(2007) ；Gong H 等人，Leukemial4 :擬6_9 Q000))。在 Ma-ADI 中的催化三聯(lián)體是Cys 398-His 269_Glu213。然而，除了 Ma-ADI對(duì)白血病細(xì)胞的效應(yīng)的一次報(bào)道外，之前幾乎不知道細(xì)菌蛋白如ADI在可能的針對(duì)白血病的治療應(yīng)用中的作用。銅綠假單胞菌也產(chǎn)生ADI (Pa-ADI)，該ADI在Cys406-His278_Aspl66具有催化三聯(lián)體，并且具有與Ma-ADI的一級(jí)序列同源性。二級(jí)結(jié)構(gòu)匹配(SSM)程序的使用揭示了在 Pa-ADI的N端區(qū)域中的胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(“CARD”)樣結(jié)構(gòu)域(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，PDB ID代碼1RXX)，它對(duì)帶有CARD結(jié)構(gòu)域的胱天蛋白酶_9的原結(jié)構(gòu)域(pro-domain) (PDB ID 代碼3YGS)具有可辨別的結(jié)構(gòu)同源性。如圖14D所示，在胍基超家族的成員中，ADI是唯一帶有CARD結(jié)構(gòu)域的。除了以上討論的在精氨酸支原體ADI中的CARD樣結(jié)構(gòu)域(PDB ID代碼1LXY)之外，在細(xì)菌蛋白中沒(méi)有已知的CARD樣結(jié)構(gòu)域。出人意料地，如本文所公開的，在 Pa-ADI (Pa-CARD)中的CARD結(jié)構(gòu)域具有很強(qiáng)的抗癌活性。簡(jiǎn)言之，CARD結(jié)構(gòu)域多肽顯示顯著的抗癌活性同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞幾乎未展示細(xì)胞毒性。哺乳動(dòng)物的包含CARD的蛋白通常由大約95個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成并且具有對(duì)死亡域 (DD)和死亡效應(yīng)域(DED)的序列相似性。CARD的結(jié)晶結(jié)構(gòu)表明它由環(huán)繞疏水袋的大約6 個(gè)緊密堆積的α -螺旋組成。類似地，Pa-CARD由形成5個(gè)堆積的α -螺旋的85個(gè)氨基酸殘基組成，這些α-螺旋采取“夾式風(fēng)扇(clip-on-fan)”部分的形式(圖14B和圖14C)。 因?yàn)橐恍┎溉閯?dòng)物CARD結(jié)構(gòu)域促進(jìn)癌癥生長(zhǎng)，所以感興趣的可能性是細(xì)菌CARD有助于干擾哺乳動(dòng)物CARD活性，從而有助于含推定的CARD樣結(jié)構(gòu)域的I3a-ADI的抗癌活性。預(yù)期 Pa-CARD結(jié)構(gòu)域可由攜帶哺乳動(dòng)物CARD的蛋白補(bǔ)充，并且Pa-CARD可在癌細(xì)胞中發(fā)揮其細(xì)胞毒效應(yīng)，至少在部分上通過(guò)與已知在癌細(xì)胞中被過(guò)高表達(dá)的哺乳動(dòng)物CARD蛋白的蛋白-蛋白相互作用。還預(yù)期這種相互作用可能是ADI在癌癥生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)中的作用的原因。Pa-CARD(SEQ ID NO :27)顯示了針對(duì)白血病細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的出人意料的細(xì)胞毒活性。特別地，Pa-CARD多肽具有抑制白血病細(xì)胞增殖的能力。在白血病細(xì)胞系HL60和 K562中，Laz和Pa-CARD的抗癌活性是通過(guò)在G2/M期的細(xì)胞周期停滯介導(dǎo)的，G2/M期涉及 Weel蛋白穩(wěn)定和磷酸化的AKT-kr-473的消耗，磷酸化的AKT-kr-473是通常在許多癌癥類型中失調(diào)的絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性形式。見實(shí)施例11和實(shí)施例12以及圖12。具體地說(shuō)，Pa-CARD和Laz通過(guò)Weel蛋白在K562細(xì)胞中的上調(diào)和活性AKT P_Ser473在HL60 細(xì)胞中的下調(diào)來(lái)抑制白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期(圖12)。已知Wfee 1和磷酸化的AKT4er473 (AKT_P_Ser473)參與G2/M期的細(xì)胞周期停滯，已知G2/M期的細(xì)胞周期停滯進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。例如，促有絲分裂激酶CDC2(也稱為 CDK1)的活化是真核細(xì)胞從G2期轉(zhuǎn)變?yōu)镸期所需要的，在真核細(xì)胞中在Thr-14和Tyr-15 殘基上的CDC2的磷酸化是重要的。抑制性Tyr-15磷酸化是由Weel蛋白激酶所介導(dǎo)的，并因此其增強(qiáng)的水平介導(dǎo)這種對(duì)轉(zhuǎn)變?yōu)镸期的抑制。已知病毒蛋白模擬Laz/Pa-CARD介導(dǎo)的 Wee蛋白激酶水平的升高。人乳頭瘤病毒1型(HPV-1)E4蛋白通過(guò)形成無(wú)活性的細(xì)胞周期蛋白Bl-CDKl復(fù)合物來(lái)抑制細(xì)胞周期的G2到M的轉(zhuǎn)變，所述Bl-CDKl復(fù)合物的形成是通過(guò)由水平升高的Weel催化的抑制性Tyr-15磷酸化實(shí)現(xiàn)的。因此，Weel的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)G2細(xì)胞周期停滯，而通過(guò)小干擾RNA(SiRNA)消耗Weel緩解E4誘導(dǎo)的G2阻斷。類似地，病毒癌基因v-akt的人同源物AKT (蛋白激酶B)在磷脂?；〈?-激酶(PI3K)途徑中起作用。在AKT-I中Ser-473殘基被PDK2磷酸化對(duì)于細(xì)胞周期進(jìn)程是重要的，而磷酸化的Akt Ser-473 (Akt-P-S473)水平的降低增強(qiáng)G2/M停滯，如通過(guò)HL60細(xì)胞中的Laz和Pa-CARD所證明的。Pa-CARD經(jīng)由編碼GM-CSF的基因的轉(zhuǎn)錄刺激而具有對(duì)SK0V-3 (卵巢癌)的效應(yīng)。 基因被刺激大約3倍的GM-CSF和IL-12已知是許多腫瘤模型中的抗腫瘤免疫性的有效誘導(dǎo)劑，在腫瘤位點(diǎn)引發(fā)粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而大大地增強(qiáng)腫瘤抗原遞呈。因此似乎I3a-CARD誘導(dǎo)的凋亡(圖18)可顯著加到在存在I^a-CARD的情況下過(guò)高生成的任何GM-CSF的抗腫瘤響應(yīng)。盡管基因譜表達(dá)顯示許多細(xì)胞因子基因的刺激，但細(xì)胞因子 CCL2(C-C基序配體2)的基因，也稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)，顯示顯著的(17倍) 阻抑(表幻。CCL2通常顯示通過(guò)在腫瘤中增加單核細(xì)胞募集和有害的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM)而促進(jìn)在乳腺癌中的惡性轉(zhuǎn)化。CCL2也已知可能經(jīng)由MCPIP促進(jìn)血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移， MCPIP是一種新穎的轉(zhuǎn)錄因子，它活化鈣粘蛋白基因cdhl2和cdhl9的轉(zhuǎn)錄。因此，Pa-CARD 降低CCL2水平可通過(guò)干擾血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)程而允許腫瘤衰退?？傊?，本文的實(shí)施例和公開內(nèi)容顯示細(xì)菌蛋白如天青蛋白、Laz和Pa-CARD能夠進(jìn)入白血病細(xì)胞并誘導(dǎo)G2/M期的細(xì)胞周期停滯，G2/M期的細(xì)胞周期停滯似乎是由CDC2-細(xì)胞周期蛋白B阻抑途徑和細(xì)胞Pi:3K/AKT途徑介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)所引發(fā)的。此外， ADI能夠具有幾種方式的抗癌活性，包括經(jīng)由酶促消耗精氨酸和通過(guò)沒(méi)有ADI活性的N端推定的CARD樣結(jié)構(gòu)域(圖14-16)。Pa-cARD蛋白顯示主要對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用，但對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有(圖18)。此外，抗癌活性可通過(guò)胱天蛋白酶活性介導(dǎo)(圖19)，并且能夠誘導(dǎo)在卵巢癌細(xì)胞中的凋亡。本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供了單獨(dú)或與一種或多種其他細(xì)胞毒劑組合的細(xì)胞毒性肽和/或這些肽的變體、衍生物、截短物或結(jié)構(gòu)等同物。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是銅氧還蛋白或其截短物。在一些這樣的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是天青蛋白或其截短物。在其他這樣的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是Laz或其截短物。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是Laz的H.8區(qū)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽包括選自由SEQ ID NO 22-24組成的組的一種或多種氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽包括CARD結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是攜帶CARD的蛋白。在一些實(shí)施方案中，攜帶CARD的蛋白來(lái)源于細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌為銅綠假單胞菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是I^a-CARD。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽包括SEQ ID N0:27。在一些實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)將細(xì)胞毒性肽與賦予其更大細(xì)胞毒效應(yīng)的另一種肽融合。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，另一種肽是Laz的H. 8區(qū)。在另一種肽中，另一種肽具有包括SEQ ID N0:24的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是融合蛋白 hu-H.8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是融合蛋白H. 8-Azu。圖1?？梢耘c本文所述的細(xì)胞毒性肽組合施用的一種或多種其他細(xì)胞毒劑可以是癌癥治療藥物，包括但不限于順鉬、Gleevec 、視黃酸、5'-氮雜-2'-脫氧胞苷(“DAC”)和 /或與三氧化二砷結(jié)合的視黃酸。除了Gleevec 、視黃酸、DAC和/或與三氧化二砷結(jié)合的視黃酸以外的癌癥治療藥物包括細(xì)胞周期控制蛋白，如P53 ；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，如pl6、p21或p27 ；自殺蛋白，如胸腺嘧啶核苷激酶或硝基還原酶；細(xì)胞因子或其他免疫調(diào)節(jié)蛋白，如白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素2或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)； 毒素，如銅綠假單胞菌外毒素A ;5_氟尿嘧啶；干擾素α ；甲氨蝶呤；他莫西芬；雷洛昔芬； 長(zhǎng)春新堿；烷化劑，如氮芥、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、氮丙啶、和三氮烯；抗代謝藥，如葉酸拮抗劑、嘌呤類似物、以及嘧啶類似物；抗生素，如蒽環(huán)類抗生素、博來(lái)霉素、絲裂霉素、更生霉素和普卡霉素；酶，如L-門冬酰胺酶；法尼基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；5 α -還原酶抑制劑； 17 β -羥基類固醇脫氫酶3型抑制劑；激素藥，如糖皮質(zhì)激素、雌激素/抗雌激素、雄激素 /抗雄激素、黃體酮、和促黃體生成素釋放激素拮抗劑、醋酸奧曲肽；微管破壞劑，如海鞘素 (ecteinascidin)或其類似物和衍生物；微管穩(wěn)定劑，如紫杉烷，例如，紫杉醇(Taxo 1 )、 多西他賽(Taxotere )、及其類似物，和埃坡霉素，如埃坡霉素A-F及其類似物；植物源產(chǎn)物，如長(zhǎng)春花生物堿、表鬼白毒素、紫杉烷；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑；異戊二烯基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；和各種各樣的劑，如羥基脲、丙卡巴胼、米托坦、六甲蜜胺、鉬配位絡(luò)合物，如順鉬和卡鉬；和用作抗癌劑和細(xì)胞毒性劑的其他劑，如生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物、生長(zhǎng)因子；免疫調(diào)節(jié)劑和單克隆抗體；鹽酸氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、異環(huán)磷酰胺、白消安、卡莫司汀、 洛莫司汀、司莫司汀、鏈佐星、噻替派、達(dá)卡巴嗪、甲氨蝶呤、硫鳥嘌呤、巰嘌呤、氟達(dá)拉濱、噴司他丁(pentastatin)、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、鹽酸阿霉素、柔紅霉素、伊達(dá)比星、 硫酸博來(lái)霉素、絲裂霉素C、放線菌素D、番紅霉素(safracin)、沙弗拉霉素(saframycin)、 quinocarcin, discodermolide、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、酒石酸長(zhǎng)春瑞濱、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸鈉、氟他胺、布舍瑞林、亮丙立德、蝶啶、雙炔 (diynes)、左旋咪唑、aflacon、干擾素、白細(xì)胞介素、阿地白介素、非格司亭、沙格司亭、利妥昔單抗、BCG、維甲酸、鹽酸伊立替康、倍他米松(betamethosone)、鹽酸吉西他濱、六甲蜜胺、 和托泊替康以及它們的任何類似物或衍生物。其他細(xì)胞毒劑的實(shí)例還包括以下如在德國(guó)專利第4138042. 8號(hào)；W097/19086、 WO 98/22461、WO 98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、WO 99/02224、WO 99/02514、 WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253 和 WO 00/00485 中發(fā)現(xiàn)的埃坡霉素衍生物；如在WO 99/對(duì)416(還參見美國(guó)專利第6，040，321號(hào))中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑；以及如在WO 97/30992和W098/54966中發(fā)現(xiàn)的異戊二烯基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；以及諸如那些一般且特定地在美國(guó)專利第6，011,0 號(hào)中描述的劑，其化合物能夠與任何NHR調(diào)節(jié)劑如AR調(diào)節(jié)劑、ER調(diào)節(jié)劑一起，與LHRH調(diào)節(jié)劑一起利用，尤其是在癌癥的治療中。本發(fā)明還提供了為銅氧還蛋白和/或攜帶CARD的蛋白的變體、衍生物、截短物或結(jié)構(gòu)等同物的細(xì)胞毒性肽。在一些實(shí)施方案中，分離細(xì)胞毒性肽。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是基本純的或藥物級(jí)的。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽在包含該細(xì)胞毒性肽或基本上由該細(xì)胞毒性肽組成的組合物中。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽在包含該細(xì)胞毒性肽和至少一種其他細(xì)胞毒劑的組合物中。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是無(wú)抗原性的并且不在哺乳動(dòng)物(且更具體為人)中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽比全長(zhǎng)銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白小，并且保留了全長(zhǎng)蛋白的某些藥理活性。具體地說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽可保留殺傷癌細(xì)胞特別是白血病細(xì)胞的能力。因?yàn)樵阢~氧還蛋白之間的高結(jié)構(gòu)同源性，預(yù)期其他銅氧還蛋白將具有與天青蛋白和Laz相同的細(xì)胞毒特性，特別是關(guān)于白血病的。在一些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白為， 但不限于天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白(rusticyanin)、綠絲菌藍(lán)色銅蛋白(auracyanin)、漆樹藍(lán)蛋白、黃瓜堿性蛋白或Laz。在特別具體的實(shí)施方案中，天青蛋白或Laz來(lái)源于銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)、木糖氧化物色桿菌反硝化亞種 I (Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans I)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、甲基單胞菌(Methylomonas sp·)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)、焚光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、參錄針{段單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、昔養(yǎng)木！flif (Xylella fastidiosa) > Ulva pertussis 或苜Ij溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。在具體的實(shí)施方案中，天青蛋白來(lái)自銅綠假單胞菌。本發(fā)明提供了如下細(xì)胞毒性肽所述細(xì)胞毒性肽為與野生型銅氧還蛋白或攜帶 CARD的蛋白相比氨基酸被取代、缺失或插入的銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白的氨基酸序列變體。本發(fā)明的變體可以是野生型蛋白的截短物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞毒性肽包含比全長(zhǎng)野生型多肽小的銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白的區(qū)域。本發(fā)明的細(xì)胞毒性肽還可以包括用非天然存在的合成氨基酸制備的肽。例如，非天然存在的氨基酸可被整合到化學(xué)預(yù)防劑中來(lái)延長(zhǎng)或優(yōu)化該組合物在血流中的半衰期。這些化學(xué)預(yù)防劑包括但不限于D，L-肽(非對(duì)映體)(例如Futaki等人， J. Biol. Chem. 276(8) :5836-40(2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779-86(2004)； Miller 等人，Biochem. Pharmacol. 36(1) 169-76，(1987)；包含罕見氨基酸的肽(例如Lee等人，J. Pept. Res. 63 (2) :69-84 (2004))，包含非天然氨基酸的烯烴接著碳化 S 釘針(hydrocarbon stapling)(例如 Schafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 5891-5892(2000) ；Walenski 等人，Science 305 1466-147(^2004))，和包含 ε-(3，5_ 二硝基苯甲?；?-Lys殘基的肽。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞毒性肽是銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白的衍生物。銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白的衍生物是化學(xué)修飾的肽，使得該肽仍保留其一些根本活性。例如，天青蛋白、Laz或I5a-CARD的“衍生物”可以是保留其殺傷癌細(xì)胞特別是白血病細(xì)胞和/或卵巢癌細(xì)胞的能力的化學(xué)修飾的蛋白。另一種衍生物可以是具有增加的或優(yōu)化的在血流中的半衰期的衍生物?；瘜W(xué)修飾可包括但不限于，在美國(guó)專利申請(qǐng)系列第 12/389，120號(hào)中公開的化學(xué)修飾，該申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，可使用包括但不限于以下的方法修飾細(xì)胞毒性肽減少肽的水解、減少肽的脫酰胺作用、減少氧化、減少免疫原性和/或增加肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。預(yù)期本文所述的或通過(guò)引用并入的兩種或更多種修飾可合并在一種修飾的銅氧還蛋白衍生肽中， 且本文所述的一種或多種修飾與改進(jìn)藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性的其他修飾的組合是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。設(shè)計(jì)這些變體和衍生物的許多方法是本領(lǐng)域公知的。使用方法本發(fā)明提供了殺傷哺乳動(dòng)物特別是人的癌細(xì)胞、特別是白血病細(xì)胞和/或卵巢癌細(xì)胞的方法。所述方法包括使癌細(xì)胞與對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)的分離肽或其變體、衍生物、截短物或結(jié)構(gòu)等同物接觸。分離肽可以是本文所述的銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白。 在一個(gè)實(shí)施方案中，分離肽是天青蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離肽是Laz。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離肽是I^a-CARD。在另外的實(shí)施方案中，分離肽是包含Laz的H.8區(qū)的融合蛋白。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，融合蛋白是H. 8-Azu。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，融合蛋白是hu-H. 8。細(xì)胞毒性肽可以單獨(dú)施用給癌細(xì)胞或與本文所述的另一種細(xì)胞毒劑組合或與Laz的H. 8區(qū)組合施用給癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽與Laz的H. 8區(qū)同時(shí)或大致同時(shí)施用。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽與包含SEQ ID NO : 的序列同時(shí)或大致同時(shí)施用。本發(fā)明還提供了通過(guò)向患者施用對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)的分離肽或其變體、衍生物、截短物或結(jié)構(gòu)等同物來(lái)治療患有癌癥的哺乳動(dòng)物患者或另外殺傷哺乳動(dòng)物患者中的癌細(xì)胞的方法。分離肽可以是本文所述的銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離肽是天青蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離肽是Laz。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離肽是I^a-CARD。在另外的實(shí)施方案中，分離肽是包含Laz的H.8區(qū)的融合蛋白。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，融合蛋白是H. 8-Azu。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，融合蛋白是hu-H. 8。 細(xì)胞毒性肽可以單獨(dú)施用或與本文所述的另一種細(xì)胞毒劑組合或與Laz的H. 8區(qū)組合施用。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽與Laz的H. 8區(qū)同時(shí)或大致同時(shí)施用。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽與包含SEQ ID NO :24的序列同時(shí)或大致同時(shí)施用。本發(fā)明還提供了通過(guò)向白血病細(xì)胞和/或卵巢癌細(xì)胞施用一種或多種細(xì)胞毒性肽來(lái)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞和/或卵巢癌細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞分化而死亡的方法。細(xì)胞毒性肽可以是本文所述的銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是天青蛋白。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是Laz。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是融合蛋白 H. 8-Azu。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是融合蛋白Azu-H. 8。本發(fā)明還提供了通過(guò)向白血病細(xì)胞和/或卵巢癌細(xì)胞施用一種或多種細(xì)胞毒性肽來(lái)選擇性進(jìn)入白血病細(xì)胞和/或卵巢癌細(xì)胞并且在其中具有細(xì)胞毒效應(yīng)的方法。細(xì)胞毒性肽可以是本文所述的銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是天青蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是Laz。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是I^a-CARD。在另外的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是包含Laz的H.8區(qū)的融合蛋白。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，融合蛋白是H. 8-Azu。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，融合蛋白是hu-H. 8。本發(fā)明還包括通過(guò)引起G2/M期的細(xì)胞周期停滯來(lái)殺傷白血病細(xì)胞和/或卵巢癌細(xì)胞的方法，所述方法包括施用一種或多種細(xì)胞毒性肽。在另外的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽穩(wěn)定Weel蛋白和/或提高細(xì)胞中的Weel蛋白水平，包括但不限于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中的Weel蛋白水平。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽消耗磷酸化的 AKT-Ser-473.又在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽既穩(wěn)定/提高Weel蛋白水平又消耗磷酸化的AKT-kr-473。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是天青蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是Laz。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是I^-CARD。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性肽是融合蛋白H. 8-Azu和hu-H. 8中的一種或多種。編碼細(xì)胞毒性肽的核酸和表達(dá)載體在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述的細(xì)胞毒性肽及其變體、衍生物和/或結(jié)構(gòu)等同物的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可通過(guò)組合本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)制備。在這些核酸中使用的編碼序列可以是那些在編碼特定肽的天然基因組DNA中發(fā)現(xiàn)的編碼序列，或者可以由已知密碼子設(shè)計(jì)。這些編碼序列也可以被設(shè)計(jì)成考慮到要表達(dá)多肽的生物的替代密碼子使用和偏好密碼子使用。細(xì)胞毒性肽的核酸序列可通過(guò)化學(xué)合成或克隆個(gè)別地制備。然后可用連接酶將核酸序列連接在一起，以便給出感興趣的核酸分子。用于使遺傳材料在生物之間穿梭的載體可分為兩大類克隆載體是具有在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中繁殖所必需的且外源DNA可插入其中的區(qū)域的復(fù)制質(zhì)?；蚴删w；外源DNA如同它是載體的組分一樣被復(fù)制和繁殖。表達(dá)載體(如質(zhì)粒、酵母或動(dòng)物病毒基因組)用來(lái)將外源遺傳材料引入宿主細(xì)胞或組織中以便轉(zhuǎn)錄和翻譯外源DNA，如細(xì)胞毒性肽像Laz、天青蛋白、Pa-CARD、H. 8_Azu或iVzu-H. 8的DNA。在表達(dá)載體中，引入的DNA與傳遞信號(hào)給宿主細(xì)胞以高效轉(zhuǎn)錄插入的DNA的元件如啟動(dòng)子可操作地連接。一些啟動(dòng)子是格外有用的， 如響應(yīng)于特定因子而控制基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。將細(xì)胞毒性肽及其變體和衍生物與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接能夠響應(yīng)于特定因子而控制該細(xì)胞毒性肽及其變體和衍生物的表達(dá)。經(jīng)典誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括那些對(duì)α-干擾素、熱休克、重金屬離子和類固醇如糖皮質(zhì)激素(Kaufman, Methods Enzymo 1. 185 :487-511(1990))以及四環(huán)素有響應(yīng)的啟動(dòng)子。其他令人期望的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括那些對(duì)于引入構(gòu)建體的細(xì)胞來(lái)說(shuō)不是內(nèi)源的但是當(dāng)外源供應(yīng)誘導(dǎo)劑時(shí)在這些細(xì)胞中有響應(yīng)的啟動(dòng)子。一般來(lái)說(shuō)，有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒。 然而，考慮其他形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒以及腺伴隨病毒)。載體選擇由正使用的生物或細(xì)胞以及期望的載體去向來(lái)決定。一般來(lái)說(shuō)，載體包括信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記基因、多聚接頭位點(diǎn)、增強(qiáng)元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。包含細(xì)胞毒性肽的藥物組合物本發(fā)明還提供了包含至少一種細(xì)胞毒性肽的組合物，所述細(xì)胞毒性肽是銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白，或是銅氧還蛋白或攜帶CARD的蛋白的變體、衍生物、截短物或結(jié)構(gòu)等同物，特別是在藥物組合物中單獨(dú)的或與至少另一種細(xì)胞毒劑組合的細(xì)胞毒性肽。在具體實(shí)施方案中，將藥物組合物設(shè)計(jì)為特定的施用方式，例如，但不限于，口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)。這些組合物可以是在水中水合的，或可以是干燥的(如通過(guò)冷凍干燥)以用于后來(lái)的水合。這些組合物可以在除水外的溶劑中，諸如但不限于醇。包含細(xì)胞毒性肽的本發(fā)明的藥物組合物能夠以任何常規(guī)方式制造，例如，通過(guò)常規(guī)的混合、溶解、成粒、制糖衣(dragee-making)、乳化、裝膠囊、截留或冷凍干燥工藝。細(xì)胞毒性肽可容易地與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體合并。這些載體使得制劑能夠被配制成片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮劑等等。適合的賦形劑還可以包括，例如，填充劑和纖維素制劑。其他的賦形劑可包括，例如，調(diào)味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑和其他可接受的添加劑、佐劑或粘合劑。在多個(gè)實(shí)施方案中，組合物包括載體和賦形劑(包括但不限于緩沖液、碳水化合物、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑、懸浮劑、增稠劑和/ 或防腐劑)，水，油，鹽水溶液，含水葡萄糖和甘油溶液，適當(dāng)?shù)纳項(xiàng)l件所需的其他藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑等等。將認(rèn)識(shí)到，盡管可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適宜的載體施用本發(fā)明的組合物，但載體類型將隨施用方式而改變。還可使用公知技術(shù)將化合物封裝在脂質(zhì)體中。也可以利用生物可降解的微球作為本發(fā)明的組合物的載體。適合的生物可降解的微球顯示在，例如美國(guó)專利第4，897，268號(hào)、5，075，109號(hào)、 5，928，647 號(hào)、5，811，128 號(hào)、5，820，883 號(hào)、5，853，763 號(hào)、5，814，344 和 5，942，252 號(hào)中。 如本文所述的“化合物”包括本發(fā)明的肽、氨基酸序列、載荷化合物(cargo compound)和絡(luò)合物和核酸。用于制備施用本文公開的細(xì)胞毒性肽和核酸的藥物組合物的靜脈注射液 (intravenous fluid)可由類晶體或膠體構(gòu)成。如本文所用的類晶體是礦物鹽或其他水溶性分子的水溶液。如本文所用的膠體包含較大的不可溶分子，如明膠。靜脈注射液可以是無(wú)菌的?？捎糜陟o脈內(nèi)施用的類晶體流體包括但不限于生理鹽水(0. 9%濃度的氯化鈉溶液)、林格氏乳酸鹽或林格氏溶液、以及有時(shí)稱為D5W的5%葡萄糖的水溶液，如表1所述。表1 常見的類晶體溶液的組成
溶液其他名稱[Na+][Cl][葡萄糖]D5W5%葡萄糖002522/3 & 1/33.3%葡萄糖 /0.3%鹽水5151168二分之一生理鹽水0.45% NaCl77770生理鹽水0.9% NaCl1541540林格氏乳酸鹽*林格氏溶液1301090*林格氏乳酸鹽還具有乳酸鹽、4mmol/L K+和3mmol/L Ca2+。本發(fā)明的組合物在血流中的半衰期可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種方法延長(zhǎng)或優(yōu)化，包括但不限于環(huán)化肽(Monk等人，BioDrugsl9(4) =261-78, (2005) ；DeFreest等人，J. Pept. Res. 63 (5) :409-19 (2004))、D，L-肽(非對(duì)映體)(Futaki 等人，J. Biol. Chem. Feb 23 ；276 (8) :5836-40(2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779-86(2004) ；Miller 等人，Biochem. Pharmacol. 36(1) 169-76，(1987))；包含罕見氨基酸(Lee 等人，J. Pept. Res. 63(2) :69-84 Q004))，以及 N 端和 C 端修飾(Labrie 等人，Clin. Invest. Med. 13(5) 275-8，(1990))的肽。特別感興趣的是經(jīng)由D-取代或L-氨基酸取代的肽穩(wěn)定性的d_異構(gòu)化(取代)和修飾。當(dāng)施用是通過(guò)注射時(shí)，組合物可以被配制在水溶液中，優(yōu)選在生理相容的緩沖液中，如漢克斯溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液。溶液可包含配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/ 或分散劑。可選地，組合物可以是在使用前以適合的媒介物例如無(wú)菌無(wú)熱原水構(gòu)建的粉末形式。當(dāng)通過(guò)吸入法施用時(shí)，組合物可以以噴霧劑形式遞送，所述噴霧劑來(lái)自利用適合的推進(jìn)劑的加壓包或噴霧器，所述推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其他適合的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可通過(guò)提供遞送計(jì)量用量的閥來(lái)確定。例如在吸入器或吹入器中使用的明膠的膠囊和藥筒可被配制成包含蛋白與適合的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。當(dāng)施用是通過(guò)局部施用時(shí)，如本領(lǐng)域所公知的，組合物可被配制成溶液、凝膠、軟膏、乳膏、懸浮液等等。在一些實(shí)施方案中，施用是借助透皮貼劑。當(dāng)施用是通過(guò)栓劑(例如，直腸栓劑或陰道栓劑)時(shí)，組合物也可以被配制在包含常規(guī)栓劑基質(zhì)的組合物中。當(dāng)施用是口服時(shí)，組合物可以容易地與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體組合在一起配制?？衫霉腆w載體，如甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂等等；這些載體使得趨化因子能夠被配制成片劑、 丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮劑等等，以用于待治療的受治療者的口服攝入。對(duì)于口服固體制劑例如像粉末、膠囊和片劑來(lái)說(shuō)，適合的賦形劑包括填充劑如糖、纖維素制劑、成粒劑和粘合劑。其他本領(lǐng)域公知的常規(guī)載體也包括多價(jià)載體，如細(xì)菌莢膜多糖、葡萄糖或基因工程載體。此外，包括所述組合物的緩釋制劑允許該組合物經(jīng)延長(zhǎng)的時(shí)間釋放，以至于如果沒(méi)有該緩釋制劑，組合物將在引起或增強(qiáng)治療效果之前從受治療者的系統(tǒng)中清除，和/或被例如蛋白酶和單純水解降解。包含細(xì)胞毒性肽的藥盒在另一方面，本發(fā)明提供了在包裝或容器中包含以下的一種或多種的藥盒(1) 包括本文所述的一種或多種細(xì)胞毒性肽的試劑；( 包括藥學(xué)上可接受的佐劑或賦形劑的試劑；C3)施用媒介物，如注射器；(4)施用說(shuō)明。在同一容器中發(fā)現(xiàn)組分(1)- )的兩種或更多種的實(shí)施方案也被考慮。在其他實(shí)施方案中，藥盒組分也可以包括一種或多種額外的細(xì)胞毒劑。在其他的實(shí)施方案中，配制試劑用于靜脈內(nèi)施用，和/或施用的媒介物適合于靜脈內(nèi)施用。當(dāng)提供藥盒時(shí)，組合物的不同組分可被包裝在各自的容器中并且在使用前立即混合。組分的這種分別包裝可分別允許長(zhǎng)期儲(chǔ)存而不損失活性組分功能。在藥盒中包括的試劑可提供在任何種類的容器中，以使得不同組分的壽命被保藏并且不被容器的材料吸附或改變。例如，密封的玻璃安瓿可盛裝凍干的多肽或多核苷酸，或在中性非反應(yīng)的氣體如氮?dú)庵掳b的緩沖液。安瓿可由任何適宜的材料組成，如玻璃，有機(jī)聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷，金屬或通常用于容納相似試劑的任何其他材料。 適合的容器的其他實(shí)例包括可由類似的物質(zhì)像安瓿一樣制造的簡(jiǎn)單的瓶，以及可包含如鋁或合金的箔內(nèi)襯的包裝袋(envelop)。其他容器包括試管、管形瓶、燒瓶、瓶、注射器或類似容器。容器可具有無(wú)菌入口(sterile access port)，如具有可被皮下注射針穿入的塞子的瓶。其他容器可具有兩個(gè)被容易移去的膜分隔的室，該膜在移去后允許組分混合?？梢迫サ哪た梢允遣Ａ?、塑料、橡膠等等。藥盒還可以配有說(shuō)明材料。可以將說(shuō)明印在紙上或其他基質(zhì)上，和/或可以作為電子可讀介質(zhì)提供，如軟磁盤、⑶_R0M、DVD-R0M、Zip盤、錄像帶、錄音帶、閃存裝置等等。詳細(xì)說(shuō)明可以不與藥盒在物理上關(guān)聯(lián)；相反，可將用戶引導(dǎo)至由藥盒的制造商或分銷商指定的因特網(wǎng)網(wǎng)站，或作為電子郵件提供。通過(guò)參考以下具體實(shí)施例，可獲得對(duì)本發(fā)明的更完整的理解。僅出于解釋的目的描述實(shí)施例，且實(shí)施例不旨在限制本發(fā)明的范圍。在情況提示有利或變得有利時(shí)，考慮形式變化和等同物的取代。盡管本文已利用特定術(shù)語(yǔ)，但這些術(shù)語(yǔ)意在描述意義而不是出于限制的目的?？稍诓槐畴x本發(fā)明的精神和范圍的情況下作出本文之前給出的本發(fā)明的修飾和變化，因此，僅這些限制應(yīng)按照由所附實(shí)施方案所指示那樣來(lái)施加。實(shí)施例
實(shí)施例1. Laz和H. 8_天青蛋白融合基因的克隆和表達(dá)基于來(lái)自淋病奈瑟氏球菌的Iaz基因的已知序列(SEQ ID NO 1)克隆該基因(圖 1A)。使用稱為paz (圖1B)的銅綠假單胞菌天青蛋白基因(SEQ ID NO 2)和來(lái)自淋病奈瑟氏球菌的Iaz的H. 8表位序列(SEQ ID NO 3)將H. 8表位基因符合讀框地克隆在paz的 5'端中產(chǎn)生H. 8-paz (圖1C)或者符合讀框地克隆在paz的3'端中產(chǎn)生paz-H. 8 (圖1D)， 如以下所述。細(xì)胞系和試劑。人癌細(xì)胞、細(xì)菌菌株和質(zhì)粒列在表2中。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和腦瘤LN-2^細(xì)胞來(lái)自伊利諾斯大學(xué)芝加哥校區(qū)(UIC)手術(shù)腫瘤學(xué)系的儲(chǔ)存培養(yǎng)物保藏中心(stock culture collection of the Department of Surgical Oncology,University of Illinois at Chicago (UIC))。將細(xì)胞培養(yǎng)在包含2mM L-谷氨酰胺、0. ImM MEM必需氨基酸和補(bǔ)充了 10%熱滅活的胎牛血清、100單位/ml青霉素和100μ g/ml鏈霉素的具有伊格爾鹽的MEM中。所有細(xì)胞在37°C、5% (02下生長(zhǎng)。(Yamada，等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 99 :14098-14103(2002) ；Punj，等人，0ncogene23 :2367-2378 (2004)) 表2.癌細(xì)胞、細(xì)菌菌株和基因構(gòu)建體
權(quán)利要求
1.一種能夠殺傷癌細(xì)胞的分離肽，所述分離肽包含胱天蛋白酶募集(CARD)樣結(jié)構(gòu)域。
2.如權(quán)利要求1所述的分離肽，所述分離肽來(lái)源于細(xì)菌。
3.如權(quán)利要求2所述的分離肽，其中所述細(xì)菌是銅綠假單胞菌(I^eudomonas aeruginosa)0
4.如權(quán)利要求1所述的分離肽，所述分離肽是I^a-CARD。
5.如權(quán)利要求1所述的分離肽，所述分離肽包括SEQID N0:27。
6.如權(quán)利要求5所述的分離肽，所述分離肽由SEQID N0:27組成。
7.如權(quán)利要求1所述的分離肽，其中所述癌選自由以下組成的組白血病、卵巢癌、纖維肉瘤和乳腺癌。
8.如權(quán)利要求1所述的分離肽，所述分離肽被化學(xué)修飾以延長(zhǎng)或優(yōu)化其在血流中的半衰期。
9.一種方法，包括通過(guò)使癌細(xì)胞與一種或多種蛋白接觸來(lái)殺傷所述癌細(xì)胞，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組權(quán)利要求1所述的分離肽、Laz, HS-Azu和hu-H8。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述癌細(xì)胞選自由以下組成的組白血病細(xì)胞、纖維肉瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，所述方法還包括使所述細(xì)胞與能夠殺傷癌細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞毒劑接觸。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞毒劑選自由以下組成的組 順鉬、Gleevec 、視黃酸、5'-氮雜-2'-脫氧胞苷和三氧化二砷。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞毒劑是順鉬。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述癌細(xì)胞在與接觸所述一種或多種蛋白大約相同的時(shí)間同所述一種或多種細(xì)胞毒劑接觸。
15.一種方法，包括向患有癌癥的哺乳動(dòng)物患者施用一種或多種蛋白，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組權(quán)利要求1所述的分離肽、Laz, HS-Azu和hu-H8。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述癌癥選自由以下組成的組白血病、纖維肉瘤、卵巢癌和乳腺癌。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，所述方法還包括向所述患者施用能夠殺傷癌細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞毒劑。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞毒劑選自由以下組成的組 順鉬、Gleevec 、視黃酸、5'-氮雜-2'-脫氧胞苷和三氧化二砷。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞毒劑是順鉬。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞毒劑在與所述一種或多種蛋白大約相同的時(shí)間施用。
21.一種方法，包括通過(guò)使白血病細(xì)胞與天青蛋白和包含Laz的H. 8區(qū)的肽接觸來(lái)殺傷所述白血病細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述白血病細(xì)胞與所述天青蛋白和所述包含Laz 的H. 8區(qū)的肽同時(shí)或大致同時(shí)接觸。
23.一種方法，包括向患白血病的哺乳動(dòng)物患者施用天青蛋白和包含Laz的H. 8區(qū)的肽。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中同時(shí)或大致同時(shí)向所述患者施用所述天青蛋白和所述包含Laz的H. 8區(qū)的肽。
25.一種方法，包括通過(guò)使白血病細(xì)胞接觸一種或多種蛋白來(lái)誘導(dǎo)所述白血病細(xì)胞中的細(xì)胞分化，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、Azu-H. 8 和權(quán)利要求1所述的分離肽。
26.一種方法，包括通過(guò)使癌細(xì)胞與一種或多種蛋白接觸來(lái)選擇性進(jìn)入所述癌細(xì)胞，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、Azu-H. 8和權(quán)利要求1所述的分離肽；其中所述癌細(xì)胞選自由白血病細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞組成的組。
27.一種方法，包括通過(guò)使癌細(xì)胞接觸一種或多種蛋白來(lái)誘導(dǎo)所述癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期停滯，所述一種或多種蛋白選自由以下組成的組Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、Azu-H. 8和權(quán)利要求1所述的分離肽。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述癌細(xì)胞選自由以下組成的組白血病細(xì)胞、纖維肉瘤細(xì)胞、乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述蛋白提高所述細(xì)胞中的Weel蛋白水平。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述蛋白引起磷酸化的AKT-kr-473的消耗。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述蛋白既提高所述細(xì)胞中的Weel蛋白水平又引起磷酸化的AKT-kr-473的消耗。
32.一種方法，包括通過(guò)使癌細(xì)胞與權(quán)利要求1所述的肽接觸而通過(guò)胱天蛋白酶3的活化在所述癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞。
34.一種方法，包括通過(guò)使癌細(xì)胞與權(quán)利要求1所述的肽接觸來(lái)調(diào)節(jié)所述癌細(xì)胞中 NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因的表達(dá)。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞。
36.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體編碼權(quán)利要求1所述的分離肽。
37.如權(quán)利要求36所述的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體編碼權(quán)利要求4所述的分離肽。
38.一種藥物組合物，所述藥物組合物包括權(quán)利要求1所述的分離肽。
39.如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體。
40.如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包括選自由以下組成的組的蛋白天青蛋白、Laz、H. 8-Azu和Azu-H. 8。
41.如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包括能夠殺傷癌細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞毒劑。
42.如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體適合于靜脈內(nèi)注射。
43.一種方法，包括向患有白血病的患者施用治療有效量的權(quán)利要求38所述的藥物組合物。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述藥物組合物以選自由以下組成的組的方式向患者施用靜脈內(nèi)、局部、皮下、肌內(nèi)、口服和進(jìn)入腫瘤內(nèi)。
45.一種藥盒，所述藥盒包括權(quán)利要求38所述的藥物組合物。
46.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求1所述的分離肽。
47. 一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求4所述的分離肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用源自細(xì)菌的蛋白殺傷癌細(xì)胞的方法和材料。本發(fā)明具體涉及天青蛋白、Laz、Pa-CARD以及融合蛋白Azu-H.8和H.8-Azu，以及它們?cè)跉籽〖?xì)胞和/或卵巢癌細(xì)胞中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/00GK102387809SQ201080016084
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者塔帕斯·達(dá)斯古普塔, 阿南達(dá)·查克拉博蒂, 阿塞尼奧·菲亞略 申請(qǐng)人:Cdg醫(yī)療公司