專利名稱：改進的抗-tnfr1多肽，抗體可變結構域和拮抗劑的制作方法
改進的抗-TNFR1多肽，抗體可變結構域和拮抗劑本發(fā)明涉及抗-腫瘤壞死因子1 (TNFR1、p55、CD120a、P60、TNF受體超家族成員 lA.TNFRSFlA.TNFa I型受體)多肽，免疫球蛋白(抗體)單個可變結構域和包含這些的拮抗劑。本發(fā)明還涉及包含或使用這些抗-TNFRl配體的方法、用途、制劑、組合物和設備。發(fā)明背景 TNFRl
TNFRl是一種跨膜受體，其包含與配體結合的胞外區(qū)和缺乏固有信號轉導活性但可以和信號轉導分子相聯(lián)系的胞內結構域。結合TNF的TNFRl復合物包含3條TNFRl鏈和3 條 TNF 鏈。(Banner ^A, Cell, 73(3) 431-445 (1993)。TNF 配體以三聚體存在，其與 3條TNFRl鏈結合。(同上)。在受體-配體復合物中3條TNFRl鏈緊密聚集在一起，并且此聚集是TNFRl介導的信號轉導的前提。事實上，結合TNFRl的多價試劑，例如抗-TNFRl 抗體可在缺乏TNF的情況下誘導TNFRl聚集和信號轉導并通常被用作TNFRl拮抗劑。(見例如 Belka 箏yl, EMBO, 74(6):1156-1165 (1995) ；Mandik-Nayak ^A, J. Immunol, 167·. 1920-1928 (2001))。因此，結合TNFRl的多價試劑通常不是有效的TNFRl拮抗劑，即使它們阻止TNF α和TNFRl的結合。在此段落中的SEQ ID號指的是在W02006038027中使用的編號。TNFRl的胞外區(qū)包含13個氨基酸的氨基端區(qū)段(SEQ ID NO: 603(人)的1-13位氨基酸；SEQ ID NO:604 (/Jn 鼠)的1-13位氨基酸)，結構域1 (SEQ ID NO:603 (人)的14-53位氨基酸；SEQ ID NO:604 (小鼠)的14-53位氨基酸)，結構域2 (SEQ ID NO:603 (人)的M-97位氨基酸；SEQ ID NO:604 (小鼠)的M-97位氨基酸)，結構域3 (SEQ ID NO:603 (人)的98-138位氨基酸； SEQ ID NO:604 (小鼠)的 98-138 位氨基酸)，和結構域 4 (SEQ ID NO:603 (人)的 139-167 位氨基酸；SEQ ID NO:604 (小鼠)的139-167位氨基酸)，結構域4之后是膜近側區(qū)(SEQ ID NO:603 (人)的168-182位氨基酸；SEQ ID NO:604 (小鼠)的168-183位氨基酸)。(見 Banner ^A, Cell 73(3) 431-445 (1993)和 Loetscher ^A, Cell 61(2) 351-359 (1990))。結構域2和3與結合的配體(TNFβ，TNFa)進行接觸。(BannerCell, 73(3) 431-445 (1993)。TNFRl的胞外區(qū)也包含被稱為配體組裝前結構域或PLAD結構域 (SEQ ID NO:603 (人)的1-53位氨基酸；SEQ ID NO:604 (小鼠)的1-53位氨基酸)(美國政府，WO 01/58953 ;Deng 藥Λ, Nature Medicine, doi: 10. 1038/nml304 (2005) )0 在體內TNFRl通過下述過程從細胞表面脫落以產生可溶形式的TNFR1，所述過程包括TNFRl在結構域4或膜近側區(qū)(SEQ ID NO:603的168-182位氨基酸；SEQ ID NO:604的168-183位氨基酸)的蛋白水解?？扇艿腡NFRl保留結合TNF α的能力，并因此作為TNF α活性的內源抑制劑發(fā)揮功能。W02006038027.W02008149144 和 W02008149148 公開了抗-TNFRl 免疫球蛋白單個可變結構域和包含這些的拮抗劑。這些文件也公開了這些結構域和拮抗劑在治療和/或預防通過TNFa介導的病癥中的用途。W02006038027公開了名為TAR2h-205的免疫球蛋白單個可變結構域(dAb)(W02006038027中的SEQ ID NO: 627)，其具有針對人TNFRl的適度效力。希望提供改進的抗-人TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域、拮抗劑、配體和包含這些的產品。它們的目的是提供改進的診斷試劑用于檢測樣品中的人TNFR1，以及或可選地提供改進的療法用于治療和/或預防在人或其他哺乳動物中TNFRl介導的病癥和疾病。特別希望提供的抗-人TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域、拮抗劑、配體和包含這些的產品是TNFR1， 特別是人TNFRl的有效中和劑(比TAR2h-205更有效);在人TNFRl和至少一種其他物種(例如通常用作藥物開發(fā)和檢測模型的物種，例如小鼠、大鼠、狗、豬或非人靈長類)的TNFRl之間具有交叉反應；對蛋白酶(例如在患者中可能遇到的蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或leucozyme)具有抗性；具有良好的藥物動力學(例如有利的半衰期)；和/或展示結合TNFRl，例如人TNFRl的高親和力。在本文中將TAR2h_205稱為D0Mlh_574 (SEQ ID NO: 11)(參見圖 5)。本發(fā)明的多個方面滿足了這些希望的特征。發(fā)明概述
在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_156、 DOMlh-574-162或D0Mlh_574_180的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述單個可變結構域是包含一個或多個以下突變(根據(jù)Kabat編號)的 D0Mlh-574-14 的突變體
位置30是L或F， 位置52是A或T， 位置5 是D或E， 位置M是A或R， 位置57是R、K或A， 位置60是D、S、T或K， 位置61是E、H或G， 位置62是A或T，
位置 100 是 R、G、N、K、Q、V、A、D、S 或 V,和位置 101 是 A、Q、N、E、V、H 或 K。任選地，所述單個可變結構域是包含一個或多個以下突變(根據(jù)Kabat編號)的 D0Mlh-574-14 的突變體
位置30是L或F， 位置52是A或T， 位置5 是D， 位置54是A， 位置57是R， 位置60是D、S或T， 位置61是H， 位置62是A，
位置100是V、A、R、G、N或K，和位置 101 是 E、V、K、A Q 或 N。
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在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白重鏈單個可變結構域，其在第101位(根據(jù)Kabat編號)包含纈氨酸。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含30G、44D、45P、55D、56R、94I和98R中的一個或多個，其中編號根據(jù)Kabat，其中單個可變結構域的氨基酸序列在其他位置與DOMlh-574的氨基酸序列相同。在一個實施方案中，提供了結合人、鼠類或食蟹猴monkey) TNFRl的可變結構域。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-72、D0Mlh_574_156、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_132、 D0Mlh-574-i;35、D0Mlh-574-138、D0Mlh-574-162 或 D0Mlh-574-180 的氨基酸序列至少 95% 相同的氨基酸序列。此方面提供的可變結構域在細胞測定中是TNFRl (例如，至少為人 TNFRl)的有效中和劑。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_93、D0Mlh_574_123、D0Mlh_574_125、 D0Mlh-574-126、D0Mlh-574-129、D0Mlh-574-133、D0Mlh-574-137 或 D0Mlh-574-160 的氨基酸序列至少94%相同的氨基酸序列。此方面提供的可變結構域是蛋白水解穩(wěn)定的。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_125、D0Mlh_574_126、 DOMlh-574-133、D0Mlh_574_135、D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_139、D0Mlh_574_155、 D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162或D0Mlh_574_180的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。此方面提供的可變結構域以高親和力結合人TNFRl并任選地也展示對鼠類TNFRl的理想親和力。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFR1，其中所述單個可變結構域由與下表12中所示的任一個DOMlh序列(除了 DOMlh-574以外)至少80、85、90、95、96、97、98或99%相同的核
苷酸序列編碼。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFR1，其中所述單個可變結構域由與 D0Mlh-574-72、D0Mlh_574_109、D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_156、DOMlh-574-162 或 D0Mlh-574-180的核苷酸序列至少80、85、90、95、96、97、98或99%相同的核苷酸序列編碼。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列D0Mlh-574-72、 D0Mlh-574-109、D0Mlh-574-138、D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的氨基酸序列相同，或與選定的氨基酸序列在不超過25個氨基酸位置處不同并具有與選定的氨基酸序列的CDRl序列至少50%相同的CDRl序列。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白單個可變結構域包含與選定的氨基酸序列的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白單個可變結構域包含與選定的氨基酸序列的CDR3序列至少50% 相同的⑶R3序列。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh-574-138、D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的氨基酸序列相同，或與選定的氨基酸序列在不超過25個氨基酸位置處不同并具有與選定的氨基酸序列的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白單個可變結構域包含與選定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白單個可變結構域包含與D0Mlh-574-72的⑶Rl序列至少50%相同的CDRl序列。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列D0Mlh-574-72、 D0Mlh-574-109、D0Mlh-574-138、D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的氨基酸序列相同，或與選定的氨基酸序列在不超過25個氨基酸位置處不同并具有與選定的氨基酸序列的⑶R3序列至少50%相同的⑶R3序列。在一個方面，本發(fā)明提供了蛋白酶抗性的抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其中當在下述條件下孵育時所述單個可變結構域具有蛋白酶抗性
(i)至少10微克/ml濃度(C)的蛋白酶在37°C孵育至少1小時的時間(t)；或
(ii)至少40微克/ml濃度(c’)的蛋白酶在30°C孵育至少1小時的時間(t)，
其中可變結構域包含與D0Mlh-574-U6或DOMlh-574-133的氨基酸序列至少94%相同的氨基酸序列，并任選地在第101位(Kabat編號)包含纈氨酸。在一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其包含本發(fā)明的免疫球蛋白單個可變結構域和抗體恒定結構域，任選地抗體Fc區(qū)，任選地其中Fc的N端連接(任選地直接連接)可變結構域的C端。在一個方面，本發(fā)明涉及多特異性配體，其包含本發(fā)明的免疫球蛋白單個可變結構域和任選地至少一個特異性結合血清白蛋白(SA)的免疫球蛋白單個可變結構域。令人驚訝地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFRl單個可變結構域與抗-SA單個可變結構域的融合不但提供了改進的半衰期(相比單獨的抗-TNFRl dAb)的優(yōu)勢，而且具有對于TNFRl結合的改進的親和力(KD)的額外好處。此發(fā)現(xiàn)在本領域現(xiàn)有技術中從未公開過。在一個實施方案中，多特異性配體是或包含選自本文公開的標注為“DMS”的任意構建體，例如DMS0111、 0112、0113、0114、0115、0116、0117、0118、0121、0122、0123、0124、0132、0133、0134、0135、 0136、0162、0163、0168、0169、0176、0177、0182、0184、0186、0188、0189、0190、0191、0192、 5519、5520、5521、5522、5525 和 5527 (SEQ ID NO: 45-92)中任一個的氨基酸序列。在一個實施方案中，多特異性配體是或包含由本文公開的任意DMS的核苷酸序列，例如DMS0111、 0112、0113、0114、0115、0116、0117、0118、0121、0122、0123、0124、0132、0133、0134、0135、 0136、0162、0163、0168、0169、0176、0177、0182、0184、0186、0188、0189、0190、0191、0192、 5519、5520、5521、5522、5525和5527的核苷酸序列中的任一個編碼的氨基酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含抗-TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域和抗-SA單個可變結構域的多特異性配體的核酸，其中所述核酸包含任意本文公開的DMS的核苷酸序列，例如，DMS0111、0112、0113、0114、0115、0116、0117、0118、0121、0122、0123、0124、0132、 0133、0134、0135、0136、0162、0163、0168、0169、0176、0177、0182、0184、0186、0188、0189、 0190、0191、0192、5519、5520、5521、5522、5525和5527的核苷酸序列中的任一個。這里提供了包含這樣的核酸的載體，以及包含這樣的載體的宿主細胞(例如，非人宿主細胞)。
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在一個方面，本發(fā)明提供了多特異性配體，其包含(i)抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ； P55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與DOMlh-574-156的氨基酸序列至少93%相同(任選地至少94、95、96、97、98或99%相同或100%相同)的氨基酸序列，(ii)至少一個特異性結合SA的抗血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述抗-SA單個可變結構域包含與D0M7h-ll-3的序列至少80% (任選地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%) 相同的氨基酸序列，和(iii)任選地其中在抗-TNFRl單個可變結構域和抗-SA單個可變結構域之間提供接頭，所述接頭包含氨基酸序列AST，任選地ASTSGPS?？蛇x地，所述接頭是 AS(Ci4S)n，其中 η 是 1、2、3、4、5、6、7 或 8，例如 AS(G4S)3O在一個方面，本發(fā)明提供了多特異性配體，其包含(i)抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ； P55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與DOMlh-574-156的氨基酸序列至少93%相同 (任選地至少94、95、96、97、98或99%相同或100%相同)的氨基酸序列，(ii)至少一個特異性結合SA的抗血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述抗-SA單個可變結構域包含與D0M7h-14-10的序列至少80% (任選地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或 100%)相同的氨基酸序列，和(iii)任選地其中在抗-TNFRl單個可變結構域和抗-SA單個可變結構域之間提供接頭，所述接頭包含氨基酸序列AST，任選地ASTSGPS?？蛇x地，所述接頭是 AS (G4S)n，其中 η 是 1、2、3、4、5、6、7 或 8、例如 AS (QS) 3。在一個方面，本發(fā)明提供了 TNFRl拮抗劑，其包含本發(fā)明的任一前述方面的單個可變結構域、多肽或多特異性配體。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)拮抗劑，其用于口服遞送、遞送至患者的胃腸道、肺部遞送、遞送至患者的肺部或全身遞送。在一個方面，本發(fā)明提供了 TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其用于結合人、 鼠類或食蟹猴 TNFRl，所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、 D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162 或 D0Mlh-574-180 的 CDRl 序列至少 50%相同的 CDRl 序列。在一個方面，本發(fā)明提供了 TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其用于結合人、 鼠類或食蟹猴 TNFRl，所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、 D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162 或D0Mlh-574-180 的 CDR2 序列至少 50%相同的 CDR2 序列。在一個方面，本發(fā)明提供了 TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其用于結合人、 鼠類或食蟹猴 TNFRl，所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、 D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162 或 D0Mlh-574-180 的 CDR3 序列至少 50%相同的 CDR3 序列。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFR1，所述拮抗劑包含免疫球蛋白單個可變結構域，所述免疫球蛋白單個可變結構域包含選自D0Mlh-574-72、D0Mlh_574_109、D0Mlh_574_138、 DOMlh-574-156,DOMlh-574-162 或 D0Mlh_574_180 的單個可變結構域的 CDR1、CDR2 和 / 或 CDR3序列。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的TNFRl拮抗劑，其用于治療和/或預防炎癥病癥。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的TNFRl拮抗劑在制備用于治療和/或預防炎癥病癥的藥物中的用途。在一個方面，提供了本發(fā)明的任一方面的抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向一個或多個選自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、 CRKNQYRHYffSENLF 和 NQYRHYWSENLFQCF 的 TNFRl 的表位序列。在一個方面，提供了本發(fā)明的任一方面的抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、 多肽或多特異性配體，其用于靶向一個或多個選自NSI CCTKCHKGTYLY、NSI CCTKCHKGTYL、 CRKNQYRHYWSENIi^n NQYRHYWSENLFQCF的TNFRl的表位序列，以治療和/或預防上文指定的任意病癥或疾病。在一個方面，本發(fā)明提供了在患者中治療和/或預防上文指定的任意病癥或疾病的方法，所述方法包括對患者施用本發(fā)明的抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于在患者中靶向一個或多個選自NSI CCTKCHKGTYLY、NSI CCTKCHKGTYL、 CRKNQYRHYffSENLF 和 NQYRHYWSENLFQCF 的 TNFRl 的表位序列。本發(fā)明的一個方面提供了多特異性配體，其包含抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55) 免疫球蛋白單個可變結構域和至少一個特異性結合血清白蛋白(SA)的免疫球蛋白單個可變結構域，其中
(a)所述抗-TNFRl單個可變結構域包含與DOMlh-574-156、D0Mlm-15-12或 D0Mlm-21-23的氨基酸序列至少80%(任選地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%) 相同的氨基酸；和
(b)所述抗-SA單個可變結構域包含與DOM^i-11-12或D0Mni-ll_12dh的氨基酸序列至少80% (任選地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%)相同的氨基酸；禾口
(c)所述配體包含在所述可變結構域之間的接頭，所述接頭包含氨基酸序列AS或AST。 本發(fā)明的另一個方面提供多特異性抗體，其包含DMS5537、DMS5538、DMS5539或DMS5540或由DMS5537、DMS5538、DMS5539或DMS5540組成。本發(fā)明的一個方面提供編碼任一多特異性配體的核酸。本發(fā)明的另一個方面提供包含與DMS5537、DMS5538、DMS5539或DMS5540的核苷酸序列至少80% (任選地至少85、90、95、96、97、98或99%相同或100%)相同的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明還提供包含所述核酸的載體，以及包含所述載體的宿主，任選地非人胚細胞。


圖1.來自對人TNFRl初次(naive)選擇的dAb的BIAcore結合。在SA BIAcore芯片上包被生物素化的人TNFRl。將來自初次選擇的4種純化的dAb (D0Mlh-509、D0Mlh-510、 DOMlh-549和DOMlh-574)注射到人TNFRl上并測定結合。用箭頭指示對應每種dAb的曲線。圖2.來自對人TNFRl初次選擇的dAb的MRC5細胞測定。在MRC5細胞測定中，就對TNF α介導的IL-8釋放的功能抑制，分析了來自初次選擇的4種純化的dAb (D0Mlh_509、 D0Mlh-510、DOMlh-549 和 DOMlh-574)和對照 dAb (D0Mlh-131_511)。如描述的進行測定并用箭頭指示對應每種dAb的曲線。在圖中，將dAb濃度對觀察到的中和百分比作圖(使用 Graphpad Prism)。圖3.來自對人TNFRl初次選擇的dAb的受體結合測定。在受體結合測定中測定了來自初次選擇的 4 種純化的 dAb (D0Mlh-509、D0Mlh_510、DOMlh-549 和 DOMlh-574)和陽性對照dAb(D0Mlh-131_511)以測定與TNF α的競爭。已知陽性對照dAb與TNF α競爭并顯示了完全抑制曲線。選擇的抗-TNFRl dAb不能抑制TNFa與受體的結合。如描述的進行測定并用箭頭指示對應每種dAb的曲線(使用Graphpad Prism)。在y-軸上的“％中和” 指示TNF α結合抑制。圖4.來自對人TNFRl易錯試驗成熟(test maturation)的dAb的MRC5細胞測定。在MRC5細胞測定中，就對TNF α介導的IL-8釋放的功能抑制，分析了來自初次選擇的3 種純化的 dAb(D0Mlh-574-7、D0Mlh-574-8 和 DOMlh-574-lO)和對照 dAb (DOMlh-131-511)。 如描述的進行測定并用箭頭指示對應每種dAb的曲線。在圖中，將dAb濃度對觀察到的中和百分比作圖(使用Graphpad Prism)。與圖2中顯示的親本DOMlh-574相比，這些dAb在 MRC5細胞測定中證明增加的效力。圖5.從DOMlh-574的易錯文庫中鑒定的dAb及其后續(xù)重組體的氨基酸序列比對。對改進的DOMlh-574 dAb的易錯、試驗成熟選擇在D0Mlh_574_7、D0Mlh_574_8、 D0Mlh-574-10、D0Mlh_574_ll、D0Mlh-574-12 和 D0Mlh_574_13 中鑒定出導致親和力提高的位置。這些突變(V30G、G44D、L45P、G55D、H56R 和 K94I )的重組產生 D0Mlh-574-14 至 D0Mlh-574-19。在特定位置處的“.”表示與在DOMlh-574中的該位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸相同。 用下劃線和粗體表示CDR (第一個下劃線序列是CDRl，第二個下劃線序列是CDR2和第三個下劃線序列是⑶R3)。圖6.來自人、食蟹猴、狗和小鼠的TNFRl的胞外區(qū)的氨基酸序列比對。比對突出了在人和小鼠TNFRl之間的有限的序列保守。在特定位置處的“.”表示與在人E⑶TNFRl 中的該位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸相同。圖 7.通過 BIAcore 測定監(jiān)控 D0Mlh_574_16 和 D0Mlh-131-206 與狗 TNFRl 的結合。用生物素化的狗TNFRl包被BIAcore SA芯片。之后，將純化的dAb D0Mlh_574_16和 D0Mlh-131-206以每種IOOnM注射到狗TNFRl上。通過示蹤曲線(traces)明顯可見，盡管 D0Mlh-574-16顯示了顯著結合，對D0Mlh-131-206僅觀察到有限的結合。圖8.通過BIAcore測定監(jiān)控D0Mlh_574_16與小鼠TNFRl的結合。用生物素化的小鼠TNFRl包被BIAcore SA芯片。之后，將純化的dAb D0Mlh_574_16以1 μ M注射到小鼠TNFRl上。示蹤曲線明確證明D0Mlh-574-16結合小鼠TNFR1。圖9. D0Mlh-574-16在小鼠細胞測定中的功能活性。通過檢測純化的 D0Mlh-574-16在放線菌素存在下保護小鼠細胞免受TNF α的細胞毒性作用的能力，測定了純化的D0Mlh-574-16 (黑線，三角形)與小鼠TNFRl的功能性交叉反應。作為陽性對照，小鼠TNFRl結合dAb，D0Mlm-21-23 (灰線，正方形)被包括在內并顯示為有活性。在圖中，將dAb濃度對TNFa活性的中和百分比作圖(使用Graphpad Prism)。如實施例中描述的進行測定。圖10. D0Mlh-574-16在食蟹猴CYNOM-Kl細胞測定中的功能活性。通過檢測D0Mlh-574-16抑制CYNOM-Kl細胞應答TNF α的IL-8釋放的能力，測定了純化的 D0Mlh-574-16 (灰虛線，三角形)與食蟹猴TNFRl的功能性交叉反應。如實施例中描述的進行測定。作為陽性對照，DOMlh-131-511 (黑實線，正方形)被包括在內。2種dAb都顯示了完全中和。在圖中，將dAb濃度對TNF α活性的中和百分比作圖(使用Graphpad Prism)。圖11A-C.在親和成熟中鑒定的DOMlh-574系中最有效的dAb的氨基酸序列比對。 將在MRC5細胞測定中具有最高效力的dAb的氨基酸序列與親本DOMlh-574，用于開始親和成熟的模板(D0Mlh-574-14)和較早鑒定出具有提高的效力的dAb (D0Mlh_574_72) —起列出。在特定位置處的“.”表示與在DOMlh-574中的該位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸相同。用下劃線和粗體表示CDR (第一個下劃線序列是CDRl，第二個下劃線序列是CDR2和第三個下劃線序列是 CDR3)。圖12A-C.在親和成熟中鑒定的DOMlh-574系中對蛋白酶最穩(wěn)定的dAb的氨基酸序列比對。在親和成熟后鑒定的顯示對胰蛋白酶消化最具抗性的dAb的氨基酸序列。為了比對，也包括了親本dAb DOMlh-574。在特定位置處的“.”表示與在DOMlh-574中的該位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸相同。用下劃線和粗體表示CDR (第一個下劃線序列是CDR1，第二個下劃線序列是CDR2和第三個下劃線序列是CDR3)。圖13A-C.選為詳細表征的dAb的氨基酸序列比對。比對包括12種被選為詳細表征的dAb以及DOMlh-574 (親本dAb)和D0Mlh_574_16，D0Mlh-574-16較早用于該系的表征。在特定位置處的“.”表示與在DOMlh-574中的該位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸相同。用下劃線和粗體表示CDR (第一個下劃線序列是CDRl，第二個下劃線序列是CDR2和第三個下劃線序列是 CDR3)。圖14.通過BIAcore對D0Mlh-574-16和DOMlh-131-511的表位作圖。用生物素化的人TNFRl包被BIAcore SA芯片。穿過該表面注入DOMlh-131-511和D0Mlh_574_16(以每種200 nM并之后再生(regeneration)注入(未顯示))。測定了每種dAb的結合RU (反應單位)數(shù)。之后，注入相同濃度的DOMlh-131-511，然后立刻注入D0Mlh-574-16。如可清楚看到的，D0Mlh-574-16的第二次注入的結合單位數(shù)與第一次注入的相同，表示dAb結合非競爭表位。圖 15.通過 BIAcore 對 D0Mlh-574-16 和 MAB225 (R&D Systems)的表位作圖。用生物素化的人TNFRl包被BIAcore SA芯片。穿過表面注入D0Mlh_574_16并定量結合。在再生后(未顯示)，注入MAB225，隨后再次注入D0Mlh-574-16。D0Mlh-574-16的結合水平與 MAB225不存在時觀察到的相差無幾，表示結合表位和MAB225是非競爭性的。圖16.通過BIAcore對D0Mlh_574_16和mAb克隆4. 12的表位作圖。用生物素化的人TNFRl包被BIAcore SA芯片。穿過表面注入克隆4. 12 (Invitrogen、Zymed)并定量結合。在再生后(未顯示)，注入D0Mlh-574-16，隨后再次注入克隆4. 12。觀察到克隆4. 12 的第二次注入的結合水平比D0Mlh-574-16不存在時觀察到的減少約20%。此結果表示人 TNFRl表位結合的有限競爭。D0Mlh-574-16與克隆4. 12可能具有輕微重疊的表位。在注入前和注入后立即的RU信號跳動是緩沖液跳動，其未被扣除。圖17. 通過BIAcore對D0Mlh_574_16和D0Mlh-510的表位作圖。用生物素化的人TNFRl包被BIAcore SA芯片。穿過表面注入D0Mlh_510并定量結合。之后，注入 D0Mlh-574-16，隨后再次注入D0Mlh-510。很明顯，D0Mlh-510的第二次注入顯示了少得多的結合，表示D0Mlh-510結合競爭表位。圖18.通過BIAcore對D0Mlh-574-16和D0Mlm-21-23的表位作圖。用生物素化的小鼠TNFRl包被BIAcore SA芯片。穿過表面注入D0Mlh_574_16并定量結合。之后，注入D0Mlm-21-23，隨后再次注入D0Mlh_574_16。第二次注入后D0Mlh_574_16結合的RU數(shù)和D0Mlm-21-23不存在時觀察到的很相似。這表示D0Mlm-21_23和D0Mlh_574_16在小鼠 TNFRl上具有不同的結合表位。
圖19.通過BIAcore將D0Mlh-574-16對TNFRl的線性肽片段進行表位作圖。用 4種生物素化的肽分別包被BIAcore SA芯片的4個通道。所述肽為1)人TNFRl的肽片段，其不顯示在R)rteBio上的結合并用作陰性對照，A3 (SGSGNDCPGPGQDTDCREC)，2)結構域-1 肽 D2 (SGSGNSICCTKCHKGTYLY)，3)結構域 _3 肽 D5 (SGSGCRKNQYRHYffSENLF)和 4)重疊結構域-3 肽 E5 (SGSGNQYRHYWSENLFQCF)。使 DOMlh-574-16 (2.5 μ Μ)流經所有 4 種肽并測定結合量。在對照肽A3上沒有觀察到DOMlh-574-16的結合，而所述dAb結合3種其他肽。在圖中，通過肽標識符指示對應不同肽的示蹤曲線。圖20.通過BIAcore評估D0Mlm-21_23與TNFRl的4種線性肽片段的結合。用4 種生物素化的肽分別包被BIAcore SA芯片的4個通道。所述肽為1)人TNFRl的肽片段， 其不顯示在R)rteBio上的結合并用作陰性對照，A3 (SGSGNDCPGPGQDTDCREC)，2)結構域_1 肽 D2 (SGSGNS I CCTKCHKGTYLY)，3)結構域 _3 肽 D5 (SGSGCRKNQYRHYffSENLF)和 4)重疊結構域-3 肽 E5 (SGSGNQYRHYffSENLFQCF)。為確定 DOMlm-21-23 也結合這些肽，將 DOMlm-21-23 (2. 5 μ Μ)注射到所有4種肽上。如圖所示，DOMlm-21-23未顯示和4種肽中的任一種結合。曲線彼此重疊。圖21.通過BIAcore將D0Mlh_131_511對TNFRl的線性肽片段進行表位作圖。用 4種生物素化的肽分別包被BIAcore SA芯片的4個通道。所述肽為1)人TNFRl的肽片段， 其不顯示在R)rteBio上的結合并用作陰性對照，A3 (SGSGNDCPGPGQDTDCREC)，2)結構域_1 肽 D2 (SGSGNS I CCTKCHKGTYLY)，3)結構域 _3 肽 D5 (SGSGCRKNQYRHYffSENLF)和 4)重疊結構域-3 肽 E5 (SGSGNQYRHYffSENLFQCF)。使 DOMlh-131-511 (2. 5 μ Μ)流經所有 4 種肽并測定結合數(shù)。如圖所示，DOMlh-131-511未顯示和4種肽中的任一種結合。曲線幾乎重疊并通過箭頭和對應的肽編號指示。圖22. DOMOIOO-AlbudAb串聯(lián)(in-line)融合物與小鼠血清白蛋白(MSA)結合的 BIAcore 分析。在 BIAcore CM5 芯片上包被 MSA(Sigma-Aldrich)，使用 EDC/NHS 化學根據(jù)制造商的說明書進行。之后，將N-端至C端分別由抗-TNFRl dAb -接頭-AlbudAb組成的DMS構建體(如表6所示)以1 μ M注射到MSA表面上并監(jiān)控結合。如BIAcore示蹤曲線所示,DMS0192和DMS0188具有最好的總體動力學，而DMS0182和DMS0184與MSA結合最弱。用箭頭指示了每個DMS克隆的對應BIAcore示蹤曲線。圖23. DOMOlOO-AlbudAb串聯(lián)融合物與人血清白蛋白(HSA)結合的BIAcore分析。 在BIAcore CM5芯片上包被HSA(Sigma-Aldrich)，使用EDC/NHS化學根據(jù)制造商的說明書進行。之后，將N-端至C端分別由抗-TNFRl dAb -接頭-AlbudAb組成的DMS構建體 (如表6所示)以1 μ M注射到MSA表面上并監(jiān)控結合。如BIAcore示蹤曲線所示，DMS0189和 DMSO190具有最好的總體動力學，而圖中顯示的其他DMS克隆(DMS0182、DMS0184、DMS0186 和DMS0188)與HSA的親和力非常相似并且顯著較弱。用箭頭指示了每個DMS克隆的對應 BIAcore示蹤曲線。圖24. DOMOlOO-AlbudAb融合物在小鼠中的ΡΚ。對小鼠給藥DMS0168 (2. 5 mg/ kg、靜脈內)、DMS0169 (2.5 mg/kg、靜脈內)或DMS0182 (10 mg/kg、腹膜內)。在每個時間點(0. 17、1、4、12、24、48和96h)處死3只小鼠并分析其血清的各種DOMOlOO-AlbudAb融合物水平。在每個時間點測定每種DOMOlOO-AlbudAb融合物的平均量并對時間作圖，DMS0168 (灰虛線)、DMS0182 (黑點線)和DMS0169 (黑實線)(對應的線也用箭頭指示)。使用
16WinNonLin 分析軟件包(例如版本 5. 1 (可從 Pharsight Corp.、Mountain View、CA94040、 USA處獲得)中的無隔分析(NCA)，測定了每種分子的終末半衰期。DMS0182具有5. 9h的終末半衰期，DMSO168為15. 4h和DMS0169為17. 8h。由于腹膜內給藥，DMSO182的曲線具有不同于DMS0168和DMS0169觀察到的形狀(通過Biacore顯示曲線)。圖25.在鹽水和DMSO169處理期間Tgl97/hp55 KI小鼠的關節(jié)炎評分。在此研究中使用的轉基因小鼠品系是Tgl97 (過表達人TNFa)和hp55 (敲入人TNFRl、又稱p55) 的雜種(cross-bred)，其自發(fā)地產生關節(jié)炎。從第6周至第15周，用10 mg/kg DMS0169或鹽水每周2次處理每組中的12只小鼠。每周測定每只小鼠兩個后部關節(jié)的關節(jié)炎評分并將12只小鼠的平均關節(jié)炎評分和平均值標準誤對時間作圖。很明顯，DMS0169處理的動物較少產生關節(jié)炎。圖26.在鹽水和DMSO169處理期間Tgl97/hp55 KI小鼠的體重。在此研究中使用的轉基因小鼠品系是Tgl97 (過表達人TNFa)和hp55 (敲入人TNFR1、又稱p55)的雜種，其自發(fā)地產生關節(jié)炎。從第6周至第15周，用10 mg/kg DMSO169或鹽水每周2次處理每組中的12只小鼠。每周對小鼠稱重并對平均數(shù)作圖，圖中顯示指示平均值標準誤的誤差條(error bar)。圖中明顯可見，與用鹽水處理的動物相比，DMS0169傾向于更重，盡管不是統(tǒng)計上顯著的。圖27.在鹽水和DMS0169處理后第15周的Tgl97/hp55 KI小鼠的組織學和關節(jié)炎評分。在此研究中使用的轉基因小鼠品系是Tgl97 (過表達人TNFa)和hp55 (敲入人 TNFR1、又稱p55)的雜種，其自發(fā)地產生關節(jié)炎。從第6周至第15周，用10 mg/kg DMSO169 或鹽水每周2次處理每組中的12只小鼠。在第15周處死小鼠并對關節(jié)炎評分(黑條)和關節(jié)中的組織學(空白條)二者評分(Keffer ^Μβ J. 10、p4025 (1991))。每組由12 只動物組成并計算標準誤。顯示處理組之間的差異是統(tǒng)計上顯著的(p<0.001)。發(fā)明詳述
在此說明書中以使成文的說明書清楚和簡明的方式參考實施方案描述了本發(fā)明。意圖是并應當理解在不背離本發(fā)明的情況下可不同地組合或分離實施方案。除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語和本領域(例如細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學)普通技術人員通常理解的具有相同的含義。使用標準技術用于分子、遺傳和生化方法(一般見Sambrook #U , Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.禾口Ausubel ^A , Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第四版John Wiley & Sons，Inc0其在此引入作為參考)和化學方法。本文描述的免疫球蛋白單個可變結構域(dAb)包含互補決定區(qū)(⑶R1，⑶R2和 CDR3)。CDR和框架(FR)區(qū)的位置和編號系統(tǒng)已由Kabat(Kabat, Ε. A., Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U. S. Department of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office (1991))定義。本文描述的Vh和Vl (Vk) dAb的⑶R (⑶R1、⑶R2、⑶R3)的氨基酸序列對本領域技術人員將是顯而易見的，其是基于熟知的Kabat氨基酸編號系統(tǒng)和CDR的定義。根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)重鏈⑶R-H3具有不同的長度，在殘基H100和HlOl之間用直到K的字母(即H100、H100A ...H100K、H101)編號插入。可選地CDR也可使用Chothia系統(tǒng)(Chothia等人，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions ；Nature 342, p877-883)石角定，根據(jù)AbM或根據(jù)以下的Contact法。確定CDR的合適方法見http //www, bioinf. org. uk/abs/o 一旦編號了每個殘基，然后可應用以下⑶R定義(“_”表示和Kabat顯示的相同的殘基編號)
Kabat-最常使用的基于序列可變性的方法 (使用Kabat編號)
CDRHl:31--35/CDRH2:50--65CDRH3:95--102CDRLi:24--34CDRL2:50--56CDRL3:89--97
Chothia-基于結構環(huán)區(qū)的位置 (使用Chothia編號) CDR Hl: 26-32 CDR H2: 52-56 CDR H3: 95-102 CDR Li: 24-34 CDR L2: 50-56 CDR L3: 89-97 AbM-Kabat 和 Chothia 的折中 (使用Kabat編號) (使用Chothia編號) /35B 26-35
CDRHl:26-35/CDRH2:50-58CDRH3:95-102CDRLi:24-34CDRL2:50-56CDRL3:89-97Contact-“基于晶
(使用Kabat編號) (使用Chothia編號)
CDRHl:30-35/35A/35B30-35CDRH2:47-58-CDRH3:93-101-CDRLi:30-36CDRL2:46-55-CDRL3:89-96O 如本文使用的，術語“腫瘤壞死因子受體1 (TNFRl)拮抗劑”或“抗-TNFRl拮抗劑”等等指結合TNFRl并可抑制(即一種或多種)TNFRl功能的試劑(例如，分子，化合物)。例如，TNFRl拮抗劑可抑制TNF α結合TNFRl和/或抑制通過TNFRl介導的信號轉導。因此， TNFRl介導的過程和細胞應答(例如，在標準細胞毒性測定中TNF α誘導的細胞死亡) 可被#拮抗劑抑制。如本文使用的，“肽”指通過肽鍵連接在一起的約2至約55個氨基酸。如本文使用的，“多肽”指通過肽鍵連接在一起的至少約50個氨基酸。多肽一般包括三級結構且折疊成功能結構域。如本文使用的，當在適合于蛋白酶活性的條件下與蛋白酶溫育時，“對蛋白酶降解有抗性的”肽或多肽(例如，結構域抗體(dAb))基本上不由蛋白酶降解。當在適合于蛋白酶活性的溫度與蛋白酶溫育約1小時后，不超過約25%、不超過約20%、不超過約15%、不超過約14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約11%、不超過約10%、不超過約9%、不超過約8 %、不超過約7 %、不超過約6 %、不超過約5 %、不超過約4 %、不超過約3 %、不超過約2%、不超過約1%、或基本上無一蛋白質由蛋白酶降解時，多肽(例如，dAb)基本上不降解。例如在37或50°C。蛋白質降解可以使用任何合適的方法例如通過SDS-PAGE或如本文描述的功能測定(例如配體結合)進行評估。如本文使用的，“展示系統(tǒng)”指這樣的系統(tǒng)，其中多肽或肽的集合可用于基于期望特征，例如物理、化學或功能特征的選擇。展示系統(tǒng)可為合適的多肽或肽庫(例如在溶液中， 在合適的支持物上固化)。展示系統(tǒng)也可為使用細胞表達系統(tǒng)(例如，在例如轉化的、感染的、轉染的或轉導的細胞中表達核酸庫并在細胞表面展示編碼的多肽)或非細胞表達系統(tǒng) (例如乳劑區(qū)室化和展示)的系統(tǒng)。示例性展示系統(tǒng)將核酸的編碼功能和核酸編碼的多肽或肽的物理、化學和/或功能特征聯(lián)系在一起。當使用這樣的展示系統(tǒng)時，可選擇具有期望物理、化學和/或功能特征的多肽或肽并可容易地分離或回收編碼選擇的多肽或肽的核酸。 將核酸的編碼功能和多肽或肽的物理、化學和/或功能特征聯(lián)系在一起的多種展示系統(tǒng)是本領域已知的，例如細菌噬菌體展示(噬菌體展示，例如噬菌粒展示)，核糖體展示，乳劑區(qū)室化和展示，酵母展示，嘌呤霉素展示，細菌展示，質粒上的展示，共價展示等等(見例如EP 0436597 (Dyax),美國專利號 6，172，197 (McCafferty 藥乂)，美國專利號 6，489，103 (Griffiths ))。如本文使用的，“庫”指由氨基酸序列多樣性表征的多肽或肽集合。庫的單個成員可具有共同特征，例如共同結構特征(例如共同核心結構)和/或共同功能特征(例如能夠結合共同的配體(例如通用配體或靶配體，TNFRl))。如本文使用的，“功能”描述了具有生物學活性，例如特定結合活性的多肽或肽。例如，術語“功能多肽”包括通過其抗原結合位點結合靶抗原的抗體或其抗原結合片段。如本文使用的，“通用配體”(“generic ligand")指結合給定庫的功能成員的基本部分(例如基本上全部)的配體。通用配體(例如共同的通用配體)可結合給定庫的多個成員即使所述成員可能不具有對共同靶配體的結合特異性。大體上，在多肽上存在的功能通用配體結合位點(由結合通用配體的能力指示)表示所述多肽是正確折疊的和有功能的。 通用配體的合適實例包括超抗原，結合在庫功能成員基本部分上表達的表位的抗體，等等。“超抗原”是本領域的術語，其指和免疫球蛋白超家族成員在異于這些蛋白質的靶配體結合位點的位點相互作用的通用配體。葡萄球菌腸毒素是和T細胞受體相互作用的超抗原的實例。結合抗體的超抗原包括結合IgG恒定區(qū)的蛋白質G(Bjorck和Kronvall，J. Immunol., 133:9m (1984))；結合IgG恒定區(qū)和Vh結構域的蛋白質A(R)rsgren和 Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966))；和結合 Vl 結構域的蛋白質 L(Bjorck, J. Immunol., 7^:1194 (1988))。如本文使用的，“靶配體”指特異性或選擇性被多肽或肽結合的配體。例如，當多肽是抗體或其抗原結合片段時，靶配體可為任意期望抗原或表位。結合靶抗原依賴于有功能的多肽或肽。如本文使用的，抗體指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F (ab，)2、Fv、 二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構象的多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙抗體)，無論是衍生自天然產生抗體的任何物種，還是通過重組DNA技術生成的；無論是從血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母還是細菌中分離的。如本文使用的，“抗體形式”，“形式化”或類似術語指任何合適的多肽結構，其中可以摻入一個或多個抗體可變結構域，以便在結構上賦予對于抗原的結合特異性。多種合適的抗體形式是本領域已知的，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、前述任何一種的抗原結合片段(例如Fv片段(例如，單鏈Fv (scFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F (ab’ ) 2片段)、單個抗體可變結構域(例如，dAb、VH、VHH, Vl)和前述任何一種的修飾形式(例如通過聚乙二醇或其他合適聚合物的共價附著修飾的或人源化Vhh)。短語“免疫球蛋白單個可變結構域”指抗體可變結構域(Vh、Vhh、\)，其不依賴于其他V區(qū)或結構域特異性結合抗原或表位。免疫球蛋白單個可變結構域可以以具有其他可變區(qū)或可變結構域的形式(例如，同或異多聚體)存在，其中所述其他區(qū)或結構域不是通過單個免疫球蛋白可變結構域的抗原結合所需的(即，其中免疫球蛋白單個可變結構域不依賴于另外的可變結構域結合抗原)?！敖Y構域抗體”或“dAb”與“免疫球蛋白單個可變結構域” 相同，如該術語在本文中使用的。“單個免疫球蛋白可變結構域”與“免疫球蛋白單個可變結構域”相同，如該術語在本文中使用的?！皢蝹€抗體可變結構域”或“抗體單個可變結構域”與“免疫球蛋白單個可變結構域”相同，如該術語在本文中使用的。免疫球蛋白單個可變結構域在一個實施方案中是人抗體可變結構域，但還包括來自其他物種例如嚙齒類動物 (例如，如WO 00/29004中公開的，其內容整體弓I入本文作為參考)、護士鯊(nurse shark)和駱駝科物種(^fflWii/) Vhh dAbs的單個抗體可變結構域。駱駝科物種Vra是免疫球蛋白單個可變結構域多肽，其衍生自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝的物種，其產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體。Vhh可以是人源化的?！敖Y構域”是具有不依賴于蛋白質的其余的三級結構的折疊蛋白質結構。一般地， 結構域負責蛋白質的不連續(xù)功能性質，并且在許多情況下可以添加、去除或轉移至其他蛋白質，而不喪失蛋白質和/或結構域的剩余部分的功能?！皢蝹€抗體可變結構域”是包括抗體可變結構域特有的序列的折疊的多肽結構域。它因此包括完整的抗體可變結構域和修飾的可變結構域，例如其中一個或多個環(huán)已由并非抗體可變結構域特有的序列替換，或已截短或包括N或C末端延伸的抗體可變結構域，以及保留至少全長結構域的結合活性和特異性的可變結構域的折疊片段。術語“文庫”指異源多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每個成員具有單一的多肽或核酸序列。在這種情況下，“文庫”(“l(fā)ibrary”)和“庫”(“r印ertoire”)是同義詞。文庫成員之間的序列差異是文庫中存在多樣性的原因。文庫可采用多肽或核酸的簡單復合物的形式，或可為用核酸文庫轉化的生物或細胞，例如細菌、病毒、動物或植物細胞等等的形式。在一個實施方案中，每個單獨生物或細胞僅包含一個或有限數(shù)目的文庫成員。在一個實施方案中，將核酸參入表達載體以允許核酸編碼的多肽的表達。因此在一個方面，文庫可采用宿主生物群的形式，每個生物包含一個或多個拷貝的表達載體，表達載體包含核酸形式的單個文庫成員，其可被表達以產生其對應的多肽成員。因此，宿主生物群具有編碼不同多肽的大庫的潛能?！巴ㄓ每蚣?，，是對應如 Kabat 定義(“kquences of Proteins of Immunological Interest，，，US Department of Health and Human Services)的保守序列的抗體區(qū)或對應如Chothia和Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917定義的人種系免疫球蛋白庫或結構的單個抗體框架序列。文庫和庫可使用單個框架，或一組這樣的框架，已發(fā)現(xiàn)這樣的框架允許通過單獨在高變區(qū)中的變異產生幾乎任意結合特異性。如本文使用的，術語“劑量”指一次(單位劑量)全部或經過限定時間間隔以2次或更多次施用施用于受試者的配體的量。例如，劑量可以指在1天(24小時)(日劑量)、2天、1 周、2周、3周或一個或多個月(例如，通過單次施用，或通過2次或更多次施用)的過程期間施用于受試者的配體(例如，包括結合靶抗原的免疫球蛋白單個可變結構域的配體)的量。 劑量之間的時間間隔可以是任何所需時間量。如本文使用的，“流體動力學大小”指基于分子通過水溶液的擴散，分子(例如蛋白質分子、配體)的表觀大小?？梢蕴幚淼鞍踪|通過溶液的擴散或運動，以得到蛋白質的表觀大小，其中大小由蛋白質粒子的“斯托克斯(Stokes)半徑”或“流體動力學半徑”給出。蛋白質的“流體動力學大小”依賴于質量和形狀(構象)，從而使得基于蛋白質的總體構象，具有相同分子量的2種蛋白質可以具有不同的流體動力學大小。如本文提及的，術語“競爭”意指第一種靶與其關連靶(cognate target)結合結構域的結合在第二種結合結構域的存在下被抑制，所述第二種結合結構域對于所述關連靶特異。例如，結合可以在立體上被抑制，例如通過結合結構域的物理封閉或通過結合結構域的結構或環(huán)境的改變，從而使得其對于靶的親和力或抗體親抗原性減少。關于如何執(zhí)行競爭 ELISA和競爭BiaCore實驗，以測定第一種和第二種結合結構域之間的競爭的詳細說明，參見 W02006038027。如下執(zhí)行2個序列之間的“同源性”或“同一”或“相似性”(該術語在本文中可互換使用)的計算。序列就最佳比較目的進行比對(例如，缺口可以引入第一個和第二個氨基酸或核酸序列的一個或兩個中用于最佳比對，并且非同源序列為了比較目的可以被忽視)。 在一個實施方案中，就比較目的比對的參考序列的長度是參考序列長度的至少30 %、或至少40 %、或至少50 %、或至少60 %、或至少70 %、80 %、90 %、100 %。隨后比較在相應氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當?shù)谝粋€序列中的位置由與第二個序列中的相應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么分子在那個位置上是等同的(如本文使用的，氨基酸或核酸“同源性”等價于氨基酸或核酸“同一性”)。2個序列之間的百分比相同性是由序列共享的等同位置數(shù)目的函數(shù)，其中考慮缺口數(shù)目和每個缺口的長度，這需要引入用于2個序列的最佳比對。如本文定義的，氨基酸和核苷酸序列比對和同源性、相似性或相同性可以使用算法BLAST 2 Sequences進行制備且測定，其中使用缺省參數(shù)(Tatusova，Τ. A.等k, FEMS Microbiol Lett,174(1999)。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；ρ55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_156、 DOMlh-574-162或D0Mlh_574_180的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。在一個實施方案中，單個可變結構域為D0Mlh-574-72、D0Mlh_574_109、 DOMlh-574-138、D0Mlh_574_156、DOMlh-574-162、D0Mlh-574_180、D0Mlh_574_7、 D0Mlh-574-8、D0Mlh-574-10、D0Mlh-574-12、D0Mlh-574-13、D0Mlh-574-14、D0Mlh-574-15、 D0Mlh-574-16、D0Mlh-574-17、D0Mlh-574-18 或 D0Mlh-574-19。在一個實施方案中，根據(jù)此方面的可變結構域可具有本發(fā)明的任意其他方面的一個或多個特征并且本文正文的公開應當被解釋為使這些特征能夠被組合，例如包含在本文的權利要求書中。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、DOMlh-574-138, D0Mlh_574_156、 DOMlh-574-162或D0Mlh_574_180的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。在一個實施方案中，單個可變結構域為D0Mlh-510、D0Mlh-543或DOMlh-549。在一個實施方案中，根據(jù)此方面的可變結構域可具有本發(fā)明的任意其他方面的一個或多個特征并且本文正文的公開應當被解釋為使這些特征能夠被組合，例如包含在本文的權利要求書中。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 免疫球蛋白單個可變結構域，其中單個可變結構域為包含一個或多個以下突變(根據(jù)Kabat編號)的 D0Mlh-574-14 突變體
位置30是L或F， 位置52是A或T， 位置5 是D或E， 位置M是A或R， 位置57是R、K或A， 位置60是D、S、T或K， 位置61是E、H或G， 位置62是A或T，
位置 100 是 R、G、N、K、Q、V、A、D、S 或 V,和位置 101 是 A、Q、N、E、V、H 或 K。在此方面的一個實施方案中，突變的氨基酸序列與DOMlh-574的氨基酸序列至少 98%或99%相同。在一個實施方案中，突變的氨基酸序列與D0Mlh-574-14的氨基酸序列相同或至少98%或99%相同。在一個實施方案中，根據(jù)此方面的可變結構域可具有本發(fā)明的任意其他方面的一個或多個特征并且本文正文的公開應當被解釋為使這些特征能夠被組合， 例如包含在本文的權利要求書中。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其在第101位(根據(jù)Kabat編號)包含纈氨酸。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)VlOl經常與結合TNFRl (例如人TNFRl)的高KD相聯(lián)系。在一個實施方案中，根據(jù)此方面的可變結構域可具有本發(fā)明的任意其他方面的一個或多個特征并且本文正文的公開應當被解釋為使這些特征能夠被組合，例如包含在本文的權利要求書中。
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在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其在第101位(根據(jù)Kabat編號)包含纈氨酸。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)VlOl經常和蛋白水解穩(wěn)定性相聯(lián)系。有關蛋白水解穩(wěn)定性和蛋白水解穩(wěn)定的免疫球蛋白單個可變結構域的更多詳細說明可在W02008149144和W02008149148中找到，其公開在此以其整體引入作為參考，特別是提供用于測定可變結構域和其他抗-TNFRl配體、拮抗劑和結合結構域的蛋白酶穩(wěn)定性的試驗。在一個實施方案中，根據(jù)此方面的可變結構域可具有本發(fā)明的任意其他方面的一個或多個特征并且本文正文的公開應當被解釋為使這些特征能夠被組合，例如包含在本文的權利要求書中。在一個實施方案中，根據(jù)任意方面的單個可變結構域包含30G、44D、45P、55D、56R、 941和98R中的一個或多個，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含 45P、55D、56R、94I和98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含55D、 56R、94I和98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含55D、94I和 98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含45P、55D、94I和98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含30G、44D、55D、94I和98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個方面，本發(fā)明提供抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含30G、44D、45P、55D、56R、94I和98R中的一個或多個，其中編號是根據(jù)Kabat，其中單個可變結構域的氨基酸序列在其他位置與DOMlh-574的氨基酸序列相同。在一個實施方案中，提供用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFRl的可變結構域。在一個實施方案中，可變結構域包含45P、55D、56R、94I和98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含55D、56R、94I和98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含 55D、94I和98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含45P、55D、94I 和98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個實施方案中，可變結構域包含30G、44D、55D、94I和 98R，其中編號是根據(jù)Kabat。在一個方面，本發(fā)明提供抗-TNFa 1型受體(TNFR1巾5幻免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-72、D0Mlh_574_156、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_132、 D0Mlh-574-135,D0Mlh-574-138,D0Mlh-574-162 或 D0Mlh_574_180 的氨基酸序列相同的或至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。此方面提供了在細胞測定中是TNFR1(例如至少人TNFRl)的有效中和劑的可變結構域，例如在標準MRC5測定中通過TNF α誘導的IL-8 分泌的抑制測定；或在標準測定中通過TNF α誘導的細胞毒性的抑制測定；在標準食蟹猴KI測定中通過TNF α誘導的IL-8分泌的抑制測定。用于TNFRl拮抗劑的標準測定詳細說明是本領域已知的，例如在W02006038027, W02008149144和W02008149148中。也在下面的實施例章節(jié)中提供了詳細說明。在一個實施方案中，本發(fā)明提供抗-TNFa 1型受體 (TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與下表11中所示的除了 DOMlh-574以外的任一 DOMlh可變結構域的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與D0Mlh-574-89至D0Mlh_574_179中任一個氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。在一個方面，本發(fā)明提供抗-TNFa 1型受體(TNFR1巾5幻免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_93、D0Mlh_574_123、D0Mlh_574_125、 DOMlh-574-126 或 D0Mlh-574-129、D0Mlh-574-133、D0Mlh-574_137 或 D0Mlh-574-160 的氨基酸序列相同的或至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列。此方面提供了蛋白水解穩(wěn)定的可變結構域。參考上文有關蛋白酶穩(wěn)定性的討論。在一個方面，本發(fā)明提供抗-TNFa 1型受體(TNFR1巾5幻免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_125、DOMlh-574-126, DOMlh-574-133、DOMlh-574-135 或 DOMlh-574-138、DOMlh-574-139、DOMlh-574-155、 DOMlh-574-156、D0Mlh_574_162 或 D0Mlh_574_180 的氨基酸序列相同的或至少 95、96、97、 98或99%相同的氨基酸序列。此方面提供以高親和力結合人TNFRl并任選地也展示對鼠類 TNFRl的理想親和力的可變結構域。單個可變結構域為例如TNFRl的非競爭性抑制劑。在一個實施方案中，本發(fā)明的任意方面的抗-TNFRl單個可變結構域結合TNFRl (例如人TNFRl)但不(或基本上不)與 TNFa競爭或抑制TNFa結合TNFRl (例如在標準受體結合測定中)。在此實施方案中，在一個實例中可變結構域特異性結合TNFRl例如人TNFRl的結構域1。在此實施方案中，在一個實例中可變結構域特異性結合TNFRl例如人TNFRl的PLAD。在一個實施方案中，本發(fā)明的任意方面的抗-TNFRl單個可變結構域包含特異性結合下述的結合位點
(i)人TNFRl，以(或以約)500pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低、或150 pM或更低的解離常數(shù)(KD)，其通過表面等離子體共振測定；或
(ii)非人靈長類TNFRl(例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFR1)，以(或以約)500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低，或150 PM或更低的解離常數(shù)(KD )，其通過表面等離子體共振測定；或
(iii)鼠類TNFRl，以(或以約)7nM或更低、6 nM或更低、5 nM或更低、4 nM或更低、3 nM或更低、2 nM或更低、或1 nM或更低的解離常數(shù)(KD)，其通過表面等離子體共振測定。 在一個實例中，可變結構域特異性結合⑴和( ) ； (i)和(iii)；⑴、( )和(iii)；或 (ii)和(iii)。在一個實施方案中，本發(fā)明的任意方面的單個可變結構域包含特異性結合下述的結合位點
(a)人TNFRl，以(或以約)2 χ 10_4 S—1 或更低、或 1 χ 10_4 S—1 或更低、或 1 χ 10_5 S-1 或更低的解離速率常數(shù)(KofT)，其通過表面等離子體共振測定；
(b)非人靈長類TNFRl(例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFR1)，以(或以約》χ 10_4 S—1或更低、或1 χ 10_4 S—1或更低、或1 χ 10_5 S—1或更低的解離速率常數(shù)(Koff)，其通過表面等離子體共振測定；或
(c)鼠類TNFR1，以(或以約)1χ 10_3 S—1或更低、或1 χ 10_4 S—1或更低的解離速率常數(shù)(Koff)，其通過表面等離子體共振測定。在一個實例中，可變結構域特異性結合(a)和 (b) ； (a)和(c) ； (a)、(b)和(c)；或(b)和(c)。在一個實施方案中，本發(fā)明的任意方面的單個可變結構域包含特異性結合下述的結合位點(a，)人 TNFRl，以(或以約)5 χ IO4 Μ、—1 或更高、1 χ IO5 Μ、—1 或更高、2 χ IO5 Μ—、—1 或更高、3 χ IO5 Μ、—1或更高、4 χ IO5 Μ、—1或更高、或5 χ IO5 Μ、—1或更高的結合速率常數(shù)(Kon)，其通過表面等離子體共振測定；
(b，)非人靈長類TNFRl (例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFRl)，以(或以約)5 χ IO4 Μ—Υ1 或更高、1 χ IO5 Μ、—1 或更高、2 χ IO5 Μ—、—1 或更高、3 χ IO5 Μ、—1 或更高、4 χ IO5 Μ、—1 或更高、或5 χ IO5 Μ—、—1或更高的結合速率常數(shù)(Kon)，其通過表面等離子體共振測定；或 (c，)鼠類TNFRl，以(或以約)0. 5 χ IO5 Μ、—1或更高、1 χ IO5 Μ、—1或更高、或2 χ IO5 Μ—、—1或更高的結合速率常數(shù)(Kon)，其通過表面等離子體共振測定。在一個實例中，可變結構域特異性結合(a，)和(b，) ;(a')和(c，) ； (a，)、(b，)和(c，)；或(b，)和(c，)。在一個實施方案中，本發(fā)明的任意方面的單個可變結構域特異性結合人、食蟹猴和任選地犬TNFR1。特異性結合由10微摩爾或更低，任選地1微摩爾或更低的解離常數(shù)KD 指示?？乖Y合蛋白質與抗原或表位的特異性結合可通過合適的測定，包括例
分析和/或競爭結合測定，例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定例如ELISA和夾心競爭測定和其不同的變體測定。在一個實例中，可變結構域也特異性結合鼠類TNFRl。在本發(fā)明的任意方面的一個實施方案中，單個可變結構域抑制人、食蟹猴和任選地犬 TNFRl 結合 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_156、 DOMlh-574-162或D0Mlh-574-180，例如在標準細胞測定中(例如本文或在W02006038027、 W02008149144或W02008149148中描述的)。在本發(fā)明的任意方面的實施方案中，單個可變結構域抑制人、食蟹猴和任選地犬TNFRl結合D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、 DOMlh-574-138、D0Mlh_574_156、DOMlh-574-162 或 D0Mlh-574-180，例如在標準受體結合測定中(例如本文或在W02006038027、W02008149144或W02008149148中描述的)。在一個實例中，在這些實施方案中的“抑制”是可為全部(100%抑制)或基本上(至少90%、95%、98%， 或99%)的抑制。在本發(fā)明的任意方面的一個實施方案中，抗-TNFRl單個可變結構域、拮抗劑、配體或多肽以(或以約)5、4、3、2或1 nM或更低的ND50在標準MRC5測定中中和TNFRl (例如人TNFRl )，其通過TNF α誘導的IL-8分泌的抑制測定。在本發(fā)明的任意方面的一個實施方案中，抗-TNFRl單個可變結構域、拮抗劑、配體或多肽以150、100、50、40、30或20 nM或更低；或從(約)150至10 nM;或從(約)150 至20 nM ；或從(約)110至10 nM ；或從(約)110至20 nM的ND50在標準測定中中和TNFRl (例如鼠類TNFRl )，其通過TNF α誘導的細胞毒性的抑制測定。在本發(fā)明的任意方面的一個實施方案中，抗-TNFRl單個可變結構域、拮抗劑、配體或多肽以5、4、3、2或1 nM或更低；或從(約)5至(約)1 nM的ND50在標準食蟹猴KI測定中中和TNFRl (例如人TNFRl )，其通過TNF α誘導的IL-8分泌的抑制測定。在本發(fā)明的任意方面的一個實施方案中，單個可變結構域包含末端，任選地C-端半胱氨酸殘基。例如，半胱氨酸殘基可用于連接PEG至可變結構域，例如使用馬來酰亞胺連接(見例如W004081(^6)。在本發(fā)明的任意方面的實施方案中，單個可變結構域被連接至聚亞烷基二醇部分，任選地聚乙二醇部分。合適的PEG部分和結合方法和試驗見例如 W004081(^6。本文引入這些公開以提供在下面的權利要求中包含的公開內容，例如特定 PEG。
在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列D0Mlh-574-72、 D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_156、DOMlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的氨基酸序列相同的，或與選定的氨基酸序列在不超過25、20、15、10或5個氨基酸位置處不同并具有與選定的氨基酸序列的CDRl序列至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDRl序列。在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域包含與選定的氨基酸序列的CDR3序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR3序列。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列D0Mlh-574-72、 D0Mlh-574-109、D0Mlh-574-138、D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的氨基酸序列相同，或與選定的氨基酸序列在不超過25、20、15、10或5個氨基酸位置處不同并具有與選定的氨基酸序列的CDR2序列至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的CDR2序列。在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域包含與選定的氨基酸序列的CDR2序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的⑶R2序列。另外地或可選地，在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域包含與選定的氨基酸序列的CDR3序列相同的或至少50、 60、70、80、90、95或98 %相同的⑶R3序列。另外地或可選地，在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域包含與選定的氨基酸序列的⑶Rl序列相同的或至少50、60、70、80、90、 95或98 %相同的CDRl序列。在一個方面，本發(fā)明提供了抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列D0Mlh-574-72、 D0Mlh-574-109、D0Mlh-574-138、D0Mlh-574-156、D0Mlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的氨基酸序列相同，或與選定的氨基酸序列在不超過25、20、15、10或5個氨基酸位置處不同并具有與選定的氨基酸序列的⑶R3序列至少50、60、70、80、90、95或98 %相同的⑶R3序列。在一個方面，本發(fā)明提供了蛋白酶抗性的抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其中當在下述條件下孵育時所述單個可變結構域具有蛋白酶抗性
(i)至少10微克/ml濃度(C)的蛋白酶在37°C孵育至少1小時的時間(t)；或 (i i )至少40微克/ml濃度(c ’)的蛋白酶在30 V孵育至少1小時的時間(t)， 其中可變結構域包含與D0Mlh-574-U6或D0Mlh_574_133的氨基酸序列至少94、95、 96、97、98或99%相同的氨基酸序列，并任選地在第101位(Kabat編號)包含纈氨酸。在另一個方面，本發(fā)明提供了蛋白酶抗性的抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其中當在下述條件下孵育時所述單個可變結構域具有蛋白酶抗性
(i)至少10微克/ml濃度(c)的蛋白酶在37°C孵育至少1小時的時間(t)；或 (i i )至少40微克/ml濃度(c ’)的蛋白酶在30 V孵育至少1小時的時間(t)，其中可變結構域包含與 D0Mlh-574、D0Mlh-574-93、D0Mlh-574-123、D0Mlh-574-125、D0Mlh-574-U6、 D0Mlh-574-U9、D0Mlh-574-133、D0Mlh-574-137 或 D0Mlh-574-160 的氨基酸序列至少 70、 75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，并任選地在第101位 (Kabat編號)包含纈氨酸。在這些方面的一個實施方案中，蛋白酶抗性的抗-TNFRl可變結構域是非競爭性可變結構域(即，其不(基本上不)抑制TNF α結合TNFR1)。見上文有關非競爭性可變結構域的討論，其也應用于這些實施方案。在這些方面的一個實施方案中，濃度(c或c’)為至少100或1000微克/ml蛋白酶。在一個實施方案中，時間(t)為1、3或對小時或過夜。在一個實施方案中，可變結構域在條件(i)下是抗性的，并且濃度(c)是10或100微克/ml蛋白酶，并且時間(t)是1小時。在一個實施方案中，可變結構域在條件(ii)下是抗性的，并且濃度(c’)是40微克/ ml蛋白酶，并且時間(t)是3小時。在一個實施方案中，蛋白酶選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶、 leucozyme和胰酶制劑。在一個實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。在一個實施方案中，可變結構域對胰蛋白酶和至少另一種選自彈性蛋白酶、leucozyme和胰酶制劑的蛋白酶有抗性。 在一個實施方案中，可變結構域在條件(i )或(ii )下孵育后特異性結合TNFRl。在一個實施方案中，可變結構域在條件(i)或(ii)下孵育后在ELISA中具有至少0. 404的OD45tl讀數(shù)。在一個實施方案中，可變結構域在條件(i )或(i i )下孵育后特異性結合蛋白質A或蛋白質L。在一個實施方案中，可變結構域在條件(i)或(ii)下孵育后在凝膠電泳中基本上展示單一條帶。在一個實施方案中，可變結構域具有至少50°C的Tm。有關蛋白酶抗性的更多詳細說明可在W02008149144和W02008149148中找到。在一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其包含本發(fā)明的免疫球蛋白單個可變結構域和效應基團或抗體恒定結構域，任選地抗體Fc區(qū)，任選地其中Fc的N-端連接(任選地直接連接) 至可變結構域的C-端。在W004058820中描述的任意“效應基團”可用于本發(fā)明的此方面， 并且本文明確引入W004058820中對效應基團的描述和在該出版物中公開的將它們連接至可變結構域的方法作為參考以提供可用于本文的描述，例如在本文的權利要求書中。在一個實施方案中，多肽包含D0Mlh-574-16或D0Mlh_574_72的Fc融合。在一個方面，本發(fā)明涉及多特異性配體，其包含本發(fā)明的免疫球蛋白單個可變結構域和任選地至少一個特異性結合血清白蛋白(SA)的免疫球蛋白單個可變結構域。令人驚訝地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFRl單個可變結構域與抗-SA單個可變結構域的融合不但提供了改進的半衰期(相比單獨的抗-TNFRl dAb)的優(yōu)勢，而且具有與TNFRl結合的改進的親和力(KD)的額外好處。此發(fā)現(xiàn)在本領域現(xiàn)有技術中從未公開過。在這方面， 本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗-TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域和抗-SA (例如抗-人 SA)免疫球蛋白單個可變結構域的多特異性配體以提供比以可變結構域單體提供的(即當抗-TNFRl可變結構域是非形式化的，例如非PEG化的或不與抗體恒定區(qū)例如Fc區(qū)融合的， 和不與任意其他結構域融合的)抗-TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域具有與TNFRl結合的更長的半衰期和更低的KD的配體。在一個實施方案中，多特異性配體以比TNFRl單體的 KD低至少2倍的KD結合TNFRl (例如人TNFRl )。另外地或可選地，在一個實施方案中，多特異性配體具有所述單體的至少5、10、20、30、40、50或100倍的半衰期。另外地或可選地， 在一個實施方案中，多特異性配體在人中具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25 天的終末半衰期(例如在人志愿者中經驗上測定的或使用技術人員熟悉的常規(guī)技術通過在動物系統(tǒng)例如小鼠、狗和/或非人靈長類(例如食蟹猴、狒狒、恒河猴)中配體的半衰期推斷計算的)。例如其中抗-SA結構域在人SA和來自動物的SA之間有交叉反應。在本發(fā)明的多特異性配體的一個實施方案中，配體是TNFRl (例如人TNFR1)，任選地TNFRl介導的信號轉導的拮抗劑。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有范圍在(或約)2. 5小時或更長的ti3半衰期的根據(jù)本發(fā)明的可變結構域、多特異性配體或拮抗劑。在一個實施方案中，范圍的下端是 (或是約)3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時、或12小時。此外或可選地，ti3半衰期是(或是約)長達并包括21或25天。在一個實施方案中，范圍的上端是(或是約)12小時、24小時、2天、3天、5天、10天、15天、19天20天、21天或22天。例如，根據(jù)本發(fā)明的可變結構域或拮抗劑將具有12至60小時范圍(或約12至60小時)的t β半衰期。在另一個實施方案中，t β半衰期將在12至48小時的范圍(或約12至48小時)。在另一個實施方案中，t β半衰期將在12至沈小時的范圍(或約12至沈小時)。作為使用二室模型的替代方案，技術人員將熟悉無隔模型的使用，其可用于測定終末半衰期(在此方面，本文使用的術語“終末半衰期”指使用無隔模型測定的終末半衰期)?？墒褂肳inNonlin分析軟件包，例如版本5. 1 (可從Pharsight Corp. , Mountain View, CA94040, USA獲得)，例如用這種方法模擬曲線。在此情況下，在一個實施方案中單個可變結構域、多特異性配體或拮抗劑具有至少(或至少約)8小時、10小時、12小時、15小時、28小時、20小時、1 day、2天、3天、7天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21 天、22天、23天、M天或25天的終末半衰期。在一個實施方案中，此范圍的上端是(或是約) 24小時、48小時、60小時或72小時或120小時。例如，終末半衰期例如在人中是(或是約) 從8小時至60小時，或8小時至48小時或12至120小時。除了上述標準以外或可選地，根據(jù)本發(fā)明的可變結構域或拮抗劑具有范圍在(或約)1 mg.min/ml或更高的AUC值(曲線下的面積)。在一個實施方案中，所述范圍的下端是 (或是約)5、10、15、20、30、100、200或300 mg.min/ml。此外或可選地，根據(jù)本發(fā)明的可變結構域、多特異性配體或拮抗劑具有范圍在(或約)高達600 mg.min/ml的AUC。在一個實施方案中，所述范圍的上端是(或是約)500、400、300、200、150、100、75或50 mg.min/ml。有利地可變結構域或拮抗劑將具有在(或約在)選自下述的范圍中的AUC 15至150 mg.min/ml、 15 至 100 mg. min/ml、15 至 75 mg.min/ml,禾口 15 至 50mg. min/ml。通過提供和PEG或特異性結合血清白蛋白(例如小鼠和/或人血清白蛋白(SA)的單個可變結構域(或結合部分)連接的一個或多個抗-TNFRl單個可變結構域(或本文定義的其他結合部分)可從人和/或動物(例如小鼠或非人靈長類，例如狒狒、恒河猴、食蟹猴) 中得到ta、ti3和終末半衰期以及本文引述的AUC中的一個或多個。PEG大小可為(或為約)至少20 kDa，例如30、40、50、60、70或80 kDa。在一個實施方案中，PEG為40kDa，例如 2x20kDa PEG。在一個實施方案中，為得到t α、t β和終末半衰期或本文引述的AUC，提供了包含和抗-SA免疫球蛋白單個可變結構域連接的抗-TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域的拮抗劑。在一個實施方案中，PEG為40kDa，例如h20kDa PEG。例如，拮抗劑僅包含1個這樣的抗-TNFRl可變結構域，例如1個僅與1個抗-SA可變結構域連接的這樣的結構域。在一個實施方案中，為得到t α、t β和終末半衰期或本文引述的AUC，提供了包含與PEG，例如 40-80 kDa PEG，例如40 kDa PEG連接的抗-TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域的拮抗劑。 例如，拮抗劑僅包含1個這樣的抗-TNFRl可變結構域，例如1個與40 kDa PEG連接的這樣的結構域。在本發(fā)明的多特異性配體的一個實施方案中，配體包含抗-SA (例如HSA)單個可變結構域，所述可變結構域包含與DOM^i-11、DOM^i-11-3、D0M7h-ll-12, D0M7h-ll-15, D0M7h-14、D0M7h-14-10、D0M7h-14-18 或 D0M7m-16 的序列相同的或至少 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列?？蛇x地或另外地，在一個實施方案中，多特異性配體包含在抗-TNFRl單個可變結構域和抗-SA單個可變結構域之間提供的接頭，所述接頭包含氨基酸序列AST，任選地ASTSGPS?？蛇x地，所述接頭是AS (Gj) n、其中η是1、2、3、 4、5、6、7 或 8、例如 AS (G4S)3O 例如，配體包含(從 N-至 C- iM>D0Mlh-574-16-AST-D0M7h-ll ； 或 D0Mlh-574-72-ASTSGPS-D0M7m-16;或 D0Mlh-574-72-ASTSGPS-D0M7h-ll_12。在一個方面，本發(fā)明提供了多特異性配體，其包含(i)抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ； P55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與DOMlh-574-156的氨基酸序列相同的或至少 93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，(ii )至少1個特異性結合SA的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述抗-SA單個可變結構域包含與DOM^1-11-3 的序列相同的或至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列， 和(iii)任選地其中在抗-TNFRl單個可變結構域和抗-SA單個可變結構域之間提供接頭，所述接頭包含氨基酸序列AST，任選地ASTSGPS?？蛇x地，所述接頭是AS (GJ)n、其中η 是1、2、3，、4、5、6、7或8、例如AS((i4Q3。例如，配體包含任選地由AST或ASTSGPS連接的 DOMlh-574-156 和 D0M7h_ll_3?？蛇x地，所述接頭是 AS (G4S)n、其中 η 是 1、2、3、4、5、6、7 或 8、例如AS(G4S)315在此實例或方面中，任選地使配體適合對患者血管內、皮下、肌肉內、腹膜內或通過吸入施用。在一個實施方案中，以干燥粉末或凍干的組合物(任選地在施用前將其與稀釋劑混合)提供配體。在一個方面，本發(fā)明提供了多特異性配體，其包含(i)抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ； P55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與DOMlh-574-156的氨基酸序列相同的或至少 93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列，(ii)至少1個特異性結合SA的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述抗-SA單個可變結構域包含與DOM^1-H-IO 的序列相同的或至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列， 和(iii)任選地其中在抗-TNFRl單個可變結構域和抗-SA單個可變結構域之間提供接頭，所述接頭包含氨基酸序列AST，任選地ASTSGPS?？蛇x地，所述接頭是AS (GJ)n、其中η 是1、2、3、4、5、6、7或8、例如AS((^)3。例如，配體包含任選地由AST或ASTSGPS連接的 DOMlh-574-156 和 D0M7h-14_10。可選地，所述接頭是 AS (G4S)n、其中 η 是 1、2、3、4、5、6、7 或8、例如AS(G4S)315在此實例或方面中，任選地使配體適合對患者血管內、皮下、肌肉內、腹膜內或通過吸入施用。在一個實施方案中，以干燥粉末或凍干的組合物(任選地在施用前將其與稀釋劑混合)提供配體。本發(fā)明提供TNFRl拮抗劑，其包含本發(fā)明的任意方面或實施方案的單個可變結構域、多肽或多特異性配體。例如，本發(fā)明的拮抗劑或可變結構域單價結合TNFR1。例如，本發(fā)明的拮抗劑或可變結構域是單價的或基本上單價的，如通過標準SEC-MALLS測定。通過可變結構域或拮抗劑的不超過5、4、3、2或1%以非單價形式存在指示基本上單價，如通過標準 SEC-MALLS 測定。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑包含第一和第二個抗-TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域，其中每個可變結構域是根據(jù)本發(fā)明的任意方面或實施方案的。第一和第二個免疫球蛋白單個可變結構域在一個實例中是相同的。在另一個實例中它們是不同的。在一個實例中，本發(fā)明的拮抗劑或拮抗劑中的每個抗-TNFRl單個可變結構域的氨基酸序列與D0Mlh-574-16或D0Mlh-574-72的氨基酸序列相同。
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在一個方面，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的任意方面的抗-TNFRl可變結構域的TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)拮抗劑，用于口服遞送、遞送至患者的胃腸道、肺部遞送、遞送至患者的肺或全身遞送。在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的任意方面的TNFRl拮抗劑在制備用于口服遞送的藥物中的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的任意方面的TNFRl拮抗劑在制備用于遞送至患者的胃腸道的藥物中的用途。在一個實例中拮抗劑或可變結構域對胰蛋白酶、彈性蛋白酶和/或胰酶制劑有抗性。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的任意方面的TNFRl拮抗劑在制備用于肺部遞送的藥物中的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的任意方面的TNFRl拮抗劑在制備用于遞送至患者的肺的藥物中的用途。在一個實例中拮抗劑或可變結構域對leucozyme有抗性。在一個方面，本發(fā)明提供了用于藥物的口服遞送或遞送至患者的胃腸道或患者的肺或肺部組織的方法，其中所述方法包括對患者施用藥物有效量的本發(fā)明的TNFRl拮抗劑。在一個方面，本發(fā)明提供了用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFRl的TNFa 1型受體 (TNFR1 ；p55)拮抗劑，所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、 DOMlh-574-156、DOMlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的 CDRl 序列相同的或至少 50、60、70、 80,90,95或98%相同的⑶Rl序列。任選地，所述拮抗劑也可具有與選定序列的⑶R2序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的⑶R2序列。任選地、另外地或可選地，所述拮抗劑也可具有與選定序列的⑶R3序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的CDR3序列。在一個方面，本發(fā)明提供了用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFRl的TNFa 1型受體 (TNFR1 ；p55)拮抗劑，所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、 DOMlh-574-156、DOMlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的 CDR2 序列相同的或至少 50、60、70、 80,90,95或98%相同的⑶R2序列。任選地，所述拮抗劑也可具有與選定序列的⑶R3序列相同的或至少50、60、70、80、90、95或98%相同的CDR3序列。在一個方面，本發(fā)明提供了用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFRl的TNFa 1型受體 (TNFR1 ；p55)拮抗劑，所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、 DOMlh-574-156、DOMlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的 CDR3 序列相同的或至少 50、60、70、 80、90、95或98%相同的CDR3序列。在一個方面，本發(fā)明提供了用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFRl的TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，所述拮抗劑包含含有選自D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、 DOMlh-574-138、DOMlh-574-156, DOMlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 的單個可變結構域的 ⑶R1、⑶R2、和/或⑶R3的序列的免疫球蛋白單個可變結構域。本發(fā)明提供了任意方面的TNFRl拮抗劑用于治療和/或預防炎癥病癥。本發(fā)明提供了任意方面的TNFRl拮抗劑在制備用于治療和/或預防炎癥病癥的藥物中的用途。在拮抗劑或其用途的一個實施方案中，病癥選自關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病和慢性阻塞性肺病。在一個實例中，關節(jié)炎是類風濕性關節(jié)炎或青少年類風濕性關節(jié)炎。在一個實例中， 炎癥性腸病選自克羅恩病(Crohn’ s disease)和潰瘍性結腸炎。在一個實例中，慢性阻塞性肺病選自慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎和肺氣腫。在一個實例中，肺炎是細菌性肺CN 102405236 A
說明書
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炎。在一個實例中，細菌性肺炎是葡萄球菌肺炎。本發(fā)明提供了任意方面的TNFRl拮抗劑用于治療和/或預防呼吸道疾病。本發(fā)明提供了任意方面的TNFRl拮抗劑在制備用于治療和/或預防呼吸道疾病的藥物中的用途。 在一個實例中所述呼吸道疾病選自肺炎癥、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸性粒細胞浸潤癥、環(huán)境相關肺病、肺炎、支氣管炎、囊性纖維化、間質性肺病、原發(fā)性肺動脈高壓、肺血栓栓塞、胸膜疾病、縱隔膜疾病、隔膜疾病、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性呼吸窘迫綜合癥、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏、石棉肺、曲霉腫、曲霉病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜酸細胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化、侵略性肺炎球菌疾病、流感、非結核性分枝桿菌、胸膜積液、塵肺病、肺孢子蟲病、 肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著癥、肺炭疽、肺水腫、肺栓塞、肺炎癥、肺組織細胞增多病X、 肺動脈高壓、肺諾卡氏病、肺結核、肝靜脈閉塞病、類風濕性肺病、肉狀瘤病和韋格納肉芽腫病(Wegener，s granulomatosis)。在一個方面，提供本發(fā)明的任一方面的抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向一個或多個選自NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、 CRKNQYRHYffSENLF和NQYRHYWSENLFQCF的TNFRl表位序列。在一個實例中，提供所述抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向NSICCTKCHKGTYLY。 在一個實例中，提供所述抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向NSICCTKCHKGTY。在一個實例中，提供所述抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向CRKNQYRHYWSENLF。在一個實例中，提供所述抗-TNFRl 拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向NQYRHYWSENLFQCF。在一個實例中，提供所述抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向 CRKNQYRHYWSENLF和NQYRHYWSENLFQCF。在一個實例中，提供所述抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向NSICCTKCHKGTYLY、CRKNQYRHYWSENLF和 NQYRHYWSENLFQCF。在一個實例中，提供所述抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靴向 NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYWSENLF 和 NQYRHYWSENLFQCF。在一個實例中，這樣的靶向用于治療和/或預防上面詳細說明的任意病癥或疾病。在一個方面，本發(fā)明提供了在患者中治療和/或預防上面詳細說明的任意病癥或疾病的方法，所述方法包括對患者施用本發(fā)明的抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靶向如任意前述實施方案中描述的1個或多個TNFRl表位序列。多肽，dAb和拮抗劑
多肽、配體、dAb、配體或拮抗劑可以在大腸桿菌或畢赤酵母屬物種(例如巴斯德畢赤酵母(尺/^1Stori1S))中表達。在一個實施方案中，當在大腸桿菌或畢赤酵母屬物種(例如巴斯德畢赤酵母)中表達時，配體或dAb單體以至少約0.5 mg/L的量分泌。盡管當在大腸桿菌或畢赤酵母屬物種(例如巴斯德畢赤酵母)中表達時，本文描述的配體和dAb單體可以是可分泌的，但它們可以使用不采用大腸桿菌或畢赤酵母屬物種的任何合適方法產生，例如合成化學方法或生物生產方法。在一些實施方案中，多肽、配體、dAb、配體或拮抗劑不包括駱駝科動物免疫球蛋白可變結構域，或由駱駝科動物種系抗體基因區(qū)段編碼的免疫球蛋白可變結構域獨特的一個或多個框架氨基酸，例如在位置108、37、44、45和/或47上。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗-TNFRl可變結構域在根據(jù)Kabat的位置44上包含G殘基并任選地在其他位置例如位置 37或103上包含一個或多個駱駝科特異性氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的TNFRl拮抗劑可以是單價或多價的。在一些實施方案中，拮抗劑是單價的，并且包含與TNFRl相互作用的一個結合位點，所述結合位點由本發(fā)明的多肽或dAb 提供。單價拮抗劑結合一個TNFR1，并且可以不誘導TNFRl在細胞表面上的交聯(lián)或聚簇，這可以導致受體激活和信號轉導。在其他實施方案中，TNFRl的拮抗劑是多價的。TNFRl的多價拮抗劑可以包含關于 TNFRl的特定結合位點的2個或更多個拷貝，或包含結合TNFRl的2種或更多種不同結合位點，至少一種結合位點由本發(fā)明的多肽或dAb提供。例如，如本文描述的，TNFRl的拮抗劑可以是包括結合TNFRl的本發(fā)明的特定多肽或dAb的2個或更多個拷貝，或結合TNFRl的2 種或更多種不同的本發(fā)明的多肽或dAbs的二聚體、三聚體或多聚體。在一個實施方案中， TNFRl的多價拮抗劑在標準細胞測定中基本上不激動TNFRl (充當TNFRl的激動劑)(即在測定中當以 1ηΜ、10 ηΜ、100 ηΜ、1 μ MUO μ MUOO μ MU000 口] 或5，000 μ M 的濃度存在時，導致不超過約5%的由TNF α (100 pg/ml)誘導的TNFRl介導的活性)。在某些實施方案中，TNFRl的多價拮抗劑包含對于TNFRl的期望表位或結構域的2 個或多個結合位點。例如，TNFRl的多價拮抗劑可包含對于TNFRl的結構域1中的相同表位結合的2個或多個結合位點。在其他實施方案中，TNFRl的多價拮抗劑包含由本發(fā)明的多肽或dAb提供的與 TNFRl的不同表位或結構域結合的2個或多個結合位點。在一個實施方案中，當在標準細胞毒性測定或在如W02006038027中描述的標準HeLa IL-8測定中以約1 nM、或約10 nM、 或約100 nM、或約1 μ M、或約10 μ M的濃度存在時，這樣的多價拮抗劑不激動(agonize) TNFRl。TNFRl的其他拮抗劑不抑制TNFa與TNFRl的結合。這樣的配體(和拮抗劑)可用作診斷試劑，因為它們可用于結合和檢測，定量或測量樣品中的TNFRl并且不與樣品中的 TNF競爭結合TNFR1。因此，可對樣品中是否有或有多少TNFRl進行精確的測定。在其他實施方案中，多肽、配體、dAb或拮抗劑結合TNFRl并在標準細胞測定中以 (100 nM的ND5tl拮抗TNFRl的活性，并且在測定中彡10 μ M濃度的dAb拮抗彡5%的TNFRl 活性。在特定的實施方案中，多肽、配體、dAb或拮抗劑在標準細胞測定中基本上不激動 TNFRl (充當TNFRl的激動劑)(即在測定中當以1 ηΜ、10 ηΜ、100 ηΜ、1 μ MUO μ MUOO μ MU000 4] 或5，000 μ M的濃度存在時，導致不超過約5%的由TNF α (100 pg/ml)誘導的TNFRl介導的活性)。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽、配體、dAb或拮抗劑當以有效量施用時在慢性炎癥疾病模型中有效。通常有效量為約1 mg/kg至約10 mg/kg (例如，約1 mg/kg、約2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/ kg,或約10 mg/kg)。慢性炎癥疾病模型(見W02006038027中描述的那些)用于在人中預測治療效力是本領域技術人員認可的。在特定實施方案中，多肽、配體、dAb或拮抗劑在標準小鼠膠原誘導的關節(jié)炎模型 (模型的詳細說明見W02006038027)中有效。例如，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可在標準小鼠膠原誘導的關節(jié)炎模型中降低四肢總和的平均關節(jié)炎評分，例如和合適的對照相比降低約1至約16、約3至約16、約6至約16、約9至約16，或約12至約16。在另一個實例中，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可在標準小鼠膠原誘導的關節(jié)炎模型中延緩關節(jié)炎癥狀的發(fā)作，例如和合適的對照相比延緩約1天約2天、約3天、約4天、約5 天、約6天、約7天、約10天、約14天、約21天或約觀天。在另一個實例中，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可導致在標準小鼠膠原誘導的關節(jié)炎模型中四肢總和的平均關節(jié)炎評分降低0至約3、約3至約5、約5至約7、約7至約15、約9至約15、約10至約15、約 12至約15，或約14至約15。在其他實施方案中，多肽、配體、dAb或拮抗劑在關節(jié)炎的小鼠AARE模型(模型的詳細說明見W02006038027)中有效。例如，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可在關節(jié)炎的小鼠AARE模型中降低平均關節(jié)炎評分，例如和合適的對照相比降低約0. 1至約2. 5、 約0. 5至約2. 5、約1至約2. 5、約1. 5至約2. 5、或約2至約2. 5。在另一個實例中，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可在關節(jié)炎的小鼠AARE模型中延緩關節(jié)炎癥狀的發(fā)作， 例如和合適的對照相比延緩約1 day、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約 10天、約14天、約21天或約28天。在另一個實例中，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可導致在關節(jié)炎的小鼠AARE模型中的平均關節(jié)炎評分降低0至約0. 5、約0. 5至約1、 約1至約1. 5、約1. 5至約2、或約2至約2. 5。在其他實施方案中，多肽、配體、dAb或拮抗劑在炎癥性腸病(IBD)的小鼠Δ ARE模型(模型的詳細說明見W02006038027)中有效。例如，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可在IBD的小鼠AARE模型中降低平均急性和/或慢性炎癥評分，例如和合適的對照相比降低約0. 1至約2. 5、約0. 5至約2. 5、約1至約2. 5、約1. 5至約2. 5、或約2至約2. 5。 在另一個實例中，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可在IBD的小鼠AARE模型中延緩IBD癥狀的發(fā)作，例如和合適的對照相比延緩約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約 6天、約7天、約10天、約14天、約21天或約觀天。在另一個實例中，施用有效量的多肽、 配體、dAb或拮抗劑可導致IBD的小鼠AARE模型中的平均急性和/或慢性炎癥評分降低0 至約0. 5、約0. 5至約1、約1至約1. 5、約1. 5至約2、或約2至約2. 5。在其他實施方案中，多肽、配體、dAb或拮抗劑在IBD的小鼠右旋糖酐硫酸酯鈉 (DSS)誘導模型(模型的詳細說明見W02006038027)中有效。例如，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可在IBD的小鼠DSS模型中降低平均嚴重度評分，例如和合適的對照相比降低約0. 1至約2. 5、約0. 5至約2. 5、約1至約2. 5、約1. 5至約2. 5、或約2至約2. 5。在另一個實例中，施用有效量的多肽、配體、dAb或拮抗劑可在IBD的小鼠DSS模型中延緩IBD 癥狀的發(fā)作，例如和合適的對照相比延緩約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、 約7天、約10天、約14天、約21天或約觀天。在另一個實例中，施用有效量的多肽、配體、 dAb或拮抗劑可導致IBD的小鼠DSS模型中的平均嚴重度評分降低0至約0. 5、約0. 5至約1、約1至約1. 5、約1. 5至約2、或約2至約2. 5。在特定實施方案中，多肽、配體、dAb或拮抗劑在慢性阻塞性肺病(CORD)的小鼠煙草煙霧模型(模型的詳細說明見W02006038027)中有效。例如，和合適的對照相比，施用有效量的配體可減少或延緩CORD癥狀的發(fā)作?？捎糜诤Y選TNFRl拮抗劑(例如其配體、抗體或結合蛋白)在防御或治療疾病中的有效性的動物模型系統(tǒng)是現(xiàn)有的。在易感小鼠中檢測全身性紅斑狼瘡的方法是本領域已知的(Knight 藥Λ (1978) J. Exp. Med. , 147: 1653 ；Reinersten 藥Λ (1978) New Eng. J. Med. , 299: 515)。在SJL/J雌性小鼠中通過用來自另一個物種的可溶性AchR蛋白誘導疾病檢測重癥肌無力(MG) (Lindstrom藥Λ (1988) Adv. Immunol. , 42: 233)。在小鼠的易感品系中通過注射II型膠原誘導關節(jié)炎(Stuart(1984) Ann. Rev. Immunol.,
42: 233)。通過注射分支桿菌熱休克蛋白在易感大鼠中誘導佐劑關節(jié)炎的模型已有描述 (Van Eden #U (1988) Nature, 331: 171)。如描述的通過施用甲狀腺球蛋白在小鼠中誘導甲狀腺炎(Maron #U (1980) J. Exp. Med., 152: 1115)。在小鼠的特定品系中天然發(fā)生或可誘導胰島素依賴的糖尿病(IDDM) JBKanasawa藥Λ (1984) Diabetologia, 27: 113描述的那些。小鼠和大鼠中的EAE充當人的MS模型。在此模型中，通過施用髓磷脂堿性蛋白誘導脫髓鞘疾病(見 Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer ^A , eds. , Grune and Stratton, New York, pp. 179-213 ；McFarlin ^A (1973) Science, 179: 478:和 Satoh 藥Λ (1987) J. Immunol. , 138: 179)。通常，本發(fā)明的配體(例如拮抗劑)將以純化形式與藥理學上的合適載體一起使用。通常，這些載體包括水或醇/水溶液，乳劑或懸浮劑，任意包括鹽水和/或緩沖介質。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸林格氏。如果需要在懸浮液中保存多肽復合物，可從增稠劑例如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽中選擇合適的生理上可接受的佐劑。靜脈內載體包括液體和營養(yǎng)補充液和電解質補充液，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可存在防腐劑和其他添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences,第 16 版)?？墒褂枚喾N制劑，包括延長釋放制劑。本發(fā)明的配體(例如，拮抗劑)可以作為分開施用的組合物或與其他試劑一起使用。這些可以包括各種免疫治療藥物，例如cylcosporine、甲氨蝶呤、阿霉素或順鉬，和免疫藥物組合物可以包括與本發(fā)明的配體一起的各種細胞毒性的或其他試劑的“混合物(cocktails)”，或甚至具有不同特異性的根據(jù)本發(fā)明的配體的組合，例如使用不同靶抗原或表位選擇的配體，無論它們是否在施用前合并。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用途徑可為本領域普通技術人員通常已知的任意施用途徑。用于治療，包括但不限于免疫治療，可對任意患者依照標準技術施用本發(fā)明的選定的其配體。施用可通過任意合適的方式，包括胃腸外、靜脈、肌肉內、腹膜內、皮下、經皮、經肺通道，或也可合適地通過用導管直接輸注。施用的劑量和頻率將取決于患者的年齡、性別和狀況，同時施用的其他藥物，禁忌和臨床醫(yī)生將考慮的其他參數(shù)。施用可為如指示的局部 (例如通過肺施用例如鼻內施用局部遞送至肺)或全身的。本發(fā)明的配體可以凍干用于貯存且在使用前在合適載體中重構。這種技術已顯示對于常規(guī)免疫球蛋白是有效的，并且可以采用領域已知的凍干和重構技術。本領域技術人員將認識到凍干和重構可以導致不同程度的抗體活性喪失(例如對于常規(guī)免疫球蛋白，IgM 抗體趨于具有比IgG抗體更大的活性喪失)，并且使用水平可能必須向上調整以補償。
包含本發(fā)明的配體(例如拮抗劑)或其混合物的組合物可以施用用于預防和/或治療處理。在特定治療應用中，實現(xiàn)所選細胞群體的至少部分抑制、阻抑、調節(jié)、殺死或一些其他可測量參數(shù)的足夠量可以被定義為“治療有效劑量”。達到這個劑量所需的量將依賴于疾病的嚴重程度和患者的自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)，但通常范圍在每千克體重0. 005至 10. 0 mg配體，例如dAb或拮抗劑，更常使用0. 05至2. 0 mg/kg/劑量的劑量。用于預防應用，包含本發(fā)明的配體或其混合物的組合物也可以類似或略微降低的劑量施用，以預防、抑制或延緩疾病的發(fā)作(例如維持緩解或靜止，或預防急性期)。有經驗的臨床醫(yī)生將能夠確定治療、阻抑或預防疾病的合適給藥時間間隔。當施用TNFRl的配體(例如拮抗劑)以治療、 阻抑或預防慢性炎癥疾病時，其可以多達每日4次、每周2次、每周1次、每2周1次，1個月 1次或每2個月1次以例如約10 μ g/kg至約80 mg/kg、約100 μ g/kg至約80 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 80 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 70 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 60 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 50 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 40 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 30 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 20 mg/kg、約 1 mg/kg 至約 10 mg/kg、約 10 μ g/kg 至約 10 mg/kg、約 10 μ g/kg 至約 5 mg/ kg、約 10 μ g/kg 至約 2. 5 mg/kg、約 1 mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/ kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg或約10 mg/kg的劑量施用。在特定的實施方案中，用于治療、阻抑或預防慢性炎癥疾病的TNFRl的配體(例如拮抗劑)以每2周1 次或1個月1次以約10 μ g/kg至約10 mg/kg (例如、約10 μ g/kg、約100 μ g/kg、約1 mg/kg、約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/ kg、約9 mg/kg或約10 mg/kg的劑量施用。如果相對于治療前存在的此種癥狀，或相對于未用此種組合物治療的個體(人或模型動物)中的此種癥狀或其他合適對照，一種或多種癥狀減少(例如，在臨床評估量表上至少10%或至少1個點)，那么使用本文描述的組合物進行的治療或療法被視為“有效的”。 癥狀將明顯依賴于靶向的疾病或病癥而改變，但可以通過普通有經驗的臨床醫(yī)生或技術員進行測量。例如通過監(jiān)控疾病或病癥的一種或多種生物化學指示劑的水平(例如，與疾病相關的酶或代謝物的水平、受累細胞數(shù)目等)，通過監(jiān)控物理表現(xiàn)(例如炎癥，腫瘤大小等等) 或通過公認的臨床評估量表，例如擴展殘疾狀態(tài)量表(用于多發(fā)性硬化)，IxxiM炎癥性腸病問卷(有關腸功能、全身癥狀、社交功能和情緒狀態(tài)的32點評估評價生活質量——評分范圍從32至324，較高的評分指示較好的生活質量)，生活質量類風濕性關節(jié)炎量表或其他公認的本領域已知的臨床評估量表可以測量此種癥狀。在疾病或失調癥狀中持續(xù)減少至少 10%或在給定臨床量表中減少1或更多點指示“有效”治療。類似地，如果相對于未用此種組合物治療的相似個體(人或模型動物)中的此種癥狀，一種或多種癥狀的發(fā)作或嚴重程度延遲、減少或取消，那么使用如本文描述的組合物執(zhí)行的預防是“有效的”。包含根據(jù)本發(fā)明的配體(例如拮抗劑)或其混合物的組合物可用于預防和治療性裝備以輔助改變、失活、殺死或去除在哺乳動物中的選定的靶細胞群。此外，本文描述的選定的多肽庫可選擇性地在身體外或體外使用以從異種細胞集合中殺死、消耗或否則有效去除靶細胞群。依照標準技術，來自哺乳動物的血液可在身體外與配體組合從而從血液中殺死或否則去除不需要的細胞，然后使血液返回哺乳動物。包含根據(jù)本發(fā)明的配體(例如拮抗劑)或其混合物的組合物可用于預防和治療性裝備以輔助改變、失活、殺死或去除在哺乳動物中的選定的靶細胞群。
配體(例如抗-TNFRl拮抗劑，dAb單體)可與一種或多種另外的治療或活性試劑一起施用或配制。當配體(例如dAb)與另外的治療劑一起施用時，可在施用另外的試劑之前、 同時或之后施用配體。通常，以提供重疊的治療效果的方式施用配體和另外的試劑。在一個實施方案中，本發(fā)明是治療、阻抑或預防慢性炎癥疾病的方法，其包括對需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑。在一個實施方案中，本發(fā)明是治療、阻抑或預防關節(jié)炎(例如類風濕性關節(jié)炎、青少年類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、銀屑病關節(jié)炎)的方法，其包括對需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明是治療、阻抑或預防銀屑病的方法，其包括對需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明是治療、阻抑或預防炎癥性腸病(例如克羅恩病、潰瘍性結腸炎)的方法，其包括對需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明是治療、阻抑或預防慢性阻塞性肺病(例如慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎、肺氣腫)的方法，其包括對需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明是治療、阻抑或預防肺炎(例如細菌性肺炎，例如金黃色葡萄球菌肺炎)的方法，其包括對需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑。本發(fā)明提供了治療、阻抑或預防除了慢性阻塞性肺病以外的肺病和肺炎的方法。 依照本發(fā)明可治療、阻抑或預防的其他肺病包括例如囊性纖維化和哮喘(例如類固醇抗性的哮喘)。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明是治療、阻抑或預防肺病(例如囊性纖維化和哮喘)的方法，其包括對需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑。在特定的實施方案中，經肺部遞送，例如通過吸入(例如支氣管內、鼻內或口腔吸入，鼻內滴劑)或通過全身性遞送(例如胃腸外、靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下)施用TNFRl的拮抗劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明是治療、阻抑或預防感染性休克的方法，其包括對需要其的哺乳動物施用治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑。在本發(fā)明的另一個方面，提供了組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或 TNFRl的拮抗劑和制藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。此外，本發(fā)明提供了使用根據(jù)本發(fā)明的多肽、配體、dAb或TNFRl的拮抗劑或組合物治療疾病的方法。在一個實施方案中疾病為癌癥或炎癥疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、哮喘或克羅恩病。在本發(fā)明的另一個方面，提供了組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、單個可變結構域、配體或拮抗劑和制藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在特定的實施方案中，經肺部遞送，例如通過吸入(例如支氣管內、鼻內或口腔吸入，鼻內滴劑)或通過全身性遞送(例如胃腸外、靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下)施用多肽、配體、單個可變結構域、拮抗劑或組合物。本發(fā)明的一個方面提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、單個可變結構域、配體、組合物或拮抗劑的肺部遞送裝置。所述裝置可為吸入器或鼻內施用裝置。在其他實施方案中，本文描述的任意配體(例如拮抗劑或單個可變結構域)還包含延長半衰期的部分，例如聚亞烷基二醇部分、血清白蛋白或其部分、轉鐵蛋白受體或其轉鐵蛋白結合部分、或包含在體內增加半衰期的多肽的結合位點的部分。在一些實施方案中，延長半衰期的部分包含在體內增加半衰期的多肽的結合位點，所述多肽選自親和體、SpA結構域、LDL受體A類結構域、EGF結構域和avimer。在其他實施方案中，延長半衰期的部分是聚乙二醇部分。在一個實施方案中，拮抗劑包含(任選地由下述組成)與聚乙二醇部分(任選地，其中所述部分具有約20至約50 kDa 的大小，任選地約40 kDa線性或分支的PEG)連接的本發(fā)明的單個可變結構域。有關dAb的 PEG化和結合部分的更多詳細說明參考W004081(^6。在一個實施方案中，拮抗劑由與PEG 連接的dAb單體組成，其中dAb單體是根據(jù)本發(fā)明的單個可變結構域?？商峁┐宿卓箘┯糜谥委熝装Y疾病、肺病癥(例如哮喘、流感或CORD)或癌癥或任選地用于靜脈內施用。在其他實施方案中，延長半衰期的部分是抗體或抗體片段(例如免疫球蛋白單個可變結構域)，其包含血清白蛋白或新生Fc受體的結合位點。本發(fā)明還涉及組合物(例如藥物組合物)，其包含本發(fā)明的配體(例如拮抗劑或單個可變結構域)和制藥上可接受的載體。在一些實施方案中，組合物包含用于靜脈內、肌肉內、腹膜內、動脈內、囊內、關節(jié)內、皮下施用、肺、鼻內、陰道或直腸施用的載體。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的組合物(例如藥物組合物)的藥物遞送裝置。在一些實施方案中，藥物遞送裝置包含多個治療有效劑量的配體。在其他實施方案中，藥物遞送裝置選自胃腸外遞送裝置、靜脈內遞送裝置、肌肉內遞送裝置、腹膜內遞送裝置、經皮遞送裝置、肺部遞送裝置、動脈內遞送裝置、囊內遞送裝置、關節(jié)內遞送裝置、皮下遞送裝置、鼻內遞送裝置、陰道遞送裝置、直腸遞送裝置、注射器、 經皮遞送裝置、膠囊、藥片、中和劑、吸入器、噴霧器(atomizer)、霧化器、噴霧器(mister)、 干粉吸入器、定量吸入器、定量噴霧器(sprayer)、定量噴霧器(mister)、定量噴霧器 (atomizer)禾口導管?？扇绫疚拿枋龅男问交景l(fā)明的配體(例如單個可變結構域、拮抗劑或多特異性配體)。例如，可形式化本發(fā)明的配體以定制體內血清半衰期。如果需要，配體可進一步包含如本文描述的毒素或毒素部分。在一些實施方案中，配體包含表面活性毒素，例如自由基產生物(例如含硒毒素)或放射性核素。在其他實施方案中，毒素或毒素部分是具有特異性結合細胞內靶的結合位點的多肽結構域(例如dAb)。在特定的實施方案中，配體是具有對 TNFRl (例如人TNFRl)的結合特異性的IgG樣形式。在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的單個可變結構域的融合蛋白?？勺兘Y構域可被融合至例如肽或多肽或蛋白質。在一個實施方案中，可變結構域被融合至抗體或抗體片段，例如單克隆抗體。通常，可通過從單個核酸序列表達融合產物或通過表達包含單個可變結構域的多肽然后使用常規(guī)技術將此多肽組裝進較大的蛋白質或抗體形式中實現(xiàn)融
I=I O
在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域、拮抗劑或融合蛋白包含抗體恒定結構域。在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域、拮抗劑或融合蛋白包含抗體 Fe，任選地其中Fc的N-端連接(任選地直接連接)可變結構域的C-端。在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域、拮抗劑或融合蛋白包含延長半衰期的部分。延長半衰期的部分可為聚乙二醇部分、血清白蛋白或其片段、轉鐵蛋白受體或其轉鐵蛋白結合部分、或包含在體內增加半衰期的多肽的結合位點的抗體或抗體片段。延長半衰期的部分可為包含血清白蛋白或新生Fc受體的結合位點的抗體或抗體片段。延長半衰期的部分可為dAb、抗體或抗體片段。在一個實施方案中，提供免疫球蛋白單個可變結構域或拮抗劑或融合蛋白使可變結構域(或拮抗劑或融合蛋白包含的可變結構域)進一步包含聚亞烷基二醇部分。聚亞烷基二醇部分可為聚乙二醇部分。下面提供了進一步的討論。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的任意方面或實施方案的單個可變結構域、蛋白質、多肽、拮抗劑、組合物或裝置，用于提供以下一種或多種目的(在此公開2種或多種以下目的的明確組合并可為權利要求的主題)
(i)與人TNFRl的有效結合(例如以(或以約)500pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低，或150 pM或更低的解離常數(shù)(KD)， 通過表面等離子體共振測定)；
(ii)與非人靈長類TNFRl(例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFRl)的有效結合(例如以(或以約)500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM 或更低，或150 pM或更低的解離常數(shù)(KD)，通過表面等離子體共振測定)；
(iii)與人TNFRl的有效結合(例如以(或以約)500pM或更低、400 pM或更低、350 pM 或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低，或150 pM或更低的解離常數(shù)(KD)， 通過表面等離子體共振測定)和與非人靈長類TNFRl (例如食蟹猴、恒河猴或狒狒TNFRl)的有效結合(例如以(或以約)500 pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、 250 pM或更低、200 pM或更低，或150 pM或更低的解離常數(shù)(KD)，通過表面等離子體共振測定)；
(iv)與人、食蟹猴和鼠類TNFRl的有效結合(例如以(或以約)500pM或更低、400 pM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低，或150 pM或更低的解離常數(shù)(KD)結合人TNFRl，通過表面等離子體共振測定；以(或以約)500 pM或更低、400 PM或更低、350 pM或更低、300 pM或更低、250 pM或更低、200 pM或更低，或150 pM或更低的解離常數(shù)(KD)結合食蟹猴TNFRl，通過表面等離子體共振測定；和以(或以約)7 nM或更低、6 nM或更低、5 nM或更低、4 nM或更低、3 nM或更低、2 nM或更低，或InM或更低的解離常數(shù)(KD)結合鼠類TNFRl，通過表面等離子體共振測定；)
(ν)有效中和患者中的人TNFR1，例如中和使用本發(fā)明的單個可變結構域、蛋白質、多肽、拮抗劑、配體或組合物以(或以約)5、4、3、2或1 nM或更低的ND50在標準MRC5測定中中和人TNFR1，通過TNFa誘導的IL-8分泌的抑制測定；
(vi)有效中和患者中的人TNFR1，例如中和使用本發(fā)明的單個可變結構域、蛋白質、多肽、拮抗劑、配體或組合物以5、4、3、2或1 nM或更低；或(約)5至(約)1 nM的ND50在標準食蟹猴KI測定中中和食蟹猴TNFIU，通過TNFa誘導的IL-8分泌的抑制測定；
(vii)有效中和患者中的人TNFR1，例如中和使用本發(fā)明的單個可變結構域、蛋白質、多肽、拮抗劑、配體或組合物以150、100、50、40、30或20 nM或更低；或從(約)150至10 nM ； 或從(約)150至20 nM ；或從(約)110至10 nM ；或從(約)110至20 nM的ND50在標準測定中中和鼠類TNFR1，通過TNFa誘導的細胞毒性的抑制測定；
(viii)有效中和患者中的人TNFR1，例如中和使用本發(fā)明的單個可變結構域、蛋白質、 多肽、拮抗劑、配體或組合物以5、4、3、2或1 nM或更低；或(約)5至(約)1 nM的ND50在標準食蟹猴KI測定中中和食蟹猴1順1 1，通過1順(1誘導的IL-8分泌的抑制測定；并以150、 100、50、40、30或20 nM或更低；或從(約)150至10 nM ；或從(約)150至20 nM ；或從 (約)110至10 nM;或從(約)110至20 nM的ND50在標準測定中中和鼠類TNFR1， 通過TNF α誘導的細胞毒性的抑制測定；
(ix)在多于1種物種的靈長類TNFRl(任選地，人和食蟹猴和/或恒河猴TNFRl和/或狒狒TNFRl，例如人和食蟹猴TNFRl)和任選的鼠類TNFRl之間提供交叉反應性；和
(χ )提供蛋白酶穩(wěn)定性(任選地，胰蛋白酶穩(wěn)定性)。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的任意方面或實施方案的單個可變結構域、蛋白質、多肽、拮抗劑、配體、組合物或裝置在提供前述緊接的段落中的(i)至(X)中一個或多個目的中的用途。本發(fā)明也提供相應的方法。參考W02006038027，其公開了抗-TNFRl免疫球蛋白單個可變結構域。本文以其整體引入此文件的公開，以特別提供用于抗-TNFRl單個可變結構域、配體、拮抗劑等等的用途、形式、選擇方法、產生方法、配制方法和測定，因此這些公開可在本發(fā)明的上下文中特別和明確地應用，包括為引入本公開的權利要求書提供明確的描述。本發(fā)明的抗-TNFRl是免疫球蛋白單個可變結構域，其任選地為人可變結構域或包含或來源于人框架區(qū)(例如DP47或DPK9框架區(qū))的可變結構域。在某些實施方案中，可變結構域是基于如本文描述的通用框架。在某些實施方案中，具有對TNFRl的結合特異性的結合位點的多肽結構域(例如免疫球蛋白單個可變結構域)抵抗聚集，可逆地展開(見W004101790，本文引入其中的教導作為參考)。核酸分子，載體和宿主細胞
本發(fā)明也提供分離的和/或重組的核酸分子，其編碼如本文描述的配體(單個可變結構域、融合蛋白、多肽、雙特異性配體和多特異性配體)。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的核酸分子，其編碼包含根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白單個可變結構域的多肽。在一個實施方案中，核酸包含DOMlh-574-156、 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_138、DOMlh-574-162 或 D0Mlh-574-180 的核苷酸序列。在一個實施方案中，核酸包含DOMlh-574-156、D0Mlh_574_72、D0Mlh_574_109、 DOMlh-574-132、D0Mlh_574_135、D0Mlh_574_138、DOMlh-574-162 或 D0Mlh-574-180 的核苷酸序列。在一個實施方案中，核酸包含D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_93、D0Mlh_574_123、 DOMlh-574-125、DOMlh-574-126 或 DOMlh-574-129、DOMlh-574-133、DOMlh-574-137 或D0Mlh-574-160的核苷酸序列。在一個實施方案中，核酸包含DOMlh-574-156、 D0Mlh-574-72、D0Mlh_574_109、DOMlh-574-125、DOMlh-574-126、D0Mlh_574_133、 DOMlh-574-135 或 D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_139、D0Mlh_574_155、DOMlh-574-162 或D0Mlh-574-180的核苷酸序列。在一個實施方案中，核酸包含D0Mlh_574_U6或DOMlh-574-133的核苷酸序列。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的核酸分子，其中核酸包含與 DOMlh-574-156、D0Mlh_574_72、D0Mlh_574_109、D0Mlh_574_138、DOMlh-574-162 或 D0Mlh-574-180的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸編碼包含特異性結合TNFRl的免疫球蛋白單個可變結構域的多肽。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的核酸分子，其中核酸包含與DOMlh-574-156、D0Mlh_574_72、 D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_132、DOMlh-574-135、DOMlh-574-138、DOMlh-574-162 或 D0Mlh-574-180的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸編碼包含特異性結合TNFRl的免疫球蛋白單個可變結構域的多肽。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的核酸分子，其中核酸包含與D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_93、 DOMlh-574-123、DOMlh-574-125、DOMlh-574-126 或 DOMlh-574-129、DOMlh-574-133, DOMlh-574-137或D0Mlh-574-160的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸編碼包含特異性結合TNFRl的免疫球蛋白單個可變結構域的多肽。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的核酸分子，其中核酸包含與DOMlh-574-156、 D0Mlh-574-72、D0Mlh_574_109、DOMlh-574-125、DOMlh-574-126、DOMlh-574-133、 DOMlh-574-135 或 DOMlh-574-138、D0Mlh_574_139、D0Mlh_574_155、DOMlh-574-162 或 D0Mlh-574-180的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸編碼包含特異性結合TNFRl的免疫球蛋白單個可變結構域的多肽。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的核酸分子，其中核酸包含與D0Mlh-574-U6或DOMlh-574-133的核苷酸序列至少80、85、90、95、98或99%相同的核苷酸序列并且其中核酸編碼包含特異性結合TNFRl的免疫球蛋白單個可變結構域的多肽。在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸的載體。在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細胞。提供了產生包含免疫球蛋白單個可變結構域的多肽的方法，所述方法包括在適于表達核酸或載體的條件下維持宿主細胞，由此產生包含免疫球蛋白單個可變結構域的多肽。任選地，所述方法還包括分離多肽和任選地產生變體例如突變的變體的步驟，所述變體和分離的多肽相比具有改進的親和力(KD);在標準MRC5、L^9 或食蟹猴KI測定中具有改進的中和TNFRl的ND5Q。本文中被稱為“分離的”核酸是已從其本來的來源(例如其存在于細胞中或核酸混合物例如文庫中)的基因組DNA或細胞RNA的核酸中分離出來的核酸，并包括通過本文描述的方法或其它合適的方法得到的核酸，其包括基本上純的核酸，通過化學合成，通過生物學和化學方法組合產生的核酸，和分離的重組核酸(見例如，Daugherty，B. L. ^A , Nucleic Acids Res., 7沒(匆2471-2476 (1991) ；Lewis, Α. P.和 J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)) 本文中被稱為“重組的”核酸是通過重組DNA技術產生的核酸，包括通過依賴人工重組方法，例如聚合酶鏈式反應(PCR)和/或使用限制酶克隆進載體的程序產生的核酸。在某些實施方案中，分離的和/或重組的核酸包含編碼如本文描述的配體的核苷酸序列，其中所述配體包含與結合本文描述的TNFRl的dAb，例如DOMlh-574-l 56、 D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、DOMlh-574-138, DOMlh-574-162 或 D0Mlh-574-180 的氨基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少
40約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%氨基酸序列相同性的氨基酸序列?？稍诰幋a選定的抗-TNFRl dAb的核苷酸序列全長上測定核苷酸序列相同性。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明的重組核酸分子的載體。在某些實施方案中，載體是包含與本發(fā)明的重組核酸有效連接的一個或多個表達控制元件或序列的表達載體。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明的重組核酸分子或載體的宿主細胞。合適的載體(例如質粒、噬菌粒)、表達控制元件、宿主細胞和產生本發(fā)明的重組宿主細胞的方法是本領域已知的，并且本文進一步描述了實例。合適的表達載體可包含若干成分，例如復制起點，可選擇的標記基因，一個或多個表達控制元件，例如轉錄控制元件(例如啟動子、增強子、終止子)和/或一個或多個翻譯信號、信號序列或前導序列，等等。如果存在，可通過載體或其它來源提供表達控制元件和信號序列。例如，克隆的編碼抗體鏈的核酸的轉錄和/或翻譯控制序列可用于引導表達?？商峁﹩幼佑糜谠谄谕乃拗骷毎械谋磉_。啟動子可為組成型或誘導型的。 例如，啟動子可有效連接至編碼抗體、抗體鏈或其部分的核酸，從而引導核酸的轉錄。用于原核(例如用于大腸桿菌的lac、tac、T3、Τ7啟動子)和真核(例如猿猴病毒40早期或晚期啟動子，勞氏肉瘤病毒長末端重復啟動子，巨細胞病毒啟動子，腺病毒晚期啟動子)宿主的多種合適的啟動子是現(xiàn)有的。此外，表達載體通常包含可選擇的標記用于選擇攜帶載體的宿主細胞，并且在可復制的表達載體的情況下包含復制起點。編碼賦予抗生素或藥物抗性的產物的基因是常用的可選擇的標記并可用于原核(例如內酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)，Tfei基因用于四環(huán)素抗性)和真核細胞(例如新霉素(G418或遺傳霉素)，gpt (霉酚酸)，氨芐青霉素或潮霉素抗性基因)。二氫葉酸還原酶標記基因允許用甲氨喋呤在多種宿主中選擇。編碼宿主的營養(yǎng)缺陷標記的基因產物的基因(例如Z^Z/么URA3、HIS3)經常用作酵母中的可選擇的標記。 也考慮使用病毒(例如桿狀病毒)或噬菌體載體，和能夠整合進宿主細胞基因組的載體，例如逆轉錄病毒載體。用于在哺乳動物細胞和原核細胞(大腸桿菌)、昆蟲細胞(施耐德果蠅 {DrosophilaS2 細胞，Sf9)和酵母(嗜甲醇畢赤酵母0°. methanol
德畢氏酵母0°. /^astoris)、釀酒酵母(5 cerevisiae))中合適的表達載體是本領域熟知的。合適的宿主細胞可為原核細胞，包括細菌細胞例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌O . subtiiism /或其它合適的細菌；真核細胞，例如真菌或酵母細胞(例如巴斯德畢氏酵母、 曲霉屬物種C^pergiWm sp.)、釀酒酵母、栗酒裂殖酵母(SbAizosaccAarofflj^es pombe)、 粗糙脈胞菌i^eurospora crassa )),或其它低等真核細胞，和高等真核細胞例如來自昆蟲 (例如施耐德果蠅S2細胞，Sf9昆蟲細胞(W0 94/26087 (0，Connor))、哺乳動物(例如COS 細胞，例如 C0S-1 (ATCC 登記號 CRL-1650)和 C0S-7 (ATCC 登記號 CRL-1651)，CHO (例如 ATCC 登記號 CRL-9096, CHO DG44 (Urlaub, G.和 Chasin, LA. , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)))，293 (ATCC 登記號 CRL-1573)，HeLa (ATCC 登記號 CCL-2), CVl (ATCC 登記號 CCL-70)，WOP (Dai ley, L. , ^A , J. Virol.,
739-749 (1985), 3T3, 293T (Pear, W. S. , ^A, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 湘:8392-8396 (1993)) NSO細胞，SP2/0，HuT 78細胞等等，或植物(例如煙草)的細胞。 (見例如，Ausubel, F. M. ,編 Current Pro toco Is in Molecular Biology, GreenePublishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)。)在一些實施方案中，宿主細胞是分離的宿主細胞并且不是多細胞生物(例如植物或動物)的一部分。在某些實施方案中，宿主細胞是非人宿主細胞。本發(fā)明也提供產生本發(fā)明的配體(例如雙特異性配體、多特異性配體)的方法，包括在適于表達重組核酸的條件下維持包含本發(fā)明的重組核酸的重組宿主細胞，由此表達重組核酸和產生配體。在一些實施方案中，方法進一步包含分離配體。適用于本發(fā)明的實施方案的公開細節(jié)參考W02006038027。例如，相關公開涉及基于免疫球蛋白單個可變結構域的配體的制備、文庫載體系統(tǒng)、文庫構建、組合單個可變結構域、配體的表征、配體的結構、骨架、蛋白質支架、典范序列的變化、測定和治療和診斷組合物和用途，以及“有效連接”、“初次(naive)”、“預防”、“阻抑”、“治療”和“治療有效劑量”的定義。形式
增加的半衰期在免疫球蛋白，特別是抗體和最特別地小尺寸的抗體片段的體內應用中有用。這些片段(Fvs、二硫鍵鍵合的Fvs、Fabs, scFvs, dAbs)可以遭受從身體快速清除的缺點；因此，雖然它們能夠快速到達身體的大多數(shù)部分，并且快速生產且更易于處理，但它們的體內應用已受其在體內的僅短暫持續(xù)限制。本發(fā)明的一個實施方案解決了此問題，通過提供增加的配體體內半衰期和因此提供配體的功能活性在體內的更長的持續(xù)時間。用于藥物代謝動力學分析和配體半衰期測定的方法將是本領域技術人員熟悉的。 S3^TtiA￠:Kenneth,A .-Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists 禾口 Zfeier1S^yLPharmacokinetic analysis :A Practical ApproachC 1996) 中找至LU 還參考"Pharmacokinetics，，，M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker,2nd Rev. ex edition (1982)，其描述了藥物代謝動力學參數(shù)，例如t α和 β半衰期和曲線下面積(AUC)。上文提供了半衰期和AUC的定義。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了配體(例如多肽、可變結構域、拮抗劑、多特異性配體)或包含根據(jù)本發(fā)明的配體的組合物，所述配體具有在15分鐘或更多的范圍中的t α 半衰期。在一個實施方案中，范圍的下端是30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、 5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。此外或可替代地，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物將具有在最高達且包括12小時的范圍中的t α半衰期。在一個實施方案中，范圍的上端是11、10、9、8、7、6或5小時。合適范圍的例子是1 - 6小時、2 - 5小時或3 - 4小時。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了配體(例如多肽、可變結構域、拮抗劑、多特異性配體)或包含根據(jù)本發(fā)明的配體的組合物，所述配體具有在約2. 5小時或更多的范圍中的 ti3半衰期。在一個實施方案中，范圍的下端為3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7 小時、約10小時、約11小時，或約12小時。此外或可替代地，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物將具有在最高達且包括21天的范圍中的t β半衰期。在一個實施方案中，范圍的上端是約12小時、約M小時、約2天、約3天、約5天、約10天、約15天或約20天。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物將具有約12至約60小時范圍中的ti3半衰期。在另一個實施方案中，將具有約12至約48小時的范圍。在另一個實施方案中，將具有約12至約26小時的范圍。
除了上述標準以外或可選地，本發(fā)明提供了配體或包括根據(jù)本發(fā)明的配體的組合物，所述配體具有在1 mg.分鐘/ml或更多的范圍中的AUC值(曲線下面積)。在一個實施方案中，范圍的下端是約5、約10、約15、約20、約30、約100、約200或約300 mg.分鐘/ml。 此外或可替代地，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物具有在最高達600 mg.分鐘/ml的范圍中的 AUC。在一個實施方案中，范圍的上端是約500、約400、約300、約200、約150、約100、約75 或約50 mg.分鐘/ml。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體將具有在選自下述的范圍中的AUC 約15至約150 mg.分鐘/ml、約15至約100 mg.分鐘/ml、約15至約75 mg.分鐘 /ml、和約15至約50mg.分鐘/ml。本發(fā)明的多肽和dAb和包含其的拮抗劑可以形式化為具有較大的流體動力學大小，例如通過附著PEG基團、血清白蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體或至少其運鐵蛋白結合部分、抗體Fc區(qū)，或通過與抗體結構域綴合。例如，多肽、dAb和拮抗劑可以形式化為抗體的較大抗原結合片段或抗體(例如，形式化為Fab、Fab，、F (ab)2、F (ab，)2、IgG、scFv)。本發(fā)明的配體(例如，dAb單體和多聚體)的流體動力學大小可以使用本領域眾所周知的方法進行測定。例如，凝膠過濾層析可以用于測定配體的流體動力學大小。用于測定配體的流體動力學大小的合適凝膠過濾基質例如交聯(lián)瓊脂糖基質是眾所周知且可容易獲得的。配體形式的大小(例如，與dAb單體附著的PEG部分的大小)可以依賴于所需應用而改變。例如，如果需要配體離開循環(huán)并進入外周組織，那么可以保持配體的低流體動力學大小以便于從血流中外滲?？蛇x地，如果需要dAb保留在體循環(huán)中更長時間段，那么可以例如通過形式化為Ig樣蛋白質增加配體的大小。iSi寸舶■■ 輔其月諭原、細立醉胃其月賬
配體的流體動力學大小及其血清半衰期還可以通過使本發(fā)明的TNFRl結合多肽、dAb 或拮抗劑與結合結構域(例如，抗體或抗體片段)綴合或結合得到增加，所述結合結構域結合增加體內半衰期的抗原或表位，如本文描述的。例如，TNFRl結合試劑(例如多肽)可以與抗血清白蛋白或抗新生Fc受體抗體或抗體片段，例如抗SA或抗新生Fc受體dAb、Fab、 Fab，或scFv綴合或連接，或與抗SA親和體或抗新生Fc受體親和體或抗SA avimer、或抗SA結合結構域綴合或連接，其包括選自但不限于下述的支架CTLA-4、脂質運載蛋白 (lipocallin)、SpA、親和體、avimer、GroEl和纖連蛋白(關于這些結合結構域的公開內容， 參見W02008096158，所述結構域及其序列引入本文作為參考且構成本文正文的公開內容的部分)。綴合指包括與結合結構域鍵合(共價或非共價)的本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑的組合物，所述結合結構域結合血清白蛋白。增強體內血清半衰期的合適多肽包括例如運鐵蛋白受體特異性配體-神經藥物試劑融合蛋白質(參見美國專利號5，977，307，其教導引入本文作為參考)、腦毛細血管內皮細胞受體、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體(例如，可溶性運鐵蛋白受體)、胰島素、胰島素樣生長因子1 (IGF 1)受體、胰島素樣生長因子2 (IGF 2)受體、胰島素受體、凝血因子X、α 1-抗胰蛋白酶和HNF Ia。增強血清半衰期的合適多肽還包括α-1糖蛋白(血清類粘蛋白；AAG)、 α -1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α -1微球蛋白(蛋白質HC ；AIM)、抗凝血酶IIKAT III)、脫脂載脂蛋白A-I (Apo A-1)、脫脂載脂蛋白B (Apo B)、血漿銅藍蛋白(Cp)、補體成分C3 (C3)、 補體成分C4 (C4)、Cl酯酶抑制劑(Cl INH)、C反應蛋白(CRP)、鐵蛋白(FER)、血紅素結合蛋白(HPX)、脂蛋白(a) (Lp (a))、甘露糖結合蛋白(MBP)、肌紅蛋白(Myo)、前白蛋白(運甲狀腺素蛋白；PAL)、視黃醇結合蛋白(RBP)和類風濕因子(RF)。來自細胞外基質的合適蛋白質包括例如膠原、層粘連蛋白、整聯(lián)蛋白和纖連蛋白。 膠原是細胞外基質的主要蛋白質。約15種類型的膠原分子是目前已知的，在身體的不同部分中發(fā)現(xiàn)，例如在骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內臟中發(fā)現(xiàn)的I型膠原(占90%的身體膠原)，或在軟骨、脊椎盤、脊索和眼的玻璃體液中發(fā)現(xiàn)的Π型膠原。來自血液的合適蛋白質包括例如血漿蛋白質(例如，血纖蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原(例如，纖維蛋白原Α、纖維蛋白原B)、血清淀粉狀蛋白A蛋白、觸珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白)、酶和酶抑制劑(例如，纖溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑)、免疫系統(tǒng)的蛋白質例如免疫球蛋白蛋白質(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈(κ/λ ))、轉運蛋白(例如，視黃醇結合蛋白、α-1微球蛋白)、防衛(wèi)素(例如，β -防衛(wèi)素1、嗜中性粒細胞防衛(wèi)素1、嗜中性粒細胞防衛(wèi)素2和嗜中性粒細胞防衛(wèi)素3)等。在血腦屏障處或在神經組織中發(fā)現(xiàn)的合適蛋白質包括例如黑皮質素受體、髓磷脂、抗壞血酸鹽轉運蛋白等。增強體內血清半衰期的合適多肽還包括定位至腎的蛋白質(例如，多囊蛋白、IV 型膠原、有機陰離子轉運蛋白Kl、Heymarm氏抗原)、定位至肝的蛋白質(例如，醇脫氫酶、 G250)、定位至肺的蛋白質(例如，分泌成分，其結合IgA)、定位至心臟的蛋白質(例如，HSP 27，其與擴張型心肌病相關)、定位至皮膚的蛋白質(例如，角蛋白)、骨特異性蛋白質例如形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMPs)，其是顯示生骨活性的蛋白質的轉化生長因子β超家族亞群(例如， ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8)、腫瘤特異性蛋白質(例如，滋養(yǎng)層抗原、赫賽汀(here印tin)受體、雌激素受體、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B，其可以在肝和脾中發(fā)現(xiàn)))。合適的疾病特異性蛋白質包括例如僅在活化T細胞上表達的抗原，包括LAG_3(淋巴細胞活化基因)、護骨蛋白配體(0PGL ；參見^Vatore 402,304-309 (1999)),0X40 (TNF受體家族成員，在活化T細胞上表達且在人T細胞白血病病毒I型(HTLV-I)生產細胞中特異性上調；參見/廁卯^. 165 (1) :263-70 (2000))。合適的疾病特異性蛋白質還包括例如金屬蛋白酶(與關節(jié)炎/癌癥相關)，包括CG6512果蠅、人截癱蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠 ftsH;和生血管生長因子，包括酸性成纖維細胞生長因子(FGF-1)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2)、血管內皮生長因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、轉化生長因子-a (TGF α)、 腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、血管生成素、白細胞介素-3 (IL_3)、白細胞介素_8 (IL_8)、 血小板衍生內皮生長因子(PD-ECGF)、胎盤生長因子(P1GF)、中期因子(midkine)血小板衍生生長因子-BB (PDGF)JP CXXXC 趨化因子(fractalkine)。增強體內血清半衰期的合適多肽還包括應激蛋白質例如熱休克蛋白(HSP)。HSP 通常在細胞內發(fā)現(xiàn)。當它們在細胞外發(fā)現(xiàn)時，它是細胞已死亡且溢出其內容物的指示劑。 當由于創(chuàng)傷、疾病或損傷，細胞外HSP觸發(fā)來自免疫系統(tǒng)的應答時，這種非程序性細胞死亡 (壞死)發(fā)生。與細胞外HSP結合可以導致本發(fā)明的組合物定位至疾病部位。涉及Fc轉運有關的合適蛋白質包括例如Brambell受體(也稱為FcRB)。這種Fc 受體具有2種功能，這兩者對于遞送都潛在有用。功能是(I)IgG從母親跨越胎盤轉運到孩子，(2)保護IgG不受降解，從而延長其血清半衰期。認為受體使來自內體的IgG再循環(huán)。 (參見，Holliger 等人，SioiecAflo/ 15 (7):632-6 (1997)·) 結合血清白蛋白的dAb
本發(fā)明在一個實施方案中提供了結合TNFRl的配體、多肽或拮抗劑(例如包含抗-TNFRl dAb的雙特異性配體(第一種dAb))和結合血清白蛋白(SA)的第二種dAb，第二種dAb以通過表面等離子體共振測定的約InM至約1、約2、約3、約4、約5、約10、約20、約 30、約 40、約 50、約 60、約 70、約 100、約 200、約 300、約 400 或約 500 μ M (即、χ 1(Γ9 至 5 χ 10_4Μ)，或約100 ηΜ至約10 μ Μ,或約1至約5 μ M或約3至約70 ηΜ或約IOnM至約1、 約2、約3、約4或約5 μ M的KD結合SA。例如通過表面等離子體共振測定的約30至約70 ηΜ。在一個實施方案中，第一種dAb (或dAb單體)以通過表面等離子體共振測定的大概約 1、約50、約70、約100、約150、約200、約300 ηΜ或約1、約2或約3 μ M的KD結合SA (例如HSA)。在一個實施方案中，對于包括第一種抗-SA dAb和針對TNFRl的第二種dAb的雙特異性配體，第二種dAb對于其靶的親和力(例如，如通過表面等離子體共振測量的KD和/ 或K。ff，例如使用BiaCore)是第一種dAb對于SA的親和力的約1至約100000倍(例如約 100至約100000，或約1000至約100000，或約10000至約100000倍)。在一個實施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。例如，第一種dAb以大概約10 μΜ的親和力結合 SA，而第二種dAb以約100 pM的親和力結合其靶。在一個實施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一個實施方案中，第一種dAb以大概約50、例如約70、約100、約150或約 200 ηΜ的KD結合SA(例如HSA)。雙特異性配體的詳細說明可在W0030(^609、W004003019、 W02008096158 和 W004058821 中找到。本發(fā)明的配體在一個實施方案中包含以通過表面等離子體共振測定的約InM至約1、約2、約3、約4、約5、約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約100、約200、約 300、約400或約500 μ M ( S卩、χ約1(Γ9至約5 χ I(T4M),或約100 ηΜ至約10 μ Μ,或約 1至約5 μ M或約3至約70 ηΜ或約IOnM至約1、約2、約3、約4或約5 μ M的KD結合血清白蛋白(SA)的dAb。例如通過表面等離子體共振測定的約30至約70 ηΜ。在一個實施方案中，第一種dAb (或dAb單體)以通過表面等離子體共振測定的大概約1、約50、約70、約 100、約150、約200、約300 ηΜ或約1、約2或約3 μ M的KD結合SA(例如HSA)。在一個實施方案中，第一和第二種dAb通過接頭連接，例如從1至4個氨基酸或從1至3個氨基酸， 或大于3個氨基酸或大于4、5、6、7、8、9、10、15或20個氨基酸的接頭。在一個實施方案中， 使用較長的接頭(大于3個氨基酸)以增強效價(在拮抗劑中的1種或2種dAb的KD)。在配體和拮抗劑的特定實施方案中，dAb結合人血清白蛋白并與選自D0M^!-11、 D0M7h-ll-3、D0M7h-ll-12、D0M7h_ll_15、D0M7h_14、D0M7h-14_10、D0M7h_14_18 禾口 D0M7m-16的dAb競爭結合白蛋白。在配體和拮抗劑的特定實施方案中，dAb結合人血清白蛋白并與選自下述的dAb
競爭結合白蛋白
MSA-16、MSA-26(關于這些序列的公開內容參見W004003019，所述序列及其核酸配對物引入本文作為參考且構成本文正文的公開內容的部分)，
D0M7m-16 (SEQ ID NO: 473)、D0M7m_12 (SEQ ID NO: 474)、D0M7m_26 (SEQ ID NO: 475)、D0M7r-l (SEQ ID NO: 476)、D0M7r_3 (SEQ ID NO: 477)、D0M7r_4 (SEQ ID NO:478、D0M7r--5(SEQ ID NO:479)、D0M7r-7(SEQIDNO480)、D0M7r--8(SEQ ID NO:481、D0M7h--2(SEQ ID NO:482)、D0M7h-3(SEQIDNO483)、D0M7h--4(SEQ ID NO:484、D0M7h--6(SEQ ID NO:485)、D0M7h-l(SEQIDNO486)、D0M7h--7(SEQ ID NO:487、DCWh--22(SEQ ID NO:489)、D0M7h-23(SEQIDNO490)、D0M7h-24(SEQ ID NO:491、DCWh--25(SEQ ID NO:492)、D0M7h-26(SEQIDNO493),D0M7h-21(SEQ ID NO:494、D0M7h--27(SEQ ID NO:495)、D0M7h-8(SEQIDNO:496)、D0M7r-13(SEQ ID NO:497、D0M7r--14(SEQ ID NO:498)、D0M7r-15(SEQIDNO499)、D0M7r-16(SEQ ID NO:500、D0M7r--17(SEQ ID NO:501)、D0M7r-18(SEQIDNO502)、D0M7r-19(SEQ ID NO:503、D0M7r--20(SEQ ID NO:504)、D0M7r-21(SEQIDNO505)、D0M7r-22(SEQ ID NO:506、D0M7r--23(SEQ ID NO:507)、D0M7r-24(SEQIDNO508)、D0M7r-25(SEQ ID NO:509、D0M7r--26(SEQ ID NO510)、D0M7r-27 (SEQIDNO: 511)、D0M7r-28 (SEQ IDNO:512)、D0M7r-29 (SEQ IENO:513)、DOM7r-30(SEQID NO:514)-D0M7r-31 (SEQID NO: 515)、D0M7r-32 (SEQ ID NC:516)、D0M7r-33(SEQ ID NO: 517)(關于這些序列
的公開內容參見W02007080392，所述序列及其核酸配對物引入本文作為參考且構成本文正文的公開內容的部分；這個段落中的SEQ ID No是W02007080392中出現(xiàn)的那些)，dAb8 (dAblO)、DAb 10， dAb36, dAb7r20 (D0M7r20)、DAb7r21 (D0M7r21)、DAb7r22 (D0M7r22)、 DAb7r23 (D0M7r23)、DAb7r24 (D0M7r24)、DAb7r25 (D0M7r25)、DAb7r26 (D0M7r26)、 DAb7r27 (D0M7r27)、DAb7r28 (D0M7r28)、DAb7r29 (D0M7r29)、DAb7r29 (D0M7r29)、 DAb7r31 (D0M7r31)、DAb7r32 (D0M7r32)、DAb7r33 (D0M7r33)、DAb7r33 (D0M7r33)、 DAb7h22 (D0M7h22)、DAb7h23 (D0M7h23)、DAb7h24 (D0M7h24)、DAb7h25 (D0M7h25)、 DAb7h26 (D0M7h26), DAb7h27 (D0M7h27)、DAb7h30 (D0M7h30)、DAb7h31 (D0M7h31)、DAb2 (dAbs 4，7，41)、DAb4, dAb7, dAbll, dAbl2 (dAb7ml2)、DAbl3 (dAb 15)、DAbl5, dAbl6 (dAb21, dAb7ml6) ， dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 (dAb26, dAb7m26)、DAb27, dAb30 (dAb35)、DAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54)、DAb41, dAb46 (dAbs 47，52 和 56)、DAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7ml2, dAb7ml6, dAb7m26, dAb7rl (DOM 7rl)、DAb7r3 (D0M7r3)、DAb7r4 (D0M7r4)、DAb7r5 (D0M7r5)、DAb7r7 (D0M7r7)、DAb7r8 (D0M7r8)、DAb7rl3 (D0M7rl3)、 DAb7rl4 (D0M7rl4)、DAb7rl5 (D0M7rl5)、DAb7rl6 (D0M7rl6)、DAb7rl7 (D0M7rl7)、 DAb7rl8 (D0M7rl8)、DAb7rl9 (D0M7rl9)、DAb7hl (D0M7hl)、DAb7h2 (D0M7h2)、DAb7h6 (D0M7h6)、DAb7h7 (D0M7h7)、DAb7h8 (D0M7h8)、DAb7h9 (D0M7h9)、DAb7hlO (DOM7hlO)、 DAb7hll (D0M7hll)、DAb7hl2 (D0M7hl2)、DAb7hl3 (D0M7hl3)、DAb7hl4 (D0M7hl4)、DAb7pl (D0M7pl),和dAb7p2 (D0M7p2)(關于這些序列的公開內容參見W02008096158，所述序列及其核酸配對物引入本文作為參考且構成本文正文的公開內容的部分)。備選名稱顯示于dAb 后的括號中，例如dAb8具有其為dAblO的備選名稱，即dAb8 (dAblO)。
在某些實施方案中，dAb結合人血清白蛋白，并且包括與選自DOi^h-ll、 D0M7h-ll-3、D0M7h-ll-12、D0M7h_ll_15、D0M7h_14、D0M7h-14_10、D0M7h-14_18 禾口 D0M7m-16的dAb的氨基酸序列具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約 95 %、或至少約96 %、或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 %的氨基酸序列相同性的氨基酸序列。
在某些實施方案中，dAb結合人血清白蛋白，并且包括與選自下述的dAb的氨基酸序列具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、 或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%的氨基酸序列相同性的氨基酸序列MSA-16、
MSA-26,D0M7m-16 (SEQ ID NO:473)、D0M7m-12(SEQIDNO:474)、D0M7m-26(SEQIDNO475、D0M7r-1(SEQIDNO476),D0M7r-3(SEQIDNO477),D0M7r-4(SEQIDNO478、D0M7r-5(SEQIDNO479),D0M7r-7(SEQIDNO480)、D0M7r-8(SEQIDNO481、D0M7h-2(SEQIDNO482),D0M7h-3(SEQIDNO483)、D0M7h-4(SEQIDNO484、D0M7h-6(SEQIDNO485),D0M7h-l(SEQIDNO486)、D0M7h-7(SEQIDNO487、DCWh-22(SEQIDNO489)、D0M7h-23(SEQIDNO490)、D0M7h-24(SEQIDNO491、DCWh-25(SEQIDNO492)、D0M7h-26(SEQIDNO493)、D0M7h-21(SEQIDNO494、D0M7h--27(SEQIDNO:495),D0M7h-8(SEQIDNO:496)D0M7r-13(SEQIDNO497、D0M7r-14(SEQIDNO498)、D0M7r-15(SEQIDNO499)、D0M7r-16(SEQIDNO500、D0M7r-17(SEQIDNO501)、D0M7r-18(SEQIDNO502)、D0M7r-19(SEQIDNO503、D0M7r-20(SEQIDNO504)、D0M7r-21(SEQIDNO505)、D0M7r-22(SEQIDNO506、D0M7r-23(SEQIDNO507)、D0M7r-24(SEQIDNO508)、D0M7r-25(SEQIDNO509、D0M7r-26(SEQIDNO510)、D0M7r-27(SEQIDNO511)、D0M7r-28(SEQIDNO512、D0M7r-29(SEQIDNO513)、D0M7r-30(SEQIDNO514)、D0M7r-31(SEQIDNO515、D0M7r-32(SEQID NO: 516)、D0M7r-33 (SEQID NO: 517)(這個段落中的
SEQ ID NO是W02007080392 中出現(xiàn)的那些)，dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29,
dAb7r30ι, dAb7r31, dAb7r32,dAb7r33,dAb7h21，dAb7h22, dAb7h23,Ab7h24,Ab7h25Ab7h26,dAb7h27, dAb7h30,dAb7h31,dAb2,dAb4,dAb7,dAbll,dAb12，dAb 13:dAb15，dAb16，dAb17，dAbl8;,dAb19，dAb21,dAb22,dAb23,dAb24:’ dAb25,dAb26;dAb27,dAb30,dAb31,dAb33;,dAb34,dAb35,dAb38,dAb41,dAb46:’ dAb47,dAb52;dAb53,dAb54,dAb55,dAb56,dAb7ml2,dAb7ml6, dAb7m26, dAb7rl,dAb7r3,dAb7r4
dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7rl3, dAb7rl4, dAb7rl5, dAb7rl6, dAb7rl7, dAb7rl8, dAb7rl9, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7hll, dAb7hl2, dAb7hl3, dAb7hl4, dAb7pl,和 dAb7p2。 例如，結合人血清白蛋白的dAb可以包括與D0M7h-ll_3或D0M7h-14_10具有至少約90 %、或至少約95 %、或至少約96 %、或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 %氨基酸序列相同性的氨基酸序列。 例如，結合人血清白蛋白的dAb可以包括與下述具有至少約90 %、或至少約95 %、 或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%氨基酸序列相同性的氨基酸序列 D0M7h-2 (SEQ ID NO:482)、D0M7h_3 (SEQ ID NO:483)、D0M7h_4 (SEQ ID NO:484)、 D0M7h-6 (SEQ ID N0:485)、D0M7h_l (SEQ ID N0:486)、D0M7h_7 (SEQ ID N0:487)、D0M7h_8 (SEQ ID N0:496)、D0M7r-13 (SEQ ID N0:497)、D0M7r_14 (SEQ ID NO:498)、D0M7h_22 (SEQ ID N0:489)、D0M7h-23 (SEQ ID NO:490)、D0M7h_24 (SEQ ID NO:491)、D0M7h_25 (SEQ ID NO:492), D0M7h-26 (SEQ ID NO:493)、D0M7h_21 (SEQ ID NO:494)或 D0M7h_27 (SEQ ID NO:495)(這個段落中的SEQ ID NO是W02007080392中出現(xiàn)的那些)，或dAb8, dAb 10，Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAbl2, dAbl3, dAbl5, dAbl6, dAbl7, dAbl8, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56,
dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAbll, dAbl9, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7hl3 或 dAb7hl4。
dAb7h9, dAb7hlO, dAb7hll, dAb7hl2,在某些實施方案中，dAb結合人血清白蛋白，并且包括與選自下述的dAb的氨基酸序列具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、 或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%的氨基酸序列相同性的氨基酸序列DOM^i-2 (SEQ ID N0:482)、D0M7h-6 (SEQ ID NO:485), D0M7h-l (SEQ ID NO:486)、D0M7h_7 (SEQ ID NO:487), D0M7h-8 (SEQ ID NO:496)、D0M7h_22 (SEQ ID NO:489)、D0M7h_23 (SEQ ID N0:490)、D0M7h-24 (SEQ ID NO:491)、D0M7h_25 (SEQ ID NO:492)、D0M7h_26 (SEQ ID NO:493), D0M7h-21 (SEQ ID NO:494)、D0M7h_27 (SEQ ID NO:49 (這個段落中的 SEQ ID NO 是 W02007080392 中出現(xiàn)的那些)，dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7hll, dAb7hl2, dAb7hl3 和 dAb7hl4。在更特定的實施方案中，dAb是結合人血清白蛋白的Vk dAb并具有選自下述的氨基酸序列 DOM^i-2 (SEQ ID NO:482), D0M7h-6 (SEQ ID NO:485), D0M7h-l (SEQ ID NO:486), D0M7h-7 (SEQ ID NO:487)、D0M7h_8 (SEQ ID NO:496)(這個段落中的 SEQ ID NO 是 W02007080392 中出現(xiàn)的那些)，dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7hll, dAb7hl2, dAb7hl3 和 dAWhH。在更特定的實施方案中，dAb是結合人血清白蛋白的VH dAb并具有選自dAbn^O 和dAbni31的氨基酸序列。在更特定的實施方案中，dAb是dAb7hll或dAb^iH。在一個實例中，dAb是 D0M7h-ll-3。在另一個實例中，dAb 是 DOM^i-14-lO。在其他實施方案中，dAb、配體或拮抗劑結合人血清白蛋白并包含任意前述氨基酸序列的一個、兩個或三個 CDR，例如 D0M7h-ll-3, D0M7h-14_10, dAb7hll 或 dAb7hl4 的一個、兩個或三個⑶R。結合血清白蛋白的合適駱駝科物種Vhh包括WO 2004/041862 (Ablynx N. V.)和 W02007080392中公開的那些(所述Vhh序列及其核酸配對物引入本文作為參考且構成本文正文的公開內容的部分)，例如序列A(SEQ ID N0:518)、序列B(SEQ ID NO:519)、序列C(SEQ ID N0:520)、序列 D (SEQ ID N0:521)、序列 E (SEQ ID NO:522)、序列 F (SEQ ID N0:523)、 序列 G (SEQ ID N0:524)、序列 H (SEQ ID N0:525)、序列 I (SEQ ID N0:526)、序列 J (SEQ ID N0:527)、序列 K (SEQ ID NO:5 )、序列 L (SEQ ID NO:5 )、序列 M (SEQ ID N0:530)、 序列 N (SEQ ID N0:531)、序列 0 (SEQ ID N0:532)、序列 P (SEQ ID N0:533)、序列 Q (SEQ ID NO:5;34)，這些序列編號與 W02007080392 或 WO 2004/041862(Ablynx N. V.)中引用的那些對應。在某些實施方案中，駱駝科物種Vhh結合人血清白蛋白，并且包括與W02007080392 中公開的ALBl或SEQ ID N0S:518_534中的任何一個具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99% 的氨基酸序列相同性的氨基酸序列，這些序列編號與W02007080392或WO 2004/041862中引用的那些對應。在一些實施方案中，配體或拮抗劑包括與本文公開的任何抗血清白蛋白dAb競爭結合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)的抗-血清白蛋白dAb。在可選的實施方案中，拮抗劑或配體包含特異性針對SA (例如人SA)的結合部分， 其中所述部分包含如在W02008096158中描述的非免疫球蛋白序列，這些結合部分、其產生和選擇(例如從不同的文庫中)方法和其序列的公開內容引入本文作為參考且構成本文正文的公開內容的部分)。與半衰期延長部分(例如，白蛋白)綴合
在一個實施方案中，(一個或多個)半衰期延長部分(例如，白蛋白、運鐵蛋白及其片段和類似物)與本發(fā)明的TNFRl結合多肽、dAb或拮抗劑綴合或結合。用于在TNFRl結合形式中使用的合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體的例子在WO 2005077042中描述，其公開內容引入本文作為參考且構成本文正文的公開內容的部分。特別地，下述白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體可以在本發(fā)明中使用
SEQ ID N0:1 (如WO 2005077042中公開的，這個序列明確引入本公開內容作為參
考)；
包括 WO 2005077042 中的 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 1-387 或由 WO 2005077042 中的 SEQ ID NO: 1的氨基酸1-387組成的白蛋白片段或變體；
包括選自下述的氨基酸序列的白蛋白、或其片段或變體(a) WO 2005077042中的 SEQ ID NO:1 的氨基酸討-61 ； (b)W0 2005077042 中的 SEQ ID NO:1 的氨基酸 76 - 89 ； (C)WO 2005077042 中的 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 92 - 100 ； (d)WO 2005077042 中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 170 - 176 ； (e)W0 2005077042 中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 M7 - 252 ； (f)W0 2005077042 中的 SEQ ID NO: 1 的氨基酸洸6 - 277 ； (g)W0 2005077042 中的 SEQ ID NO:1 的氨基酸沘0 - 288 ； (h)W0 2005077042 中的 SEQ ID NO:1 的氨基酸 362 - 368 ； (i)W0 2005077042 中的 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 439 - 447 ； (j) WO 2005077042 中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 462 - 475 ； (k)W0 2005077042 中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 478 - 486 ； 和(I)WO 2005077042 中的 SEQ ID NO:1 的氨基酸 560 - 566。用于以TNFRl結合形式使用的合適白蛋白、片段和類似物的進一步例子在WO 03076567中描述，其公開內容引入本文作為參考且構成本文正文的公開內容的部分。特別地，下述白蛋白、片段或變體可以在本發(fā)明中使用
如WO 03076567中例如在圖3中描述的人血清白蛋白(這個序列信息明確引入本公開內容作為參考)；
由具有式分子量66，500的585個氨基酸的單條非糖基化多肽鏈組成的人血清白蛋白(HA)(參見，Meloun,等k, FEBS Letters ^:136 (1975) ；Behrens,等k，F(xiàn)eci Proc. 34-.m\ (1975) ；Lawn, ^A, Nucleic Acids Research 夕6102-6114 (1981) ；Minghetti, 等人，7； Biol. Chem. 261:6747 (1986))；
如Weitkamp,等人，J/w. Hum. Genet. 219 (1973)中描述的白蛋白的多態(tài)變體或類似物或片段； 如EP 322094中描述的白蛋白片段或變體，例如HA (1-373.、HA (1-388)、HA (1-389)、HA (1-369)和 HA (1-419)和在 1-369 和 1-419 之間的片段；
如EP 399666中描述的白蛋白片段或變體，例如HA (1-177)和HA (1-200)和在HA (1-X)之間的片段，其中X是從178到199的任何數(shù)目。當(一個或多個)半衰期延長部分(例如，白蛋白、運鐵蛋白及其片段和類似物)用于形式化本發(fā)明的TNFRl結合多肽、dAbs和拮抗劑時，它可以使用任何合適方法進行綴合，例如通過直接融合至TNFRl結合部分(例如抗-TNFRl dAb)，例如通過使用編碼融合蛋白的單個核苷酸構建體，其中所述融合蛋白以單條多肽鏈編碼，在TNFRl結合部分的N-或 C-端具有半衰期延長部分。可替代地，綴合可以通過使用部分之間的肽接頭來達到，例如如TO 03076567或WO 2004003019中描述的肽接頭(這些接頭公開內容引入本公開內容作為參考，以提供用于在本發(fā)明中使用的例子)。一般地，增強體內血清半衰期的多肽是這樣的多肽，其在體內天然存在并且抵抗通過內源機制的降解或去除，所述內源機制從生物(例如，人)中去除不希望有的材料。例如，增強體內血清半衰期的多肽可以選自來自細胞外基質的蛋白質，在血液中發(fā)現(xiàn)的蛋白質，在血腦屏障處或在神經組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白質，定位至腎、肝、肺、心臟、皮膚或骨的蛋白質，應激蛋白質，疾病特異性蛋白質或與Fc轉運有關的蛋白質。在本公開通篇描述的本發(fā)明的實施方案中，作為在本發(fā)明的拮抗劑或配體中使用抗-TNFRl單個可變結構域(“dAb”)的替代，考慮有技能的讀者(addressee)可使用包含結合TNFRl的本發(fā)明的dAb的1個或多個或所有3個CDR(例如，嫁接至合適的蛋白質支架或骨架，例如親和體，SpA支架，LDL受體A類結構域或EGF結構域上的CDR)的多肽或結構域。 因此本公開作為一個整體應當被解釋為提供使用這些結構域替代dAb的拮抗劑的公開。在此方面，有關如何產生基于蛋白質支架的文庫和從這些文庫中選擇和表征結構域的細節(jié)見 W02008096158，引入其公開內容作為參考。在一個實施方案中，因此，本發(fā)明的拮抗劑包含對TNFRl具有結合特異性的免疫球蛋白單個可變結構域或結構域抗體(dAb)或合適形式的這樣的dAb的互補決定區(qū)。拮抗劑可為由這樣的dAb組成的，或基本上由這樣的dAb組成的多肽。拮抗劑可為包含合適形式的dAb (或dAb的CDR)，例如抗體形式(例如，IgG樣形式，scFv, Fab, Fab，，F(xiàn)(ab，)2) 的多肽，或為包含結合TNFRl的dAb和結合另一種靶蛋白、抗原或表位(例如血清白蛋白)的第二種dAb的雙特異性配體。根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb和拮抗劑可形式化為多種合適的本領域已知的抗體形式， 例如IgG樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、前述任意抗原結合片段(例如Fv片段 (例如，單鏈Fv (scFv)、二硫鍵鍵合的Fv)、Fab片段、Fab，片段、F (ab，)2片段)、單個可變結構域(例如，VH、Vl)和任意前述的修飾形式(例如通過聚亞烷基二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合適聚合物的共價連接修飾的)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了 IgG樣形式的配體(例如抗-TNFRl拮抗劑)。這樣的形式具有IgG分子的常規(guī)4鏈結構(2條重鏈和2條輕鏈)，其中一個或多個可變區(qū)(Vh 和或已被替換為本發(fā)明的dAb。在一個實施方案中，每個可變區(qū)(2個Vh區(qū)和2個八區(qū)) 被替換為dAb或單個可變結構域，其中至少1個是根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFRl dAb。在IgG樣形式中包含的dAb或單個可變結構域可具有相同的特異性或不同的特異性。在一些實施方案中，IgG樣形式是四價的并可具有1 (僅抗-TNFR1)、2 (例如抗-TNFRl和抗_SA)、3或4 種特異性。例如，IgG樣形式可為單特異性的并包含4個具有相同特異性的dAb ；雙特異性的并包含3個具有相同特異性的dAb和另一個具有不同的特異性的dAb ；雙特異性的并包含2個具有相同特異性的dAb和2個具有共有的但不同特異性的dAb ；三特異性的并包含具有相同特異性的第一和第二個dAb，具有不同特異性的第三個dAb和與第一、第二和第三個 dAb具有不同特異性的第四個dAb ；或四特異性的并包含4個分別具有不同特異性的dAb。 可制備IgG樣形式的抗原結合片段(例如Fab，F(xiàn)(ab，)2，F(xiàn)ab', Fv, scFv)。在一個實施方案中，IgG樣形式或抗原結合片段對TNFRl可為單價的。如果需要補體激活和/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，配體可為IgGl樣形式。如果需要，IgG樣形式可包含突變的恒定區(qū) (變體IgG重鏈恒定區(qū))以最小化與Fc受體的結合和/或固定補體的能力。(見例如Winter ^A, GB 2, 209, 757 B ；Morri son ^A , WO 89/07142 ；Morgan ^A , WO 94/29351， December 22， 1994)。本發(fā)明的配體(例如多肽、dAb和拮抗劑)可形式化為包含與第二個免疫球蛋白單個可變結構域直接融合的第一個免疫球蛋白單個可變結構域的融合蛋白。如果需要，這樣的形式可進一步包含半衰期延長部分。例如，配體可包含與第二個免疫球蛋白單個可變結構域直接融合的第一個免疫球蛋白單個可變結構域，第二個免疫球蛋白單個可變結構域與結合血清白蛋白的免疫球蛋白單個可變結構域直接融合。一般地，具有對于靶具有結合特異性的結合位點的多肽結構域的定向，和配體是否包括接頭，是設計選擇的問題。然而，一些定向連同或不連同接頭，可以提供比其他定向更好的結合特征。由本發(fā)明包含的所有定向(例如，dAbl-接頭-dAb2 ;dAb2-接頭-dAbl) 是包含提供所需結合特征的定向的配體，可以通過篩選容易地鑒定。根據(jù)本發(fā)明的多肽和dAb包括dAb單體、二聚體和三聚體，可以與抗體Fc區(qū)連接， 包括Ch2和Ch3結構域中的一個或兩個，和任選地鉸鏈區(qū)。例如，編碼作為單個核苷酸序列與Fc區(qū)連接的配體的載體可以用于制備此種多肽。此外本發(fā)明提供上述dAb單體的二聚體、三聚體和多聚體。
實施例抗-TNFRl dAb的初次選擇
抑制TNF 1型受體(p55)信號轉導的2種不同機制已有描述(W02006038027)。第一種包括通過用結構域抗體在一個表位結合TNFRl抑制信號轉導，在所述表位上結構域抗體直接競爭TNFa與其受體的結合。此競爭可在例如體外受體結合測定中測定，其中將受體包被在固體支持物上，結構域抗體和生物素化TNF α結合受體的競爭通過使用例如鏈霉抗生物素-HRP測量剩余的生物素化TNF α結合來測定。競爭性TNFRl抑制劑將阻止TNF α與其受體結合，造成無TNF α信號。相反地，非競爭性TNFRl抑制劑將對TNF α與受體的結合具有很小的影響，導致持續(xù)的生物素化TNF α的讀出，甚至在μ M級濃度的抑制性dAb的存在下。在功能性細胞測定中，例如人MRC5成纖維細胞細胞系在低水平的TNF α (10-200 pg/ ml,持續(xù)18h)刺激下釋放IL-8，然而，競爭性和非競爭性抑制劑都以劑量依賴的方式減少 IL-8分泌。后一結果證明2種類型的抑制劑在基于細胞的系統(tǒng)中的功能活性。因此具體的目的是分離在細胞測定中結合TNFRl并抑制其功能活性的結構域抗體，然而這些結構域抗體應當(基本上)不與TNF α競爭結合TNFRl。 為了分離非競爭性TNFRl結合dAb，設計了選擇策略以富集此亞類的dAb。所述方法包括使用Domantis，4G和6G天然(na'ive)噬菌體文庫，噬菌體文庫展示從GASl前導序列(見W02005093074)表達的抗體單個可變結構域用于4G和另外地具有加熱/冷卻預先則用于6G (見W004101790)。這些噬菌體文庫在第一輪中與200 nM生物素化的人TNFRl (R&D systems,貨號 636-R1/CF,使用 EZ-Link NHS-LC-LC-生物素(Pierce 貨號 21343) 生物素化，根據(jù)制造商的說明書)孵育，接著用鏈霉抗生物素包被的磁珠下拉(pull-down)。 在第2和3輪中，噬菌體和TNFRl (200 nM -第2輪，75 nM -第3輪)預孵育，并且然后和生物素化的TNF α (P印rotech貨號300-01Α) (200 nM -第2輪，75 nM -第 3輪)，接著用鏈霉抗生物素包被的磁珠下拉。在所有輪中，洗滌磁珠以去除弱結合的噬菌體并在擴增前通過胰蛋白酶消化洗脫結合的噬菌體。基本原理是能夠在TNF α存在下結合 TNFRl的那些dAb將被特別富集而與TNF α競爭的那些將不被下拉，因為此表位是TNF α結合磁珠所需要的。使用此實驗設計，進行了 3輪噬菌體選擇并且將第2輪和第3輪都克隆至 PD0M5大腸桿菌表達載體(見PCT/EP2008/067789 ；W02009/002882)中，接著表達dAb和在 BIAcore 上篩選TNFRl結合。pD0M5載體是基于pUC119的載體。蛋白質的表達通過LacZ 啟動子驅動。GASl前導序列(見WO 2005/093074)確保分離的可溶性dAb分泌至大腸桿菌的周質和培養(yǎng)上清。通過Sall/NotI將dAb克隆進此載體，所述載體在dAb的C-端添加myc 標簽。結合的dAb以50 ml規(guī)模表達并親和純化以用于功能表征。這包括測定在MRC5細胞測定中TNFa介導的信號轉導的抑制(如上所述)以及在受體結合測定中TNF α與TNFRl 結合的抑制(如下所述)。對6000個上清的篩選得到許多TNFRl結合物。然而，絕大多數(shù)或者結合無關表位，因此在細胞測定或受體結合測定中不具有活性，或者是競爭性的，如在受體結合測定中證明的。盡管大多數(shù)如此，對1)在BIAcore上結合TNFRl (圖1)，2)在MRC5 細胞測定中抑制TNFa (圖2)同時3)在受體結合測定中證明無TNFa競爭(圖3)的那些 dAb的序列分析鑒定出5個獨特的dAb(D0Mlh-543的數(shù)據(jù)在圖中未顯示)。這5個dAb是 D0Mlh-509、D0Mlh-510、DOMlh-543、DOMlh-549 和 DOMlh-574。
為了測定 D0Mlh-509，D0Mlh-510, DOMlh-543, DOMlh-549 和 D0Mlh_574 的成熟性，使用 Genemorph II 試劑盒(Stratagene (San Diego, USA)貨號 200550)根據(jù)制造商的說明書制備了 dAb突變體的易錯PCR文庫。序列分析顯示這些文庫具有約m的在氨基酸水平上的平均突變率。將這些文庫克隆進噬菌體載體PD0M4并在噬菌體上表達。pD0M4是絲狀噬菌體(fd)展示載體，其基于具有myc標簽的fd載體并且其中可在限制性位點之間克隆蛋白質序列以提供蛋白質-基因III融合物。歡SalI/驢片段克隆編碼dAb的基因。
進行了連續(xù)3輪與遞減量的生物素化人TNFRl (R&D Systems) (50碰(第1輪)、 5 nM (第2輪)和0.5 nM (第3輪))孵育的改進的結合物的選擇。在3輪選擇后，將dAb 基因克隆進大腸桿菌表達載體PD0M5，表達并通過BIAcore篩選上清在結合動力學中的改進。選擇了來源于所有5個親本系的變體；當在BIAcore上篩選時來自D0Mlh-574系的dAb 顯示了在解離速率中的顯著改進。純化了在解離速率中改進最顯著的那些dAb并在MRC5 細胞測定中表征(表 1 和圖 4)，最佳的 dAb 是D0Mlh-574-7、D0Mlh_574_8、D0Mlh_574_10、D0Mlh-574-ll、D0Mlh-574-12 和 D0Mlh_574_13。在檢查了這些 dAb 之后，我們進行了我們的判斷并鑒定出可能導致親和力改進的位置和突變，具體是V30G、G44D、L45P、G55D、H56R 和K94I (Kabat編號)。為了尋求累加效應，我們生成了在單個dAb中組合這些特定突變的新dAb變體。使用DOMlh-574模板改造的新變體為D0Mlh-574_14 (G55D、H56R和K94I)、 D0Mlh-574-15 (G55D 和 K94I)、D0Mlh-574-16 (L45P、G55D、H56R 和 K94I)、D0Mlh-574-17 (L45P、G55D 和 K94I)、D0Mlh-574-18 (V30G、G44D、G55D、H56R 和 K94I)和 D0Mlh_574_19 (V30G、G44D、G55D和K94I)(圖幻。這些變體在MRC5細胞測定中的效價和在BIAcore上對TNFRl的親和力的表征鑒定了進一步的改進(表1)。最有效的dAb是D0Mlh-574-16。
表1 對DOMlh-574親本和在試驗成熟中鑒定的并通過有利突變的重組構建的dAb 的BIAcore親和力和在MRC細胞測定中的效價的總結。D0Mlh_574_16組合了在BIAcore上的最高親和力和在MRC5細胞測定中的最高效價。當未測定數(shù)值時指示(ND)
EC50 測量通過 Graphpad Prism 測定。估計對 DOMlh-574 的 EC5tl 測量是 D0Mlh_574_16 的EC5tl測量的約200倍。
D0Mlh-574-16的物種交叉反應件
抗-TNFRl dAb的顯著優(yōu)勢可為不同物種間的交叉反應性?？紤]到小鼠、狗、食蟹猴和人之間的TNFRl胞外結構域的有限序列保守性(圖6)，對任意抗體或單個可變結構域，以類似的親和力識別這些不同物種的TNFRl將是優(yōu)越的(exceptional)。因此，我們在BIAcore上檢測了 D0Mlh-574-16 結合小鼠 TNFRl (R&D systems 貨號 425-R1-050/CF)，狗 TNFIU (R&D Systems貨號4017-TR-025/CF)和人TNFRl (R&D Systems)的能力。用于小鼠實驗，使用 EZ-Link NHS-LC-LC-生物素(Pierce貨號21343)根據(jù)制造商的說明書生物素化TNFR1， 接著使生物素化的TNFRl結合鏈霉抗生物素包被的BIAcore芯片(小鼠實驗)。用于人和狗 TNFRl，使用胺連接的TNFRl。然后，將D0Mlh_574_16注入人、小鼠和狗TNFRl并在BIAcore 上監(jiān)控結合。圖7和8中顯示了結合不同物種的實例，且結果總結在表2中。很明顯，D0Mlh-574-16證明了與不同TNFRl的高親和力結合，與我們以前描述的(W02008149148)競爭性抗-TNFRl dAb D0Mlh_131_206形成對比，D0Mlh_131_206基本未顯示與小鼠TNFRl的結合并且僅與狗TNFRl非常微弱地結合。表 2 通過 BIAcore 測定的 D0Mlh_131_206 和 D0Mlh_574_16 與小鼠、狗和人 TNFRl 的結合親和力。*=親和力過低無法通過BIAcore測定(> μΜ)
使用Bioevaluation 3. 1軟件包估計數(shù)據(jù)。下一步評估了 D0Mlh-574-16抑制小鼠細胞(L929)的TNFa介導的細胞毒性和抑制食蟹猴細胞(CYNOM-Kl)的TNFa介導的IL-8釋放的效價。標準小鼠和CYNOM-Kl 細胞測定都依照前面(W02006038027)和下面描述的進行。簡單來說，小鼠細胞和100 pg/ml小鼠TNFa在放線菌素D和一定劑量范圍的D0Mlh_574_16的存在下孵育過夜。18小時后，檢測細胞活力并對D0Mlh-574-16濃度作圖。在食蟹猴CYNOM-Kl細胞測定中，在劑量范圍的D0Mlh-574-16的存在下用QOO pg/ml)刺激細胞18小時。孵育后，移取培養(yǎng)基并測定IL-8水平。將中和百分比對D0Mlh-574-16濃度作圖。在2種細胞類型中，D0Mlh_574_16 都能夠有效抑制TNFa介導的效應。其效價在小鼠標準基于細胞的測定中為 250 nM 和在食蟹猴CYNOM-Kl測定中為 10 nM (圖9和10)。這些結果證明D0Mlh_574_16在基于細胞的測定中的功能性物種交叉反應性。DOMlh-574的親和成熟
基于此試驗成熟和組合突變體的結果，決定使用D0Mlh-574-14作為模板用于進一步的親和成熟。盡管此特定dAb不是最有效的，其相比種系DP47框架不具有任何框架突變， 因此被選中。用于親和成熟，通過使用以下寡核苷酸擴增⑶R隨機化D0Mlh-574-14的⑶R AS1(^9 和 AS339 (CDRl)，AS1030 和 AS339 (CDR2)和 AS1031 和 AS339 (CDR3)。使用以下寡核苷酸組合產生用于每個文庫的第二個PCR片段AS1031，和AS9 (CDR1)，AS1032和AS9 (CDR2), AS1033 和 AS9 (CDR3)。使用 SOE PCR (Horton 藥Λ Gene, 77，p61 (1989))組合2個⑶Rl PCR產物以產生⑶Rl文庫，組合⑶R2產物用于⑶R2文庫和組合⑶R3產物用于⑶R3文庫。用于所有反應，然后使用巢式引物AS639和AS65擴增SOE產物并通過SalI/ NotI連接進W02006018650中描述的pIE2aA2載體。隨機化寡核苷酸(AS1029，AS1030和 AS1031)由固定位置(由大寫字母指示和在此情況下100%的寡核苷酸具有在該位置指示的核苷酸)和混合核苷酸組合(由小寫字母指示，在此情況下85%的寡核苷酸將具有在該位置的優(yōu)勢核苷酸和15%將在其余3個核苷酸之間具有平等的分割)構成。使用DNA展示構建體pIE2aA2制備了 3個不同的文庫。使用等分試樣的文庫轉化大腸桿菌并測序。相比親本克隆，親和成熟文庫包含遍布CDR的許多突變。使用在乳劑中的體外分割和通過scArc DNA 結合蛋白的DNA展示進行選擇(見W02006018650)。總共進行了 13輪選擇，同時保持文庫分開。4輪平衡選擇使用20、20、10和10 nM的生物素化人TNFRl (R&D Systems)，接著是7 輪在130 nM非生物素化hTNFRl和5nM生物素化hTNFRl存在下長達150分鐘的解離速率選擇。未標記的hTNFRl是競爭物。也使用合并的文庫進行選擇(共14輪選擇用于合并的文庫)。通過實時PCR測定了在選擇過程中的文庫適度。使用的方法的原理如下通過qPCR 的多克隆群體適度的體外滴定提供了多克隆dAb群體平均親和力的半定量測量，通過在溶液條件中(無基因型-表型連接)的體外表達反應后測量通過表面結合的抗原捕獲的具有 dAb-scArc蛋白的復合物中編碼DNA的量?；厥盏妮斎隓NA的部分越高，多克隆dAb群體越有效。合適的參考點是親本克隆與用無關抗原包被的非特異性表面的結合水平和與用靶抗原包被的表面的特異性結合。在不同選擇階段回收的DNA模板在0. 1 mg/ml RNA溶液中稀釋至1. 7 nM濃度。在10 μ 1體積的補充0. 3 μ 1 100 mM氧化型谷胱甘肽，0. 05 μ 1 340 nM 抗-HA mAb 3F10 (來自 Roche)和 0. 5 μ 1 1. 7 nM DNA 模板的 EcoPro T7 大腸桿菌提取物中進行體外表達反應。用生物素化的hTNFRl靶抗原(0. 1 μ 1 30 μ M儲液/孔) 或BSA陰性對照(0. 1 μ 2 mg/ml儲液/孔)包被Strep ThermoFast板的孔，室溫進行 1 小時，接著用緩沖液 C(10 mM Tris, 100 mM KCl, 0. 05% Tween 20，5 mM MgCl2 禾0 0. 1 mM EDTA)洗3次。體外表達反應在25°C孵育3小時，然后使用緩沖液C稀釋至100 μ 1， 以2個50 μ 1的等分試樣應用于之前用生物素化hTNFRl或BSA包被的Mi^p ThermoFast 板(ABgene，UK)的孔，在室溫再孵育1小時并用緩沖液C洗3次以去除任意未結合的DNA。 使用寡核苷酸 AS79 和 AS80 和 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories,貨號 170-8880)(其根據(jù)制造商的說明書使用)擴增結合的DNA分子，并且擴增循環(huán)是2分鐘 940C，接著是 40 個循環(huán)的 15 秒 94°C，30 秒 60°C和 30 秒 72°C。在 BioRad MiniOpticon Real-Time PCR Machine (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) i^fi^^ffi Bio-Rad Laboratories 提供的 Opticon Monitor version 3. 1.32 (2005)軟件分析DNA 的量。從已知DNA濃度的樣品得到的標準曲線覆蓋從500至切108分子/反應的范圍。直到第10輪選擇時，文庫的適度增加，因為每輪比上一輪回收更多的DNA，指示結合的dAb的平均數(shù)在增加。從此點往后，通過實時PCR測定的回收的DNA水平未見增加，提示更多輪的選擇在dAb 親和力中未得到顯著的進一步改進。第9和14輪的選定群體被克隆進pD0M13載體(見 W02008/149148)，測序，表達并用BIAcore測定在未純化形式中的解離速率常數(shù)。發(fā)現(xiàn)文庫多樣性大大降低了，并具有若干克隆展示改進的(2-3倍)解離速率常數(shù)， 其通過BIAcore dAb上清篩選測定。這些改進的dAb的DNA測序鑒定出D0Mlh_574_25至 D0Mlh-574-40。下面對每個⑶R單獨列出了基于這些dAb鑒定的有利突變(編號根據(jù)Kabat) CDRl V30被有利地突變?yōu)镮、L或F，
⑶R2 S52被有利地突變?yōu)锳或T，
N52a被有利地突變?yōu)镈或E， G54被有利地突變?yōu)锳或R， T57被有利地突變?yōu)镽、K或A， A60被有利地突變?yōu)镈、S、T或K， D61被有利地突變?yōu)镋、H或G， S62被有利地突變?yōu)锳或T， CDR3: ElOO被有利地突變?yōu)镼、V、A、D或S， DlOl被有利地突變?yōu)镋、V、H或K。
最初，克隆D0Mlh-574-30、-31、-38和-39的CDR1+2在小型文庫中與克隆 D0Mlh-574-25、-27、-28、-29和-32的CDR3重組。選擇這些dAb是因為它們代表了在 BIAcore親和力中具有最大改進的dAb和因此組合這些dAb最有可能鑒定出具有提高的親和力的新序列。得到的重組dAb是D0Mlh-574-65至D0Mlh_574_79，和D0Mlh_574_84 至 D0Mlh-574-88，其中 D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)是最有效的。之后使用此 dAb 評估單個氨基酸突變的有效性，通過使用-72作為模板和引入氨基酸改變以產生克隆 D0Mlh-574-89 至 D0Mlh-574-93, D0Mlh-574-109 至 DOMlh-574-149,和 DOMlh-574-151 至 D0Mlh-574-180。大多數(shù)這些克隆被表達、純化和測定在BIAcore上的結合，在MRC5細胞測定中的效價和通過對胰蛋白酶消化的抗性測定蛋白酶穩(wěn)定性。蛋白酶穩(wěn)定性通過孵育在 PBS中的1 mg/ml dAb和遞減量的胰蛋白酶(Promega，V511A胰蛋白酶)測定。在5個不同濃度的胰蛋白酶(34、17、8.5、4.25和2.13 Pg/ml)以及缺乏胰蛋白酶的對照下進行孵育。在37 °C孵育3小時后，通過加入上樣染料終止蛋白水解反應并在LabChip 90 system (Caliper Life Sciences)上測定殘余的未被切割的dAb的量。改進最大的克隆比用于親和成熟的起始dAb，D0Mlh-574-16具有約30倍的效價改進。在MRC5細胞測定中最有效的是D0Mlh-574-109、D0Mlh_574_132、D0Mlh_574_135、D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_156、 DOMlh-574-162 和 D0Mlh-574-180 (圖 11)。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)一方面有關親和力/效價和另一方面有關蛋白酶穩(wěn)定性的結構決定因素是不同的。盡管大多數(shù)列舉的突變將親和力改進至低于nM范圍(通過BIAcore測定)，它們也導致降低的胰蛋白酶抗性(有關測定dAb的蛋白酶穩(wěn)定性的合適測定的更多細節(jié)見W02008149143和W02008149148)。另一方面，突變DlOlV (Kabat編號)非常頻繁地與最佳蛋白酶穩(wěn)定性相聯(lián)系，雖然和任意其他檢測的序列相比以約2倍的dAb親和力的降低作為代價。蛋白酶穩(wěn)定性最高的 dAb 是D0Mlh-574-93、D0Mlh_574_123、D0Mlh_574_125、 DOMlh-574-126、D0Mlh_574_129、D0Mlh_574_133、DOMlh-574-137 和 D0Mlh-574-160 (圖 12)。最有希望的D0M0100 dAb的表征
基于BIAcore結合和MRC5細胞測定效價的數(shù)據(jù)，選擇了 12個D0M0100 dAb的子集以進一步表征與TNFRl的結合動力學，在細胞測定中的效價和生物物理性能。用于所有這些實驗，在大腸桿菌中表達dAb并使用蛋白質A流線型(streamline)純化，接著在PBS 中透析。用于此表征的 12 個 dAb 是:D0Mlh-574-72、D0Mlh-574-109、DOMlh-574-126, D0Mlh-574-133、D0Mlh_574_135、D0Mlh_574_138、D0Mlh_574_139、D0Mlh_574_155、 D0Mlh-574-156,DOMlh-574-162 和 D0Mlh-574-180。在某些實驗中包括 D0Mlh_574_16 作為參考(圖13)。DOMO100 dAb (抗-TNFRl dAb)的結合性能
進行了 BIAcore以測定不同dAb的結合和解離速率并以該方法確定其與人和小鼠 TNFRl的結合親和力。使用各個物種的生物素化TNFRl (R&D Systems)聯(lián)接鏈霉抗生物素包被的BIAcore芯片，接著注入濃度范圍的dAb進行實驗。結果總結在表3中。所有dAb顯示以高親和力結合人TNFRl (KD <350 pM)以及對小鼠TNFRl (KD <7 nM)的良好親和力。考慮到小鼠和人TNFRl之間的有限序列同源性，在人和小鼠TNFRl之間約20倍的dAb親和力中的此差異非常驚人并可能指示靶向受體中的高度保守基序。
表3 :D0M0100 dAb與人和小鼠TNFRl的結合和解離的BIAcore分析。最有效的抗-人TNFRl dAb也傾向于是最有效的抗-小鼠TNFRl dAb,例如D0Mlh_574_138和 DOMlh-574-156。DOMO100 dAb的牛物物理件能
對D0M0100 dAb進一步表征了其生物物理性能，這包括其蛋白酶穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和溶液內狀態(tài)。蛋白酶穩(wěn)定性通過孵育在PBS中的1 mg/ml dAb和遞減量的胰蛋白酶(Promega， V511A trypsin)測定。在5個不同濃度的胰蛋白酶(34，17，8.5，4. 25和2. 13 Pg/ml)以及缺乏胰蛋白酶的對照下進行孵育。在37°C孵育3小時后，通過加入上樣染料終止蛋白水解反應并在LabChip 90 system (Caliper Life Sciences)上測定殘余的未被切割的dAb 的量。將dAb量定量為相對對照反應中存在的量的百分比并總結在表4中。D0M0100 dAb 的穩(wěn)定性使用差示掃描量熱法(DSC)儀器(MicroCal，ΜΑ)測定。在儀器中孵育在PBS中的 1 mg/ml dAb并測定熔解溫度。結果總結在表4中。最后，dAb的溶液內狀態(tài)使用大小排阻層析和多角度激光光散射(SEC-MALLS)測定。將在PBS中的1 mg/ml dAb注入SEC-MALLS 并測定主峰的質量。基于其的溶液內狀態(tài)，D0M0100 dAb可分為2組，單體或二聚體?？偨Y見表4。表4 :D0M0100 dAb的生物物理性能總結。在dAb中組合性能的目的是為了其高胰蛋白酶穩(wěn)定性、高熱穩(wěn)定性和單體的溶液內狀態(tài)以避免受體交聯(lián)和之后的活性激動 (agonism)或缺乏。下表列出了在37°C與34 Pg/ml胰蛋白酶孵育3小時后的殘余活性，以相對t0時的活性的百分比表示。通過DSC測定熔解溫度(Tm)并通過SEC-MALLS測定溶液內狀態(tài)。下表指示胰蛋白酶穩(wěn)定性最高的dAb(DOMlh-574-13;3)是二聚體并因此不適合。具有最佳性能組合的dAb是D0Mlh-574-109、D0Mlh-574-156和D0Mlh_574_162。其中指示的值是未測定的(ND)。
DOMO100 dAb 的功能表征
表征了 D0M0100 dAb的功能活性和物種交叉反應性，使用人MRC-5細胞測定，小鼠細胞測定和如下所述的食蟹猴CYNOM-Kl細胞系。用于人TNFRl信號轉導的功能抑制，將人成纖維細胞系MRC-5與劑量范圍的dAb孵育并然后用200 pg/ml TNFa (Peprotech)(除了在L929測定中使用20pg/ml小鼠TNF a (R&D Systems)以外)刺激18小時。此刺激后， 移去培養(yǎng)基并使用ABI8200 (Applied Biosystems)測定培養(yǎng)基中細胞應答TNF α產生的 IL-8水平。dAb阻止IL-8分泌的能力是其在多大程度上抑制TNFRl介導的信號轉導的功能性讀出。在MRC5細胞測定中檢測12個D0M0100 dAb的結果在表5種顯示。功能性小鼠交叉反應性使用小鼠細胞系測定，其中評估了通過12個DOMO100 dAb對抗TNFa誘導的細胞毒性提供的保護水平。在此測定中，細胞再一次與劑量范圍的dAb孵育，接著用 TNFa在放線菌素的存在下刺激。過夜孵育后，測量細胞活力并對dAb濃度作圖。D0M0100 dAb對抗TNFa細胞毒性并導致在20-40 nM范圍中的ND40值。在人MRC5細胞和小鼠細胞之間觀察到的D0M0100 dAb的效價差異和通過BIAcore測定的親和力的差異具有相似的數(shù)量級。最后，dAb的食蟹猴交叉反應性使用CYNOM-Kl細胞系檢測。簡單地說，dAb和 CYNOM-Kl細胞(ECACC 90071809) (5xl03細胞/孔)在平底細胞培養(yǎng)板上在37°C孵育1小時。加入重組人TNF a (P^rotech)(終濃度200pg/ml)并將板孵育18-20小時。然后在培養(yǎng)上清中使用DuoSet ELISA顯色系統(tǒng)(R&D Systems, catTNFRl DY208)根據(jù)制造商的說明書(文檔號750364. 16版本11/08)測量分泌的IL-8水平。通過dAb濃度對IL-8分泌抑制的百分比作圖測定ND50。D0M0100 dAb的結果顯示在表5中。
表5 :D0M0100 dAb在不同物種的基于細胞的測定中的功能活性總結。所有數(shù)值以在各個細胞測定中測定的ND50值(單位nM)表示，同時ND代表未測定。盡管在MRC5測定中 D0M0100 dAb之間的差異有限，其與在小鼠和食蟹猴細胞測定中觀察到的具有相同的趨勢。 在物種間，DOMlh-574-156、D0Mlh-574-109 和 D0Mlh_574_138 是最有效的 dAb。對 MRC5 測定，我們采用被判斷為S形的曲線。在表中顯示了來自這些曲線的平均值。 DOMO100 dAb 的表位作圖
由于D0M0100 dAb在TNFRl上的結合表位可與作用機制相關，進行了多種努力以確定 TNFRl中的哪些殘基被D0M0100 dAb識別。選擇了 2種實驗方法確定表位1) BIAcore表位競爭和2)使用部分重疊的肽進行肽掃描。
1) BIAcore 表位競爭
測定2個不同抗體或抗體片段之間是否存在對TNFRl上的單個表位的競爭的一種定量方法可通過 BIAcore 進行(Malmborg, J. Immunol. Methods 183，p7 (1995))。為此,在 BIAcore SA-芯片上包被生物素化TNFRl，接著連續(xù)注入不同dAb或抗體以確定每種抗體在缺乏任意競爭抗體(片段)時的結合水平。之后，使用相同濃度的抗體(片段)重復注入，但現(xiàn)在在抗體注入后立刻注入待測定的競爭抗體。結合抗體(片段)被定量為共振單位(RU)并比較存在或缺乏第二種抗體時的結合抗體。如果在2種抗體(片段)之間不存在競爭，在存在或缺乏另一種抗體時結合的RU數(shù)將是相同的。相反地，如果存在競爭，在注入第二種抗體(片段)期間將有很少或沒有結合的RU。對D0Mlh-574-16，結果顯示在存在或缺乏TNFa 競爭性 dAb (DOMlh-I3I-5Il (見 WO2OO8H9144))和 mAb (mAb225 (R&D systems ；貨號 MAB225)時結合的共振單位數(shù)沒有變化。指示相對提及的dAb和mAb的新表位(圖14和15)。 TNFRl是多結構域受體，由4個富含半胱氨酸的結構域組成。結構域2和3負責TNF α結合(Banner #U , Cell, 73，p431 (1993))，而第一個結構域，又稱配體組裝前結構域促進受體與 TNF α 結合前的預組裝(Chan 藥Λ Science, vol 288, p2351 QOOO))。在BIAcore 上與已知 PLAD 結合 mAb 克隆 4. 12，(Supplied by Invitrogen,貨號 Zymed 33-0100)的競爭很有限，結合的克隆4. 12的RU數(shù)在存在D0M0100 dAb (D0Mlh-574-16)時相比其缺乏時顯示了最高20%的降低(圖16)。這指示D0Mlh-574-16識別的表位的絕大部分不被克隆 4. 12識別。顯示與D0Mlh-574-16完全競爭的唯一 dAb是在選擇期間分離的另一個D0M0100 dAb :D0Mlh-510 (圖17)。由于D0M0100 dAb顯示了與小鼠TNFRl的交叉反應性，相同的實驗可在小鼠TNFRl包被的BIAcore芯片上進行以確定是否存在與抗-鼠類TNFR1、非競爭性dAb D0Mlm-21-23 (見W02006038027)的競爭。驚人地，沒有觀察到D0Mlm-21_23和 DOMO100 dAb D0Mlh_574_16之間的競爭(圖18)。D0Mlh_574 dAb與小鼠交叉反應的獨特性能也強調了其肯定是識別了新的表位，因為上述dAb或抗體(D0Mlh-131-511，mAB225,克隆4. 12和D0Mlm-21-23)無一顯示了任何顯著的小鼠/人交叉反應性。2) TNFRl 的肽掃描
為了確定是否TNFRl上的任意線性表位被我們的D0Mlh-574 dAb系識別，合成了用于掃描的15肽，每種肽位移3個殘基以覆蓋TNFRl的完整胞外結構域。這些肽各自含有用于聯(lián)接至i^orteBio Octet儀器(Menlo Park, CA, USA)的不同傳感器末端的生物素基團。ForteBio Octet 儀器使用 Bio-Layer Interferometry (BLI)，一種能夠實時測量分子相互作用的無標記的生物傳感器技術。Octet儀器照射白光至生物傳感器并收集反射回來的光。與生物傳感器末端結合的分子數(shù)的任意變化導致此反射光的干涉圖形的偏移并被實時測定。在我們的實驗中，每個末端用不同的肽包被并與D0Mlh-574-16 dAb孵育并監(jiān)控dAb與每個末端的結合。絕大部分末端顯示了不可信的結合。將3種肽和在BioForte Octet上未顯示任何結合的陰性對照肽一起聯(lián)接至鏈霉抗生物素包被的BIAcore芯片并測定 DOMlh-574-16, D0Mlh_131_511 和 DOMlm-21-23 與這些肽的結合(圖 19、20 和 21)。只有 DOMO100 dAb (D0Mlh-574-16)顯示了與這些特定肽的輕微結合，而其他dAb無一顯示任何結合。在陰性肽對照上未觀察到與任意dAb的結合。3種TNFRl肽可分為2組1)位于結構域 1 的肽 1 (NSICCTKCHKGTYLY)和 2)肽 2 (CRKNQYRHYffSENLF)和 3 (NQYRHYffSENLFQCF)， 其有重疊且位于TNFRl的結構域3。特別地，肽1值得注意，因為除了最后1個殘基以外，此序列對應在小鼠和人TNFRl之間完全保守的TNFRl中唯一的15個連續(xù)的氨基酸殘基段(此保守段具有序列NSICCTKCHKGITL)。與此表位的結合可解釋在D0Mlh_574系中觀察到的小鼠交叉反應性。形式化DOMO100 dAb以延長體內半衰期
為了將D0M0100 dAb用于治療慢性炎癥性疾病，例如RA和銀屑病，可能希望全身遞送 dAb并使其在延長的時間段中有活性。為了實現(xiàn)此目的可使用許多不同的方法，其中包括例如添加PEG部分至dAb，作為與血清白蛋白結合dAb (AlbudAb )基因融合或與IgG的 Fc部分的基因融合表達dAb。對D0M0100 (抗-TNFR1) dAb D0Mlh-574-16檢測了 PEG和 AlbudAb融合二者。1)通過綴合40K(40 KDa)線性PEG延長半衰期
為此創(chuàng)造了 D0Mlh-574-16變體，其在dAb的C-端具有游離半胱氨酸(C-端絲氨酸被取代為半胱氨酸)。在大腸桿菌中表達變體并使用蛋白質A流線型純化。使用馬來酰亞胺化學過程(見W004081026)將40K線性PEG DOffpharma)綴合至此DOMlh-574-16變體的C 端并通過流經FPLC柱凈化。將所述分子命名為DMS0162。在大鼠I3K研究中評估了 PEG綴合延長DMS0162的半衰期的作用。以2. 5 mg/kg的靶劑量對3只雌性Sprague-Dawley大鼠靜脈內施用蛋白質。在施用后0. 17、1、4、8、24、48、72、96、120和168小時從大鼠中采集血樣并測定以確定DMS0162在血液中的量。在用TNFRl-捕獲和山羊抗-hfAb檢測的ELISA 中檢測DMS0162樣品。將測定中的原始數(shù)據(jù)轉化為在每個血清樣品中的藥物濃度。然后在 WinNonLin 分析軟件，例如版本 5.1 (可從Pharsight Corp. , Mountain View, CA94040, USA獲得)中使用無隔分析(NCA)分析了在各個時間點的平均yg/mL值。從這些數(shù)據(jù)得到 DMSO162在大鼠中的平均終末半衰期為20. 4h。2)通過與AlbudAb “的基因融合延長半衰期
a)具有AlbudAb的抗-TNFRl dAb融合物的功能表征
前面我們描述了使用具有白蛋白結合dAb (AlbudAb)的基因融合物延長dAb的體內1 半衰期(見例如W004003019、W02006038027、W02008149148)。這些融合物的理想方面是
1)AlbudAb的融合應當不基本影響TNFRl結合dAb的結合親和力，
2)AlbudAb對來自不同物種的白蛋白的親和力應當為這樣，即可預期1 半衰期的增加。為了評估DOMlh-574-16和不同AlbudAb對，構建了表6中所列的配對(構建體從 N-至 C-端為，抗-TNFRl dAb (即 DOMO100 dAb)-接頭-AlbudAb-myc)。除了 DMSO184 以外都在C-端包含myc標簽，其可能用于檢測目的。表6 抗-TNFRl dAb/AlbudAb融合物的BIAcore解離速率參數(shù)和抗-TNFRl dAb在 MRC5細胞測定中的效價。除了 DMSO184以外，列出的所有dAb/AlbudAb融合物都在AlbudAb 的C-端包含myc標簽。在一些情況下通過BIAcore觀察到與血清白蛋白無結合(NB)，而在其他情況下未測定結合(ND)。在MRC5測定中，一些數(shù)據(jù)常常未能充分地測定以證明引用的值正確(ND*)。
6權利要求
1.一種抗-TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、DOMlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOMlh-574-138 (SEQ ID NO: 4)、D0Mlh_574_162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
2.一種抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述單個可變結構域是包含一個或多個以下突變(根據(jù)Kabat編號)的D0Mlh-574-14 (SEQ ID NO: 10) 突變體位置30是L或F， 位置52是A或T， 位置5 是D或E， 位置M是A或R， 位置57是R、K或A， 位置60是D、S、T或K， 位置61是E、H或G， 位置62是A或T，位置 100 是 R、G、N、K、Q、V、A、D、S 或 V,和位置 101 是 A、Q、N、E、V、H 或 K。
3.一種抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其在第101位(根據(jù)Kabat編號)包含纈氨酸。
4.根據(jù)權利要求3的單個可變結構域，其中所述可變結構域如權利要求1中的定義。
5.任一前述權利要求的單個可變結構域，其包含30G、44D、45P、55D、56R、94I和98R中的一個或多個，其中編號根據(jù)Kabat。
6.一種抗-TNF a 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含30G， 44D, 45P, 55D, 56R, 941和98R中的一個或多個，其中編號根據(jù)Kabat，其中所述單個可變結構域的氨基酸序列在其他位置與D0Mlh-574 (SEQ ID NO: 11;圖5)的氨基酸序列相同。
7.權利要求5或6的免疫球蛋白單個可變結構域，其包含45P、55D、56R、94I和98R，其中編號根據(jù)Kabat。
8.一種抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1),D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574_109 (SEQ ID NO: 3)、D0Mlh-574-132 (SEQ ID NO: 7)、D0Mlh_574_135 (SEQ ID NO: 8),DOMlh-574-138 (SEQ ID NO: 4)、D0Mlh-574-162 (SEQ ID NO: 9)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
9.一種抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、D0Mlh_574_93 (SEQ ID NO: 12)、D0Mlh_574_123 (SEQ ID NO: 13)、D0Mlh-574-125 (SEQ ID NO: 14), D0Mlh-574-126 (SEQ ID NO: 15)或 D0Mlh-574-129 (SEQ ID NO: 16)、D0Mlh_574_133 (SEQ ID NO: 17)、D0Mlh_574_137 (SEQ ID NO: 18)或D0Mlh-574-160 (SEQ ID NO: 19)的氨基酸序列至少94%同一的氨基酸序列。
10.一種抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與 DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、DOMlh-574-125 (SEQ ID NO: 14)、D0Mlh_574_126 (SEQ ID NO: 15)、 DOMlh-574-133 (SEQ ID NO: 17)、D0Mlh_574_135 (SEQ ID NO: 8)、D0Mlh_574_138 (SEQ ID NO: 4)、DOMlh-574-139 (SEQ ID NO: 20)、D0Mlh_574_155 (SEQ ID NO: 21)、 DOMlh-574-162 (SEQ ID NO: 5)或D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列至少95% 相同的氨基酸序列。
11.一種用于結合人、鼠類或食蟹猴monkey)TWRl的抗-TNF a 1型受體 (TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述單個可變結構域由與DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 22)、D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 23)、D0Mlh_574_109 (SEQ ID NO: 109)、 D0Mlh-574-138 (SEQ ID NO: 25), DOMlh-574-162 (SEQ ID NO: 26)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 27)的核苷酸序列至少80%相同的核苷酸序列編碼。
12.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域包含以通過表面等離子體共振測定的500 pM或更低的解離常數(shù)(KD)特異性結合人TNFRl的結合位點。
13.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域包含以通過表面等離子體共振測定的2 χ 10_4 s—1或更低的解離速度常數(shù)(KofT)特異性結合人TNFRl的結合位點。
14.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域特異性結合人、食蟹猴和任選地犬TNFRl。
15.權利要求14的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域結合鼠類TNFR1。
16.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域抑制人、食蟹猴和任選地犬 TNFRl 與 DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_72 (SEQ ID NO: 2)、 D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、D0Mlh_574_138 (SEQ ID NO: 4), DOMlh-574-162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的結合。
17.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域抑制人、鼠類、食蟹猴和任選地犬 TNFRl 與 DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3),D0Mlh-574-138 (SEQ ID NO: 4),DOMlh-574-162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的結合。
18.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域在標準MRC5測定中以約5 nM或更低的ND50中和TNFR1，如通過TNF α誘導的IL-8分泌的抑制所測定的。
19.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域在標準測定中以約150 nM或更低的ND50中和TNFR1，如通過TNF α誘導的細胞毒性的抑制所測定的。
20.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域在標準食蟹猴KI 測定中以約5 nM或更低的ND50中和TNFR1，如通過TNF α誘導的IL-8分泌的抑制所測定的。
21.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域是TNFRl的非競爭性抑制性。
22.權利要求21的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域特異性結合TNFRl的結構域1。
23.權利要求21或22的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域特異性結合人 TNFRl的PLAD結構域。
24.任一前述權利要求的免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述單個可變結構域包含末端半胱氨酸殘基，任選地C-端半胱氨酸殘基。
25.任一前述權利要求的免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述單個可變結構域連接聚亞烷基二醇部分，任選地聚乙二醇部分。
26.一種抗-TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、D0Mlh_574_138 (SEQ ID NO: 4)、 DOMlh-574-162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列相同， 或與選定的氨基酸序列在不超過25個氨基酸位置處不同并具有與所述選定的氨基酸序列的CDRl序列至少50%相同的CDRl序列。
27.一種抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、D0Mlh_574_138 (SEQ ID NO: 4)、 DOMlh-574-162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列相同， 或與選定的氨基酸序列在不超過25個氨基酸位置處不同并具有與所述選定的氨基酸序列的⑶R2序列至少50%相同的⑶R2序列。
28.一種抗-TNF a 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、D0Mlh_574_138 (SEQ ID NO: 4)、 DOMlh-574-162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列相同， 或與選定的氨基酸序列在不超過25個氨基酸位置處不同并具有與所述選定的氨基酸序列的⑶R3序列至少50%相同的⑶R3序列。
29.根據(jù)權利要求沈的一種抗-TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與所述選定的氨基酸序列的CDR2序列至少50%相同的CDR2序列。
30.根據(jù)權利要求沈的一種抗-TNFa1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與所述選定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
31.根據(jù)權利要求27的一種抗-TNFa1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與所述選定的氨基酸序列的CDR3序列至少50%相同的CDR3序列。
32.根據(jù)權利要求31的一種抗-TNFa1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)的CDRl序列至少50%相同的CDRl序列。
33.一種蛋白酶抗性的抗-TNF a 1型受體(TNFR1 ；p55)免疫球蛋白單個可變結構域， 其中當在下述條件下孵育時所述單個可變結構域具有蛋白酶抗性(i)至少10微克/ml濃度(c)的蛋白酶在37°C孵育至少1小時的時間(t)；或(i i )至少40微克/ml濃度(c ’)的蛋白酶在30 V孵育至少1小時的時間(t)，其中所述可變結構域包含與 D0Mlh-574-U6(SEQ ID NO: 15)或 D0Mlh_574_133 (SEQ ID NO: 17)的氨基酸序列至少94%相同的氨基酸序列，并任選地在第101位(Kabat編號) 包含纈氨酸。
34.任一前述權利要求的單個可變結構域，其中所述單個可變結構域具有至少50°C的Tm。
35.一種多肽，其包含如任一前述權利要求定義的免疫球蛋白單個可變結構域和抗體恒定結構域，任選地抗體Fc區(qū)，任選地其中所述Fc的N端連接(任選地直接連接)所述可變結構域的C端。
36.一種多特異性配體，其包含如任一前述權利要求定義的免疫球蛋白單個可變結構域和任選地至少一種特異性結合血清白蛋白(SA)的免疫球蛋白單個可變結構域。
37.權利要求36的多特異性配體，其中所述抗-SA單個可變結構域包含與DOM^1-Il (SEQ ID NO: 28)、D0M7h-ll-3 (SEQ ID NO: 29)、D0M7h-ll_12 (SEQ ID NO: 30)、 D0M7h-ll-15 (SEQ ID NO: 31)、D0M7h_14 (SEQ ID NO: 32)、D0M7h-14_10 (SEQ ID NO: 33)、D0M7h-14-18 (SEQ ID NO: 34)或 D0M7m_16 (SEQ ID NO: 35)的序列至少 80% 相同的氨基酸序列。
38.權利要求36或37的多特異性配體，其中在所述抗-TNFRl單個可變結構域和所述抗-SA可變結構域之間提供接頭，所述接頭包含氨基酸序列AST，任選地ASTSGPS。
39.一種多特異性配體，其包含(i)抗-TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與D0Mlh-574-156(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列至少93%相同的氨基酸序列，(ii)至少一種特異性結合SA的抗血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述抗-SA單個可變結構域包含與DOM^i-11-3 (SEQ ID N0: 29)的序列至少80%相同的氨基酸序列，和(iii)任選地其中在所述抗-TNFRl單個可變結構域和所述抗-SA單個可變結構域之間提供接頭，所述接頭包含氨基酸序列AST，任選地ASTSGPS。
40.一種多特異性配體，其包含(i)抗-TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與D0Mlh-574-156(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列至少93%相同的氨基酸序列，(ii)至少一種特異性結合SA的抗血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述抗-SA單個可變結構域包含與DOM^i-14-lO (SEQ ID N0: 33)的序列至少80%相同的氨基酸序列，和(iii)任選地其中在所述抗-TNFRl單個可變結構域和所述抗-SA單個可變結構域之間提供接頭，所述接頭包含氨基酸序列AST，任選地ASTSGPS。
41.一種TNFRl拮抗劑，其包含任一前述權利要求的單個可變結構域、多肽或多特異性配體。
42.一種TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其包含根據(jù)權利要求33的可變結構域， 其用于口服遞送，遞送至患者的胃腸道，肺部遞送，遞送至患者的肺或全身遞送。
43.一種TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFR1， 所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、 D0Mlh-574-138 (SEQ ID NO: 4)、D0Mlh_574_156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的 CDRl 序列至少 50% 相同的 CDRl 序列。
44.一種TNFal型受體(TNFR1 ；p55)拮抗劑，其用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFR1， 所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、 D0Mlh-574-138 (SEQ ID NO: 4)、D0Mlh_574_156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的 CDR2 序列至少 50% 相同的 CDR2 序列。
45.一種TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFR1，所述拮抗劑具有與 D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3)、 DOMlh-574-138 (SEQ ID NO: 4)、D0Mlh_574_156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的 CDR3 序列至少 50% 相同的 CDR3 序列。
46.根據(jù)權利要求43的一種TNFα 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其具有與所述選定序列的⑶R2序列至少50%相同的⑶R2序列。
47.根據(jù)權利要求43的一種TNFα 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其具有與所述選定序列的⑶R3序列至少50%相同的⑶R3序列。
48.根據(jù)權利要求46的一種TNFα 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其具有與所述選定序列的⑶R3序列至少50%相同的⑶R3序列。
49.根據(jù)權利要求44的一種TNFα 1型受體(TNFR1 ；ρ55)拮抗劑，其具有與所述選定序列的⑶R3序列至少50%相同的⑶R3序列。
50.一種TNFa 1型受體(TNFR1 ；p55)拮抗劑，其用于結合人、鼠類或食蟹猴TNFR1， 所述拮抗劑包含免疫球蛋白單個可變結構域，所述免疫球蛋白單個可變結構域包含選自 D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh-574-109 (SEQ ID NO: 3), DOMlh-574-138 (SEQ ID NO: 4)、D0Mlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、D0Mlh_574_162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的單個可變結構域的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。
51.權利要求41至50中任一項的TNFRl拮抗劑，其用于治療和/或預防炎癥病癥。
52.權利要求41至50中任一項的TNFRl拮抗劑在制備用于治療和/或預防炎癥病癥的藥物中的用途。
53.權利要求51的拮抗劑或權利要求52的用途，其中所述病癥選自關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病和慢性阻塞性肺病。
54.權利要求53的拮抗劑或用途，其中所述關節(jié)炎是類風濕性關節(jié)炎或青少年類風濕性關節(jié)炎。
55.權利要求53的拮抗劑或用途，其中所述炎癥性腸病選自克羅恩病和潰瘍性結腸炎。
56.權利要求53的拮抗劑或用途，其中所述慢性阻塞性肺病選自慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎和肺氣腫。
57.權利要求53的拮抗劑或用途，其中所述肺炎是細菌性肺炎。
58.權利要求57的拮抗劑或用途，其中所述細菌性肺炎是葡萄球菌肺炎。
59.權利要求41至50中任一項的TNFRl拮抗劑，其用于治療和/或預防呼吸道疾病。
60.權利要求41至50中任一項的TNFRl拮抗劑在制備用于治療和/或預防呼吸道疾病的藥物中的用途。
61.權利要求59的拮抗劑或權利要求60的用途，其中所述呼吸道疾病選自肺部炎癥、 慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸性粒細胞浸潤癥、環(huán)境相關肺病、肺炎、支氣管炎、囊性纖維化、間質性肺病、原發(fā)性肺動脈高壓、肺血栓栓塞、胸膜疾病、縱隔膜疾病、 隔膜疾病、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性呼吸窘迫綜合癥、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏、石棉肺、曲霉腫、曲霉病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜酸細胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化、侵略性肺炎球菌疾病、流感、非結核性分枝桿菌、胸膜積液、塵肺病、肺孢子蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著癥、肺炭疽癥、肺水腫、肺栓塞、肺炎癥、肺組織細胞增多病X、肺動脈高壓、肺諾卡氏病、肺結核、肝靜脈閉塞病、類風濕性肺病、肉狀瘤病和韋格納肉芽腫病。
62.權利要求1至50中任一項的抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靴向一個或多個選自 NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYffSENLF 和 NQYRHYWSENLFQCF 的 TNFRl 表位序列。
63.權利要求62的抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于靴向一個或多個選自 NSICCTKCHKGTYLY、NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYffSENLF 和 NQYRHYffSENLFQCF的TNFRl表位序列，以治療和/或預防在權利要求51至62中任一項詳細說明的病癥或疾病。
64.一種在患者中治療和/或預防在利要求51至62中任一項詳細說明的病癥或疾病的方法，所述方法包括對患者施用權利要求1至50中任一項的抗-TNFRl拮抗劑、單個可變結構域、多肽或多特異性配體，其用于在患者中靶向一個或多個選自NSICCTKCHKGTYLY、 NSICCTKCHKGTYL、CRKNQYRHYffSENLF 和 NQYRHYWSENLFQCF 的 TNFRl 表位序列。
65.—種分離的或重組的核酸，其中所述核酸包含與DOMlh-574-156 (SEQ ID NO: 1)、 D0Mlh-574-72 (SEQ ID NO: 2)、D0Mlh_574_109 (SEQ ID NO: 3)、D0Mlh_574_138 (SEQ ID NO: 4)、D0Mlh-574-162 (SEQ ID NO: 5)或 D0Mlh-574-180 (SEQ ID NO: 6)的核苷酸序列至少80%相同的核苷酸序列并且其中所述核酸編碼多肽，所述多肽包含特異性結合人 TNFRl的免疫球蛋白可變結構域。
66.一種多特異性配體，其包含抗-TNF α 1型受體(TNFR1 ；ρ55)免疫球蛋白單個可變結構域和至少一種特異性結合血清白蛋白(SA)的免疫球蛋白單個可變結構域，其中(a)所述抗-TNFRl單個可變結構域包含與DOMlh-574-156(SEQ ID NO: 1)、 D0Mlm-15-12 (SEQ ID NO: 36)或 DOMlm-21-23 (SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列至少 80% 相同的氨基酸；和(b)所述抗-SA單個可變結構域包含與D0M7h-ll-12(SEQ ID NO: 30)或 D0M7h-ll-12dh (SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸；和(c)所述配體包含在所述可變結構域之間的接頭，所述接頭包含氨基酸序列AS或AST。
67.一種多特異性配體，其包含DMS5537 (SEQ ID NO: 39)、DMS5538 (SEQ ID NO: 40)、 DMS5539 (SEQ ID NO: 41)或 DMS5540 (SEQ ID NO: 42)或由 DMS5537 (SEQ ID NO: 39)、 DMS5538 (SEQ ID NO: 40)、DMS5539 (SEQ ID NO: 41)或DMS5540 (SEQ ID NO: 42)組成。
68.一種編碼權利要求66或67的多特異性配體的核酸。
69.一種核酸，其包含與 DMS5537 (SEQ ID NO: 43)、DMS5538 (SEQ ID NO: 44)、 DMS5539 (SEQ ID NO: 38)或DMS5M0 (SEQ ID NO: 9)的核苷酸序列至少80%相同的核苷酸序列。
70.一種包含權利要求68或69的核酸的載體。
71.一種包含權利要求70的載體的宿主，任選地非人胚胎細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗-TNFR1多肽、抗體單個可變結構域(dAb)、拮抗劑和多特異性配體，以及它們的方法和用途。所述抗-TNFR1多肽、抗體單個可變結構域(dAb)、拮抗劑和多特異性配體可用于治療和/或預防炎癥疾病，例如關節(jié)炎或CORD，以及用于肺部施用，口服施用，遞送至患者的肺和遞送至患者的胃腸道。
文檔編號A61K39/395GK102405236SQ201080017330
公開日2012年4月4日 申請日期2010年2月17日 優(yōu)先權日2009年2月19日
發(fā)明者A. 斯圖普 A., 塞普 A., 埃內弗 C., 劉 H., 肖恩 O., 杜菲爾德 S. 申請人:葛蘭素集團有限公司