專利名稱：通過抑制針對腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)的天然反義轉(zhuǎn)錄物來治療bdnf相關(guān)的疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實施方案包括調(diào)節(jié)BDNF和相關(guān)分子的表達和/或功能的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對于核酸功能的許多方面(包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯) 而言為重要的。雜交對于探測特定核酸或者改變其表達的各種技術(shù)而言亦為主要的。反義核苷酸例如通過與靶RNA雜交來擾亂基因表達，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。 反義DNA具有附加的特征，該特征為DNA-RNA雜合體充當(dāng)核糖核酸酶H消化的底物，該活性存在于大多數(shù)細胞類型中。可將反義分子遞送到細胞中，這與寡脫氧核苷酸(ODN)的情況一樣，或者它們?nèi)鏡NA分子一樣可由內(nèi)源基因表達。FDA最近批準了一種反義藥物， VITRAVENE (用于治療巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎)，這反映了反義物具有治療應(yīng)用。發(fā)明概述提供本概述以呈現(xiàn)本發(fā)明的概述，從而簡要地指出本發(fā)明的性質(zhì)和實質(zhì)。在理解以下的情況下提出本概述其不會用于解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義。在一個實施方案中，本發(fā)明提供通過使用靶定天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的反義寡核苷酸來抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用，引起相應(yīng)有義基因的增量調(diào)節(jié)的方法。本文也考慮天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可通過siRNA、核酶和小分子來達到，認為所述siRNA、核酶和小分子在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。一個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的BDNF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括用長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細胞或組織，其中所述寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :2(圖3)的核苷酸1-3175之內(nèi)的5_30個連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中BDNF多核苷酸的功能和/或表達。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶定BDNF多核苷酸的天然反義序列，例如 SEQ ID NO :2所述的核苷酸，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO 3-8所述(圖4)。另一個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中BDNF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括用長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細胞或組織，其中所述寡核苷酸與BDNF多核苷酸的反義物的反向互補序列具有至少50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中BDNF多核苷酸的功能和/或表達。另一個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中BDNF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括用長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細胞或組織，其中所述寡核苷酸與BDNF反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中BDNF多核苷酸的功能和/或表達。在優(yōu)選的實施方案中，組合物包含一種或多種與有義和/或反義BDNF多核苷酸結(jié)合的反義寡核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經(jīng)修飾或取代的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經(jīng)修飾的鍵。在又一個實施方案中，所述修飾核苷酸包含經(jīng)修飾的堿基，其包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -0-甲基、氟或碳、亞甲基或其他鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選地，所述修飾核苷酸為鎖定核酸分子，包括a-L-LNA。在另一個優(yōu)選的實施方案中，將所述寡核苷酸經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予患者。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，將所述寡核苷酸在藥物組合物中給予。治療方案包括至少一次向患者給予反義化合物；然而，可將此治療修改成在一段時間內(nèi)包含多次給藥。 所述治療可與一種或多種其它類型的療法組合。在另一個優(yōu)選的實施方案中，將所述寡核苷酸封裝到脂質(zhì)體中或附著于載體分子 (例如膽固醇、TAT肽)。其它方面描述于下文。附圖
簡述圖 1圖IA 為實時PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對照，用LNA gapmer硫代磷酸寡核苷酸處理H印G2細胞后BDNF mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準偏差，所述LNA gapmer硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。實時PCR結(jié)果顯示，H印G2細胞中BDNF mRNA的水平在用針對BDNF反義物NM_170735設(shè)計的具有完全硫代磷酸酯化(phosphothioated)骨架的兩種 LNA gapmer 處理后 48h 顯著增加(CUR-0071,P = 0. 04 ；CUR_0073，P = 0. 07 ；CUR-0075, P = O. 03)。表示為 CUR-0071、CUR-0072、CUR-0073、CUR-0074、CUR-0075 和 CUR-0076 的條分別對應(yīng)用SEQ ID NO :6、7、8、3、4和5處理的樣品。圖IB 為實時PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理H印G2細胞后BDNF mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。實時PCR結(jié)果顯示BDNF反義物的水平在用除CUR-0072之外的所有寡核苷酸處理后顯著減少，這可能是因為不同寡核苷酸影響B(tài)DNF和/或BDNF反義物NM_170735的不同剪接變體。表示為CUR-0071、CUR-0072、 CUR-0073、CUR-0074、CUR-0075 和 CUR-0076 的條分別對應(yīng)用 SEQ ID NO :6、7、8、3、4 和 5 處理的樣品。圖IC 為實時PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對照，用LNA gapmer-硫代磷酸寡核苷酸處理CHP212細胞后BDNF mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準偏差，所述LNA gapmer-硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。實時PCR結(jié)果顯示，CHP212細胞中BDNF mRNA的水平在用針對BDNF反義物NM_170735設(shè)計的具有完全硫代磷酸酯化骨架的兩種LNA gapmer處理后4 顯著增加。表示為CUR-0071、CUR-0072和CUR-0076的條分別對應(yīng)用SEQ ID NO 6、7和3處理的樣品。
圖2顯示SEQ ID NO 1 人類腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、轉(zhuǎn)錄物變體1、 mRNA(NCBI檢索號NM_170735)和SEQ ID NO 11顯示BDNF的基因組序列(外顯子用大寫字母顯示，內(nèi)含子用小寫字母顯示)。圖3顯示SEQ ID NO 2 天然BDNF反義序列(NR_002832. 1)人類BDNF相反鏈(非蛋白編碼)(BDNFOS)，非編碼RNA。圖4顯示反義寡核苷酸，SEQ ID NO :3_8。*指硫代磷酸酯鍵而+指LNA修飾。圖 5 顯示 SEQ ID NO 9 和 10。發(fā)明詳述參考用于說明的示例應(yīng)用在下文中描述本發(fā)明的數(shù)個方面。應(yīng)當(dāng)理解的是，陳述許多具體細節(jié)、關(guān)系和方法來提供對本發(fā)明的充分理解。然而，在相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認識到，可在不含一個或多個具體細節(jié)的情況下實施本發(fā)明或者可用其他方法來實施本發(fā)明。本發(fā)明不受行為或事件的排序限制，因為一些行為可以不同的順序進行和/ 或與其他行為或事件同時進行。此外，并非所有說明性的行為或事件對實施本發(fā)明的方法都為必需的。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物意圖對應(yīng)來自任何物種的同源物，對該物種而言本文公開的組合物和方法為適用的。因此，該術(shù)語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。理解的是，當(dāng)公開來自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時，意圖此公開僅為示范性的，并且除非其出現(xiàn)的文段中明確指示，否則不應(yīng)理解為限制。因此，例如，對于本文公開的在一些實施方案中有關(guān)哺乳動物核酸和氨基酸序列的基因而言，意圖包括來自其他動物(包括但不限于其他哺乳動物、魚類、兩棲動物、爬行動物和鳥類)的同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物。在優(yōu)選的實施方案中，所述基因或核酸序列為人的。定義本文所用的術(shù)語僅以描述具體的實施方案為目的而不意圖限制本發(fā)明。除非文段另有明確指示，否則本文所用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“所述”也意圖包括復(fù)數(shù)形式。此外，就術(shù)語“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其變型在詳述和/或權(quán)利要求中所用的程度而言，這類術(shù)語意圖以類似于術(shù)語“包含”的方式是包括在內(nèi)的。術(shù)語“約”或“大約”意為在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)，這部分取決于該值是如何測定或確定的，即，測量系統(tǒng)的限制。例如，按照本領(lǐng)域的實踐，“約”可意為在1之內(nèi)或大于1的標(biāo)準偏差?；蛘?，“約”可意為高達給定值的20%， 優(yōu)選10%，更優(yōu)選5%，和還更優(yōu)選1 %的范圍?；蛘?，具體地關(guān)于生物系統(tǒng)或過程，該術(shù)語可意為在值的一個數(shù)量級之內(nèi)，優(yōu)選在值的5倍之內(nèi)，更優(yōu)選在2倍之內(nèi)。當(dāng)本申請和權(quán)利要求描述具體值時，除非另作說明，否則應(yīng)假設(shè)術(shù)語“約”意為在具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)。本文所用的術(shù)語“mRNA”意為目前已知的靶定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及任何可闡明的其它轉(zhuǎn)錄物。“反義寡核苷酸”或“反義化合物”意為與另一個RNA或DNA (靶RNA、DNA)結(jié)合的 RNA或DNA分子。例如，如果其為RNA寡核苷酸，則其通過RNA-RNA相互作用結(jié)合另一個RNA 靶標(biāo)并改變靶RNA的活性(Eguchi等，(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反義寡核苷酸可增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)特定多核苷酸的表達和/或功能。該定義意在包括從治療、診斷或其他觀點來看有用的任何外源RNA或DNA分子。這類分子包括例如反義RNA或DNA分子、 干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療用編輯RNA(therapeutic editing RNA)以及激動劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列 (EGS)寡核苷酸、可變剪接物(alternate splicer)、引物、探針以及其他與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。因此，可將這些化合物以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的文段中，術(shù)語“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語“寡核苷酸”，也包括天然和/或經(jīng)修飾單體或鍵 (linkage)的線性或環(huán)狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-異頭物形式、 肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過單體與單體相互作用的規(guī)律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對、Ho0gsteen或反 Ho0gsteen型堿基配對等)特異地結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可為“嵌合的”，即，由不同的區(qū)組成。在本發(fā)明的文段中，“嵌合的”化合物為寡核苷酸，其包含兩個或更多個化學(xué)區(qū)，例如，DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等。每個化學(xué)區(qū)由至少一個單體單元(即，在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸典型地包含至少一個區(qū)，其中所述寡核苷酸為經(jīng)修飾的以表現(xiàn)出一種或多種所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增強的對核酸酶降解的抗性、增強的細胞攝取和/或增強的對靶核酸的結(jié)合親和力。因此寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同的特性。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結(jié)構(gòu)。寡核苷酸可由可“全符合狀態(tài)(in “register”)”地連接或通過間隔物連接的區(qū)組成，所述“全符合狀態(tài)”地連接即此時單體像在天然DNA —樣連續(xù)地連接。所述間隔物意在構(gòu)成區(qū)之間的共價“橋”，并在優(yōu)選的情況下具有不超過約100個碳原子的長度。所述間隔物可攜帶不同的功能性，例如具有正或負電荷的、具有特殊的核酸結(jié)合特性(嵌入劑、溝黏合劑、毒素、熒光團等)、為親脂的、誘導(dǎo)特殊的二級結(jié)構(gòu)如例如誘導(dǎo)α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“BDNF”和“腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子”包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用的措詞“腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子”、“腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子”和BDNF，在本申請中可交換地使用。本文所用的術(shù)語“對......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復(fù)合體，或(ii) 能夠與靶定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計算和/或體外測定來確定。用于確定雜交復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測定法描述于下文實施例中。本文所用的術(shù)語“靶核酸”包括DNA、從這類DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前mRNA和mRNA)， 以及從這類RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。這種通過特異地與靶核酸雜交的化合物對該靶核酸功能的調(diào)節(jié)，一般稱為“反義”。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能，包括所有的生活機能，例如，RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、 產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進的催化活性。對靶核酸功能的這類干擾的整體效果為對編碼產(chǎn)物或寡核苷酸表達的調(diào)節(jié)。RNA干擾“RNAi ”由雙鏈RNA (dsRNA)分子介導(dǎo)，該分子具有與其“靶”核酸序列的序列特異性同源性(Caplen，N. J.等，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :9742-9747)。在本發(fā)明的某些實施方案中，介體為5-25個核苷酸的“小干擾” RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA通過稱為切酶的 RNA 酶對 dsRNA 的加工得到(Bernstein，E.等，(2001) Nature409 :363-366)。 siRNA雙鏈體產(chǎn)物募集到叫做RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。不希望受任何具體理論所約束，認為隨后RISC被引向靶核酸(適當(dāng)?shù)貫閙RNA)，其中siRNA 雙鏈體以序列特異性的方式相互作用來介導(dǎo)催化方式的切割(Bernstein，Ε.等，Q001) Nature 409 :363-366 ；Boutla，A.等，(2001)Curr. Biol. 11 :1776-1780)。可依照本發(fā)明使用的小干擾RNA，可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知和普通技術(shù)人員熟悉的程序來合成和使用。用于本發(fā)明的方法中的小干擾RNA適當(dāng)?shù)匕s1-約50個核苷酸(nt)。在非限制性實施方案的實例中，siRNA可包含約5-約40nt、約5-約30nt、約10-約30nt、約15-約25nt、或約 20-25個核苷酸。適當(dāng)寡核苷酸的挑選通過使用電腦程序來促進，該程序自動比對核酸序列并指出具有同一性或同源性的區(qū)。將這類程序用于比較通過例如搜索諸如GenBank等的數(shù)據(jù)庫或通過測序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。對來自一系列物種的核酸序列的比較，允許選擇在物種之間顯示適度同一性的核酸序列。在未測序基因的情況下，進行DNA印跡來確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域眾所周知的，通過在不同的嚴格程度下進行DNA印跡，可能獲得同一性的近似衡量。這些程序允許選擇以下寡核苷酸，其對待控制的受試者中的靶核酸序列表現(xiàn)出高度的互補性，并且對其他物種中的相應(yīng)核酸序列表現(xiàn)出較低程度的互補性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，在挑選用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)幕騾^(qū)方面具有相當(dāng)大的自由?！懊复?RNA"意為具有酶活性的 RNA 分子(Cech，(1988) J. American. Med. Assoc.沈0，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過首先結(jié)合靶RNA來起作用。這類結(jié)合通過酶促核酸的靶結(jié)合部分進行，所述靶結(jié)合部分保持緊密靠近進行切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶促核酸首先識別而后通過堿基配對結(jié)合靶RNA，且一旦結(jié)合到正確的位點，即進行酶促切割靶RNA。“誘餌RNA”意為模擬配體的天然結(jié)合域的RNA分子。因此誘餌RNA與天然結(jié)合靶標(biāo)競爭與特異性配體的結(jié)合。例如，已顯示HIV反式激活應(yīng)答(TAR)RNA的過表達可充當(dāng)“誘餌”并有效地結(jié)合HIVtat蛋白，從而阻止其結(jié)合到在HIV RNA中編碼的TAR序列(Sullenger 等，(1990)Cell，63，601-608)。這意指特定的實例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，這只是一個實例，而其他的實施方案可使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)容易地產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語“單體”通常指以下單體，其通過磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小范圍從少量單體單元(例如從約3-4)到約數(shù)百個單體單元的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。術(shù)語“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，先前認為“非天然存在”的多種核苷酸后來已在自然中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其他類型的核苷酸的說明性實例為以下分子，其含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-橋亞乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷和在Bermer等美國專利第5，432，272號中描述的“非天然存在的”核苷酸。術(shù)語“核苷酸”意在涵蓋這些實例以及其類似物和互變異構(gòu)體中的每一個和全部。尤其令人關(guān)注的核苷酸為含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被認為是有關(guān)人中的治療和診斷應(yīng)用的天然存在核苷酸。核苷酸包括天然 2，-脫氧和 2，-羥基糖，例如，如 Kornberg 和 Baker，DNA 復(fù)制(DNA Replication), H 2 版(Freeman，San Francisco, 1992)中所述的以及其類似物。提及核苷酸的“類似物”包括具有經(jīng)修飾的堿基部分和/或經(jīng)修飾的糖部分的合成核苷酸(參見例如，由Scheit，核苷酸類似物(Nucleotide Analogs), John Wiley, New York，1980 ;Freier 禾口 Altmann， (1997)Nucl. Acid. Res. ,25(22), 4429-4443, Toulme, J. J. , (2001)Nature Biotechnologyl9 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Actal489 :117-139 ；Freier S. Μ. , (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443, UhIman, E. ， (2000)Drug Discovery&Development,3 :203-213, Herdewin P.， (2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297-310 —般描述的)；2，-0，3，-C-連接的[3.2.0] 二環(huán)阿糖核苷(參加例如 N. KChristiensen.等，(1998) J.Am. Chem. Soc., 120 :5458-5463 ；Prakash TP,Bhat B. (2007)Curr Top Med Chem. 7(7) :641-9 ；Cho EJ 等， (2009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，24H64)。這類類似物包括設(shè)計以增強結(jié)合特性的合成核苷酸，所述結(jié)合特性為例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等。本文所用的“雜交”意為寡聚化合物的基本上互補鏈的配對。一種配對的機理涉及寡聚化合物的鏈的互補核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可為沃森-克里克、HoGgsteen或反Ho0gsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶為互補的核苷酸，其通過形成氫鍵配對。雜交可在各種環(huán)境下發(fā)生。反義化合物為“可特異地雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補性來避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測定或治療性處理情況中的生理條件下，以及其中在體外測定情況下進行測定的條件下。本文所用的短語“嚴格雜交條件”或“嚴格條件”是指以下條件，在該條件下本發(fā)明的化合物與其靶序列雜交，但與最少數(shù)量的其他序列雜交。嚴格條件為序列依賴的且在不同環(huán)境下將不同，在本發(fā)明的文段中，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴格條件”由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及正在其中研究它們的試驗來確定。一般而言，嚴格雜交條件包括低濃度(< 0. 15M)的含有諸如Na++或K++等無機陽離子的鹽(即，低離子強度)、溫度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體的Tm，以及存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，雜交率對于每甲酰胺減少1. 1%。高嚴格雜交條件的實例為0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. 1% (w/v)SDS、60°C下達30分鐘。本文所用的“互補的”是指在一條或兩條寡聚鏈上兩個核苷酸之間精確配對的能力。例如，如果在反義化合物的某個位置上的核破基能夠與在靶核酸的某個位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認為所述寡核苷酸和所述靶核酸之間氫鍵合的位置為互補位置。當(dāng)可彼此氫鍵合的核苷酸占據(jù)了每個分子中足夠數(shù)量的互補位置時，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子為彼此互補的。因此，“可特異性雜交的”和“互補的”為以下術(shù)語，其用于表示在足夠數(shù)量的核苷酸上有足夠程度的精確配對或互補性，使得穩(wěn)定和特異的結(jié)合發(fā)生在寡聚化合物和靶核酸之間。據(jù)本領(lǐng)域了解，寡聚化合物的序列不需要與其可特異雜交的靶核酸的序列100% 互補。此外，寡核苷酸可在一個或多個區(qū)段上雜交，使得間插或鄰近的區(qū)段不涉及雜交事件 (例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包含與其靶定的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約 95%、或至少約99%的序列互補性。例如，其中反義化合物的20個核苷酸中有18個與靶區(qū)互補且因而會特異地雜交的反義化合物，表示90%互補性。在此實例中，余下的非互補核苷酸可與互補核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此鄰接或鄰接互補核苷酸。因此，長度為 18個核苷酸的反義化合物具有4 (四)個非互補核苷酸，該非互補核苷酸位于與靶核酸完全互補的兩個區(qū)的側(cè)翼，所述反義化合物會具有與靶核酸77. 8%的總互補性，因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸區(qū)的互補性百分比可使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)地確定(Altschul等，(1990) J. Mol. Biol.， 215,403-410 ；Zhang和Madden，(1997)Genome Res. ,7,649-656) 同源性、序列同一性或互補性百分比可通過例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系統(tǒng)版本8，Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)使用默認設(shè)置來石角定，該禾呈序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math.，(1981)2,482-489)。本文所用的術(shù)語“解鏈溫度(Tm) ”是指以下溫度，在限定的離子強度、pH和核酸濃度下，在該溫度下平衡時50%與靶序列互補的寡核苷酸與靶序列雜交。典型地，對于短寡核苷酸(例如，10-50個核苷酸)而言嚴格條件為以下條件，其中鹽濃度至少為約0.01-1. OM Na離子濃度(或其他鹽)，pH 7. 0-8. 3且溫度至少為約30°C。嚴格條件也可通過外加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來達到。本文所用的“調(diào)節(jié)”意為在基因表達方面的增加(刺激)或減少(抑制)。術(shù)語“變體”，當(dāng)用于多核苷酸序列的情況下時，可包括有關(guān)野生型基因的多核苷酸序列。此定義也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)的”變體。剪接變體可具有與參比分子顯著的同一性，但因為在mRNA加工期間外顯子的可變剪接而通常具有更多或更少數(shù)量的多核苷酸。對應(yīng)的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物種變體為在不同物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中尤其實用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可由核酸序列中的至少一個突變產(chǎn)生并可導(dǎo)致產(chǎn)生改變的mRNA或者其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不變的多肽。任何給定的天然或重組基因可不具有、具有一個或許多等位基因形式。 產(chǎn)生變體的常見突變變化一般歸因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。這些變化類型中的每一個可單獨或與其他類型聯(lián)合發(fā)生，在給定序列中發(fā)生一次或多次。產(chǎn)生的多肽一般將具有相對于彼此的顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體為在給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體也可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單堿基突變，其中多核苷酸序列因一個堿基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病狀態(tài)傾向(即與抗性相對的易感性)的某個種群。衍生多核苷酸包括經(jīng)過化學(xué)修飾的核酸，例如用烷基、?；虬被脫Q氫。衍生物 (例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這些中示例性的是硫代磷酸酯及本領(lǐng)域已知的其他含硫的種類。衍生核酸也可含有標(biāo)記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒，等等。“衍生的”多肽或肽為經(jīng)修飾的多肽或肽，例如，通過糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸鹽化作用、還原/烷基化、酰化、化學(xué)偶聯(lián)或溫性福爾馬林處理。也可將衍生物修飾以含有可檢測標(biāo)記(直接地或間接地)，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。本文所用的術(shù)語“動物”或“患者”意在包括例如人、棉羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、貂、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蜘蛛類?！安溉閯游铩焙w通常在醫(yī)療護理下的溫血哺乳動物(例如，人和馴養(yǎng)動物)。實例包括貓科動物、犬、馬、?？苿游锖腿?，以及僅僅人?！疤幚怼被颉爸委煛焙w對哺乳動物中疾病狀態(tài)的治療，并包括(a)防止疾病狀態(tài)出現(xiàn)于哺乳動物中，特別是當(dāng)這類哺乳動物傾向于疾病狀態(tài)但尚未診斷為患有該疾病狀態(tài)時；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如，阻止其發(fā)展；和/或(c)減輕疾病狀態(tài)，例如，引起疾病狀態(tài)的退行直到達到所需的終末點。治療也包括改善疾病的癥狀(例如，減少疼痛或不適)，其中這類改善可直接或可非直接地影響疾病(例如，原因、傳遞、表達等)。本文所用的術(shù)語“癌癥”是指任何惡性腫瘤，具體地在肺、腎臟或甲狀腺中產(chǎn)生的惡性腫瘤。癌癥自身表現(xiàn)為包含癌癥惡性細胞的“腫瘤”或組織。腫瘤的實例包括肉瘤或癌，例如但不限于纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、 腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、 成神經(jīng)細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤。如上所述，本發(fā)明特別地允許肺、腎臟和甲狀腺腫瘤的鑒別診斷。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶標(biāo)在一個實施方案中，靶標(biāo)包括腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的核酸序列，包括但不限于與BDNF有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白為一類結(jié)構(gòu)上相關(guān)的生長因子，其促進神經(jīng)生存和分化。它們刺激神經(jīng)突生長，表明其可促進受損神經(jīng)元的再生，并充當(dāng)靶標(biāo)-衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子以刺激在靶組織中側(cè)支出芽，所述靶組織產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(Korsching.，(1993) J. Neurosci. , 13 2739)。腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)最初表征為存在于腦提取物中并能夠增加背根神經(jīng)節(jié)生存的堿性蛋白(Leibrock.等，(1989)Nature，341 149)。當(dāng)與細胞體的軸突交流被損傷中斷時，神經(jīng)膜細胞產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如神經(jīng)生長因子(NGF)和BDNF。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白從神經(jīng)膜細胞中釋放且圍繞再生軸突以梯度形式擴散地分布，再生軸突然后順著神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的密度梯度向遠側(cè)延伸(Ide.，(1996)Neurosci. Res. ,25 101)0已顯示局部施用BDNF 至新生大鼠中的橫斷神經(jīng)預(yù)防軸突顯微外科術(shù)后運動神經(jīng)元的大量死亡(DiMefano.等， (1992) Neuron, 8 983 ；Oppenheim.等，(1992) Nature, 360 755 ；Yan.等，(1992) Nature, 360 753)。BDNF的mRNA效價在軸突顯微外科術(shù)四天后增加到正常水平的數(shù)倍，并在4周時達到其最大值(Meyer.等，(1992) J. Cell Biol. 119 :45)。此外，已報道BDNF增強培養(yǎng)物中膽堿能神經(jīng)元的生存(Nonomura 等，(1995) Brain Res. 683 129) 可用由使用反義化合物獲得的干細胞再生的細胞/組織治療的示例性腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)介導(dǎo)的疾病和病癥包括缺陷性神經(jīng)發(fā)生有關(guān)的疾病或病癥；神經(jīng)變性疾病或病癥(例如，阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化等)；神經(jīng)精神障礙(抑郁癥、精神分裂癥、精神分裂癥樣精神障礙(schizofreniform disorder), 情感分裂性精神障礙和妄想性障礙)；焦慮性障礙例如驚恐性障礙、恐怖癥(包括廣場恐怖癥)、強迫性神經(jīng)失調(diào)、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、雙相性精神障礙、神經(jīng)性厭食、神經(jīng)性貪食、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病(例如，多發(fā)性硬化)、記憶喪失、長期或短期記憶障礙、良性健忘、兒童學(xué)習(xí)障礙、閉合性顱腦損傷、注意力缺陷障礙、對病毒感染的神經(jīng)元反應(yīng)、腦損傷、發(fā)作性睡病、睡眠障礙(例如，晝夜節(jié)律障礙、失眠癥和發(fā)作性睡病)；神經(jīng)中斷或神經(jīng)損傷、腦脊髓神經(jīng)索(CNS)中斷和腦或神經(jīng)細胞損傷、與AIDS有關(guān)的神經(jīng)功能缺損、以運動和/或發(fā)聲性抽搐(vocal tic)為特征的運動和抽搐障礙(例如，圖雷特精神障礙 (Tourette' s disorder)、慢性運動或發(fā)聲性抽搐障礙、短時抽搐性障礙和刻板型活動障礙)、物質(zhì)濫用病癥(例如，物質(zhì)依賴、物質(zhì)濫用以及物質(zhì)濫用/依賴的后遺癥，例如物質(zhì)誘發(fā)的心理障礙、物質(zhì)戒斷和物質(zhì)誘發(fā)的癡呆或遺忘癥)、外傷性腦損傷、耳鳴、神經(jīng)痛(例如，三叉神經(jīng)痛)、疼痛(例如，慢性疼痛、慢性炎性痛、與關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關(guān)的疼痛、與消化性疾病有關(guān)的疼痛、與克羅恩氏病有關(guān)的疼痛、與自身免疫性疾病有關(guān)的疼痛、與內(nèi)分泌疾病有關(guān)的疼痛、與糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)的疼痛、幻肢痛、自發(fā)性疼痛、慢性術(shù)后疼痛、慢性顳下頌疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、AIDS相關(guān)的疼痛、I和II型復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷有關(guān)的疼痛、與藥物攝入有關(guān)的疼痛和復(fù)發(fā)性急性疼痛、神經(jīng)性疼痛)、在諸如糖尿病、MS和運動神經(jīng)元病等疾病中導(dǎo)致 neurodysthesias的不適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元活性、共濟失調(diào)、肌肉強直(痙攣狀態(tài))、顳下顎關(guān)節(jié)功能障礙、獎賞缺陷綜合征(Reward deficiency syndrome, RDS)、由酒精或物質(zhì)濫用(例如，搖頭丸(ecstacy)、去氧麻黃堿等)引發(fā)的神經(jīng)毒性、精神發(fā)育遲緩或認知缺損(例如， 非綜合征性X連鎖精神發(fā)育遲緩、脆性X綜合征、唐氏綜合征、孤獨癥)、失語癥、貝爾氏麻痹(Bell’ s palsy)、克-雅病、腦炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、ondine綜合征、WAGR綜合征、 聽力損失、雷特綜合征、癲癇、脊髓損傷、中風(fēng)、缺氧、缺血、腦損傷、視神經(jīng)損傷、糖尿病神經(jīng)病變、周圍神經(jīng)病、神經(jīng)移植并發(fā)癥、運動神經(jīng)元病、周圍神經(jīng)損傷、肥胖癥、代謝綜合征、癌癥、哮喘、特應(yīng)性疾病、過敏性炎癥、濕疹、神經(jīng)腫瘤學(xué)疾病或病癥、神經(jīng)免疫學(xué)疾病或病癥和神經(jīng)耳科疾病或病癥；以及與老化和衰老有關(guān)的疾病或病癥。在一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸對于BDNF的多核苷酸(其包括但不限于非編碼區(qū))而言為特異的。BDNF靶標(biāo)包括BDNF或BDNFOS的變體；BDNF或BDNFOS的突變體，包括SNP ；BDNF的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA分子。
依照本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不單獨限于BDNF多核苷酸，而是擴展到BDNF的任何同種型、受體、同源物、非編碼區(qū)等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶定BDNF靶標(biāo)的天然反義序列(針對編碼和非編碼區(qū)的天然反義物)，所述BDNF靶標(biāo)包括但不限于其變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA或DNA分子。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括變體，其中在所述化合物的一個或多個核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個核苷酸為腺嘌呤，則可產(chǎn)生在此位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的變體。這可在所述反義化合物的任何位置上完成。然后使用本文所述的方法來檢測這些化合物以確定其抑制靶核酸的表達的能力。在一些實施方案中，反義化合物與靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補性為約50%-約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約60% -約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約70% -約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約80%-約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。反義化合物在以下情況時為可特異性雜交的所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起活性損失，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。這類條件包括，即，在體內(nèi)測定或治療性處理情況中的生理條件，以及其中在體外測定情況下進行測定的條件。反義化合物，不論DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情況時為可特異性雜交的所述化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用損失，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測定或治療性處理情況中的生理條件下，以及在體外測定情況下在其中進行測定的條件下。在另一個優(yōu)選的實施方案中，靶定BDNF調(diào)節(jié)BDNF的表達或功能，BDNF包括但不限于使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列、一個或多個如SEQ ID NO :2所述的序列，等等。在一個實施方案中，表達或功能與對照相比為增量調(diào)節(jié)的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，表達或功能與對照相比為減量調(diào)節(jié)的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO :3_8所述的核酸序列，包括使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸、較短或較長的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無需在此描述。反義物的特異性和敏感性也被本領(lǐng)域的技術(shù)人員用于治療用途。已將反義寡核苷酸用作在動物和人的疾病狀態(tài)治療中的治療部分。已將反義寡核苷酸安全和有效地施用給人，并且目前正在進行許多臨床試驗。因此已確定寡核苷酸可為有用的治療形式，其可將經(jīng)配置以在用于治療細胞、組織和動物尤其人的治療方案中有用。
在本發(fā)明的實施方案中，寡聚反義化合物(具體地寡核苷酸)結(jié)合到靶核酸分子并調(diào)節(jié)由靶基因編碼的分子的表達和/或功能。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有的生活機能，例如RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進的催化活性。所述功能可被增量調(diào)節(jié)或受抑制，這取決于所需的功能。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少一部分雜交的其他寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的情況下，將反義化合物靶定到特定的核酸分子可為多步過程。所述過程通常以鑒定待調(diào)節(jié)其功能的靶核酸開始。此靶核酸可為，例如其表達與特定病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或來自傳染劑的核酸分子。在本發(fā)明中，所述靶核酸編碼腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。靶定過程通常也包括確定靶核酸內(nèi)的至少一個靶區(qū)、區(qū)段或位點以用于發(fā)生反義相互作用，使得產(chǎn)生所需的效應(yīng)，例如，表達的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的文段中，術(shù)語“區(qū)”定義為具有至少一個可識別結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區(qū)內(nèi)為區(qū)段?！皡^(qū)段”定義為在靶核酸內(nèi)區(qū)的較小或亞部分。本發(fā)明所用的“位點”定義為靶核酸內(nèi)的位置。在優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的天然反義序列并調(diào)節(jié)腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) (SEQ ID NO 1)的表達和/或功能。反義序列的實例包括SEQ ID NO 2-8 ο在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的一個或多個區(qū)段并調(diào)節(jié)腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達和/或功能。所述區(qū)段包含腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)有義或反義多核苷酸的至少五個連續(xù)的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸對腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的天然反義序列而言為特異的，其中所述寡核苷酸與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達和/或功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID N0:3_8所述的序列、使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷酸、較短或較長的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可連接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無需在此描述。由于如本領(lǐng)域已知，翻譯起始密碼子通常為5' -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)的DNA分子中為5' -ATG)，因而翻譯起始密碼子也稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子”或“AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有翻譯起始密碼子，其具有RNA序列5' -GUG、5' -UUG或5' -CUG ；以及5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包括許多密碼子序列，但在每個情況下起始氨基酸通常為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有兩個或更多個備選起始密碼子，其中的任何一個可優(yōu)先地用于在特定細胞類型或組織中或在特定條件組下的翻譯起始。在本發(fā)明的文段中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指這樣的一個或多個密碼子，其在體內(nèi)用于起始由編碼腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯，與這類密碼子的一個或多個序列無關(guān)?；虻姆g終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三個序列中的一個，即，5 ‘ -UAA、5 ‘ -UAG和5 ‘ -UGA (對應(yīng)的DNA序列分別為 5' -TAA、5' -TAG 和 5' -TGA)。術(shù)語“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”是指從翻譯起始密碼子開始在任一方向上(即，5’或3’)包含約25-約50個連續(xù)的核苷酸的這類mRNA或基因的部分。類似地，術(shù)語“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”是指從翻譯終止密碼子開始在任一方向上(即，5’或3’)包含約25-約50個連續(xù)的核苷酸的這類mRNA或基因的部分。因此，“起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或“翻譯終止密碼子區(qū)”)均為可用本發(fā)明的反義化合物有效地靶定的區(qū)。本領(lǐng)域已知的可讀框(ORF)或“編碼區(qū)”是指在翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)，也為可有效地靶定的區(qū)。在本發(fā)明的內(nèi)容內(nèi)，靶定的區(qū)為包含基因可讀框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)。另一種靶區(qū)包括本領(lǐng)域已知的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，是指在翻譯起始密碼子的5’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5’加帽位點和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上對應(yīng)的核苷酸)。再一種靶區(qū)包括本領(lǐng)域已知的3’非翻譯區(qū)(3' UTR)，是指在翻譯終止密碼子3’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻譯終止密碼子和3’末端之間的核苷酸(或基因上對應(yīng)的核苷酸)。mRNA的5’加帽位點包含經(jīng)由5’ -5’三磷酸酯鍵連接到mRNA的5’最末端殘基的N7-甲基化鳥苷殘基。認為mRNA的5’帽區(qū)包括5’帽子結(jié)構(gòu)本身以及鄰近該帽位點的前50個核苷酸。用于本發(fā)明的另一種靶區(qū)為5’帽區(qū)。盡管一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物為直接翻譯的，但是許多包含一個或多個稱為“內(nèi)含子”的區(qū)，其在翻譯前被從轉(zhuǎn)錄物中切除。余下的(且因此翻譯的)區(qū)稱為“外顯子”，并將其剪接在一起形成連續(xù)的mRNA序列。在一個實施方案中，靶定剪接位點(即，內(nèi)含子-外顯子連接處或外顯子-內(nèi)含子連接處)在疾病牽涉異常剪接或疾病牽涉特定剪接產(chǎn)物過度產(chǎn)生的狀況中特別有用。因重排或缺失所致的異常融合連接處為靶位點的另一個實施方案。經(jīng)由來自不同基因來源的兩個(或更多個)mRNA的剪接過程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為“融合轉(zhuǎn)錄物”。內(nèi)含子可使用靶定到例如DNA或前-mRNA的反義化合物來有效地靶定。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到天然反義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到有義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能?？勺僐NA轉(zhuǎn)錄物可產(chǎn)生自DNA的相同基因組區(qū)。這些可變轉(zhuǎn)錄物一般稱為“變體”。更具體地，“前mRNA變體”為產(chǎn)生自相同的基因組DNA的轉(zhuǎn)錄物，其與產(chǎn)生自相同的基因組DNA的其他轉(zhuǎn)錄物在其起始或終止位置上不同且包含內(nèi)含子和外顯子序列二者。當(dāng)剪接期間切除了一個或多個外顯子或內(nèi)含子區(qū)、或其部分時，前mRNA變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體為經(jīng)加工的前mRNA變體，并且由于剪接所致，每種獨
1特的前mRNA變體必須總是產(chǎn)生獨特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱為“可變剪接變體”。如果未發(fā)生前mRNA變體的剪接，則前mRNA變體與mRNA變體完全相同。變體可通過使用可變信號啟動或終止轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生。前mRNA和mRNA可具有多于一個起始密碼子或終止密碼子。起源于使用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體稱為該前mRNA或mRNA的“可變起始變體”。使用可變終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物稱為該前mRNA或mRNA的“可變終止變體”?？勺兘K止變體的一個具體類型為“聚腺苷酸變體”，其中所產(chǎn)生的多重轉(zhuǎn)錄物起因于轉(zhuǎn)錄機構(gòu)對其中一種“聚腺苷酸終止信號”的可變選擇，從而產(chǎn)生終止在獨特的聚腺苷酸位點上的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的文段內(nèi)，本文所述的變體類型也為靶核酸的實施方案。將反義化合物與之雜交的靶核酸上的位置定義為活性反義化合物靶定的靶區(qū)的至少5個核甘酸長的部分。雖然將某些示例性靶區(qū)段的具體序列列舉于此，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到，這些用于說明和描述在本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實施方案。根據(jù)本公開內(nèi)容，其他靶區(qū)段可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地鑒定。認為以下靶區(qū)段同樣適合靶定，該靶區(qū)段長度為5-100個核苷酸并包含選自說明性的優(yōu)選靶區(qū)段之內(nèi)的一段至少五( 個連續(xù)的核苷酸。靶區(qū)段可包括DNA或RNA序列，其包含來自說明性優(yōu)選靶區(qū)段之一的5’末端的至少5個連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續(xù)段，其開始于靶區(qū)段5’末端的緊接上游且持續(xù)到該DNA或RNA包含約5-約100個核苷酸為止)。類似優(yōu)選的靶區(qū)段由以下DNA或RNA序列表示，該序列包含來自說明性優(yōu)選靶區(qū)段之一的3’末端的至少5個連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續(xù)段，其開始于靶區(qū)段3’末端的緊接下游且持續(xù)到該DNA或RNA包含約5-約100個核苷酸為止)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文所說明的靶區(qū)段，無需過度試驗就能夠鑒定進一步優(yōu)選的靶區(qū)段。一旦鑒定一個或多個靶區(qū)、區(qū)段或位點，就選出與該靶標(biāo)足夠互補的反義化合物，所述足夠互補即充分良好且具有足夠的特異性雜交以得到所需的效果。在本發(fā)明的實施方案中，寡核苷酸與特定靶標(biāo)的反義鏈結(jié)合。所述寡核苷酸長度為至少5個核苷酸且可為合成的，使得每個寡核苷酸靶定重疊的序列，由此將寡核苷酸合成為覆蓋靶多核苷酸的全長。靶標(biāo)也包括編碼區(qū)以及非編碼區(qū)。在一個實施方案中，優(yōu)選通過反義寡核苷酸來靶定特定核酸。將反義化合物靶定到特定核酸為多步過程。該過程通常開始于鑒定其功能待調(diào)節(jié)的核酸序列。這可為，例如其表達與特定的病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細胞基因(或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA(ncRNA)。可將RNA歸類為(1)信使RNA(mRNA)，其被翻譯成蛋白，和(2)非編碼蛋白的RNA(ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度的終止密碼子并缺少任何廣泛的“可讀框”的其他轉(zhuǎn)錄單元(TU)。許多ncRNA似乎開始于蛋白編碼基因座的3’非翻譯區(qū)(3 ‘ UTR)中的起始位點。ncRNA常常為罕見的且至少一半已由FANTOM協(xié)會測序的ncRNA似乎未聚腺苷酸化。大多數(shù)研究者因為明顯的原因而關(guān)注經(jīng)加工并輸出到細胞質(zhì)的聚腺苷酸化mRNA。近來，已顯示非聚腺苷酸化核RNA的群體可非常巨大，且許多這類轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生于所謂的基因內(nèi)區(qū)(Cheng, J.等，(2005) Science 308 (5725), 1149-1154 ；Kapranov,P.等，(2005). Genome Res 15 (7)，987-997)。ncRNA可調(diào)節(jié)基因表達的機制為通過與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對。通過堿基配對起作用的RNA可分組成(1)順式編碼RNA，其在相同的基因位置、但在其所作用的RNA相反的鏈上編碼，因此顯示對其靶標(biāo)完美的互補性，和( 反式編碼RNA，其在與其所作用的RNA不同的染色體位置上編碼，一般不表現(xiàn)出與其靶標(biāo)完美的堿基配對潛能。不希望受到理論的約束，通過本文所述的反義寡核苷酸來擾亂反義多核苷酸，可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達。然而，此調(diào)節(jié)可為不一致的(反義敲減導(dǎo)致信使RNA上升)或一致的(反義敲減導(dǎo)致伴隨的信使RNA下降)。在這些情況下，可將反義寡核苷酸靶定到反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，引起其敲減或隔離。編碼以及非編碼反義物可以相同的方式來靶定，并且任一種類別均能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)有義轉(zhuǎn)錄物——以一致或不一致的方式。用于鑒定針對靶標(biāo)使用的新寡核苷酸的策略可基于通過反義寡核苷酸或任何其他調(diào)節(jié)所需靶標(biāo)的方法來敲減反義RNA轉(zhuǎn)錄物。策略1 在不一致調(diào)節(jié)的情況下，敲減所述反義轉(zhuǎn)錄物提升常規(guī)(有義)基因的表達。若后者基因編碼已知或假定的藥物靶標(biāo)，則其反義配對物的敲減可預(yù)料到地模擬受體激動劑或酶刺激劑的作用。策略2 在一致調(diào)節(jié)的情況下，可伴隨地敲減反義和有義轉(zhuǎn)錄物兩者，從而達到常規(guī)(有義)基因表達的協(xié)同下降。如果例如將反義寡核苷酸用于進行敲減，則此策略可用于應(yīng)用針對有義轉(zhuǎn)錄物靶定的一種反義寡核苷酸和針對相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的另一種反義寡核苷酸，或同時靶定重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個有力對稱的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)，以及與靶核酸的至少一部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。因此，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物且可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或末端突起、錯配或環(huán)。將反義化合物常規(guī)地制備為線性的，但可被連接或者另外制備成環(huán)狀和/或分枝的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交以形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈，或具有足夠自我互補性以允許雜交并形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈?？蓪⑺鰞蓷l鏈內(nèi)部連接而留下游離的3’或5’末端，或可將其連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在5’或3’末端上包含突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。所述雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進一步的修飾可包括與末端之一、經(jīng)挑選的核苷酸位置、糖位置或與核苷間鍵之一連接的綴合基團。或者，所述兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或連接基團來連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時，dsRNA可呈自我互補的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的?；虮磉_的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細胞系中穩(wěn)定表達dsRNA發(fā)夾來完成，然而，在一些實施方案中，基因表達或功能為增量調(diào)節(jié)的。當(dāng)形成自兩條鏈，或呈在其自身上對折形成雙鏈體的自身互補發(fā)夾型分子形式的單鏈時，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))為以沃森-克里克模式堿基配對的互補RNA鏈。一旦引入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可經(jīng)由基于占據(jù)的機制來運作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個或多個2’脫氧糖和一般地T而不是U堿基)或"RNA樣”(即，一般具有一個或多個2’羥基或2’修飾的糖和一般U而不是T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最普通地A和B型。據(jù)認為，一般而言，具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“RNA樣”。在一些(嵌合的)實施方案中，反義化合物可包含A和B型區(qū)兩者。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所需的寡核苷酸或反義化合物，包括以下中的至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含經(jīng)修飾的鍵的反義寡核苷酸、干擾RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA)；微小干擾 RNA (miRNA)；小時序 RNA (stRNA)；或短發(fā)夾RNA(shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)、或其組合。dsRNA也可激活基因表達，這是已被稱為“小RNA誘導(dǎo)的基因激活”或RNAa的機制。靶定基因啟動子的dsRNA誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。在人細胞中使用合成dsRNA(稱為“小激活RNA” (saRNA))證實RNAa。目前未知RNAa在其他生物體中是否為保守的。已發(fā)現(xiàn)小雙鏈RNA (dsRNA)(例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA))是稱為RNA干擾(RNAi)的進化保守機制的觸發(fā)物。RNAi總是經(jīng)由重構(gòu)染色質(zhì)來導(dǎo)致基因沉默，從而抑制轉(zhuǎn)錄、降解互補mRNA或阻斷蛋白翻譯。然而，在下文實施例章節(jié)詳述的例子中，顯示寡核苷酸增加腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸和其編碼產(chǎn)物的表達和/或功能。dsRNA也可充當(dāng)小激活RNA(saRNA)。不希望受理論約束，通過靶定基因啟動子中的序列，saRNA在稱為dsRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的現(xiàn)象中誘導(dǎo)靶基因表達。在另一個實施方案中，本文鑒定的“優(yōu)選靶區(qū)段”可用于篩選調(diào)節(jié)腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸表達的另外化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”為以下化合物，其減少或增加編碼腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的核酸分子的表達并包含與優(yōu)選靶區(qū)段互補的至少5個核苷酸的部分。篩選方法包括以下步驟使編碼腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，以及選擇一種或多種減少或增加編碼腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的核酸分子表達的候選調(diào)節(jié)劑(例如SEQ IDNO :3-8)。一旦顯示一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如減少或增加)編碼腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的核酸分子表達，則可將所述調(diào)節(jié)劑用于腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸功能的進一步調(diào)查研究，或用作依照本發(fā)明的研究、診斷或治療劑。靶定天然反義序列優(yōu)選地調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，BDNF基因(例如檢索號NM_170735，圖2)。在一個優(yōu)選的實施方案中，靶標(biāo)為BDNF基因的反義多核苷酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸靶定腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸(例如檢索號匪_170735，圖幻的有義和/或天然反義序列、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子且所述靶標(biāo)包括反義和/或有義BDNF多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)。本發(fā)明的優(yōu)選靶區(qū)段也可與本發(fā)明的其各自互補的反義化合物結(jié)合，以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領(lǐng)域中已顯示這類雙鏈寡核苷酸部分經(jīng)由反義機制來調(diào)節(jié)靶表達和調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。此外，所述雙鏈部分可經(jīng)受化學(xué)修飾(Fire等，(1998) Nature, 391,806-811 ；Timmons 禾口 Fire， (1998)Nature,395,854 ；Timmons 等，(2001)Gene,263,103-112 ；Tabara等，(1998) Science, 282,430-431 ；Montgomery 等，(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,15502-15507 ;Tuschl 等，(1999) Genes Dev.，13，3191-3197 ;Elbashir 等，(2001) Nature,411,494-498 ;Elbashir 等，Q001)Genes Dev. 15，188-200)。例如，已顯示這類雙鏈部分通過所述雙鏈體的反義鏈與靶標(biāo)的典型雜交來抑制該靶標(biāo)，從而觸發(fā)靶標(biāo)的酶促降解(Tijsterman 等，Q002) Science, 295,694-697)。在一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸靶定腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸(例如檢索號匪_17073幻、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子。依照本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不單獨限于腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)而是延伸到腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)分子的任何同種型、受體、同源物等等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶定BDNF多核苷酸的天然反義序列(例如，如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸)，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :3-8所述。在一個實施方案中，所述寡核苷酸與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)反義物的核酸序列互補或結(jié)合，并調(diào)節(jié)腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)分子的表達和/或功能，所述核酸序列包括但不限于與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸有關(guān)的非編碼有義和/或反義序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸與如SEQ ID NO :2所述的BDNF天然反義物的核酸序列互補或結(jié)合，并調(diào)節(jié)BDNF分子的表達和/或功能。在一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :3_8的至少5個連續(xù)核苷酸的序列且調(diào)節(jié)腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)分子的表達和/或功能。多核苷酸靶標(biāo)包括BDNF，包括其家族成員、BDNF的變體；BDNF的突變體，包括SNP ；BDNF的非編碼序列；BDNF的等位基因；物種變體、片段等等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子。在另一個優(yōu)選的實施方案中，靶定腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)；微小干擾RNA(miRNA)；小時序RNA(StRNA)；或短發(fā)夾RNA (shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；或小激活RNA (saRNA)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸(例如SEQ IDNO 2)的靶定調(diào)節(jié)這些靶標(biāo)的表達或功能。在一個實施方案中，表達或功能相比于對照為增量調(diào)節(jié)的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，表達或功能相比于對照為減量調(diào)節(jié)的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義化合物包括如SEQ ID N0:3_8所述的序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸、更短或更長的片段、經(jīng)修飾的鍵等等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，SEQ ID NO :3_8包含一個或多個LNA核苷酸。表1顯示可用于本發(fā)明的方法中的示例性反義寡核苷酸。表權(quán)利要求
1.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :2(圖3)的核苷酸1-3175之內(nèi)的約5-約30個連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表達。
2.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的天然反義物的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表達。
3.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表達。
4.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與靶定腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表達。
5.權(quán)利要求4的方法，其中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的功能和/或表達在體內(nèi)或體外相對于對照增加。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定核酸序列，所述核酸序列包括腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包含一種或多種選自以下的修飾至少一種經(jīng)修飾的糖部分、至少一種經(jīng)修飾的核苷間鍵、至少一種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾核苷間鍵硫代磷酸酯、2’ -0-甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其類似物、衍生物和組合。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包含至少一個如SEQID NO :3-8所述的寡核苷酸序列。
14.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為約5-約30個核苷酸的短干擾RNA(SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的功能和/或表達。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與至少約五個連續(xù)核酸的序列具有至少 80%序列同一性，所述序列與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補。
16.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為約5-約30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異，其中所述至少一種反義寡核苷酸與至少一個如SEQ ID N0:1和2所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的功能和/或表達。
17.一種合成的、經(jīng)修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種經(jīng)修飾的糖部分、至少一種經(jīng)修飾的核苷酸間鍵、至少一種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸為在體內(nèi)或體外與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因雜交并與正常對照相比調(diào)節(jié)所述基因的功能和/或表達的反義化合物。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵的骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種經(jīng)修飾的核苷酸，所述經(jīng)修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物和組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物和組合。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、 2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有至少約5-約30個核苷酸的長度且與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約20%序列同一性。
27.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約80%序列同一性。
28.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在體內(nèi)或體外與至少一種腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸雜交并與正常對照相比調(diào)節(jié)所述多核苷酸的表達和/或功能。
29.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含如SEQID N0:3_8所述的序列。
30.一種組合物，所述組合物包含對一種或多種腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述一種或多種寡核苷酸與如SEQID NO :3_8所述核苷酸序列中的任一個相比，具有至少約40 %序列同一性。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中所述一種或多種寡核苷酸中的至少一種包含如SEQID NO 3-8所述的核苷酸序列之一。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中如SEQID NO :3_8所述的寡核苷酸包含一種或多種修飾或取代。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預(yù)防或治療與至少一種腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸和/或至少一種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給患者施用治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與所述至少一種腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的天然反義序列結(jié)合，并調(diào)節(jié)所述至少一種腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸的表達；從而預(yù)防或治療與至少一種腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸和/或至少一種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病。
36.權(quán)利要求35的方法，其中與至少一種腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多核苷酸有關(guān)的疾病選自缺陷性神經(jīng)發(fā)生有關(guān)的疾病或病癥；神經(jīng)變性疾病或病癥(例如，阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化等)；神經(jīng)精神障礙(抑郁癥、精神分裂癥、精神分裂癥樣精神障礙、情感分裂性精神障礙和妄想性障礙)；焦慮性障礙例如驚恐性障礙、 恐怖癥(包括廣場恐怖癥)、強迫性神經(jīng)失調(diào)、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、雙相性精神障礙、神經(jīng)性厭食、神經(jīng)性貪食、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病(例如，多發(fā)性硬化)、記憶喪失、長期或短期記憶障礙、良性健忘、兒童學(xué)習(xí)障礙、閉合性顱腦損傷、注意力缺陷障礙、對病毒感染的神經(jīng)元反應(yīng)、腦損傷、發(fā)作性睡病、睡眠障礙(例如，晝夜節(jié)律障礙、失眠癥和發(fā)作性睡病)； 神經(jīng)中斷或神經(jīng)損傷、腦脊髓神經(jīng)索(CNS)中斷和腦或神經(jīng)細胞損傷、與AIDS有關(guān)的神經(jīng)功能缺損、以運動和/或發(fā)聲性抽搐為特征的運動和抽搐障礙(例如，圖雷特精神障礙、慢性運動或發(fā)聲性抽搐障礙、短時抽搐性障礙和刻板型活動障礙)、物質(zhì)濫用病癥(例如，物質(zhì)依賴、物質(zhì)濫用以及物質(zhì)濫用/依賴的后遺癥，例如物質(zhì)誘發(fā)的心理障礙、物質(zhì)戒斷和物質(zhì)誘發(fā)的癡呆或遺忘癥)、外傷性腦損傷、耳鳴、神經(jīng)痛(例如，三叉神經(jīng)痛)、疼痛(例如， 慢性疼痛、慢性炎性痛、與關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關(guān)的疼痛、與消化性疾病有關(guān)的疼痛、與克羅恩氏病有關(guān)的疼痛、與自身免疫性疾病有關(guān)的疼痛、與內(nèi)分泌疾病有關(guān)的疼痛、與糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)的疼痛、幻肢痛、自發(fā)性疼痛、慢性術(shù)后疼痛、慢性顳下頌疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、AIDS相關(guān)的疼痛、I和II型復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷有關(guān)的疼痛、與藥物攝入有關(guān)的疼痛和復(fù)發(fā)性急性疼痛、神經(jīng)性疼痛)、在諸如糖尿病、MS和運動神經(jīng)元病等疾病中導(dǎo)致neurodysthesias的不適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元活性、共濟失調(diào)、肌肉強直(痙攣狀態(tài))、顳下顎關(guān)節(jié)功能障礙、獎賞缺陷綜合征(RDS)、 由酒精或物質(zhì)濫用(例如，搖頭丸、去氧麻黃堿等)引發(fā)的神經(jīng)毒性、精神發(fā)育遲緩或認知缺損(例如，非綜合征性X連鎖精神發(fā)育遲緩、脆性X綜合征、唐氏綜合征、孤獨癥)、失語癥、貝爾氏麻痹、克-雅病、腦炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、ondine綜合征、WAGR綜合征、聽力損失、雷特綜合征、癲癇、脊髓損傷、中風(fēng)、缺氧、缺血、腦損傷、視神經(jīng)損傷、糖尿病神經(jīng)病變、 周圍神經(jīng)病、神經(jīng)移植并發(fā)癥、運動神經(jīng)元病、周圍神經(jīng)損傷、肥胖癥、代謝綜合征、癌癥、哮喘、特應(yīng)性疾病、過敏性炎癥、濕疹、神經(jīng)腫瘤學(xué)疾病或病癥、神經(jīng)免疫學(xué)疾病或病癥和神經(jīng)耳科疾病或病癥；以及與老化和衰老有關(guān)的疾病或病癥。
37.一種鑒定和選擇用于體內(nèi)施用的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)有關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個連續(xù)核苷酸的至少一種反義寡核苷酸， 所述連續(xù)核苷酸與所選的靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義多核苷酸互補；在嚴格雜交條件下，測定所述反義寡核苷酸與所述靶多核苷酸或所選靶多核苷酸的反義多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；以及基于獲得的信息選擇用于體內(nèi)施用的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，具體而言，其通過靶定腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的天然反義多核苷酸，來調(diào)節(jié)腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達和/或功能。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與BDNF表達有關(guān)的疾病和病癥中的用途。
文檔編號A61P25/00GK102387817SQ201080017060
公開日2012年3月21日 申請日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日
發(fā)明者C·科伊托, J·科拉德, 謝爾曼 O·霍爾科瓦 申請人:歐科庫爾納有限責(zé)任公司