專利名稱：用于以SIRPα-CD47的相互作用為靶標(biāo)治療血液癌癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以SIRP α -⑶47的相互作用為靶標(biāo)從而治療血液癌癥(特別是人類急性粒細(xì)胞白血病(AML))，以及用于該目的的化合物。
背景技術(shù)：
雖然供體-受體的人白細(xì)胞抗原具有遺傳同一性，但是在造血干細(xì)胞的移植中仍會(huì)發(fā)生移植失敗，這表明有其它因素調(diào)節(jié)移植。最近通過非肥胖糖尿病(NOD)-重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的異種移植模型發(fā)現(xiàn)，與具有等效的免疫缺陷相關(guān)突變的其它品系相比， NOD 情況能進(jìn)行更好的造血移植(Takenaka，K.等，Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells. Nat. Immunol. 8,1313-1323(2007))。 已經(jīng)鑒定出Sirpa等位基因的多態(tài)性，并表明其是導(dǎo)致所分析的小鼠品系之間的移植差異的原因。雖然NOD情況可給予人移植最好的支持，但是具有Sirpa的其它多態(tài)性的小鼠不能被移植(即N0D.N0R-Iddl3.SCID)。在小鼠和人類中，Sirpa編碼SIRP α蛋白， 所述的SIRPa蛋白與其配體⑶47相互作用。在造血系統(tǒng)中，SIRPa主要發(fā)現(xiàn)于巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和粒細(xì)胞中，而⑶47存在于大多數(shù)造血細(xì)胞中(Matozaki，Τ.，Murata, Y.， Okazawa, H. &0hnishi, H. Functions and molecular mechanisms of the CD47_SIRPalpha signalling pathway. Trends Cell Biol. 19, 72-80 (2009)) 據(jù)顯示，小鼠 Sirpa 等位基因在與CD47相互作用的胞外的免疫球蛋白的V樣結(jié)構(gòu)域中是高度多態(tài)性的。對(duì)三十七(37) 個(gè)不相關(guān)的正常人對(duì)照進(jìn)行測(cè)序，鑒定出了 4種多態(tài)性，這表明人的Sirpa等位基因同小鼠的Sirpa等位基因一樣，也是多態(tài)的(Takenaka等，同上)。大量的工作已經(jīng)表明，人類急性粒細(xì)胞白血病(AML)克隆是由白血病起始細(xì)胞 (AML-LSC)分層組織和維持的(Wang，J. C. &Dick, J. Ε. Cancer stem cells =Iessons from leukemia. Trends Cell Biol. 15,494-501 (2005)) 但是，對(duì)于用于控制 AML-LSC 的分子調(diào)節(jié)子仍然知之甚少。大多數(shù)的人AML樣本中均表達(dá)CD47，但是白血病母細(xì)胞的表達(dá)水平卻各不相同。相比于正常的HSC，人AML LSC的⑶47表達(dá)水平更高(Majeti，R.等，⑶47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell 138, 286 (2009)) 較高的 CD47 表達(dá)在 AML 中已經(jīng)顯示為獨(dú)立的不良預(yù)測(cè)因素(Majeti等，同上)。用直抗CD47的單克隆抗體治療移植了人 AML的免疫缺陷小鼠，可導(dǎo)致小鼠骨髓中的白血病性移植的減少(Majeti等，同上)。但是， 由于⑶47也與SIRP γ和整聯(lián)蛋白β 3亞基相結(jié)合，因此尚不明確這種效應(yīng)是否是通過破壞⑶47-SIRP α相互作用而特異性地介導(dǎo)的(Matozaki等，同上)。發(fā)明概述
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于治療血液癌癥的方法，其包括調(diào)節(jié)人 Sirpa和人CD47之間的相互作用。優(yōu)選的是，通過給予治療有效量的多肽，從而調(diào)節(jié)所述人Sirp α和人⑶47之間的相互作用，所述多肽能夠與人⑶47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于治療血液癌癥的化合物的用途，所述化合物包含一種多肽，所述多肽能通過與人CD47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間的相互作用。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種化合物在制備用于治療血液癌癥的藥物中的用途，所述化合物包含一種多肽，所述多肽能夠通過與人CD47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間的相互作用。優(yōu)選地，所述多肽包含可溶性人Sirp a、或其⑶47結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中， 所述多肽為人Sirp α的胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽為Sirp a-Fc融合蛋白，并優(yōu)選為SEQ ID NO. 13。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種確定人類中的影響血液癌癥的存活率的遺傳多態(tài)性的方法，所述方法包括a)對(duì)多個(gè)患有血液癌癥的人的Sirp α基因進(jìn)行測(cè)序；b)確定所述多個(gè)人的Sirpa基因的核苷酸的差異；以及c)將所述的核苷酸的差異與存活率相關(guān)聯(lián)，從而確定相關(guān)多態(tài)性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種預(yù)測(cè)血液癌癥的存活可能性的方法，所述方法包括a)對(duì)受體的Sirp α基因進(jìn)行測(cè)序；以及b)確定本文所述相關(guān)多態(tài)性是否存在。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，能夠調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間的相互作用的多肽，選自由下列物質(zhì)所組成的組中a)由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽，其中所述片段包含 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的
至少一個(gè)。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，能夠調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間的相互作用的多肽，選自由下列物質(zhì)所組成的組中a)由SEQ ID N0. 2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQ ID N0. 2的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換；其中i.在所述多肽中，SEQ ID N0. 2 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)被置換為 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、 77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相應(yīng)殘基；或 在所述多肽中，SEQ ID NO. 2的第1 和130位殘基中至少一個(gè)是缺失的。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，能夠調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間的相互作用的多肽，選自由下列物質(zhì)所組成的組中a)由選自由SEQ ID NOs. 4-7所組成的組中的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由選自由SEQ ID NOs. 4_7所組成的組中的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽；以及c) a)和b)所述多肽的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于治療血液癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的上述多肽以及可藥用的載體，所述血液癌癥優(yōu)選白血病，更優(yōu)選人類急性粒細(xì)胞白血病。優(yōu)選地，所述血液癌癥優(yōu)選地包括存在⑶47+的癌細(xì)胞或腫瘤(⑶47+presenting cancer cell or tumor)。


在隨后的發(fā)明詳述中，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的上述特征和其它特征將更加清楚，所述發(fā)明詳述將參照以下附圖，其中圖 1 示出了攜帶 N0R-Iddl3 基因座的 NOD. SCID 小鼠(NOD. NOR-Iddl3. SCID)中無法進(jìn)行人AML-LSC的再增殖(!^population)。Y軸表示的是在注射了來自4個(gè)患者的原發(fā) AML細(xì)胞7-8周之后，NOD. SCID(NS)和NOD. NOR-Iddl3. SCID(Idd)小鼠的以下器官中發(fā)生人細(xì)胞移植的百分比所注射的右股骨(RF)、非注射點(diǎn)的骨頭的骨髓(BM)或脾(SpI)。通過靜脈(IV)或股骨內(nèi)(IF)注射，將3X106個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入每只小鼠體內(nèi)。移植了同一患者樣本的小鼠用相同形狀的標(biāo)記表示。圖2 (A)示出了 NOD. N0R_Iddl3. SCID小鼠中的AML細(xì)胞有缺陷的歸巢(homing)。 通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)以下小鼠的BM或脾中發(fā)生人CD45+移植的百分比在靜脈注射原發(fā)性 AML細(xì)胞16h后，亞致死劑量輻照NOD. SCID和NOD. N0R-Iddl3. SCID(IDD)的小鼠。各個(gè)點(diǎn)、 方形或三角形表示的是一只小鼠。條狀物表示平均值士SEM。圖2(B)示出了 AML-LSC的功能被天然免疫細(xì)胞抑制。用抗小鼠⑶122抗體對(duì)N0D. SCID或NOD. N0R-Iddl3. SCID(IDD)小鼠進(jìn)行預(yù)處理，將具有不同白血病亞型和細(xì)胞遺傳標(biāo)記的10例AML患者的原發(fā)細(xì)胞股骨內(nèi)移植入上述小鼠中。7-8周后測(cè)定在所注射的右股骨 (RF)、未經(jīng)注射的骨頭的骨髓(BM)、或脾中的人細(xì)胞移植的百分比(Y軸)。與未經(jīng)處理的小鼠(圖1)相比，使用了抗CD122的預(yù)處理降低了 IDD小鼠對(duì)白血病細(xì)胞移植的抑制。圖3示出了小鼠的天然免疫對(duì)人類急性粒細(xì)胞白血病(AML)在小鼠中異種移植的影響。A)N0D. SCID或N0D.N0R-Iddl3. SCID中自然殺傷(NK)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(ΜΦ)群的調(diào)節(jié)。示出了小鼠NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面表型。B)巨噬細(xì)胞衰竭后人AML細(xì)胞移植入 NOD. SCID或N0D.N0R-Iddl3. SCID(Idd)中。圖中示出了在收獲器官中人白血病細(xì)胞的百分比。
圖4示出了人AML細(xì)胞的體外吞噬作用分析。A) CFSE標(biāo)記的人AML細(xì)胞與NOD. SCID或NOD. N0R-Iddl3. SCID小鼠巨噬細(xì)胞共孵育。2小時(shí)后收獲巨噬細(xì)胞，并且通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)F4/80+CFSE陽性小鼠巨噬細(xì)胞的百分比。B)通過熒光激活細(xì)胞分類術(shù)分選 CFSE+/F4/80+細(xì)胞，并通過共聚焦顯微鏡顯影。C)用細(xì)胞松弛素D預(yù)處理共培養(yǎng)物，所述細(xì)胞松弛素D通過抑制巨噬細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白的聚合作用，而抑制吞噬作用。D)示出了未經(jīng)處理的或如上文所述的經(jīng)細(xì)胞松弛素D處理的CFSE+/F4/80+小鼠巨噬細(xì)胞中人⑶45的表達(dá)。圖5示出了對(duì)人SIRPa (V2)融合蛋白進(jìn)行的體外預(yù)孵育，阻斷了原發(fā)AML細(xì)胞歸巢到NOD. SCID小鼠骨髓(BM)和脾臟中。A)采用鼠抗人抗體，通過流式細(xì)胞儀，測(cè)量人⑶44+AML細(xì)胞在BM和脾臟的百分比。每個(gè)符號(hào)代表不同的小鼠。B)通過下式計(jì)算AML細(xì)胞歸巢到NOD. SCID的BM和脾臟中的效率[回收的AML細(xì)胞總數(shù)]/[所注射的AML細(xì)胞總數(shù)]X 100。圖6示出了采用人Sirp α融合蛋白(hSirp α -Fe)的體外處理降低了原發(fā)性AML 細(xì)胞在NOD. SCID小鼠中的再增殖能力。條狀物表示的是hCD45+細(xì)胞的平均百分比。圖7示出了采用人Sirp α融合蛋白(hSirp α-Fe)的體內(nèi)處理降低了原發(fā)性AML 細(xì)胞在NOD. SCID小鼠中的移植。通過流式細(xì)胞儀分析染色的細(xì)胞，從而在hCD45+細(xì)胞的百分比的基礎(chǔ)上確定每個(gè)小鼠中的移植水平。條狀物表示各組中hCD45+人細(xì)胞的平均百分比。所顯示的P值用于比較hSirp α -Fc處理與PBS處理。圖8示出了 WO 09/046541中所公開的小鼠SIRP α的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。采用由BM 的巨噬細(xì)胞所制備的cDNA作為模板，對(duì)NOD和NOR小鼠Sirp α轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Β6 小鼠序列來自EnsEMBL數(shù)據(jù)庫。圖9示出了 WO 09/046541中所公開的小鼠和人SIRPa IgV結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。(a)采用由BM巨噬細(xì)胞所制備的cDNA作為模板，對(duì)NOD和NOR小鼠Sirp α轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。C57BL/6 (Β6)、BALB/c和129/Sv序列得自EnsEMBL和NCBI數(shù)據(jù)庫。開放框代表的是b-折疊(所述b-折疊是在SIRP α的X-射線晶體結(jié)構(gòu)中鑒定得到的)并對(duì)應(yīng)于Ig重鏈可變區(qū)中的類似區(qū)域。將在小鼠品系之間不相同的氨基酸打上陰影。將Β6 用作親本序列。(b)對(duì)人類基因組單體型圖(HapMap)第1階段發(fā)布的37個(gè)個(gè)體的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到包含IgV結(jié)構(gòu)域的SIRP α的外顯子3。開放框區(qū)域表示的是與(a)相同的特征，其以Vl作為親本序列。發(fā)明詳述在以下描述中，為了深入地理解本發(fā)明，對(duì)許多具體細(xì)節(jié)進(jìn)行了說明。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明在不包括這些具體細(xì)節(jié)的情況下也可以實(shí)施。申請(qǐng)人:示出了在異種移植模型中，⑶47-SIRP α的相互作用調(diào)節(jié)人AML-LSC的歸巢和移植。通過以⑶47或SIRPa為靶標(biāo)而中斷⑶47-SIRP α信號(hào)，是一種有可能用于根除患者體內(nèi)的血液的CD47+癌細(xì)胞和腫瘤的治療方法，所述癌細(xì)胞和腫瘤包括癌干細(xì)胞， 例如 AML-LSC。本文所用的術(shù)語“癌干細(xì)胞”是指在腫瘤和血液癌癥(例如AML)中發(fā)現(xiàn)的癌細(xì)胞， 在AML中癌干細(xì)胞被稱為白血病干細(xì)胞(AML-LSC)，其在生物學(xué)上不同于塊狀腫瘤細(xì)胞，并且具有與干細(xì)胞相關(guān)的特性，特別是自我更新和增殖的能力，并在特定的癌樣本中產(chǎn)生所有細(xì)胞類型。本文所用的術(shù)語“保守氨基酸置換”是指在某些共同特性的基礎(chǔ)上對(duì)氨基酸進(jìn)行分組。對(duì)各個(gè)的氨基酸的共同特性進(jìn)行定義的一種可行方式是，對(duì)同源生物體的相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸的改變的歸一頻率進(jìn)行分析(Schulz，G. E. and R. H. Schirmer. ,Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。根據(jù)該分析，可以這樣定義氨基酸組，其中在一組內(nèi)的氨基酸彼此優(yōu)先互換，因此在其對(duì)整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響上彼此最為類似(Schulz， G. Ε. and R. H. Schirmer. ,Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。以這禾中方式定義的氨基酸組的例子包括⑴帶電組，由Glu和Asp、Lys、Arg和His組成，(ii)帶正電組，由Lys、Arg和His組成，(iii)帶負(fù)電組，由GIu和Asp組成，(iv)芳香組，由 Phe、Tyr 和 Trp 組成，(ν)氮環(huán)組，由His和Trp組成，(vi)大型脂肪族非極性組，由Val、Leu和Ile組成，(vii)弱極性組，由Met和Cys組成，(viii)小殘基組，由 kr、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 組成，(ix)脂肪族組，由Val、Leu、lie、Met和Cys組成，以及(χ)小羥基組，由Ser和Thr組成。除上述各組外，每個(gè)氨基酸殘基可形成其特有的組，并且由單個(gè)氨基酸所形成的組可由本領(lǐng)域常用的該氨基酸的一個(gè)和/或三個(gè)字母的縮寫來表示。本文中所用的術(shù)語“移植”細(xì)胞(例如癌干細(xì)胞，并優(yōu)選為人急性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞)，指的是將所述干細(xì)胞放入(例如通過注射放入)動(dòng)物中，其中所述細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)存在。這可以很容易地通過腫瘤干細(xì)胞的能力(例如增殖能力)測(cè)量。本文中所用的術(shù)語“片段”涉及多肽或多核苷酸，是指僅由相關(guān)基因的完整的多肽序列和結(jié)構(gòu)或核苷酸序列和結(jié)構(gòu)的一部分所組成的多肽或多核苷酸。多肽片段可包括天然多肽的C-末端缺失和/或N-末端缺失，或可來自分子內(nèi)部的部分。類似地，多核苷酸片段可包括天然多核苷酸的3'和/或5'缺失，或可來自分子內(nèi)部的部分。本文中所用的術(shù)語“融合蛋白”是指復(fù)合多肽，即，單個(gè)鄰接的氨基酸序列，由兩個(gè) (或多個(gè))不同的異源多肽組成，所述異源多肽在同一個(gè)氨基酸序列中通常不融合在一起或不天然融合在一起。因此，融合蛋白可包括這樣的單一的氨基酸序列，其中所述單一的氨基酸序列包含兩個(gè)完全不同的氨基酸序列或兩個(gè)相似或相同的多肽序列，而這些序列通常不會(huì)在自然發(fā)現(xiàn)的單個(gè)氨基酸序列中以相同的結(jié)構(gòu)組合在一起。通?？赏ㄟ^以下方法制備融合蛋白采用重組核酸的方法，即作為重組基因融合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)果，其中所述融合包含編碼本發(fā)明的多肽的片段和編碼異源多肽的片段；或者通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法。融合蛋白還可包含融合蛋白的組成性多肽之間的連接體多肽。術(shù)語“融合構(gòu)建體” 或“融合蛋白構(gòu)建體”通常是指編碼融合蛋白的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白為與Ig分子的一部分相融合的本文所述的多肽。融合蛋白的Ig部分可包括免疫球蛋白恒定區(qū)，例如人C γ 1結(jié)構(gòu)域或C γ 4結(jié)構(gòu)域(如人IgC γ 1結(jié)構(gòu)域或IgC γ 4結(jié)構(gòu)域的鉸合部、 CH2 和 CH3 區(qū)域(參見(例如)Capon 等，美國專利 Nos. 5，116，964 ；5，580, 756 ；5，844，095
11等))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Ig融合蛋白包括與免疫球蛋白恒定區(qū)(例如Fc區(qū)域) 偶聯(lián)的本文所述的多肽。在多肽與Fc結(jié)構(gòu)域相偶聯(lián)的實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu)域可選自任意免疫球蛋白 (例如IgG，如IgG1或IgGh或IgG4)。適合地，所選的Fc結(jié)構(gòu)域是經(jīng)過修飾的(例如，通過在與Fc受體相結(jié)合的關(guān)鍵殘基上進(jìn)行氨基酸置換)，以減少或防止與Fc受體在體內(nèi)的結(jié)合 (即，經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地表現(xiàn)出降低的親和力，所述親和力是針對(duì)內(nèi)源性Fc受體，而非新生Fc受體(FcRn)的，所述內(nèi)源性Fc受體包括例如，F(xiàn)c γ RI，F(xiàn)c γ RII和Fc γ RIII)。 同時(shí)，所選的Fc結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為經(jīng)修飾而改變了效應(yīng)子功能的Fc結(jié)構(gòu)域，如降低了補(bǔ)體的結(jié)合和/或降低或消除補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性。(例如)Clark及其同事已經(jīng)對(duì)這樣的修飾進(jìn)行了大量的描述，他們?cè)O(shè)計(jì)和描述了一系列IgGl或IgG2和IgG4的Fc結(jié)構(gòu)域的突變體，以及其與Fc YR的結(jié)合屬性(Armour等，1999 ；Armour等，2002，在本申請(qǐng)中通過引用的方式將其內(nèi)容并入到本文中)。例如，選自第234、235、236、237、四7、318、320和322位的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被置換，從而改變對(duì)效應(yīng)子配體的親和力，所述效應(yīng)子配體例如為Fc受體或補(bǔ)體的Cl組分，如Winter等的美國專利US5, 624，821和5，648，260中所詳細(xì)報(bào)道的那樣。如 (例如)US6, 194，551所述，選自第329、331和322位的一個(gè)或多個(gè)氨基酸也可被置換，從而改變Clq的結(jié)合并且/或者降低或消除CDC。在特別優(yōu)選的經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域來自IgG1 (Wines等，2000)，并且包含在氨基酸第234和/或235位的氨基酸(即Leu234 和/或Leu235)修飾。這些亮氨酸殘基位于IgG1的低鉸合部區(qū)，F(xiàn)c受體與Fc結(jié)構(gòu)域在所述鉸合部區(qū)處連接?？蓪⑺隽涟彼釟埢械囊粋€(gè)或兩個(gè)進(jìn)行置換或刪除，以阻止Fc受體的連接(即結(jié)合)；例如可將Leu234和Lei^5中的一個(gè)或兩個(gè)置換為丙氨酸(即L234A和/或 L235A)，或其它合適的氨基酸(Wines等，2000)。在其他實(shí)施方案中，通過引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾，而改善融合蛋白的半衰期，所述引入通常是氨基酸置換的形式，例如，在第252位殘基上(例如)引入Thr，在第254 位殘基上(例如)引入kr，和/或在第256位殘基上(例如)引入Wre。也可作出其它修飾來改善半衰期，如通過改變CHl或CL區(qū)域從而引入補(bǔ)救受體基序(salvage receptor motif)，如發(fā)現(xiàn)于IgG的Fc區(qū)域的CH2結(jié)構(gòu)域的2個(gè)回環(huán)之間的基序。在(例如)US 5，869，046和US 6，121，022中描述了上述改變。如US 6194551所述，可通過改變恒定區(qū)第329、331和322位的氨基酸，改變Clq的結(jié)合或降低補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性。如W094/(^9351所述，可通過在恒定區(qū)第231和239位引入置換，而進(jìn)一步改變抗體固定補(bǔ)體的能力。本文所用的術(shù)語“血液癌癥”是指血液的癌癥，并且其中包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等?！鞍籽　笔侵秆旱囊环N癌癥，其中產(chǎn)生了過量的對(duì)抵抗感染不起作用的白細(xì)胞，從而擠占了組成血液的其它部分，如血小板和紅細(xì)胞?？梢岳斫?，白血病的例子分為急性的或慢性的。某些形式的白血病可以是(例如)，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)；急性粒細(xì)胞白血病(AML)；慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)；慢性粒細(xì)胞白血病(CML)；骨髓增生性疾病 /瘤(MPDQ ；骨髓增生異常綜合征?！傲馨土觥笔侵富羝娼鹆馨土觥⒍栊院颓忠u性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、和濾泡型淋巴瘤(小細(xì)胞和大細(xì)胞)等。骨髓瘤可指多發(fā)性骨髓瘤(MM)、巨細(xì)胞性骨髓瘤、重鏈骨髓瘤Oieavy chain myeloma)、輕鏈骨髓瘤(light chain myeloma)或本其jf -瓊其jf骨髓瘤(Bence-Jones myeloma)。
術(shù)語“CD47+”用于表示與所述多肽結(jié)合的靶細(xì)胞的表型。可通過流式細(xì)胞儀，采用⑶47抗體作為親合配體，來鑒定⑶47+細(xì)胞。用于檢測(cè)⑶47表型的細(xì)胞可以包括標(biāo)準(zhǔn)腫瘤活檢樣本，所述樣本特別包含從懷疑具有CD47+腫瘤細(xì)胞的個(gè)體中獲得的血液樣品。本文中所用的術(shù)語“巨噬細(xì)胞去抑制”或“巨噬細(xì)胞的去抑制”是指對(duì)巨噬細(xì)胞的作用、活性和/或效果的去抑制、抑制的消除、提高或啟動(dòng)。本文中所用的術(shù)語“可藥用的載體”是指生理上可兼容的任意的和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。可藥用的載體的例子包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一種或多種，及其組合。在許多情況下，優(yōu)選在其成分中包括等滲劑(如糖)、多元醇(如甘露醇)、山梨醇，或氯化鈉?？伤幱玫妮d體， 還可包括少量輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，所述輔助物質(zhì)能延長藥劑的保質(zhì)期或提高藥效。本文中所用的術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，是指蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)、氨基酸序列和合成的氨基酸序列。所述多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本文中所用的術(shù)語“預(yù)測(cè)”是指預(yù)測(cè)或鑒定受試者的臨床結(jié)果。預(yù)測(cè)包括提供疾病惡化的指征，還包括提供因疾病或其它情況的死亡的可能性的指征。本文中所用的術(shù)語“治療有效量”是指經(jīng)過必要的特定時(shí)期達(dá)到所需治療效果的有效劑量。藥劑的治療有效量可根據(jù)各種因素(如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個(gè)體重量)而變化，并且所述藥劑引起個(gè)體中的所需反應(yīng)的能力也可不同。治療有效量也具有如下特性其治療性有益效果超過藥劑的任何毒性或不利影響。根據(jù)一個(gè)方面，提供了一種治療血液癌癥的方法，其包括調(diào)節(jié)人Sirp α和人 CD47之間的相互作用。優(yōu)選地，通過給予治療有效量的多肽，調(diào)節(jié)所述人Sirp α和所述人 CD47之間的相互作用，所述多肽能夠與人CD47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。根據(jù)另一個(gè)方面，提供了一種用于治療血液癌癥的化合物的用途，所述化合物包括一種多肽，所述多肽能夠通過與人CD47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，來調(diào)節(jié)人Sirp α和人CD47 之間的相互作用。根據(jù)另一個(gè)方面，提供了一種化合物在制備用于治療血液癌癥的藥物中的用途， 所述化合物包括一種多肽，所述多肽能夠通過與人CD47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，來調(diào)節(jié)人 Sirp α和人⑶47之間的相互作用。在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含可溶性人Sirp α或其片段，優(yōu)選的是，所述多肽為人Sirp α的胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述多肽與第二蛋白(優(yōu)選IgG的Fc部分)融合。優(yōu)選地， 所得的融合蛋白為SEQ ID NO. 13。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的去抑制。在一些實(shí)施方案中，所述血液癌癥為白血病，優(yōu)選地是，選自急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、和骨髓增生異常綜合征， 優(yōu)選為人急性粒細(xì)胞白血病。在一些實(shí)施方案中，所述血液癌癥為淋巴瘤或骨髓瘤，所述淋巴瘤或骨髓瘤選自霍奇金淋巴瘤、惰性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤(小細(xì)胞和大細(xì)胞)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、巨細(xì)胞性骨髓瘤、重鏈骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤或本斯-瓊斯骨髓瘤。目前顯示，在AML中SIRP α -⑶47相互作用的中斷，會(huì)導(dǎo)致?lián)p害AML細(xì)胞的歸巢、移植和遷移。這些效果是通過宿主骨髓微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞，由經(jīng)改善的天然免疫監(jiān)視介導(dǎo)的。該治療方法有可能對(duì)其它占據(jù)了骨髓微環(huán)境生態(tài)位(bone marrow microenvironmental niche)的血液癌癥有效。W009/065541描述了 SIRP α的多態(tài)性使NOD巨噬細(xì)胞具有分化能力，以支持人的造血作用。在圖8和9中再現(xiàn)了 WO 09/065541中所述的SIRPa的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。采用 BM來源的巨噬細(xì)胞的cDNA作為模板，對(duì)NOD和NOR小鼠的Sirp α轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 對(duì)NOD和NOR的Sirp α編碼序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示出有M個(gè)氨基酸是不同的，其中的20 個(gè)氨基酸位于該分子的胞外類IgV結(jié)構(gòu)域，在所述類IgV結(jié)構(gòu)域中，相比于NOR和Β6，NOD 序列示出了 18個(gè)置換和2個(gè)缺失。在NOD和NOR或Β6的Sirp α類IgV結(jié)構(gòu)域的N-端中觀測(cè)到的差異，比之前報(bào)道的在B6、BALB/c和129/Sv品系的該區(qū)域中的差異(Sano，S等， (1999)Biochem J 344 Pt 3，667-75)更大。WO 09/065541進(jìn)一步描述了 SIRPa的多態(tài)性使其與人CD47進(jìn)行不同的結(jié)合。 WO 09/065541描述了對(duì)來自人類HapMap基因組計(jì)劃中的37個(gè)彼此不相關(guān)的正常個(gè)體的 SIRPa IgV結(jié)構(gòu)域進(jìn)行測(cè)序(其中所述個(gè)體分別來自高加索(CEU)、非洲(YRI)、中國(CHB) 和日本(JPT))，并鑒定出了 4個(gè)不同的SIRP a IgV等位基因，其反映出了 18個(gè)氨基酸的組合變異，如圖9再現(xiàn)所示。申請(qǐng)人在預(yù)測(cè)的CD47結(jié)合殘基處觀察到人等位基因的變異，并且所述變異在區(qū)分NOD和NOR等位基因的SIRPa IgV結(jié)構(gòu)域的相同亞區(qū)域上。W009/065541 進(jìn)一步教導(dǎo)了，人CD47對(duì)得自NOD的SIRP a IgV結(jié)構(gòu)域的結(jié)合力非常高，并可用于預(yù)測(cè)人干細(xì)胞的移植，以及該效應(yīng)是通過⑶47-SIRPa信號(hào)介導(dǎo)的。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種確定人中的遺傳多態(tài)性影響血液癌癥的存活率的方法， 所述方法包括a)對(duì)多個(gè)患有所述血液癌癥的人的Sirp α基因進(jìn)行測(cè)序；b)確定在所述多個(gè)人中Sirpa基因的核苷酸差異；以及c)將核苷酸差異與存活率相關(guān)聯(lián)，從而確定相關(guān)多態(tài)性。另外一個(gè)方面，還提供了一種預(yù)測(cè)血液癌癥存活可能性的方法，所述方法包括a)對(duì)受體的Sirp α基因進(jìn)行測(cè)序；以及b)確定本文所述的相關(guān)多態(tài)性是否存在。在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸差異導(dǎo)致氨基酸差異，優(yōu)選為下列情形的至少一種a) SEQ ID NO. 2 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、 118、126 位殘基中的至少一個(gè)被置換為 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、 87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相應(yīng)殘基；或b) SEQ ID N0. 2的第1 和130位中的至少一個(gè)殘基的缺失。另外，根據(jù)一些實(shí)施方案，能夠調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間相互作用的所述多肽，選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽，其中所述片段包含
14SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘
基中的至少一個(gè)；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的
至少一個(gè)。優(yōu)選地，所述多肽為⑶47結(jié)合片段，并且在以下至少一個(gè)區(qū)域中包含至少3個(gè)連續(xù)氨基酸所述區(qū)域?yàn)樵?SEQ ID NO. 1 內(nèi)第 50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、 114-125或128-141位殘基之間的區(qū)域。根據(jù)另一實(shí)施方案，能夠調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間相互作用的所述多肽，選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由SEQ ID NO. 2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換；其中i.在所述多肽中，SEQ ID N0. 2 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、 100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)被置換為 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、 77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相應(yīng)殘基；或 在所述多肽中，SEQ ID Ν0. 2的第1 和130位殘基中的至少一個(gè)是缺失的。優(yōu)選地，所述多肽為⑶47結(jié)合片段，并且在以下至少一個(gè)區(qū)域中包含至少3個(gè)連續(xù)氨基酸所述區(qū)域?yàn)樵?SEQ ID N0. 2 內(nèi)第 50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、 114-125或U8-143位殘基之間的區(qū)域。根據(jù)另一實(shí)施方案，能夠調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間相互作用的所述多肽，選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由選自由SEQ ID NOs. 4-7組成的組中的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由選自由SEQ ID NOs. 4-7組成的組中的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換。優(yōu)選地，所述多肽為⑶47結(jié)合片段，并且在以下至少一個(gè)區(qū)域中包含至少3個(gè)連續(xù)氨基酸，所述區(qū)域?yàn)?SEQ ID NOs. 4、6和7中任意一個(gè)內(nèi)第24-31、37_45、48巧4、62_66、 69-74、77-83、88-99 或 102-116 位殘基之間的區(qū)域；或 SEQ ID N0. 5 內(nèi)第 24_31、37_45、 48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-115 位殘基之間的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸插入、缺失或置換為保守氨基酸置換。在其它實(shí)施方案中，沒有氨基酸插入、缺失或置換。在一些實(shí)施方案中，所述多肽為⑶47結(jié)合片段，并且長度為6到30個(gè)氨基酸，以下優(yōu)選性依次增加的是，長度為8到觀個(gè)氨基酸，長度為10到沈個(gè)氨基酸，長度為12到 24個(gè)氨基酸，長度為14到22個(gè)氨基酸。
在一些實(shí)施方案中，所述多肽與第二多肽融合，優(yōu)選IgG的Fc部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽為Sirpa融合蛋白，并且優(yōu)選為SEQ ID NO. 13。根據(jù)另一方面，提供了一種治療血液癌癥的藥物組合物，所述血液癌癥優(yōu)選為白血病，更優(yōu)選為人急性粒細(xì)胞白血病，所述藥物組合物包含有效量的本文所述的多肽以及可藥用的載體。通過下面的實(shí)施例，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行說明。本文所述的實(shí)施例及其具體細(xì)節(jié)僅用作說明之用，而不應(yīng)當(dāng)用于對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求進(jìn)行限制。
實(shí)施例小鼠在安大略癌癥研究所(位于加拿大多倫多市)內(nèi)在無菌條件下繁殖并飼養(yǎng)NOD/ LtSz-Prdkcsc7sc(NOD. SCID) (Shultz,L. D.等，Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 154，180-191 (1995))。在兒童醫(yī)院(位于安大略省多倫多市)內(nèi)在特定的無病原體或隔離條件下飼養(yǎng)N0D.N0R-Iddl3 小鼠。將NOD. NOR-Iddl3 與 NOD. SCID 小鼠雜交產(chǎn)生 NOD. N0R-Iddl3. SCID 小鼠，然后進(jìn)行兄妹交配，并通過表型輔助型的標(biāo)記進(jìn)行篩選，直到Iddl3和SCID基因座均獲得純合性 (Takenaka ，胃 )。將人造血細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)獲得知情同意后，根據(jù)人體實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)的程序，從患者中取得外周血細(xì)胞以及原發(fā)性或繼發(fā)性AML。在Ficoll-泛影鈉(Ficoll-Hypaque)(得自位于美國新澤西州皮斯卡塔韋的Wiarmacia公司)上分離后，收集低密度細(xì)胞(小于1. 077g/ml)，然后在含有 10%二甲基亞砜的FCS中凍存。移植人類細(xì)胞前，用137Cs γ -輻照器發(fā)出的275cGy亞致死性地輻照8_10周齡小鼠M小時(shí)。移植7-8周后處死小鼠，通過流式細(xì)胞儀分析是否存在人CD45+細(xì)胞，而對(duì)小鼠的BM和脾中的人細(xì)胞的移植進(jìn)行評(píng)估。在進(jìn)行股骨內(nèi)移植的小鼠中，分別對(duì)所注射的股骨和其它骨頭(非注射的股骨，脛骨)進(jìn)行分析。在一些實(shí)驗(yàn)中，輻照后用200yg的抗小鼠CD122進(jìn)行腹腔注射，從而對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理。流式細(xì)胞術(shù)在流式細(xì)胞儀中采用LSR II(BD公司)。為了對(duì)小鼠中的人細(xì)胞的移植進(jìn)行分析，收集小鼠骨髓中的細(xì)胞，并用結(jié)合藻紅蛋白_Cy7的抗人CD45進(jìn)行染色(HI. 30 ；BD Pharmingen 公司)?？寺〉絀型TM載體中的人SIRP Vl和V2在5XHF緩沖液中采用含有)(h0 1的正向引物、含有BgIII的反向引物和Phusion Hot start II型高保真聚合酶，對(duì)pUC57質(zhì)粒中的人SIRP α變體1和2的cDNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以獲得SIRP α變體1和2的完整的IgV結(jié)構(gòu)域。用Xhol和BgIII對(duì)pUC57SIRPa載體進(jìn)行限制性酶切。用EcoRI和BgIII對(duì) pINFUSE-hIgG4-FCL進(jìn)行酶切，并采用購自Promega 公司的LigaFast Rapid DNA連接體系，將SIRPa插入物連接入pINFUSE-hIgG4-Fcl中。
將所得的pINFUSE_hIgG4 Fcl-人SIRP α載體轉(zhuǎn)化入購自hvitrogen公司的One Shot T0P10 感受態(tài) Ε. coli 中。轉(zhuǎn)染用適當(dāng)體積的OptiMeM稀釋質(zhì)粒DNA和fectin并混合。在空氣中含8% CO2的濕氛條件下在37°C的培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染FreeMyleTM293-F細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4_6天后收獲細(xì)胞或培養(yǎng)基。收獲蛋白質(zhì)收獲培養(yǎng)物中的Fc蛋白。旋轉(zhuǎn)分離培養(yǎng)物，收集上清并通過PES 0. 45 μ m過濾器過濾，然后通過PES 0. 22 4 111過濾器過濾。采用0611廿化011-701^離心過濾器在；3500\8 下離心10-20分鐘，從而對(duì)上清進(jìn)行濃縮，并在4°C下將所述上清在G柱中洗脫。蛋白質(zhì)收集在IM Tris HCl (pH 8.0)中。將該樣品通過離心進(jìn)一步脫鹽，并用PBS重懸。實(shí)施例1為了研究原發(fā)性人AML中的⑶47-SIRP α相互作用的相關(guān)性，我們將3個(gè)AML患者的原發(fā)性細(xì)胞，通過靜脈注射(i. v.)移植到NOD. SCID和NOD. N0R-Iddl3. SCID(Idd)小鼠中。上述AML樣品都不能移植入Idd小鼠中，但是卻觀測(cè)到其大量移植入NOD. SCID小鼠中 (圖1)，從而證實(shí)了之前用正常人HSCs獲得的數(shù)據(jù)。當(dāng)將相同的樣品通過股骨注射(i.f.) 進(jìn)行移植時(shí)，6只Idd小鼠中的2只在所注射的股骨中表現(xiàn)出了移植，但在其它骨骼或脾中沒有發(fā)現(xiàn)移植(圖1)。實(shí)施例2接下來，我們通過股骨注射(i.f.)移植到小鼠中，其中所述小鼠用直抗小鼠⑶ 122的抗體進(jìn)行了預(yù)處理，所述⑶122可消耗宿主的自然殺傷(NK)細(xì)胞和一些巨噬細(xì)胞。 在NOD. SCID小鼠的所檢測(cè)的10個(gè)AML樣品中全部觀察到所注射的股骨內(nèi)的移植(43/43， 100% )，有趣的是，在42只Idd小鼠中的31只(74% ) (8/10AML檢測(cè)樣品)中觀測(cè)到所注射的股骨內(nèi)的移植(圖2B)，然而相比于NOD. SCID小鼠，Idd小鼠的移植水平較低。與未經(jīng)抗⑶122預(yù)處理獲得的結(jié)果形成對(duì)比，在8/42只Idd小鼠中(19%，2/10AML檢測(cè)樣品) 可檢測(cè)到未注射骨頭中的移植，而與預(yù)期一致的是，大部分進(jìn)行移植后的NOD. SCID小鼠能發(fā)生遷移(38/43，88%，10/10AML檢測(cè)樣品)。然而相比于NOD. SCID小鼠，在Idd小鼠中未注射的骨頭的移植水平顯著降低。此外，AML-LSC無法在Idd小鼠的脾臟中再增殖。在本研究中采用具有最佳移植效果的AML樣品進(jìn)行歸巢分析，結(jié)果表明相比于NOD. SCID小鼠， Idd小鼠具有嚴(yán)重的歸巢缺陷(圖2A)。實(shí)施例3我們研究了在小鼠異種移植中，小鼠天然免疫對(duì)人類急性粒細(xì)胞白血病(AML)的影響。圖3A示出了 NOD. SCID或NOD. N0R-Iddl3. SCID中自然殺傷(NK)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 (ΜΦ)群的調(diào)節(jié)。示出了小鼠NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面表型。巨噬細(xì)胞而非NK細(xì)胞，可表達(dá)Sirp α (左欄)。通過腹腔注射(i. p.)抗⑶122 (主要在NK細(xì)胞中表達(dá))的抗體或氯膦酸鹽(Clodronate)，對(duì)小鼠進(jìn)行處理。⑶122抗體處理(已被證明可提高人造血細(xì)胞在 NOD. SCID小鼠中的移植)導(dǎo)致NK細(xì)胞迅速被消耗，但不減少小鼠巨噬細(xì)胞(右上欄)。雙膦酸鹽(氯膦酸鹽)的處理導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和快速消耗(圖3A右下欄)。圖;3B 示出了在巨噬細(xì)胞耗竭后，NOD. SCID或NOD. N0R-Iddl3. SCID(Idd)中的人AML細(xì)胞的移植。亞致死劑量輻照的小鼠分別腹腔注射PBS(對(duì)照組)或氯膦酸鹽(CL)，48 小時(shí)后股骨內(nèi)注射移植人AML細(xì)胞。每周一次氯膦酸鹽處理，直到小鼠移植8周后處死。收獲小鼠的經(jīng)注射的骨髓、非注射的骨髓、脾臟和外周血，并且通過流式細(xì)胞儀，采用人特異性標(biāo)記物，來評(píng)價(jià)人白血病移植。圖中示出了收獲器官中的人白血病細(xì)胞的百分比。相比于NOD. SCID小鼠，股骨注射了 PBS對(duì)照的Idd小鼠中移植較低，而其他位點(diǎn)則沒有發(fā)生移植；在氯膦酸鹽處理后，在Idd小鼠的所有位點(diǎn)中均發(fā)現(xiàn)了移植。這些發(fā)現(xiàn)為以下假設(shè)提供了支持=SIRP α -⑶47的相互作用是AML移植的關(guān)鍵，以及Idd小鼠中的AML細(xì)胞的移植是通過巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的。實(shí)施例4進(jìn)行人AML細(xì)胞的體外吞噬作用分析。將CFSE-標(biāo)記的人AML細(xì)胞與NOD. SCID或 NOD. N0R-Iddl3. SCID小鼠巨噬細(xì)胞共孵育。2小時(shí)后收獲巨噬細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀測(cè)定CFSE陽性的F4/80+小鼠巨噬細(xì)胞的百分比。小鼠巨噬細(xì)胞的CFSE陽性表明了對(duì)人的 CFSE+AML 細(xì)胞的吞噬(圖 4A)。相比于 NOD. SCID-AML 共培養(yǎng)物，NOD. N0R-Iddl3. SCID-AML 共培養(yǎng)物總是表現(xiàn)出CFSE+/F4/80+更高的百分比。這表明，AML細(xì)胞上的⑶47和小鼠巨噬細(xì)胞上的Sirp α不發(fā)生相互作用，會(huì)導(dǎo)致對(duì)AML細(xì)胞的吞噬作用增強(qiáng)。進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選之后，采用共聚焦顯微鏡對(duì)CFSE+/F4/80+細(xì)胞進(jìn)行顯影。 圖4Β示出了一個(gè)指示巨噬細(xì)胞吞噬CFSE+細(xì)胞的區(qū)域。用細(xì)胞松弛素D預(yù)處理共培養(yǎng)物，所述細(xì)胞松弛素D可通過抑制巨噬細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白聚合作用，而抑制其吞噬作用。細(xì)胞松弛素D的處理顯著地降低了 CFSE+/F4/80+細(xì)胞的百分比(圖4C)。圖4D示出了人⑶45在未經(jīng)處理的或經(jīng)細(xì)胞松弛素D處理的CFSE+/F4/80+小鼠巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。由于人的抗體不能結(jié)合被吞噬的細(xì)胞，人CD45的低表達(dá)表明小鼠巨噬細(xì)胞吞噬了人AML細(xì)胞。這些結(jié)果證實(shí)了大部分未經(jīng)處理的CFSE+/F4/80+細(xì)胞是吞噬人 AML細(xì)胞的巨噬細(xì)胞(⑶45陰性)?？偠灾?，這些研究結(jié)果表明，SIRP α -⑶47的相互作用對(duì)AML細(xì)胞逃避天然免疫攻擊是關(guān)鍵性的，所述天然免疫攻擊是通過巨噬細(xì)胞進(jìn)行的。實(shí)施例5實(shí)施例5證明了對(duì)人SIRP α (V2)融合蛋白進(jìn)行的體外預(yù)孵育，阻斷了原發(fā)性AML 細(xì)胞歸巢到NOD. SCID小鼠骨髓(BM)和脾臟中。從AML Pt9601收獲的原代細(xì)胞與或不與濃度為50μ g/ml的人SIRP α -Fc融合蛋白，在IMDM+15% BIT中37°C下孵育2小時(shí)。收獲與(hSIRPa-Fc)或不與(無處理)融合蛋白孵育的細(xì)胞，并通過靜脈注射移植入亞致死劑量輻照后的NOD. SCID小鼠。移植16小時(shí)后，處死小鼠并從BM和脾臟中收獲細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀，采用鼠抗人抗體，測(cè)量BM和脾臟中的人⑶44+AML細(xì)胞的百分比。相比于未處理組，在體外與人SIRP α -Fc的共孵育顯著降低了 BM(P < 0. 02)和脾臟(P =0. 018)中的人⑶44+AML細(xì)胞的百分比(圖5Α-每個(gè)符號(hào)代表不同的小鼠)。通過下式計(jì)算AML細(xì)胞歸巢到NOD. SCID的BM和脾臟中的效率[所回收的AML細(xì)胞總數(shù)]/[所注射的AML細(xì)胞總數(shù)]X 100。人SIRP α -Fc處理顯著地降低了 AML細(xì)胞歸巢到NOD. SCID的BM (P = 0. 036)和脾臟(NS)中的效率(圖5B)。實(shí)施例6實(shí)施例6示出了用人Sirp α融合蛋白(hSirp α -Fe)進(jìn)行的體外處理，降低了原發(fā)性AML細(xì)胞在NOD. SCID小鼠中的再增殖能力。Pt90181 (未分類的AML)的原發(fā)性AML 細(xì)胞與或不與濃度為50 μ g/ml的hSirp α -Fe，在IMDM+15% BIT中在37°C下孵育2小時(shí)。 孵育后收獲細(xì)胞，并以每只鼠2. 7 X IO6細(xì)胞通過股骨內(nèi)注射移植到亞致死劑量輻照的NOD. SCID小鼠中。移植4周后處死小鼠，并從所注射的股骨(RF)和非注射的股骨(BM)中收獲細(xì)胞，并用抗人抗體染色。通過流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞，從而在hCD45+細(xì)胞的百分比的基礎(chǔ)上，確定每只小鼠的移植水平(圖6)。條狀物表示的是hCD45+細(xì)胞的平均百分比。相比于未處理的對(duì)照組，AML細(xì)胞與hSirp α -Fc的預(yù)孵育，顯著地降低了 RF(P = 0. 0016)和 BM (P = 0. 01)中AML的移植水平。實(shí)施例7實(shí)施例7證明了人Sirp α融合蛋白(hSirp α-Fe)的體內(nèi)處理，降低了原發(fā)性AML 細(xì)胞在NOD. SCID小鼠的移植。將來自患者0285 (FAB M2)的原發(fā)性AML細(xì)胞，通過股骨內(nèi)注射入亞致死劑量輻照的NOD. SCID小鼠中。移植后的最初10天內(nèi)，以每只鼠200 μ g (8mg/ kg)的劑量，腹腔注射hSirp α-Fc，3次/周注射7個(gè)劑量。之后處死小鼠，并收獲從所注射的股骨(RF)和非注射的股骨(BM)和脾中收獲細(xì)胞，并用抗人抗體染色。通過流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞，從而在hCD45+細(xì)胞的百分比的基礎(chǔ)上，確定每個(gè)小鼠的移植水平(圖7)。 條狀物表示的是每組中h⑶45+人細(xì)胞的平均百分比。所標(biāo)示的P值用于比較hSirp α -Fc 處理與PBS處理。用hSirp α -Fc處理顯著地降低了所分析的所有組織中的AML的移植水平。在BM和脾臟中的AML細(xì)胞大幅降低至幾乎檢測(cè)不到的水平，這表明hSirp α -Fc完全抑制了 AML干細(xì)胞從所注射的股骨到其它造血位點(diǎn)的遷移。討論在此我們已經(jīng)表明了，人AML-LSC在NOD. N0R-Iddl3. SCID小鼠中的移植能力顯著降低了，這與正常造血細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)一致。我們的研究結(jié)果與抗⑶47處理移植了 AML 的小鼠所得到的結(jié)果一致(Majeti等，同上)，并支持以下假設(shè)⑶47-SIRPa相互作用的弱化(如在Idd小鼠中)削弱了 AML-LSC的功能。通過抗⑶122處理后的NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的消耗，這種效果或多或少會(huì)得以改善，從而使得其能夠在所注射的股骨中移植，以及在某些情況下能夠遷移到其它骨頭中。這表明至少有一些體內(nèi)抗白血病活性可通過天然免疫系統(tǒng)細(xì)胞介導(dǎo)，特別是通過表達(dá)SIRP α的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明，SIRP α -CD47的相互作用對(duì)于AML細(xì)胞逃避天然免疫攻擊是關(guān)鍵性的，所述天然免疫攻擊是通過巨噬細(xì)胞進(jìn)行的。通過以⑶47或SIRPa為靶標(biāo)而中斷⑶47-SIRP α信號(hào)，是一種可用于消除血液癌癥細(xì)胞的治療方法，所述血液癌癥細(xì)胞為例如白血病干細(xì)胞，優(yōu)選 AML-LSC。我們證實(shí)了，人SIRPa (V2)融合蛋白阻斷了原發(fā)性AML細(xì)胞歸巢到NOD. SCID小鼠骨髓(BM)和脾中，并且降低了原發(fā)性AML細(xì)胞在NOD. SCID小鼠中的再增殖能力。值得注意的是，我們證實(shí)了，體內(nèi)的人Sirpa融合蛋白(hSirp a-FC)的處理降低了 NOD. SCID 小鼠中的原發(fā)性AML細(xì)胞的移植。以上對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神或隨附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)的情況下，可以進(jìn)行各種變化。通過引用的方式并入本文所公開的所有文件。
權(quán)利要求
1.一種治療血液癌癥的方法，其包括調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間的相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過給予治療有效量的多肽，來調(diào)節(jié)所述的人 Sirpa和人⑶47之間的相互作用，所述多肽能夠與人⑶47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述多肽包含可溶性人Sirpa、或其CD47結(jié)合片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述多肽為人Sirpα的胞外結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多肽與第二蛋白融合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述第二蛋白為IgG的Fc部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所得的融合蛋白為SEQID NO. 13。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的去抑制。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述血液癌癥為白血病。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述白血病選自急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、骨髓增生性疾病/瘤和骨髓增生異常綜合征。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述白血病為人急性粒細(xì)胞白血病。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述血液癌癥為淋巴瘤或骨髓瘤， 所述淋巴瘤或骨髓瘤選自霍奇金淋巴瘤、惰性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤(小細(xì)胞和大細(xì)胞)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、巨細(xì)胞性骨髓瘤、重鏈骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤或本斯-瓊斯骨髓瘤。
13.一種用于治療血液癌癥的化合物的用途，所述化合物包括一種多肽，所述多肽能夠通過與人⑶47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，來調(diào)節(jié)人Sirp α和人⑶47之間的相互作用。
14.一種化合物在制備用于治療血液癌癥的藥物中的用途，所述化合物包括一種多肽， 所述多肽能夠通過與人CD47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，來調(diào)節(jié)人Sirp α和人CD47之間的相互作用。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述的能夠與人CD47的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的所述多肽包含可溶性人Sirp α、或其CD47結(jié)合片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其中，所述多肽為人Sirpα的胞外結(jié)構(gòu)域。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述多肽與第二蛋白融合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中，所述第二蛋白為IgG的Fc部分。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中，所得的融合蛋白為SEQID NO. 13。
20.根據(jù)權(quán)利要求13-19中任意一項(xiàng)所述的用途，該用途還可用于巨噬細(xì)胞的去抑制。
21.根據(jù)權(quán)利要求13-19中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述血液癌癥為白血病。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中，所述白血病選自急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、骨髓增生性疾病/瘤和骨髓增生異常綜合征。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中，所述白血病為人急性粒細(xì)胞白血病。
24.根據(jù)權(quán)利要求13-19中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述血液癌癥為淋巴瘤或骨髓瘤，所述的淋巴瘤或骨髓瘤選自霍奇金淋巴瘤、惰性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤(小細(xì)胞和大細(xì)胞)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、巨細(xì)胞性骨髓瘤、重鏈骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤或本斯-瓊斯骨髓瘤。
25.一種用于確定人類遺傳多態(tài)性影響血液癌癥的存活率的方法，所述方法包括a)對(duì)多個(gè)患有所述血液癌癥的人的Sirpα基因進(jìn)行測(cè)序；b)確定所述多個(gè)人中的所述Sirpα基因的核苷酸差異；以及c)將所述的核苷酸差異與存活率相關(guān)聯(lián)，從而確定相關(guān)多態(tài)性。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述核苷酸差異導(dǎo)致氨基酸差異。
27.一種用于預(yù)測(cè)血液癌癥的存活可能性的方法，所述方法包括a)對(duì)受體的Sirpα基因進(jìn)行測(cè)序；以及b)確定根據(jù)權(quán)利要求23所述的相關(guān)多態(tài)性是否存在。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述核苷酸差異導(dǎo)致氨基酸差異。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述氨基酸差異為以下情形的至少一種a)SEQ ID NO. 2 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、 126 位殘基中的至少一個(gè)被置換為 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、 90、91、96、100、102、114、118、126 位的相應(yīng)殘基；或b)SEQID NO. 2的第1 和130位中的至少一個(gè)殘基的缺失。
30.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述多肽選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由SEQID NO. 1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQID NO. 1的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)。
31.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述多肽選自由下列物質(zhì)所組成的組中a)由SEQID N0. 2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQID N0. 2的氨基酸序列的CD47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每 個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換；其中i.在所述多肽中，SEQ ID N0. 2 的第 31、32、；34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、 102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)被置換為 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、 83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相應(yīng)殘基；或 在所述多肽中，SEQ ID Ν0. 2的第1 和130位殘基中的至少一個(gè)是缺失的。
32.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述多肽選自由下列物質(zhì)所組成的組中a)由以下氨基酸序列構(gòu)成的多肽所述氨基酸序列選自由SEQID NOs. 4-7所組成的組中；b)由以下氨基酸序列的CD47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽所述氨基酸序列選自由SEQID NOs. 4-7所組成的組中；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述多肽為CD47結(jié)合片段，并且在以下至少一個(gè)區(qū)域中包含至少3個(gè)連續(xù)氨基酸所述區(qū)域?yàn)樵赟EQ ID NO. 1內(nèi)第50_57、63-71、74_80、 88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-141 位殘基之間的區(qū)域。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述多肽為CD47結(jié)合片段，并且在以下至少一個(gè)區(qū)域中包含至少3個(gè)連續(xù)氨基酸所述區(qū)域?yàn)樵赟EQ ID NO. 2內(nèi)第50_57、63-71、74_80、 88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-143 位殘基之間的區(qū)域。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述多肽為CD47結(jié)合片段，并且在以下至少一個(gè)區(qū)域中包含至少3個(gè)連續(xù)氨基酸，所述區(qū)域?yàn)樵赟EQ ID NOs. 4、6和7中任意一個(gè)內(nèi)第 M-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-116 位殘基之間的區(qū)域；或者在 SEQ ID NO. 5 內(nèi)第 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-115 位殘基之間的區(qū)域。
36.根據(jù)權(quán)利要求30-35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的氨基酸插入、缺失或置換為保守氨基酸置換。
37.根據(jù)權(quán)利要求30-35中任意一項(xiàng)所述的方法，該方法中沒有氨基酸插入、缺失或置換。
38.根據(jù)權(quán)利要求30-35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多肽與人CD47相結(jié)合。
39.根據(jù)權(quán)利要求30-35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多肽為CD47結(jié)合片段，并且長度為6到30個(gè)氨基酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述片段的長度為8到觀個(gè)氨基酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述片段的長度為10到沈個(gè)氨基酸。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述片段的長度為12到M個(gè)氨基酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述片段的長度為14到22個(gè)氨基酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求30-43中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多肽與第二多肽融合。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述第二蛋白為IgG的Fc部分。
46.根據(jù)權(quán)利要求30-45中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述血液癌癥為白血病，優(yōu)選為人急性粒細(xì)胞白血病。
47.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述多肽選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由SEQID NO. 1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQID NO. 1的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)。
48.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述多肽選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由SEQID NO. 2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQID NO. 2的氨基酸序列的CD47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每 個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換；其中i.在所述多肽中，SEQ ID NO. 2 的第 31、32、；34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、 102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)被置換為 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、 83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相應(yīng)殘基；或 在所述多肽中，SEQ ID NO. 2的第1 和130位殘基中的至少一個(gè)是缺失的。
49.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述多肽選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由下列氨基酸序列構(gòu)成的多肽所述氨基酸序列選自由SEQID NOs. 4-7所組成的組中；b)由下列氨基酸序列的CD47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽所述氨基酸序列選自由SEQID NOs. 4-7所組成的組中；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換。
50.根據(jù)權(quán)利要求47-49中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述血液癌癥為白血病，優(yōu)選為人急性粒細(xì)胞白血病。
51.一種用于治療血液癌癥的藥物組合物，其包含有效量的多肽以及可藥用的載體， 所述血液癌癥優(yōu)選為人急性粒細(xì)胞白血病(AML)，所述多肽選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由SEQID NO. 1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQID NO. 1的氨基酸序列的⑶47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)。
52.一種用于治療血液癌癥的藥物組合物，其包含有效量的多肽以及可藥用的載體，所述血液癌癥優(yōu)選為人急性粒細(xì)胞白血病(AML)，所述多肽選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由SEQID N0. 2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)由SEQID N0. 2的氨基酸序列的CD47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每 個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換；其中i.在所述多肽中，SEQ ID N0. 2 的第 31、32、；34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、 102、114、118、126 位殘基中的至少一個(gè)被置換為 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、 ·83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相應(yīng)殘基；或 在所述多肽中，SEQ ID NO. 2的第1 和130位殘基中的至少一個(gè)是缺失的。
53. 一種用于治療血液癌癥的藥物組合物，其包含有效量的多肽以及可藥用的載體，所述血液癌癥優(yōu)選為人急性粒細(xì)胞白血病(AML)，所述多肽選自由下列物質(zhì)組成的組中a)由以下氨基酸序列構(gòu)成的多肽所述氨基酸序列選自由SEQID NOs. 4-7所組成的組中；b)由以下氨基酸序列的CD47結(jié)合片段構(gòu)成的多肽所述氨基酸序列選自由SEQID NOs. 4-7所組成的組中；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一個(gè)的CD47結(jié)合變體，所述變體在該多肽的長度上的每7個(gè)氨基酸中具有至多一個(gè)氨基酸插入、缺失或置換。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)SIRPα-CD47的相互作用，以治療血液癌癥，本發(fā)明還涉及用于該目的的化合物。在一些實(shí)施方案中，提供了SIRPα多肽、片段和融合蛋白用于治療血液癌癥、尤其是人急性粒細(xì)胞白血病的方法和用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102596233SQ201080021398
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者亞歷山大·塞奧哈利德斯, 杰恩·丹斯卡, 王君怡, 約翰·迪克, 蘇伊薩·拉亞庫瑪, 靳黎清 申請(qǐng)人:兒童醫(yī)院, 大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò)