專利名稱：：活化的白細(xì)胞組合物的制作方法活化的白細(xì)胞組合物相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求享有2009年3月5日提交的名稱為“活化的白細(xì)胞組合物”的第61/209，298號(hào)申請(qǐng)和2009年4月1日提交的名稱為“用于血管機(jī)能不足的活化的白細(xì)胞組合物”的第61/211，587號(hào)申請(qǐng)的權(quán)益，其公開(kāi)的內(nèi)容在此通過(guò)引用并入本文。
背景技術(shù)：
：傷口愈合過(guò)程涉及白血細(xì)胞(也被稱為白細(xì)胞)的參與。白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。三種常見(jiàn)的淋巴細(xì)胞類型是τ細(xì)胞、B細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。T細(xì)胞和B細(xì)胞在體內(nèi)抗原識(shí)別中發(fā)揮重要作用(Parkin，2001)。天然殺傷(NK)細(xì)胞通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)水平的變化識(shí)別被感染的細(xì)胞，并殺死被感染的細(xì)胞(Moretta，2008)。愈合過(guò)程中淋巴細(xì)胞的參與在很大程度上與其產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子有關(guān)(Keen，2008)。已經(jīng)描述了皮膚中的一類新型Y-δ-T細(xì)胞(Jameson，2002.Havran，2005)。粒細(xì)胞的不同類型是嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。單核細(xì)胞分化成為巨噬細(xì)胞，后者負(fù)責(zé)清除組織碎片或者侵入的外源物質(zhì)。巨噬細(xì)胞還產(chǎn)生控制炎癥和修復(fù)的分子(Riches，1996)。傷口愈合過(guò)程存在3個(gè)重疊的時(shí)期(Li，2007；Broughton,2006,-Tsirogianni，2006；Singer,1999；Martin,1997)。第一個(gè)時(shí)期是炎癥期。其特征是招募嗜中性粒細(xì)胞，隨后招募單核細(xì)胞至傷口位點(diǎn)，在此處將細(xì)菌殺死并吞噬(Agaiby，1999)。傷口愈合的第二個(gè)時(shí)期被稱為增殖期，其涉及形成新的肉芽組織。成纖維細(xì)胞增殖并遷移至傷口區(qū)域，合成膠原和其他胞外基質(zhì)組分(Greiling，1997)。同時(shí)發(fā)生血管新生，為代謝活躍的新肉芽組織提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣(Tormesen，2000)。完整表皮中的角化細(xì)胞開(kāi)始遷移經(jīng)過(guò)臨時(shí)基質(zhì)并開(kāi)始增殖，為新的上皮組織做準(zhǔn)備(Kim，1992)。重塑是傷口愈合中的第三個(gè)和最后一個(gè)時(shí)期。其特征是成纖維細(xì)胞分化成為肌成纖維細(xì)胞，后者相互接觸并使傷口邊緣更加接近(Tomasek，2002)。通過(guò)降解和重新合成而進(jìn)行的膠原纖維重塑通過(guò)膠原纖維的重新定位(由細(xì)胞因子嚴(yán)密控制的過(guò)程)使得傷口獲得強(qiáng)度(Werner，2003)。處理傷口的挑戰(zhàn)通常在患有多種病癥(例如糖尿病、冠狀動(dòng)脈疾病和高血壓)的患者中復(fù)雜化。由于多種生理?xiàng)l件，這些疾病具有使血管并發(fā)癥惡化的共同效應(yīng)。傷口的并發(fā)癥可以導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增加(Doshi，2008)。常規(guī)的傷口處理包括外科清創(chuàng)術(shù)、抗生素治療和多種敷料(Moran，2008；Fonder,2008)。抵御常規(guī)處理的傷口也被稱為難治性傷口。這些傷口使得生活質(zhì)量下降，并可以導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增加。因此，對(duì)有效的傷口愈合組合物和方法的需求持續(xù)存在。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)方面是針對(duì)制備來(lái)源于血液的活化的白細(xì)胞組合物(ALC)(例如從全血樣品中可獲得或者已經(jīng)獲得)的方法。該方法包括將白細(xì)胞(可以從人全血中獲得)在一定溫度下第一孵育一段時(shí)間的步驟，這使得白細(xì)胞開(kāi)始活化，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述孵育是于室溫進(jìn)行大約8至大約20小時(shí)。孵育后，使白細(xì)胞與生理上可接受的水溶液(例如無(wú)菌蒸餾水)相接觸，以引發(fā)低滲休克，隨后使休克的白細(xì)胞與生理上可接受的鹽溶液相接觸，以恢復(fù)等滲性。該活化的白細(xì)胞組合物(ALC)可以用于治療。但是，在一些實(shí)施方案中，與白細(xì)胞的第一孵育分開(kāi)和基本同時(shí)，與白細(xì)胞孵育的同時(shí)使可以從相同或者不同的全血樣品中(即從相同或者不同的人中)獲得的血漿樣品與凝固劑于37°C相接觸，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接觸是大約8至大約20小時(shí)，隨后從已凝固的血漿樣品中分離血清。將白細(xì)胞重懸于從已凝固的血漿樣品中收集的血清中，因而形成ALC。第一孵育后，可以將白細(xì)胞進(jìn)一步于37°C第二孵育大約60至大約120分鐘。本發(fā)明的另一個(gè)方面是針對(duì)來(lái)源于血液的ALC。從其中存在的白細(xì)胞群方面來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的活化的白細(xì)胞組合物包含大約40%至大約90%的粒細(xì)胞、大約5%至大約20%的單核細(xì)胞和大約5%至大約30%的淋巴細(xì)胞(基于ALC中白細(xì)胞的總體數(shù)量)。如實(shí)施例中所顯示，還可以從白細(xì)胞的最低產(chǎn)率(相對(duì)于全血樣品)、白細(xì)胞的活力和粒細(xì)胞的最低活化水平(例如如CDllb所表示)方面對(duì)本發(fā)明的ALC進(jìn)行表征和鑒定。ALC進(jìn)一步包含殘留水平的血小板(大約46.8+/-39.2(ΙΟ3/μ1)的量)和ALC紅血細(xì)胞(大約0.1+/-0.06(106/μ1)的量)。淋巴細(xì)胞群可以包含大約至大約25%的B細(xì)胞(⑶19+)、大約20%至大約30%的NK細(xì)胞(⑶3-/⑶56+)、大約40%至大約60%的T細(xì)胞(⑶3+)、大約0.1%至大約30%的NKT細(xì)胞⑶3+/⑶56+、大約8%至大約20%的輔助性T細(xì)胞(⑶4+/⑶3+)和大約20%至大約30%的⑶8+/⑶3+細(xì)胞。可以將細(xì)胞懸浮于載體(例如血清(相對(duì)于受體可以是自體的或者同種異體的))或者適于儲(chǔ)存和對(duì)細(xì)胞施用的某些其他生理上可接受的iso-標(biāo)準(zhǔn)液體中，例如用于恢復(fù)等滲性的溶液。而本發(fā)明的另一個(gè)方面是針對(duì)促進(jìn)傷口愈合的方法，其包括對(duì)傷口施用或者應(yīng)用ALC。與含有白血細(xì)胞的至少一種已知的傷口愈合組合物相比，本文公開(kāi)的發(fā)明達(dá)到了幾個(gè)出乎意料的結(jié)果。如本文實(shí)施例中所描述，這些結(jié)果包括白細(xì)胞(WBCs)的產(chǎn)量和活力增加，以及活化的粒細(xì)胞的百分比較高。還可以相信，本文公開(kāi)的發(fā)明包括較高百分比的活化的單核細(xì)胞和與⑶8T細(xì)胞相比百分比相對(duì)較高的⑶4T細(xì)胞。附圖簡(jiǎn)述圖1圖解描述了用于生產(chǎn)本發(fā)明ALC組合物的代表性系統(tǒng)的第一部分，其包括袋A-C(第1組)，其是血液儲(chǔ)存袋或者容器，其中袋A含有充滿的從供體中收集的紅血細(xì)胞；袋B含有血漿；和袋C含有白細(xì)胞(最初從全血中分離后形成一個(gè)層，通常被稱為血沉棕黃層)。圖2圖解描述了用于生產(chǎn)本發(fā)明ALC組合物的代表性系統(tǒng)的第二部分，其包括7個(gè)袋的組，將含有RBC的袋A從系統(tǒng)中去除后，圖1中的袋B和C與袋1-5(第2組)焊接。圖3A和;3B是說(shuō)明⑶62L和⑶42b(細(xì)胞活化的指示物)表達(dá)的總體趨勢(shì)的圖。發(fā)明詳述本文中的血液定義為全血或者其任意組成成分(例如血漿、白細(xì)胞、血小板或者紅血細(xì)胞)。本發(fā)明ALC中存在的血小板和紅血細(xì)胞的量低于全血中存在的量。本文中與任何和所有數(shù)值(包括數(shù)值范圍的上限和下限)相連使用的術(shù)語(yǔ)“大約”是具有可接受偏離范圍的任何數(shù)值，所述范圍是+/-0.5%至+/-20%(和其間的數(shù)值，例如士1%、士1.5%、士2%、士2.5%、士3%、士3.5%、士4%、士4.5%、士5%、士5.5%、士6%、士6.5%、士7%、士7.5%、士8%、士8.5%、士9%、士9.5%、士10%、士10.5%、士11%、士11.5%、士12%、士12.5%、士13、士13.5%、士14%、士14.5%、士15%、士15.5%、士16%、士16.5%、士17%、士17.5%、士18%、士18.5%、士19%、士19.5%和士20%)。用于生產(chǎn)本發(fā)明ALC的起始材料可以從幾種來(lái)源獲得?？梢詮淖泽w或者同種異體來(lái)源獲得全血或者其一種或多種組分(例如白細(xì)胞和血漿)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，從最終用ALC處理的患者中收集血液樣品，所述血液樣品在本文中是指自體血液樣品或者來(lái)源。在從非預(yù)期ALC受體的個(gè)體中獲得來(lái)源(即血液或者其組分)(是指同種異體血液樣品或者來(lái)源)的實(shí)施方案中，這些起始材料可以便利地從血庫(kù)中獲得。由血庫(kù)對(duì)樣品進(jìn)行血型(AB0、Ih)、紅細(xì)胞抗原的不規(guī)則抗體和輸血可傳染性疾病(transfusion-transmittabledisease)的篩選。更具體地，可以使用AbbottPRISM儀器利用乙型肝炎、丙型肝炎、HIV1/2、HTLV和梅毒的抗體(-HCV、HbsAg、抗-HIV1/20+和抗-HTLVI/II)進(jìn)行篩選。還可以利用分子方法(NAT-NucleicAcidTesting)對(duì)樣品進(jìn)行HIV、HCV和HBV的篩選。分子篩選可以利用市售儀器(例如Chiron的TIGRIS系統(tǒng))進(jìn)行。在涉及同種異體來(lái)源的這些實(shí)施方案中，樣品可以從與預(yù)期ALC受體具有相同血型的供體中獲得?？蛇x地和如本文中進(jìn)一步描述的，可以從具有AB+血液的供體中獲得血漿樣品，從具有0-血液的患者中獲得白細(xì)胞。具有AB+血液的患者是血漿的全適供體，具有0-血液的患者是白細(xì)胞的全適受體。不管來(lái)源如何，無(wú)需高度專業(yè)化的設(shè)備即可對(duì)樣品進(jìn)行所有必要的處理。制備本發(fā)明ALC組合物的一種優(yōu)選方法利用圖1和圖2進(jìn)行描述，其中說(shuō)明了含有兩組相互連接的無(wú)菌輸液袋的系統(tǒng)。該系統(tǒng)是密封的，以使其不暴露于外部環(huán)境中。具體地,利用無(wú)菌連接設(shè)備(SterileConnectingDevice，例如，TSCD_II，Terumo產(chǎn)品號(hào)ME-203AH)將連接兩個(gè)組的導(dǎo)管焊接到一起，以形成一個(gè)系統(tǒng)。更具體地，為了保證符合無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)將特殊晶圓預(yù)加熱至300°C，來(lái)進(jìn)行導(dǎo)管的焊接和切割。這種高溫增加了焊接步驟的無(wú)菌性。為了進(jìn)一步保證無(wú)菌，可以在100級(jí)的生物安全柜中在100，000級(jí)的阻隔區(qū)內(nèi)進(jìn)行焊接。如這些圖中所說(shuō)明，該系統(tǒng)含有兩個(gè)無(wú)菌袋組。第1組含有袋A、B和C，是通常用于輸血的標(biāo)準(zhǔn)市售三袋組。通過(guò)靜脈穿刺并置于袋A中，將人血液樣品(通常體積為大約400至大約550ml)收集于血庫(kù)中，接著利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使其分級(jí)成各組分至袋A、B和C中。例如，將含有血液樣品的袋A離心。離心后，例如利用Baxter生產(chǎn)的血液組分提取器使血液組分分離。將含有白細(xì)胞的血沉棕黃層置于袋C中，血漿置于袋B中，紅細(xì)胞保留于袋A中。因此，該過(guò)程之后，袋A含有充滿的紅細(xì)胞；袋B含有血漿；和袋C含有含有白細(xì)胞(還可能含有殘留的血漿和紅細(xì)胞)的血沉棕黃層?？蛇x地，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的血液分離技術(shù)使血液組分分離。接著將袋A從三袋組中分離。如圖2中所說(shuō)明，接著將袋B和袋C焊接至定制的輸液袋1_5(第2組)上，以形成用于制備活化的白細(xì)胞組合物的系統(tǒng)。袋1含有第一水溶液(例如200ml無(wú)菌蒸餾水)，其用于使血沉棕黃層中的細(xì)胞發(fā)生低滲休克。這使得可能存在的殘留紅細(xì)胞裂解。袋2含有第二溶液(例如20ml氯化鈉緩沖液(8.91%NaCl,USP)，或者含有無(wú)機(jī)離子的任何其他生物上可接受的溶液、有機(jī)滲透物(例如蔗糖)或者其組合(例如乳酸林格(Hartmans)溶液))，其用于使白細(xì)胞在低滲休克后恢復(fù)等滲性。當(dāng)將氯化鈉溶液加入到200ml蒸餾水中時(shí)，其成為0.9%的NaCl溶液。袋3含有第三溶液(例如大約60ml氯化鈣緩沖液(1.17%CaCl2，二水合物，USP))，其用于使袋B中的血漿凝固，有助于分離成為血小板和血清。袋4和袋5分別含有大約60ml和大約500ml的無(wú)菌過(guò)濾空氣。將該組包裝成單個(gè)部件，并利用高壓蒸汽滅菌，這大大降低了患者繼發(fā)性感染的風(fēng)險(xiǎn)。接著將白細(xì)胞從袋C轉(zhuǎn)移至袋4(或者袋幻中并進(jìn)行孵育，優(yōu)選處于垂直位置，以使其活化。為了本發(fā)明的目的，細(xì)胞活化定義為使細(xì)胞(白細(xì)胞)開(kāi)始活化的過(guò)程，更具體地，定義為從靜態(tài)至功能活化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，其中伴有生物活性物質(zhì)的合成或者預(yù)先合成的物質(zhì)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜或者釋放到細(xì)胞外。這些物質(zhì)可以包括蛋白或者多肽、脂類、糖、氧自由基和用作粘附分子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、酶、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞信號(hào)受體和介導(dǎo)物的其他生化部分。當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)部或者細(xì)胞表面被檢測(cè)和鑒定時(shí)，這些分子被稱為活化標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使白細(xì)胞保持于室溫中，對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單孵育。為了本發(fā)明的目的，室溫是指范圍為大約12°C至大約的溫度，在一些實(shí)施方案中，是大約16°C至大約25°C。孵育時(shí)間根據(jù)溫度而變化。在較高溫度下孵育時(shí)間較低。使白細(xì)胞活化所需的孵育時(shí)間大體上與進(jìn)行孵育的溫度成反比。例如，在使白細(xì)胞保持于室溫中的實(shí)施方案中，孵育時(shí)間總體上從大約90分鐘和上至2、3、4、5、6、7或者8小時(shí)至大約20小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，孵育時(shí)間是大約8至大約20小時(shí)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，白細(xì)胞的孵育于18°C至大約進(jìn)行大約8小時(shí)至大約12小時(shí)。在其他實(shí)施方案中，白細(xì)胞的孵育包括對(duì)其進(jìn)行加熱，例如在高于室溫的溫度下，高至大約37°C。較高溫度下的孵育時(shí)間一般是大約5小時(shí)至大約M小時(shí)。再次參考圖2，將袋C中的白細(xì)胞轉(zhuǎn)移至通常小于袋C(例如大約250ml-大約500ml)的袋4中。還可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)500ml的袋(袋5)中。為了使白細(xì)胞活化，將袋4(或者袋5)置于垂直位置并于室溫孵育大約8至大約20小時(shí)。孵育后，對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行低滲休克，這使得紅細(xì)胞溶解。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，立即進(jìn)行低滲休克(即前述步驟完成后，不進(jìn)行間隔步驟或者不必要的耽擱，通常少于2分鐘)?？梢酝ㄟ^(guò)將蒸餾水從袋1轉(zhuǎn)移至含有白細(xì)胞的袋4(或者袋幻中，開(kāi)始進(jìn)行低滲休克。低滲休克處理通常進(jìn)行大約45秒。該步驟后，優(yōu)選其后立即通過(guò)將氯化鈉溶液從袋2轉(zhuǎn)移至袋4(或者袋幻中，使等滲性恢復(fù)。氯化鈉溶液與細(xì)胞水懸浮液的體積比通常是大約110。接著將袋4中的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至體積大于袋4的袋1(或者袋5的左側(cè))中。如上面所描述，該組合物在本發(fā)明的方法中可以用于治療。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括至少一個(gè)額外的步驟。因此，在可以與白細(xì)胞孵育同時(shí)進(jìn)行的分離步驟中，通過(guò)利用凝固劑(例如CaCl2)隨后離心，使血漿分離成為血小板和血清。因此，在該代表性實(shí)施方案中，將袋3的CaCl2R移至袋B中。通常使含有血漿和CaCl2組合物的袋B在大約37°C的溫度下凝固。血漿與凝固劑在基本上與白細(xì)胞孵育時(shí)間相同的一段時(shí)間內(nèi)保持接觸。白細(xì)胞低滲休克和等滲性恢復(fù)并隨后將袋4中的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至袋1中(或者保留于袋5中)后，以及袋B中的血漿凝固后，將整個(gè)7袋系統(tǒng)離心。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將白細(xì)胞轉(zhuǎn)移至袋1中(或者保留于袋5中)后立即進(jìn)行離心，以使細(xì)胞不會(huì)發(fā)生溶血。離心后，將袋1(或者袋幻的上清液轉(zhuǎn)移至袋C中，并將離心后袋1(或者袋幻中形成的白細(xì)胞沉淀重懸于大約20ml至大約50ml袋B中的血清中。而在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)步驟中，在制備最終組合物前，使白細(xì)胞在上面提到的已凝固的血漿中進(jìn)行孵育。通常該第二孵育期于37°C進(jìn)行大約1-2小時(shí)。在其他實(shí)施方案中，可以從較小體積的血液樣品中制備ALC組合物，其中所有溶液的體積相應(yīng)減少并使用較小的袋。此外，使用這些大小不同的袋產(chǎn)生具有不同組成的ALC。甚至在這些實(shí)施方案中，可以使用同種異體或者自體的血液樣品作為起始材料。使用較小體積為臨床醫(yī)師提供了不必利用外部血庫(kù)而進(jìn)行自主血液收集的能力，例如在緊急情況時(shí)對(duì)具有健康免疫系統(tǒng)但患有某些類型的外傷傷口的患者進(jìn)行治療(例如戰(zhàn)場(chǎng)和戰(zhàn)斗情況)。在這些實(shí)施方案中，提供對(duì)可傳染疾病和抗原的測(cè)試。但是在這些情況下，具有難治性傷口的患者不是制備有效ALC的臨床上可接受的血液供體。當(dāng)發(fā)生這種情況時(shí)，通過(guò)本文中描述的方法從同種異體供體中產(chǎn)生ALC。本發(fā)明的ALC包括白細(xì)胞，例如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。粒細(xì)胞包括嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。從其最廣泛的意義來(lái)說(shuō)，ALC的白細(xì)胞群包含大約40%至大約90%的粒細(xì)胞、大約5%至大約20%的單核細(xì)胞和大約5%至大約30%的淋巴細(xì)胞。細(xì)胞的特定量基于所實(shí)施的分析技術(shù)而不同。當(dāng)利用FACS(例如利用側(cè)向散射對(duì)前向散射散點(diǎn)圖分析)進(jìn)行分析時(shí)，白細(xì)胞組合物一般包含大約55%至大約80%的粒細(xì)胞、大約5%至大約15%的單核細(xì)胞和大約5%至大約30%的淋巴細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，包含大約58-76%的粒細(xì)胞、大約5-11%的單核細(xì)胞和大約9-23%的淋巴細(xì)胞。當(dāng)利用CellDyn分析儀進(jìn)行分析時(shí)，白細(xì)胞組合物一般包含大約50%至大約90%的粒細(xì)胞、大約5%至大約15%的單核細(xì)胞和大約10%至大約25%的淋巴細(xì)胞。ALC中的淋巴細(xì)胞亞群經(jīng)確認(rèn)包含大體范圍如下的下列細(xì)胞大約7%至大約25%的B細(xì)胞(⑶19+)、大約20%至大約30%的NK細(xì)胞(⑶3-/⑶56+)、大約40%至大約60%的T細(xì)胞(⑶3+)、大約0.1%至大約30%的NKT細(xì)胞⑶3+/⑶56+、大約8%至大約20%的輔助性T細(xì)胞(⑶4+/⑶3+)和大約20%至大約30%的⑶8+/⑶3+細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞亞群富含至少9%的CD56+細(xì)胞(CD3-/CD56+、CD3+/CD56+、CD3+/CD56+/CD8+)，輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+/CD3+)的量降至少于20%，和/或輔助性T細(xì)胞與抑制性T細(xì)胞(CD4+/CD3+CD8+/CD3+)的比率小于0.8。具有傷口的患者可以是生理上缺乏免疫力的或者是健康的。例如，由于代謝系統(tǒng)已經(jīng)受損，糖尿病和其他醫(yī)學(xué)上缺乏免疫力的患者是來(lái)源于異源血液之ALC的候選者，因?yàn)槠渥陨淼陌准?xì)胞對(duì)于該方案不是最佳的。但是，如在外傷患者的實(shí)施例中，健康患者也是本發(fā)明ALC組合物的適宜候選者。本發(fā)明可用于促進(jìn)大量類型的傷口愈合。盡管在實(shí)踐中可以與其他治療形式結(jié)合使用，但是其并不需要其他治療形式來(lái)達(dá)到有效的傷口愈合。發(fā)明人已經(jīng)考慮將ALC施用于任何類型的傷口，并且預(yù)料可以治療的傷口類型不限。容易施用(例如利用標(biāo)準(zhǔn)注射器或者類似的施用設(shè)備)使得本發(fā)明的ALC組合物安全并且易于使用?？梢杂帽景l(fā)明處理的傷口通常是有生命的組織的刺傷、切口或者撕裂形式。皮膚傷口可以穿透表皮、真皮，或者在全皮層受損傷口的情況中穿透皮下組織。因此，可以用本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行治療的傷口的代表性類型包括褥瘡或者壓力性潰瘍、糖尿病性潰瘍、深部胸骨傷口(例如開(kāi)胸手術(shù)(冠狀血管再生并獲取大隱靜脈后對(duì)大隱靜脈進(jìn)行)后)以及腹腔手術(shù)和任何其他類型的手術(shù)后的術(shù)后傷口。其他傷口是外傷引起的那些傷口，所述外傷例如通過(guò)槍擊、刀或者能夠產(chǎn)生皮膚切口或者撕裂的任何其他物體?？谇?例如牙齒)傷口，以及作為藥物的副作用或者作為多種病癥的癥狀出現(xiàn)的傷口(例如與卡波劑氏肉瘤(Kaposi’sSarcoma)相關(guān)的瘡)，以及內(nèi)部傷口(例如肛裂和胃腸道傷口或者損傷(例如胃或腸潰瘍))也可以用本發(fā)明進(jìn)行治療。ALC還可以用于治療由血管功能不足惡化的任何傷口。為了本發(fā)明的目的，血管功能不足是指血液循環(huán)不足，導(dǎo)致其不足以充滿受損區(qū)域。這種不足可以由外傷(例如骨折附近的脈管損傷)或者多種病癥(例如糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化)引起。在另一種情況下，無(wú)論是外傷或者疾病誘導(dǎo)，血管功能不足使傷口有效愈合的可能性降低。ALC可以用于促進(jìn)這些患者中的傷口愈合效果，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)本文中描述的方法施用。此外，治療方案不應(yīng)當(dāng)受到嚴(yán)重性或者傷口類型或者血管功能不足程度的限制。ALC對(duì)于表現(xiàn)出最嚴(yán)重的傷口和血管功能不足的患者更加有效。大體上，通過(guò)將ALC—次或者多次直接注射到傷口或者傷口周圍的組織中，來(lái)施用活化的白細(xì)胞組合物?？梢詫LC直接施用到開(kāi)放性傷口中。對(duì)于注射到傷口中，優(yōu)選使用Luer-Lock注射器或者在注射器和針頭之間具有鎖定機(jī)制的任何其他市售注射器。傷口特別是壓力性傷口的生物學(xué)區(qū)域通常是有限。當(dāng)注射到傷口中時(shí)，存在壓力使注射器與針頭分離的風(fēng)險(xiǎn)。利用鎖定注射器消除了這種風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)不能注射到傷口組織時(shí)，可以將ALC直接施用到傷口的洞中。使用該方法可以通過(guò)用注射器或者管直接施用?？梢栽诜罅系膸椭聦LC施用至傷口位點(diǎn)或者其周圍。干性敷料包括紗布和繃帶、非膠粘網(wǎng)篩、膜和箔、泡沫和組織粘合劑。保濕隔離敷料包括膏、乳液和軟膏、不可透或者半透膜或箔、水膠體、水凝膠和組合產(chǎn)品。生物活性敷料包括抗菌敷料、交互式敷料、單組分生物敷料和組合產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，用在ALC中浸泡過(guò)的無(wú)菌紗布包扎傷口?？梢杂媒M合物(例如乳酸林格(Hartman)溶液、含有藻酸鹽的敷料、聚氨酯敷料或者羥甲基化纖維素敷料)使敷料(例如無(wú)菌紗布?jí)K)浸透，所述組合物覆蓋傷口，隨后施用干性敷料。如果傷口對(duì)象高度感染，接著可以施用銀敷料，例如Silverlon。注射后敷料的選擇基于臨床醫(yī)生的決定。市售、以前臨床成功的經(jīng)驗(yàn)和患者耐受力均是選擇傷口敷料時(shí)需要考慮的因素?？梢灾芷谛缘?例如通常大約M小時(shí)后)移除敷料，以沖洗傷口(例如用無(wú)菌水和肥皂)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將組合物置于生理惰性和/或可吸收的基質(zhì)或者支架(例如膠原)上，并利用壓配合插入傷口中。這使得可以將ALC持續(xù)遞送到位點(diǎn)中，使患者受益，因?yàn)榧?xì)胞在原位存活時(shí)期較長(zhǎng)?？梢詫?duì)傷口施用一次或者多于一次的ALC組合物，例如4周后，一旦臨床醫(yī)生確定再次施用是否是必要的。需要考慮的因素包括傷口面積(寬度、長(zhǎng)度和深度)的增加、化膿、發(fā)熱或者表明有必要進(jìn)行再次治療的頑固性感染的任何其他標(biāo)志或者癥狀。除了再次治療之外，在臨床醫(yī)生認(rèn)為合適的任何時(shí)刻均可以推薦進(jìn)行外科清創(chuàng)術(shù)。ALC可以與任何其他常規(guī)傷口治療方法結(jié)合使用，例如升溫(治療性加熱)、電刺激、磁療、激光冶療、擺線振動(dòng)治療和超聲波。其還可以與生物療法結(jié)合使用，例如蛆療、皮膚替代、培養(yǎng)的角蛋白形成細(xì)胞(Epicel,Genzymebiosurgery)、人真皮替換(Dermagraft，SmithandNephewhe·)、尸源加工真皮(Alloderm，LifeCellCorporation)、雙層皮膚等同物(Apligraf,OrganogenesisInc.)>TransCyte(SmithandNephewInc.)、生長(zhǎng)因子(PDGF是唯一批準(zhǔn)局部使用的生長(zhǎng)因子)和血纖蛋白粘合劑。在一些實(shí)施方案中，ALC與由KCI生產(chǎn)的市售傷口療法VAC結(jié)合使用。VAC通過(guò)對(duì)傷口實(shí)施負(fù)壓來(lái)促進(jìn)傷口愈合。在這些實(shí)施方案中，傷選在VAC治療之前對(duì)傷口施用ALC。而在其他實(shí)施方案中，ALC與高壓氧治療(Thacldiam，2008)結(jié)合使用。例如，在患者接受高壓氧治療之前對(duì)傷口施用ALC。ALC還可以與低能休克波治療(例如，大約0.lmj/mm2的脈沖；每厘米傷口長(zhǎng)度5Hz)結(jié)合使用。參見(jiàn)例如Dumfarth等，Ann.Thorac.Surg.86:1909-13(2008)。治療后，可以對(duì)傷口的長(zhǎng)度、寬度和高度測(cè)量值進(jìn)行評(píng)估。通常，當(dāng)所有這些參數(shù)測(cè)量值均可忽略不計(jì)時(shí)，認(rèn)為傷口已經(jīng)愈合。ALC還提供鎮(zhèn)痛作用。該活化的白細(xì)胞組合物特別用于包括糖尿病性足潰瘍和褥瘡的傷口中。褥瘡是由血液流動(dòng)不良引起的壓力性潰瘍，通常是由于特定區(qū)域上的長(zhǎng)時(shí)間壓力(Berlowitz，2007)。褥瘡在老年人中發(fā)病并且致死。至少48%的IV期壓力性潰瘍?cè)谥委熞荒旰笕晕粗斡?Girouard，2008)?；加腥殳彽幕颊哌€通常患有共病病癥(co-morbidpathologies)，例如糖尿病和高血壓。這些病癥使褥瘡的成功治療進(jìn)一步復(fù)雜化。在治療褥瘡的一個(gè)實(shí)施方案中，利用18針規(guī)(18G)的針將組合物吸入任何大小的注射器中。緩慢吸入，以使對(duì)細(xì)胞的損傷最小化。盡管注射器和針的大小不受任何限制，優(yōu)選吸入時(shí)使用大針規(guī)的針。這有助于轉(zhuǎn)移并且減少細(xì)胞損傷。對(duì)潰瘍施用活化的白細(xì)胞組合物包括將組合物注射到傷口中?？梢允┯米⑸淦髦械娜繕悠?，而且臨床醫(yī)生可以選擇施用額外的ALC，如果基于臨床參數(shù)確定這是必要的。將吸入時(shí)使用的18G針調(diào)換成大小為22-35G的針?？梢詫LC注射到傷口的多個(gè)位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在傷口總長(zhǎng)度的大約每1厘米至大約每3厘米進(jìn)行注射。在每個(gè)注射位點(diǎn)注射0.1-0.3ml的ALC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將整個(gè)注射器一次注射到傷口內(nèi)部單個(gè)位點(diǎn)中。將根據(jù)下面非限定性實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的方面進(jìn)行描述。實(shí)施例實(shí)施例1-細(xì)胞活化的分析通過(guò)分析多種細(xì)胞表面標(biāo)記物，對(duì)根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案制備的活化的白細(xì)胞組合物進(jìn)行定量。根據(jù)P-選擇素的表達(dá)所顯示的血小板與單核細(xì)胞或者粒細(xì)胞的凝集增加是單核細(xì)胞和粒細(xì)胞活化的標(biāo)志。CD62L是活化過(guò)程中消失的質(zhì)膜蛋白，因而隨著細(xì)胞活化而減少。CD42b是作為凝固因子參與凝固過(guò)程的血小板活化標(biāo)志物。其與胞外基質(zhì)以及粘附分子相互作用，并且在本發(fā)明中還用作單核細(xì)胞和粒細(xì)胞活化的指示物。在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行取樣新鮮的血沉棕黃層(Fr.BC)、經(jīng)孵育的血沉棕黃層(IBC)和最終活化的白細(xì)胞組合物(FP)(表1)。表1顯示白細(xì)胞活化的細(xì)胞表面標(biāo)志物權(quán)利要求1.一種制備活化的白細(xì)胞組合物的方法，其包括a.將人白細(xì)胞于室溫孵育大約8至大約20小時(shí)；b.對(duì)所述白細(xì)胞進(jìn)行低滲休克；c.將恢復(fù)等滲性有效量的生理上可接受的鹽溶液加入到所述步驟b的所述白細(xì)胞中；d.使人血漿的分離樣品與凝固試劑相接觸，其中所述白細(xì)胞與所述血漿可以從相同或者不同的供體中獲得，并移除已凝固的固體，以獲得血清；和e.將所述步驟c的白細(xì)胞與所述步驟d的血清混合。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述孵育進(jìn)行大約8至大約12小時(shí)。3.權(quán)利要求1或者2的方法，其中所述白細(xì)胞和所述血清從不同的供體中獲得。4.權(quán)利要求1或者2的方法，其中所述白細(xì)胞和所述血清從相同的供體中獲得。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述白細(xì)胞從具有0陰性血型的供體中獲得。6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述血漿從具有AB陽(yáng)性血型的供體中獲得。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述休克包括使白細(xì)胞與水相接觸。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中c)中所述生理上可接受的鹽溶液是氯化鈉溶液。9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中d)中所述接觸于大約37°C進(jìn)行。10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中d)中所述接觸進(jìn)行大約8-20小時(shí)。11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中所述凝固試劑是CaCl2。12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述移除包括離心。13.權(quán)利要求1-12的方法，其進(jìn)一步包括f)將白細(xì)胞在血清中于大約37°C孵育大約60至大約120分鐘。14.一種用于傷口愈合的活化的白細(xì)胞組合物，其中所述白細(xì)胞包含a)大約40%至大約90%的粒細(xì)胞；b)大約5%至大約20%的單核細(xì)胞；和c)大約5%至大約30%的淋巴細(xì)胞。15.權(quán)利要求14的組合物，其進(jìn)一步包含大約0.IXIO6μ1的紅細(xì)胞。16.權(quán)利要求14或者15的組合物，其進(jìn)一步包含大約的46.8XIO3μ1血小板。17.權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的組合物，其中所述粒細(xì)胞包含a)大約52%至大約78%的中性粒細(xì)胞；b)大約至大約9%的嗜酸性粒細(xì)胞；和c)大約至大約2%的嗜堿性粒細(xì)胞。18.權(quán)利要求14-17任一項(xiàng)的組合物，其中所述淋巴細(xì)胞包含；a)大約7%至大約25%的B細(xì)胞(⑶19+)；b)大約20%至大約30%的NK細(xì)胞(CD3-/CD56+)；c)大約40%至大約60的T細(xì)胞(⑶3+)；d)大約0%至大約30%的NKT細(xì)胞(CD3+/CD56+)；e)大約8%至大約20%的輔助性T細(xì)胞(⑶4+/⑶3+)；和f)大約20%至大約30%的CD8+/CD3+細(xì)胞。19.一種治療傷口的方法，其包括對(duì)傷口施用權(quán)利要求14-18任一項(xiàng)的活化的白細(xì)胞組合物。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述傷口是褥瘡。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述傷口是壓力性潰瘍。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述傷口是糖尿病患者的下肢潰瘍。23.權(quán)利要求19的方法，其中所述傷口是深部胸骨傷口。24.權(quán)利要求19的方法，其中所述傷口是術(shù)后傷口。25.權(quán)利要求對(duì)的方法，其中所述傷口是軀體的難治性術(shù)后傷口。26.權(quán)利要求對(duì)的方法，其中所述傷口位于大隱靜脈。27.權(quán)利要求19的方法，其中所述傷口是靜脈潰瘍。28.權(quán)利要求19的方法，其中所述活化的白細(xì)胞組合物來(lái)源于自體的血液樣品。29.權(quán)利要求19的方法，其中所述活化的白細(xì)胞組合物來(lái)源于同種異體的血液樣品。全文摘要公開(kāi)了治療性來(lái)源于血液的活化的白細(xì)胞組合物、其制備方法和利用該組合物修復(fù)或者促進(jìn)傷口愈合的方法。文檔編號(hào)A61P17/02GK102438635SQ201080020134公開(kāi)日2012年5月2日申請(qǐng)日期2010年3月5日優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日發(fā)明者A·祖洛夫-沙尼,E·拜因,E·施納,I·吉尼斯,M·布比斯,M·施爾文,O·弗倫克爾申請(qǐng)人:馬克羅柯?tīng)栍邢薰?