專利名稱：新型蛋白酶體激活性抗衰老肽及含有所述肽的組合物的制作方法
新型蛋白酶體激活性抗衰老肽及含有所述肽的組合物本發(fā)明涉及抗衰老有效物質(zhì)(actifs anti-age)的領(lǐng)域以及特別是其在化妝品
中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及下述通式(I)的肽化合物R1-X1-X2-Asp-Cys-Arg-X3-X4- (AA) p-R2以及其在化妝品和/或藥物中的應(yīng)用以防止和/或矯正衰老和光衰老對(duì)皮膚和角質(zhì)附件(phar^res)的作用并保護(hù)皮膚免于UV輻射的侵害。衰老相應(yīng)于從特定年齡改變生物體的結(jié)構(gòu)和功能的所有生理和心理過程?？梢詤^(qū)分出兩種類型的衰老，第一內(nèi)在衰老，和第二種外在衰老。內(nèi)在衰老是由于疲勞和應(yīng)激以及激素變化如懷孕等狀態(tài)期間所發(fā)生的遺傳因素和生化修飾所致。外在衰老是由于生物體在其終生所經(jīng)受的環(huán)境因素如污染、日光、疾病等所致。衰老是緩慢漸進(jìn)的過程，其通過不同方式影響生物體的所有細(xì)胞并以不同方式顯現(xiàn)。例如，在皮膚水平，皮膚的外觀被各種類型的內(nèi)部或外部侵害所改變，繼而可出現(xiàn)皺紋和細(xì)紋、色素沉著過多或色素沉著不足斑點(diǎn)、皮膚干燥或者甚至脫水、表皮變薄(amincissement)、彈性組織變性、瑕疵、老年斑等。所有這些變化不僅影響皮膚，還影響角質(zhì)附件如指甲和毛發(fā)。這些變化例如是由于細(xì)胞更新和細(xì)胞粘合功能的改變以及由于膠原、彈性蛋白和其它蛋白的合成所致，最終導(dǎo)致皮膚防護(hù)屏障質(zhì)量的降低以及美感喪失的皮膚外觀。但是造成細(xì)胞衰老的主要過程之一毫無疑問是細(xì)胞中受損蛋白質(zhì)的聚積。事實(shí)上，蛋白質(zhì)是各種異常翻譯后修飾如氧化、糖化以及與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物綴合的靶，該現(xiàn)象的發(fā)生率隨年齡而強(qiáng)烈增加。已知自由基在衰老過程中以及更特別是氧化的受損蛋白的形成中起關(guān)鍵作用 (Harman et al. “Aging :a theory based on free radical and radiation chemistry"J. Gerontol. ,11,298-300).受損蛋白的聚積因而引出了負(fù)責(zé)消除這些蛋白的蛋白水解系統(tǒng)有效性的問題，以及特別是引出了不僅涉及消除改變(特別是氧化)的蛋白而且還涉及細(xì)胞內(nèi)蛋白的持續(xù)更新的蛋白酶體系統(tǒng)的有效性問題。泛素-蛋白酶體通路在大量的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。事實(shí)上，由蛋白酶體降解蛋白的機(jī)制涉及重大的細(xì)胞機(jī)制如DNA修復(fù)、基因表達(dá)控制、細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)節(jié)、新合成蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、凋亡或免疫應(yīng)答(Glickman and Ciechanover，2002)。存在于人細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體是非常大的多蛋白復(fù)合物，其存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。蛋白酶體的純化形式包括2個(gè)大亞基；一方面，是稱為20S蛋白酶體的蛋白水解核，以及另一方面，是結(jié)合至所述20S蛋白酶體兩個(gè)末端中每一個(gè)的19S調(diào)節(jié)復(fù)合物(Coux et al., 1996 ；Glickman and Coux, 2001) 所述20S蛋白酶體是空心圓筒狀顆粒，由沘個(gè)α和β 亞基組成，分布在4個(gè)七聚體環(huán)中。肽酶活性存在于所述圓筒的內(nèi)表面上并互相變構(gòu)影響。 三種蛋白水解活性(“胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胱天蛋白酶類”)已與所述20S蛋白酶體相關(guān)聯(lián)并幫助將蛋白破壞成具有3至20個(gè)氨基酸的無活性肽。在所述20S蛋白酶體之外， 26S蛋白酶體包含0. 7MDa的所述19S調(diào)節(jié)復(fù)合物，由大約20個(gè)亞基構(gòu)成。最近的免疫純化研究顯示，其它蛋白可以與所述20S蛋白酶體和19S組合(例如IlS調(diào)節(jié)復(fù)合物)。鑒于經(jīng)蛋白降解控制的細(xì)胞過程的多樣性，觀察到泛素-蛋白酶體通路變化是若干遺傳疾病和許多人類病理的根源或者與其緊密相關(guān)就并不令人驚奇了，所述遺傳疾病和人類病理如結(jié)腸直腸癌、淋巴瘤、炎癥性綜合征或神經(jīng)退化疾病如帕金森病或阿爾茨海默病。過去幾年所進(jìn)行的工作使得可以用蛋白酶體活性來矯正衰老。事實(shí)上，隨年齡增長，氧化蛋白的聚積也增長，觀察到蛋白酶體系統(tǒng)的有效性降低(Petropoulos et al., J. Gerontol. A. Biol. Sci. 2000，55A :B220_7)。蛋白酶體系統(tǒng)有效性的此種降低事實(shí)上是由于蛋白酶體量的降低所致。這些結(jié)果已經(jīng)得到了對(duì)中年個(gè)體對(duì)比青年個(gè)體的細(xì)胞中蛋白酶體的量和活性的那些研究所證實(shí)(Chondrogianni et al.，Exp. Gerontol. 2000 ；35 721-8)。這些結(jié)果以及其他很多結(jié)果證明了衰老和蛋白酶體活性之間的關(guān)聯(lián)并且可以設(shè)想對(duì)皮膚或角質(zhì)附件細(xì)胞中的蛋白酶體表達(dá)的誘導(dǎo)可以對(duì)衰老有正面影響，甚至是延緩衰
ο出于防止或延緩衰老的目的，已提出了 “天然”化妝品組合物例如，專利FR 觀22701公開了基于褐指藻(phaeodactylum algae)提取物的組合物用以促進(jìn)蛋白酶體活性?；蛘撸瑢＠暾?qǐng)F(tuán)R 2898808描述了使用含有微觀藻類(micro-algue)提取物和精氨酸阿魏酸鹽(ferrulate d’ arginine)的組合物用于激活蛋白酶體。其他組合物包含能夠調(diào)節(jié)蛋白酶體活性的化學(xué)化合物以具有抗衰老作用。這些組合物在專利申請(qǐng)WO 2006/105811 或TO 2005/061530中描述。然而，所提議的肽化合物具有很大的大小因而在化妝品領(lǐng)域難以對(duì)其進(jìn)行使用。因此存在需求，特別是在化妝品產(chǎn)業(yè)中，需要新型的具有較小大小的能有效地作為蛋白酶體激活物的化合物。 這就是申請(qǐng)人如何發(fā)現(xiàn)式Ii1-X1-X2-AsP-Cys-Arg-X3-X4-(AA)p-R2的化合物能夠激活蛋白酶體并因而可用于防止或處理衰老的皮膚跡象以及由于UV所致的侵害。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是通式(I)的肽化合物R1-X1-X2-Asp-Cys-Arg-X3-X4- (AA) p-R2其中，X1表示天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或者等于零，X2表示精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或者等于零，&表示精氨酸、賴氨酸或者等于零，X4表示精氨酸、脯氨酸、組氨酸、賴氨酸或者等于零，AA表示除了半胱氨酸之外的任何氨基酸或者其衍生物之一，并且ρ是0和2之間的整數(shù)，R1表示N-端氨基酸的伯胺官能團(tuán)，其是游離的或被保護(hù)基取代，所述保護(hù)基可以選自乙?；?、苯甲酰基、甲苯磺?；蚱S氧羰基，R2表示C-端氨基酸的羧基官能團(tuán)的羥基，其是游離的或被保護(hù)基取代，所述保護(hù)基可以選自C1至C2tl的烷基鏈或者NH2、NHY或NYY基團(tuán)，其中Y表示C1至C4的烷基鏈，所述通式(I)的序列由3至9個(gè)氨基酸殘基組成，所述通式(I)的序列可以包括氨基酸Xp X2> X3、和\被其它化學(xué)等價(jià)氨基酸的取代。本發(fā)明的第二個(gè)目的是包含所述通式(I)的肽化合物作為有效物質(zhì)的化妝品組合物。另外，本發(fā)明的第三個(gè)目的是包含所述通式(I)的肽化合物的化妝品組合物用于防止和/或處理衰老和光衰老的皮膚跡象以及用于改善蛋白酶體對(duì)受損蛋白的降解的用途。最后，本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過使用含有所述通式(I)的肽化合物的組合物來處理皮膚或角質(zhì)附件的化妝品處理的方法。本發(fā)明的目的是下述通式⑴的肽化合物R1-X1-X2-Asp-Cys-Arg-X3-X4- (AA) p-R2其中，X1表示天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸，或者等于零，&表示精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，或者等于零，X3表示精氨酸、賴氨酸，或者等于零，&表示精氨酸、脯氨酸、組氨酸、賴氨酸，或者等于零，AA表示除了半胱氨酸之外的任何氨基酸，或者其衍生物之一，并且ρ是0和2之間的整數(shù)，R1表示N-端氨基酸的伯胺官能團(tuán)，其是游離的或被保護(hù)基取代，所述保護(hù)基團(tuán)可以選自乙酰基、苯甲酰基、甲苯磺酰基或芐氧羰基，R2表示C-端氨基酸的羧基官能團(tuán)的羥基，其是游離的或被保護(hù)基取代，所述保護(hù)基可以選自C1至C2tl的烷基鏈，或者NH2、NHY或NYY基團(tuán)，其中Y表示C1至C4的烷基鏈，所述通式(I)的序列由3至9個(gè)氨基酸殘基組成，所述通式(I)的序列可以包括氨基酸Xp X2> X3、和\被其它化學(xué)等價(jià)氨基酸的取代。本發(fā)明的肽化合物特征在于該化合物能使蛋白酶體活性提高。“能使蛋白酶體活性提高”的肽化合物理解為是指能夠通過增加蛋白酶體亞基的蛋白合成(通過直接或間接調(diào)節(jié)基因表達(dá))或者通過其它生物學(xué)過程如使構(gòu)成蛋白酶體的亞基穩(wěn)定或者使RNA信使轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定而提高蛋白酶體活性的任何生物學(xué)活性肽或衍生物。
本發(fā)明的肽化合物特征在于其激活蛋白酶體對(duì)受損蛋白的降解。“受損蛋白”理解為是指由于活性氧(自由基)而經(jīng)歷了氧化反應(yīng)的蛋白、糖化的或與脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物綴合的蛋白等。在第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽化合物在氨基末端經(jīng)?；蛞阴；槐Ｗo(hù)。在第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽化合物相應(yīng)于下式之一(SEQ ID No. 1) Asp-Cys-Arg-NH2(SEQ ID No. 2)Asp-Cys-Arg-Lys(SEQ ID No. 3)Glu-Leu-Asp-Cys-Arg-Lys-NH2(SEQ ID No. 4)Ser-Asp-Cys-Arg-His-Pro(SEQ ID No. 5)Arg-Asp-Cys-Arg-Arg-Phe-NH2優(yōu)選本發(fā)明的肽化合物相應(yīng)于序列ID No. 1，即Asp-Cys-Arg-NH2。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽化合物相應(yīng)于序列ID No.4，即 Ser-Asp-Cys-Arg-His-Pro0本發(fā)明還涉及這些序列的同源形式。術(shù)語“同源”根據(jù)本發(fā)明是指與選自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 5序列的所述肽序列至少50%、或者優(yōu)選至少80%以及更優(yōu)選至少90%
6相同的任何肽序列。“至少相同的肽序列”理解為是指要比較的兩個(gè)序列的氨基酸殘基之間的百分比相同性，其是在所述兩個(gè)序列的最佳排列對(duì)比后獲得的。所述最佳排列對(duì)比是通過使用局部同源性算法獲得的，如由NCBI站點(diǎn)上可用的BLAST P計(jì)算機(jī)軟件所使用的那些。術(shù)語“同源”還可以指與SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 5序列的肽序列通過化學(xué)等價(jià)氨基酸的取代而不同的肽，即通過由另一個(gè)具有相同性質(zhì)的殘基的取代。因此，常規(guī)取代發(fā)生在Ala、Val、Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln 之間；以及堿性殘基Lys和Arg之間；或者芳香殘基Phe和Tyr之間。構(gòu)成本發(fā)明肽的氨基酸可以是左旋即L-和/或右旋即D-構(gòu)型。因此本發(fā)明的肽可以是L-、D-或DL-形式。術(shù)語“肽”或“肽化合物”是指通過肽鍵或通過修飾的肽鍵相互連接的2個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連接?！半摹被颉半幕衔铩崩斫鉃槭侵干鲜霰景l(fā)明的天然或合成肽，或者經(jīng)蛋白水解或合成而獲得的其片段的至少一個(gè)，或者其序列部分或完全由前述肽的序列所構(gòu)成的任何天然或合成肽。為了改善對(duì)降解的抗性，可能需要使用本發(fā)明肽的受保護(hù)形式。保護(hù)的形式顯然必須是生物學(xué)相容的形式并且必須與化妝品或者藥物領(lǐng)域的用途相容?？梢栽O(shè)想很多生物學(xué)相容保護(hù)形式。其是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如例如氨基末端和/或羧基末端的酰化或乙?；?。因此，本發(fā)明涉及組合物，如前述所定義的，特征在于SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 5的肽為單一保護(hù)或雙重保護(hù)的形式。優(yōu)選使用基于用NYY 基團(tuán)對(duì)羧基末端的羥基官能團(tuán)的酰胺化的保護(hù)，其中Y表示C1至C4的烷基鏈；或者使用基于通過烷基的酯化的保護(hù)。也可以保護(hù)肽的兩個(gè)末端。本發(fā)明通式(I)的肽可以由組成氨基酸或其衍生物通過常規(guī)化學(xué)合成獲得(以固相或者均質(zhì)液相)或者通過酶合成獲得(Kullman et al. , J. Biol. Chem. 1980，225，8234)。本發(fā)明的肽可以是天然或合成來源的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選所述肽得自化學(xué)合成。最后，所述有效物質(zhì)可以是單一的肽、肽的混合物或肽衍生物和/或由氨基酸衍生物構(gòu)成。 本發(fā)明的肽化合物可以用作藥物。本發(fā)明的第二個(gè)目的涉及包含所述通式(I)的肽化合物作為有效物質(zhì)的化妝品組合物。優(yōu)選本發(fā)明的組合物呈適于表面應(yīng)用的含化妝品可接受介質(zhì)的形式。“化妝品可接受的”理解為是指適用于與皮膚或與人角質(zhì)附件接觸而無毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答或其它繼發(fā)效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的介質(zhì)。優(yōu)選所述肽化合物以大約0. 0005至500ppm之間的濃度、優(yōu)選為0. 01至5ppm之間的濃度存在于所述組合物中。在本發(fā)明的組合物中，所述肽化合物溶解在一或多種溶劑中，如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基二乙二醇或丙氧基二乙二醇、環(huán)多元醇、白凡士林、植物油或任何這些溶劑的混合物。根據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，本發(fā)明的有效物質(zhì)被溶解在化妝品或者藥物載體中如脂質(zhì)體，或者被吸附在粉末狀有機(jī)聚合物、礦物支持物上如滑石和膨潤土，更常見的是溶解在任何生理可接受的載體中或者固定于其上。要應(yīng)用于皮膚上的組合物可以呈水溶液或水醇溶液(de solutionhydroalcoolique)的形式、油包水乳劑或水包油乳劑、微乳劑、含水或無水凝膠、漿液、或其他小泡擴(kuò)散劑(dispersion de Wsicules)、貼片、乳液、噴劑、軟膏、潤發(fā)油、洗液、膠質(zhì)、溶液、懸浮液或其它形式。所述組合物也可以洗發(fā)水、以刷子或梳子應(yīng)用的染發(fā)劑或睫毛膏的形式應(yīng)用至表皮附件上，特別是應(yīng)用至睫毛、眉毛或頭發(fā)上，或者指甲處理如指甲油。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還含有至少一種促進(jìn)所述肽化合物作用的其它有效物質(zhì)?？梢苑窍拗菩缘姆绞教峒跋骂惓煞制渌幕钚晕镔|(zhì)、植物提取物、結(jié)瘢劑、 抗衰老劑、抗皺紋劑、撫慰劑、抗自由基劑、抗UV劑、刺激真皮大分子合成或能量代謝的物質(zhì)、保濕劑、抗菌劑、抗真菌劑、抗炎劑、麻醉劑、調(diào)節(jié)皮膚分化的物質(zhì)、著色或脫色劑、刺激指甲和毛發(fā)生長的物質(zhì)。優(yōu)選使用在抗皺紋領(lǐng)域中表現(xiàn)出活性的物質(zhì)，如抗自由基劑或抗氧化劑，或刺激真皮大分子合成的物質(zhì)或者刺激能量代謝的物質(zhì)。更具體地，所述有效物質(zhì)選自維生素類、植物留醇類、黃酮類化合物、DHEA和/或其前體之一或者其化學(xué)或生物學(xué)衍生物之一、金屬蛋白酶抑制劑或類視色素。此外，也可向該組合物加入添加劑，如增稠劑、乳化劑、濕潤劑、軟化劑、香味劑、抗氧化劑、成膜劑、螯合劑、掩蔽劑、調(diào)節(jié)劑等。在所有情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)確保對(duì)這些佐劑以及其比例進(jìn)行選擇以便不會(huì)損害本發(fā)明組合物的所希望的有利特性。這些佐劑可以例如范圍在該組合物總重量的0.01 至20%。當(dāng)本發(fā)明的組合物是乳劑時(shí)，脂肪相相對(duì)于該組合物總重量可以占重量的5至 80%以及優(yōu)選占重量的5至50%。該組合物中所使用的乳化劑和共乳化劑將從所考慮領(lǐng)域中通常使用的那些中選取。例如，它們相對(duì)于該組合物總重量可以使用重量的0. 3至30% 的比例。最后，本發(fā)明涉及包含所述肽化合物以提高蛋白酶體活性并改善由蛋白酶體對(duì)受損蛋白的降解的組合物。本發(fā)明的第三個(gè)目的涉及利用包含所述肽化合物以及化妝品可接受介質(zhì)的化妝品組合物來防止和/或處理衰老和光衰老的皮膚跡象。“衰老的皮膚跡象”包括但不限于由衰老所引起的皮膚上可見的所有表現(xiàn)。特別地，這理解為是指皺紋、深紋和粗紋、細(xì)紋、劃痕、松弛的皮膚和皮下組織、皮膚彈性的喪失和張力缺失、皮膚硬度和緊張性的喪失以及皮膚萎縮。此外，“衰老的皮膚跡象”也理解為是指擴(kuò)大的毛孔、瑕疵、變色、老年斑、角化癥、膠原蛋白喪失以及真皮和表皮中的其它變化， 還有皮膚和角質(zhì)附件外觀的任何由于衰老的改變，如例如表皮角質(zhì)層的表面粗糙，還有不系統(tǒng)性地導(dǎo)致外觀變化的皮膚的任何內(nèi)部變化，如例如真皮變薄?！肮馑ダ稀崩斫鉃槭侵赣砷L期和累積的日光暴露所引起的皮膚的提早衰老。本發(fā)明因此涉及利用組合物來處理或防止皺紋、深紋和粗紋、細(xì)紋、劃痕、松弛的皮膚和皮下組織、皮膚彈性喪失和張力缺失、皮膚硬度和緊張性的喪失以及皮膚萎縮。此外，本發(fā)明的所述組合物激活細(xì)胞更新以及徹底地清潔細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及利用本發(fā)明的組合物保護(hù)皮膚抵抗由于UV輻射導(dǎo)致的侵害。最后，本發(fā)明涉及利用包含所述肽化合物的組合物來提高蛋白酶體活性并改善由蛋白酶體對(duì)受損蛋白的降解。本發(fā)明的最后的目的涉及化妝品處理的方法，其特征在于將包含有效量的本發(fā)明肽化合物的組合物表面應(yīng)用于要處理的皮膚或角質(zhì)附件以防止和/或處理衰老和光衰老的皮膚跡象。此外，此化妝品處理方法特征在于所述組合物在就寢前應(yīng)用以便在細(xì)胞更新周期期間清潔細(xì)胞和皮膚。事實(shí)上，在夜間，皮膚優(yōu)先進(jìn)行更新功能以及代謝合成過程。因此，根據(jù)皮膚的生物節(jié)律應(yīng)用所要求保護(hù)的組合物，使得能夠使細(xì)胞恢復(fù)活力、刺激細(xì)胞更新以及獲得再生效應(yīng)。如下實(shí)施例描述并證明了本發(fā)明所述肽化合物的有效性，但是不應(yīng)解讀為是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 衰老的角質(zhì)形成細(xì)胞樽型的確認(rèn)衰老的角質(zhì)形成細(xì)胞上泛素化蛋白和20S蛋白酶體的免疫印跡培養(yǎng)中的角質(zhì)形成細(xì)胞的衰老過稈正常的人角質(zhì)形成細(xì)胞(NHK)，細(xì)胞分離自人皮膚活組織檢查。這些細(xì)胞在37°C 于5% CO2的加濕空氣中在特定角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)中維持培養(yǎng)。通過進(jìn)行一系列重復(fù)傳代培養(yǎng)獲得衰老的NHK細(xì)胞。簡言之，將細(xì)胞在75cm2燒瓶中以低密度接種并在兩次傳代之間培養(yǎng)5至10天。通過將有效物質(zhì)每周3次直接加入到培養(yǎng)基中用有效物質(zhì)處理細(xì)胞或者不處理細(xì)胞。繼而將該細(xì)胞在這些條件下維持45天?！銎颓鑫告R 艦成細(xì)卜她_跡。石角·們的模型，首先應(yīng)證明在培養(yǎng)中的經(jīng)實(shí)驗(yàn)衰老的角質(zhì)形成細(xì)胞上，泛素化蛋白表達(dá)水平以及 20S蛋白酶體的水平，根據(jù)文獻(xiàn)隨時(shí)間降低。通過免疫印跡技術(shù)來評(píng)價(jià)這些蛋白的表達(dá)水平。免疫印跡(或者western印跡)技術(shù)是半定量方法，其使得可以確定細(xì)胞中所研究的蛋白的水平，即由泛素特異性抗體(DAKO)所確定的泛素化蛋白的水平以及由蛋白酶體特異性抗體(CALBI0CHEM)所確定的20S蛋白酶體的水平。將衰老的角質(zhì)形成細(xì)胞在75cm2燒瓶中于37°C在含有5% CO2的加濕空氣中培養(yǎng) 10、20、30和40天。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)日不處理細(xì)胞。通過使用提取緩沖液QOmM TRIS, 150mM NaCl, IOmM EDTA,0. 2% Triton X10)在存在蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的情況下清洗細(xì)胞并繼而使其與支持物分開。在使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce)測定之前將如此所提取的蛋白在4°C以IOOOOrpm離心10分鐘。將細(xì)胞裂解產(chǎn)物與變性緩沖液混合并進(jìn)行SDS PAGE 電泳。所使用的凝膠是Nupage 4-12%凝膠(Invitrogen)。繼而將蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜 (Pal corporation)。在PBS-牛奶5%、0. 1 % tween 20中將該膜于環(huán)境溫度飽和2小時(shí)， 繼而在4°C與一抗溫育整夜。對(duì)于泛素化蛋白研究，一抗是以1/500稀釋使用的兔抗泛素抗體(DAKO)。對(duì)于20S蛋白酶體研究，一抗是以1/1000稀釋使用的小鼠抗20S蛋白酶體抗體 (CALBI0CHEM)。與一抗溫育之后，對(duì)于泛素化蛋白的情況是與稀釋至1/1000的抗兔IgG過氧化物酶二抗(IMMUN0TECH)溫育，或者對(duì)于蛋白酶體的情況是與稀釋至1/1000的抗小鼠IgG過氧化物酶二抗(IMMUN0TECH)溫育。通過化學(xué)發(fā)光底物來進(jìn)行顯影。通過Chemiimager軟件(Alpha Innotech Corporation USA)評(píng)估細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)。所研究的蛋白的量表示為與實(shí)驗(yàn)時(shí)間0的對(duì)照條件對(duì)比的發(fā)光強(qiáng)度的百分比。結(jié)果泛素化蛋白在衰老期間的角質(zhì)形成細(xì)胞上的免疫印跡
權(quán)利要求
1.下述通式(I)的肽化合物 R1-X1-X2-Asp-Cys-Arg-X3-X4- (AA) p-R2 其中，X1表示天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、或者等于零， X2表示精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、或者等于零， X3表示精氨酸、賴氨酸、或者等于零， X4表示精氨酸、脯氨酸、組氨酸、賴氨酸、或者等于零，AA表示除了半胱氨酸外的任何氨基酸、或者其衍生物之一，并且ρ是0和2之間的整數(shù)，R1表示N-端氨基酸的伯胺官能團(tuán)，其是游離的或被保護(hù)基取代，所述保護(hù)基可以選自乙酰基、苯甲?；?、甲苯磺?；蚱S氧羰基，R2表示C-端氨基酸的羧基官能團(tuán)的羥基，其是游離的或被保護(hù)基取代，所述保護(hù)基可以選自Cl至C20的烷基鏈，或者NH2、NHY或NYY基團(tuán)，其中Y表示Cl至C4的烷基鏈， 所述通式(I)的序列由3至9個(gè)氨基酸殘基組成，所述通式(I)的序列可以包括氨基酸&、&、&、和&被其它化學(xué)等價(jià)氨基酸的取代。
2.權(quán)利要求1的肽化合物，特征在于所述化合物相應(yīng)于下式之一 (SEQ ID No. l)Asp-Cys-Arg-NH2(SEQ ID No. 2)Asp-Cys-Arg-Lys (SEQ ID No. 3)Glu-Leu-Asp-Cys-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID No. 4)Ser-Asp-Cys-Arg-His-Pro (SEQ ID No. 5)Arg-Asp-Cys-Arg-Arg-Phe-NH2。
3.任何前述權(quán)利要求任一的肽化合物，特征在于所述化合物用作藥物。
4.包含權(quán)利要求1或2之一的肽化合物作為有效物質(zhì)的化妝品組合物。
5.權(quán)利要求4的化妝品組合物，特征在于所述組合物是包含化妝品可接受介質(zhì)的適于表面應(yīng)用的形式。
6.權(quán)利要求4或5的組合物，特征在于所述肽化合物在所述組合物中的濃度在大約 0. 0005至500ppm之間，優(yōu)選濃度在以0.01 M 5ppm之間。
7.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的組合物，特征在于所述肽有效物質(zhì)溶解于一或多種溶劑中， 如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基或丙氧基二乙二醇、環(huán)多元醇、白凡士林、植物油或者任何這些溶劑的混合物。
8.權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)的組合物，特征在于所述組合物還含有至少一種促進(jìn)所述肽化合物的作用的其它有效物質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的組合物，特征在于所述有效物質(zhì)是在抗皺紋領(lǐng)域中呈現(xiàn)出活性的物質(zhì)如抗自由基劑或抗氧化劑，或者是刺激真皮大分子合成的物質(zhì)或者刺激能量代謝的物質(zhì)。
10.權(quán)利要求8或9之一的組合物，特征在于所述有效物質(zhì)選自維生素類、植物留醇類、 黃酮類化合物、DHEA和/或其前體之一或其化學(xué)或生物學(xué)衍生物之一、金屬蛋白酶抑制劑或類視色素。
11.包含如權(quán)利要求1或2之一所定義的所述肽化合物以及化妝品可接受介質(zhì)的化妝品組合物用于防止和/或處理衰老和光衰老的皮膚跡象的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，特征在于衰老的跡象理解為是指皺紋、深紋和粗紋、細(xì)紋、劃痕、松弛的皮膚和皮下組織、皮膚彈性喪失和張力缺失、皮膚硬度和緊張性的喪失、和皮膚萎縮。
13.權(quán)利要求11的用途，特征在于所述組合物激活細(xì)胞更新和徹底地清潔細(xì)胞。
14.權(quán)利要求11的用途，特征在于所述組合物使皮膚能夠被保護(hù)免受UV輻射所致的侵害。
15.權(quán)利要求11的用途，化妝品組合物用于提高蛋白酶體活性并改善由蛋白酶體對(duì)受損蛋白的降解。
16.化妝品處理方法，特征在于將包含有效量的如權(quán)利要求1或2之一所定義的肽化合物的組合物表面應(yīng)用于要進(jìn)行處理的皮膚或角質(zhì)附件以防止和/或處理衰老和光衰老的皮膚跡象。
17.如前述權(quán)利要求所定義的化妝品處理方法，特征在于在就寢前應(yīng)用該組合物以便在細(xì)胞更新周期期間清潔皮膚。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的肽化合物R1-X1-X2-Asp-Cys-Arg-X3-X4-(AA)p-R2。此外，本發(fā)明涉及(i)在化妝或藥物可接受的介質(zhì)中包含至少一種通式(I)的肽的化妝品組合物或藥物組合物；以及(ii)其在防止或處理衰老和光衰老的皮膚跡象以及保護(hù)皮膚免受UV輻射所致?lián)p害中的用途。本發(fā)明還涉及化妝品處理方法，所述方法用于防止和/或抵抗衰老和光衰老的皮膚跡象。
文檔編號(hào)A61K38/06GK102428095SQ201080021998
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者C·達(dá)爾法拉, J-M·博托, N·東洛熱 申請(qǐng)人:Isp投資公司