專利名稱：癌癥起始細胞的線粒體活性抑制劑及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于預防和/或治療腫瘤的化合物。更具體而言，本發(fā)明涉及神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性的抑制劑，所述抑制劑用于在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞的腫瘤的方法。本發(fā)明還提供一種包含本發(fā)明的抑制劑的藥物組合物，以及一種識別本發(fā)明的抑制劑的篩選方法。
背景技術：
神經膠質瘤是成人中最常見的一種腦部腫瘤。神經膠質瘤的惡性形式，IV級，也稱為多形性成膠質細胞瘤(GBM)，是眾所周知地難以治療。在大多數(shù)情況下這種腫瘤都會復發(fā)，而實際上與包括手術、放療和化療的目前所有的治療方法無關。存活率非常低，例如， 14. 6個月，即使在結合了化療與放療的情況下。還沒有環(huán)境風險因素被確認，而且關于這些腦部腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的生物學機制，了解的也非常少。奧托-瓦爾堡(Otto Warburg) 1930年提出，當非腫瘤細胞在以下兩個連續(xù)階段之后采用無氧代謝時，癌癥會發(fā)生，所述兩個連續(xù)階段為(1)呼吸作用的不可逆損傷；(2)醣酵解成功取代呼吸作用的不可挽回的損失。根據(jù)這個理論，大多數(shù)的癌細胞被認為在有氧環(huán)境下會優(yōu)先通過由葡萄糖產生乳酸來生產能量，這種現(xiàn)象通常被稱為“有氧糖酵解”并被稱為瓦爾堡效應(Warburg's effect) 0因此，針對這種有氧糖酵解代謝途徑開發(fā)癌癥治療在最近幾十年中受到越來越多的關注，這種途徑可以允許代謝過程向有效呼吸的重建和通過線粒體產生能量。一些出版物提出，神經膠質瘤細胞的線粒體是癌癥化療的潛在靶點(Daley等， 2005, Biochemical and Biophysical Research Communications,328 (2) :623-632; Pilkington 等，2008，Seminars in cancer biology England, 18(3) :226-235)。這些出版物公開了無需進一步化療或手術的治療，所述治療涉及作為線粒體復合物III抑制劑的氯丙咪嗪或常規(guī)三環(huán)化合物和用于神經膠質瘤細胞(癌細胞)的潛在化學療法。所述抑制劑通過激活線粒體途徑即通過釋放細胞色素C和激活胱天蛋白酶-3誘導細胞凋亡。這種療法是可能的，因為神經膠質瘤細胞(癌細胞)具有與正常細胞不同的代謝。WO 2008/031171 (格里菲斯大學)也公開了一些抗癌化合物和治療或預防癌癥的方法。具體而言，公開了促氧化劑抗癌化合物，例如維生素E的助氧化劑形式，其選擇性地與癌細胞中線粒體呼吸鏈的復合物II (琥珀酸-泛醌氧化還原酶)相互作用，產生活性氧并誘導這些細胞的凋亡。然而，這種治療策略假定了每一個單獨的癌細胞(例如神經膠質瘤細胞)的生物學和代謝是相似的，不幸的是，這種治療策略沒有在神經膠質瘤的治療中提供顯著進步。盡管神經膠質瘤確切的細胞起源仍不清楚，人們認為，只有一部分具有干細胞性質的癌細胞，通常被稱為癌癥干細胞(CSC)，才具有真正致瘤的可能性，并構成神經膠質瘤中的腫瘤起始細胞的離散儲存庫。最近在許多人類癌癥如急性骨髓性白血病(AML)、乳腺癌、卵巢癌和腦癌中類似干細胞的細胞(SC)的識別，重新喚起了對癌癥可能來源于成人干細胞/祖細胞的體細胞突變這一假設的興趣。稱為神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腦部腫瘤癌癥起始細胞最初被識別為CD133+ 細胞，但最近的研究證明這個標志特異性相對不足。這些細胞是具有不同致瘤能力的異質細胞群體，某些腫瘤細胞具有出眾的腫瘤發(fā)生和繁殖能力。神經膠質瘤起始細胞(GIC)是神經膠質瘤的發(fā)生和復發(fā)的原因。具有干細胞性質的神經膠質瘤起始細胞的作用還沒有被充分地研究。這些細胞表現(xiàn)出典型的干細胞特征，包括在單細胞層面上的自我更新能力、具有星形膠質跡象的多潛能性、在體外的神經元和少突神經膠質分化和在在體內的致瘤性。 像其他人類癌癥那樣，神經膠質瘤包括多個細胞層次，在所述細胞層次的頂端具有干細胞性質的腫瘤起始和繁殖細胞(稱為癌癥干細胞-csc)似乎控制腫瘤的生長。這種較少兩的類似癌癥干細胞的細胞GIC只占腫瘤細胞(神經膠質瘤)的約5%的GIC可能代表著腫瘤細胞擴張、復發(fā)和轉移的來源，從而決定腫瘤的生物學行為，包括增殖、生長以及隨后的對治療的響應。標靶神經膠質瘤起始細胞仍然具有挑戰(zhàn)性，因為這些細胞培養(yǎng)時罕見且不穩(wěn)定， 并且缺乏有效的追蹤試劑。到目前為止，沒有針對神經膠質瘤起始細胞的治療顯示完全根除神經膠質瘤生長，或在任何常位異種移植和/或轉基因小鼠模型中沒有復發(fā)。已經證明了神經膠質瘤衍生的腫瘤起始細胞對常規(guī)放療的抵抗性(Bao等，2006 ；Clement等，2007)。 例如眾所周知，神經膠質瘤起始細胞抵抗化療藥物如替莫唑胺。這些數(shù)據(jù)可以解釋神經膠質瘤不可避免的復發(fā)，并且將神經膠質瘤起始細胞定義為新型靶點以克服這種疾病中對常規(guī)療法的抵抗性。到目前為止，還沒有針對神經膠質瘤復發(fā)的有效治療。仍然需要找到特別是針對神經膠質瘤起始細胞的有效治療。但是，在識別任何針對神經膠質瘤起始細胞的有效分子以及在神經膠質瘤治療中獲得任何重大進展之前，更好并更深入地了解神經膠質瘤起始細胞的細胞和分子機制是至關重要的。

發(fā)明內容
出乎意料地，本申請人已經證明，神經膠質瘤起始細胞具有與其他癌細胞如神經膠質瘤不同的代謝方式。因此，本發(fā)明提供一種神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA 循環(huán)活性的抑制劑，所述抑制劑用于在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和 /或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時間里，GIC的存活降低超過50% ；2)在最多20天的恢復階段的時間里，GIC的恢復低于0. 2倍；以及3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑期間和之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的。并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑阻止由GIC產生
能量°此外，本發(fā)明提供一種用于在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和
6/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物含有至少一種本發(fā)明所述的電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑，以及一種或多種可藥學可接受的稀釋劑或載體。本發(fā)明的另一目的是一種在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/ 或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，所述方法包括施用有效量的電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時間里GIC的存活降低超過50% ；2)在最多20天的恢復階段期間，GIC的恢復低于0. 2倍；以及3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑期間以及之后， 正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的。并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑阻止由GIC產生
能量°此外，本發(fā)明提供一種用于識別神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性抑制劑的篩選方法，所述方法包括使從腫瘤細胞樣本中分離的FLl+細胞和正常腦細胞與待篩選的抑制劑接觸，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述抑制劑最多20天的時間里，F(xiàn)Ll+細胞的存活降低超過50% ；2)在最多20天的恢復階段的時間里，F(xiàn)Ll+細胞的恢復低于0. 2倍；3)在暴露于所述抑制劑期間以及之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的。本發(fā)明還包括一種用于篩選神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性抑制劑的試劑盒，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述抑制劑最多20天的時間里，F(xiàn)Ll+細胞的存活降低超過50% ；2)在最多20天的恢復階段的時間里，F(xiàn)Ll+細胞的恢復低于0. 2倍；3)在暴露于所述抑制劑期間以及之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的；所述試劑盒用于治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞的腫瘤，其中所述試劑盒含有原代 CIC培養(yǎng)物、原代黏附性神經膠質瘤細胞、正常細胞以及線粒體電子傳輸鏈復合物(I)或復合物(III)活性的至少一種標準抑制劑，所述標準抑制劑選自魚藤酮和抗霉素A。


圖1表示哺乳動物細胞的厭氧和有氧途徑的示意圖。(修改自Lemire等，2008， PLoSONE, 3 (2)卷，el250)圖2表示指示癌癥干細胞中線粒體活性的參數(shù)。A :FLl+(具有黑色短劃線的白色背景)和FL1°細胞群(白色)中Mito+細胞(通過在加入M75-13染料后通過對FL3陽性細胞的數(shù)量定量來確定)的百分比以及通過FACS中的FLl-H和FL3-H通道檢測的FLl+細胞(黑色)中FLl自體熒光的水平。圖3示出了與FL1°、原代神經膠質瘤和正常腦細胞相比的FLl+細胞降低的糖酵解活性。A =FLl+和FLl0細胞的代謝水平(LAC 乳酸(lactate)，PYR 丙酮酸(pyruvate)， GLUC 葡萄糖)。B和C 乳酸(LAC)增加對相差成像的FLl+細胞形態(tài)(B)和FLl0細胞百分含量(C)的影響。未處理的(NT)；比例尺150μΜ。D 在純化的FLl+和FL1°細胞中活性乳酸脫氫酶的水平(以UI/L表達的LD)。圖4示出了 DCA或草酸鹽處理對FLl+細胞的影響，所述影響基于用上述試劑處理的樣品中與處理載體對照的樣品中死亡的FLl+細胞百分比的比值。A :DCA處理(氧化途徑的活化劑)。B 草酸鹽處理(細胞質基質的乳酸脫氫酶3-5 (LDH3-5)的抑制劑)。圖5示出了實施例2中描述的用于測試抗癌癥干細胞試劑的方案。A 治療及恢復期間的實驗操作。B 用有效的(黑色粗線)抗SCS試劑或無效的(黑色粗虛線)抗SCS試劑處理CIC之后的存活響應曲線的示意圖。Tx代表處理了 χ時間的期間，例如10天(TlO)、 20天(T20)，R代表特定時間期間的恢復階段，如10天(RlO)和20天(R20)。圖6示出了實施例2所描述的體外復發(fā)分析中藥物的效果，用存活的處理過的 FLl+百分含量與存活的對照FLl+百分含量的比(1)，或者存活的處理過的細胞的百分含量與存活的對照細胞的百分含量的比⑵來表示。A:25Gy的Y-射線。Β:25μΜ的替莫唑胺(TMZ)。C :5 μ M 的魚藤酮(Rot) ；D :5 μ M 的抗霉素 A(AA)。E :5 μ M 的寡霉素 A/B (Oligo A)。F 氯丙咪嗪，又稱為氯米帕明(anfranil) (10 μ M)。Tx代表處理了 χ時間的期間，例如 10天(TlO)、20天(Τ20)，R代表特定時間期間的恢復階段，如10天(RlO)和20天(R20)。圖7示出了用不同抑制劑處理的細胞的體內致腫瘤性。曲線圖示出了在用原代 GBM-2細胞注射之后的所有無病癥小鼠總數(shù)的百分比，所述原代GBM-2細胞在植入前用不同分子在體外處理了 10天。對照小鼠在植入4周后出現(xiàn)病癥并被處死。組織學分析表明有塊狀腫瘤的存在。植入有用ΑΑ、魚藤酮或氯米帕明處理的細胞的小鼠仍然存活并沒有病癥。實驗在植入后17周停止。組織學分析表明沒有可見的腫瘤。
具體實施例方式盡管與本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐或測試，但是下面描述合適的方法與材料。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其參考文獻都通過弓丨用并入它們的全部內容。提供本文所討論的出版物和申請僅是針對其在本申請?zhí)峤蝗罩暗墓_。本文并不被解釋為承認本發(fā)明無權憑借在先發(fā)明而這些出版物。 此外，材料、方法和實施例都只是說明性的，并不是為了限定。在有沖突的情況下，本說明書，包括定義，將作為標準。 除非另有定義，本文所使用的所有技術和科學術語與本領域技術人員的通常理解一致。當在本文中使用時，為了方便理解本發(fā)明，提供以下定義。術語“含有” 一般用于表達包含的意思，即是說允許存在一個或多個特征或組分。除非上下文中另外清楚地表述，當在本說明書與權利要求書中使用時，單數(shù)形式 “一個”、“一種”和“所述”包括有復數(shù)的含義。當在本文中使用時，術語“受試者”或“患者”是本領域中公知的，在本文可交替地用于表示哺乳動物，包括狗、貓、大鼠、小鼠、猴子、牛、馬、山羊、綿羊、豬、駱§它，以及最優(yōu)選地，人。在某些實施方案中，所述受試者是需要治療的受試者，或患有疾病或病癥的受試者， 所述疾病或病癥例如癌癥，優(yōu)選神經膠質瘤。然而，在其他實施方案中，受試者可以是正常受試者或已經經過治療的受試者，所述治療例如神經膠質瘤實體的前期移除。這一術語不表示具體年齡或性別。因此，成熟和新生受試者，無論雄性或雌性，都將被覆蓋。在治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞的癌癥中有用試劑例如抑制劑的識別，是指運用可靠的篩選方法識別、分離并表征整個癌癥起始細胞(CIC)庫。優(yōu)選使用由一般從常規(guī)干細胞生物學(Burdsal等，1995，Cytometry, 21,145-152)外推得到的任意標記物(如作為干性的讀出的CD133)確定的癌細胞系例如神經膠質瘤細胞系的方法被認為是有偏差的。因此，本申請人采用在國際專利申請PCT/IB2008/0M872中描述的他們近期所開發(fā)的方法來分離和富集表現(xiàn)出自我更新和腫瘤起始性質的亞群。這種方法依賴于來源于人樣本的原代細胞培養(yǎng)物并依賴于腫瘤細胞的簡單、強大的表型特征，并且允許從非致瘤性神經膠質瘤細胞(被稱為FLltl細胞)中快速的識別和分離癌癥起始細胞(CIC)(在本方法中被稱為FLl+細胞)，而不依賴于任何細胞表面標記，例如CD133。本申請人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，癌癥起始細胞(CIC)，例如神經膠質瘤起始細胞，(更具體而言，本文使用的FLl+細胞群)確實使用有氧途徑(TCA循環(huán)/氧化磷酸化-電子轉移鏈)來產生它們的能量、分裂以及存活。本申請人還出乎意料地發(fā)現(xiàn)，神經膠質瘤起始細胞 (GIC)與來自腫瘤實體的其他神經膠質瘤細胞(癌細胞)相比，具有不同的代謝方式，腫瘤實體優(yōu)先使用有氧糖酵解(Warburg’ s效應)。本申請人確實得到了一個有趣且出乎意料的的發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ll+細胞(GIC)富有NADH、活性線粒體和活性LD。此外，與FLltl細胞相比，F(xiàn)Ll+ 細胞具有較低的乳酸水平，這表明FLl+細胞可能優(yōu)先于采用有氧-線粒體途徑來產生ATP。PCT/IB2008/054872所述方法有以下步驟(a)提供腫瘤細胞樣品；(b)在培養(yǎng)基中任選地培養(yǎng)在步驟(a)中提供的細胞；(c)在亞樣品中從根據(jù)步驟(a)或(b)提供的細胞中分離表現(xiàn)自發(fā)熒光發(fā)射的細胞(FLl+細胞)，當通過熒光活化細胞分選的方法用波長為或約為488納米的激光束激發(fā)時，在FLl通道中檢測所述自發(fā)熒光發(fā)射。(d)在另一亞樣品中通過熒光活化細胞分選法分離在步驟(C)中沒有熒光性的細胞(FL1°細胞)以及在FL3和/或FL4通道中檢測的熒光中表現(xiàn)出微小正偏移的細胞；(e)從根據(jù)步驟(C)和(d)獲得的每個分離細胞亞樣品中排除死細胞；(f)在根據(jù)步驟(e)處理之后匯集根據(jù)步驟(C)得到的細胞亞樣品；(g)在根據(jù)步驟(e)處理之后匯集根據(jù)步驟(d)得到的細胞亞樣品。FLl+和FLltl神經膠質瘤細胞群之間的體外和體內的表型和行為差異由進一步的表征支持，所述表征證明FLl+細胞富有干性相關基因、是多能性的、能夠產生FLltl細胞并且是超長時間保持長期自我更新能力的原因。因為源自FLltl的培養(yǎng)物不產生任何FLl+細胞的培養(yǎng)基，其進一步證明FL1°細胞來源于FLl+細胞群，保持存活若干代，但一旦它們從FLl+ 狀態(tài)轉變?yōu)镕Lltl狀態(tài)它們就不能重新獲得自發(fā)熒光的性質。因此，這種方法和這種分離出的細胞群提供了用于測試試劑如抑制劑的可靠的技術，所述試劑可以用于治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞的癌癥。采用篩選他們設計的抗GIC試劑的特異性的新型體外復發(fā)分析法，本申請人發(fā)現(xiàn)，標靶氧化性細胞能量制造過程的試劑如抑制劑表現(xiàn)出了可靠的持續(xù)時間長的根除CICs 的功效。因此，防止NADH在線粒體復合物I或III中轉化為細胞ATP并誘導H2O2生成的抑制劑，可以被認為是針對神經膠質瘤起始細胞的新型的特異性治療策略。采用上述用于識別GIC的強大的技術，本申請人還開發(fā)了一種強大且可靠的篩選工具來識別特異性的和有效的抗GIC試劑。
通過利用本申請人的上述技術和他們設計用于測試和驗證特異性的抗CSC試劑 (抗癌癥干細胞試劑)的體外分析法，本申請人證明，阻止通過有氧途徑產生的能量制造足以殺死整個CIC細胞群(所述殺死通過餓死CIC而不是通過凋亡來完成)。干擾電子傳輸鏈如在復合物I和III水平上線粒體的電子傳輸鏈的抑制劑表現(xiàn)出在體外和體內殺死每個神經膠質瘤起始細胞的特殊能力。由于復合物I和III的抑制劑會產生大量的活性氧物質 (ROS)和自由基，所以CIC也很有可能由于ROS的堆積或解毒系統(tǒng)的飽和而被殺死。與其他優(yōu)先利用腫瘤細胞系和干細胞標記如CD133作為干性讀出的方法相比，本申請人的技術依靠來源于人樣本的原代細胞培養(yǎng)物以及依賴于獨立于任何標記物的使用的簡單且無偏差的CIC檢測。因此本申請人利用這種方法設計并開發(fā)了體外復發(fā)分析法來篩選和驗證用于根除神經膠質瘤中癌癥干細胞的潛在治療試劑。在被轉移回沒有任何試劑如抑制劑的恢復階段(恢復R)之前，使CIC、原代神經膠質瘤細胞和正常腦細胞暴露于試劑如抑制劑最多20天，優(yōu)選10天或20天(處理T)。新穎性本文的在于用于測試任何藥物的效用的干性讀出以及識別特異性抗CSC試劑的可能性。基本上，任何試劑或抑制劑可以被認為是有效的抗CSC試劑，只要其符合以下條件1)在暴露于所述試劑或抑制劑最多20天的時間里，GIC(FLl+細胞)的存活降低超過50% ；2)在最多20天的恢復階段的時間里，GIC(FLl+細胞)的恢復低于0. 2倍；以及3)在暴露于所述試劑或抑制劑期間以及之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的。優(yōu)選地，所述試劑或抑制劑是電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑。作為本申請人的體外復發(fā)分析法的概念和驗證的證據(jù)，測試了 Y-輻射和目前用于GBM的首要細胞毒性試劑替莫唑胺的效用。與FBS-培養(yǎng)的神經膠質瘤細胞相比， 40% 的FLl+細胞能夠耐受25Gy的輻射，存活并因此在基因毒性壓力后30天內恢復，這證實了輻射主要不是靶向到CIC亞群而是腫瘤實體中快速分化的細胞。之前的替莫唑胺治療，如 Hegi等，N Engl J Med.，2005，352 (10)，997-1003中所描述的，首次測試了神經膠質瘤球 (gliomasphere)細胞中MGMT啟動子的甲基化狀態(tài)，預測了神經膠質瘤球細胞應當是對替莫唑胺敏感的。然而，即使用25 μ M的替莫唑胺處理多達20天之后，這比臨床使用劑量高 5倍，仍有超過30%的FLl+細胞存活，并能在20天內恢復(0.2 <R< 1)。從表型和分子觀點看，根據(jù)定義，GBM是高度異質的腫瘤。在區(qū)別地被激活或沉默的信號傳導途徑中，在 60%的GBM中表皮生長因子受體(EGFR)信號級聯(lián)被放大/過表達，并且在 65%的GBM中PII/AKT/PTEN信號級聯(lián)在PTEN表達中顯示變化。相似的，PTEN 的喪失似乎與不良預后和輻射耐受性相關。使用5μΜ埃羅替尼的長期處理在超過50%的 FLl+細胞中誘導細胞死亡，僅在2/6GBM中誘導細胞死亡，而與EGFR狀態(tài)無關，這因此證實 EGFR基因的擴增與對EGFR激酶抑制劑如吉非替尼或埃羅替尼的響應能力無關。此外，所有的神經膠質瘤球培養(yǎng)物均能在10天內從處理中恢復，這表明在受體水平上阻斷EGFR信號傳導途徑是無效的。主要的發(fā)育途徑如Notch、SHH-Gli和WNT、mT0R與若干人腫瘤有關，通常包括神經膠質瘤，但很少有研究系統(tǒng)地強調它們在人癌癥干細胞中的作用。更具體而言，用環(huán)巴胺抑制SHH-Gli的活性，或用Y-分泌酶抑制劑DAPT抑制NOTCH信號傳導途徑的活性，或通過潛在的影響癌癥起始細胞群的增殖和自我更新來降低腫瘤生長。相似但不完全相同的，用特癌適抑制mTOR，或分別用5 μ M環(huán)巴胺的或5 μ M的DAPT靶向發(fā)育途徑如SHH-Gli或NOTCH 引起存活FLl+細胞的數(shù)量的降低。但是，即使在治療20天后仍能觀察到殘留的CIC，并導致CIC群的快速恢復，這些藥物仍被認為是無效的。根據(jù)活性線粒體的數(shù)量、代謝的含量以及無氧能量制造途徑的抑制劑的效用，與 FLltl細胞相比，F(xiàn)Ll+細胞很可能優(yōu)先通過有氧途徑來制造它們的能量。因此，本申請人提出這樣的概念，任何具有抑制線粒體活性有效能力的試劑都會削弱CIC中的能量制造，很可能殺死CIC。這一概念通過本發(fā)明所使用的體外復發(fā)分析法進行測試，并篩選電子傳輸鏈 (如魚藤酮，抗霉素A，安那芬尼)和質子泵(寡霉素A/B)的抑制劑。暴露于5μ M的魚藤酮或抗霉素A或安那芬尼(氯丙咪嗪)或寡霉素Α/Β 20天殺死所有的FLl+細胞。對于治療的開發(fā)和治療策略的設計，本申請人縮短了暴露于抑制有氧途徑的試劑的時間，發(fā)現(xiàn)10天的治療甚至足以殺死整個CIC庫。為了測試這些抑制劑對CIC的特異性，使正常腦細胞和原代神經膠質瘤細胞(FBS培養(yǎng)物)暴露于上述線粒體試劑10天。發(fā)現(xiàn)正常腦細胞和原代神經膠質瘤細胞對寡霉素Α/Β也是敏感的，這表明阻斷線粒體復合物IV活性可能不是合適的，因為其確實影響正常腦細胞的存活。雖然輕微地影響生長和增殖，但是暴露于抗霉素A 或安那芬尼以及在較小程度上暴露于魚藤酮允許正常腦細胞存活，并因此打開了作為治療藥物的前景。有趣的是，在FBS中培養(yǎng)的原代神經膠質瘤可以抵抗這些試劑，這進一步證實了來自腫瘤實體的細胞具有與CIC不同的代謝方式。本發(fā)明提供神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性的抑制劑，所述抑制劑用于在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時間里，GIC的存活降低超過50% ；2)在最多20天的恢復階段的時間里，GIC的復發(fā)低于0. 2倍；以及3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑期間和之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的。并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑阻止由GIC制造
能量°優(yōu)選地，神經膠質瘤實體的所述移除是指神經膠質瘤實體的部分切除。優(yōu)選地，所述神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑以相當于最多10倍IC2劑量的劑量施用。最優(yōu)選地，所述IC2劑量在0. 157至 0. 315mg/kg 的范圍。表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤優(yōu)選選自神經膠質瘤、神經鞘瘤、轉移到腦組織的腫瘤、腦膜瘤、室管膜細胞瘤、星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、少突星形細胞瘤、復發(fā)性癌癥以及轉移性癌癥。術語“樣品，，包括來自任何來源的組織或液體樣品，例如來自于患有癌癥、具有復發(fā)癌癥或疑似患有例如人神經膠質瘤、神經鞘瘤、轉移到腦組織的腫瘤、腦膜瘤、星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、少突星形細胞瘤和室管膜細胞瘤的癌癥的患者(例如哺乳動物患者，
11更具體而言，人類患者)的組織或液體樣品。在另一個實施方案中，所述樣品包括來自任何來源的組織或液體樣品，例如來自于患有轉移性癌癥或懷疑患有例如從黑色素瘤，乳腺癌， 結腸癌，肺癌轉移至大腦的癌癥的患者(例如哺乳動物患者，更具體而言，人類患者)的組織或液體樣品。術語“癌癥干細胞樣品”是指選自含有根據(jù)本發(fā)明所述的FLl+和FL1°細胞的混合物的神經膠質瘤球培養(yǎng)物(如實施例中所述的那樣培養(yǎng))或含有兩種被分離的FLl+或FL1° 細胞群的樣品，其中細胞通過根據(jù)本發(fā)明的方法分離。術語“癌細胞樣品”包括新鮮地從腫瘤樣品中解離的細胞樣品，或從腫瘤樣品中解離之后經過培養(yǎng)的細胞樣品，例如，諸如在干細胞培養(yǎng)基等中培養(yǎng)的神經膠質瘤球培養(yǎng)物、 諸如在富含血清的培養(yǎng)基等中培養(yǎng)的附著的細胞培養(yǎng)物以及諸如在分化培養(yǎng)基等中培養(yǎng)的分化的細胞培養(yǎng)物。本文所使用的術語“腫瘤”(或瘤)是指贅生物或由于細胞異常生長形成的贅生物或固態(tài)病變。腫瘤可以是良性的，癌前的或惡性的。腫瘤可能與中樞和外周神經系統(tǒng)、轉移至腦部和肺部轉移、急性粒細胞性白血病(AML)、乳腺腫瘤、結腸腫瘤和卵巢腫瘤有關。此外，術語腫瘤還包括諸如神經膠質瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤、室管膜細胞瘤、星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、少突星形細胞瘤、黑色素瘤。術語“干細胞培養(yǎng)基等”包括其中鋪展有來源于新鮮解離的組織樣品的癌癥干細胞(也成為神經膠質瘤球)的培養(yǎng)基。例如，神經干細胞培養(yǎng)基包括用1/1’ 000的盤尼西林-鏈霉素(Gibco 公司)、B27(l/50Gibco 公司)或 BIT950(K20 % Stem cell Technologies公司)、30mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma-Aldrich公司)、人重組 EGF (20ng/mlInvitrogen 公司)以及堿性 FGF-2 QOng/ml Invitrogen 公司)補充的 DMEM-F12-Ham，s (Gibco 公司)。術語“富含血清的培養(yǎng)基等”包括其中鋪展有來源于新鮮解離的組織樣品的附著培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。(例如10%的FBS，用1/1，000的盤尼西林-鏈霉素(Gibco公司)補充的 DMEM-F12-Ham，s (Gibco 公司))。術語“分化培養(yǎng)基等”包括其中鋪板有癌癥干細胞的用于分析其多潛能能力的培養(yǎng)基，例如涂覆有在水中1 100稀釋的聚-L-鳥氨酸和層粘連蛋白(Sigma公司) 混合物的平板，用于37攝氏度下0/N。解離細胞并以10個細胞/μ 的密度鋪板于用 1/1000 (Gibco 公司)地盤尼西林-鏈霉素、B27 (l/50Gibco 公司)或 BIT9500 (20 % Stem cell Technologies公司)、30mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma-Aldrich公司)補充的 DMEM-F12-Ham，s (Gibco 公司)中。術語“FL1通道”是諸如在 Practical Flow Cytometry，Shapiro 等，第四版，2003， Wiley & Sons，he.中描述的熒光的縱向檢測通道。典型地，對于488nm的激發(fā)波長，在FLl 通道中以520nm或約520nm的波長進行自發(fā)熒光的檢測。術語“FL3通道”是諸如在 Practical Flow Cytometry，Shapiro 等，第四版，2003， Wiley & Sons，Inc.中描述的熒光的側向檢測(45度)通道。典型地，對于488nm的激發(fā)波長，在FL3通道中以> 630nm的波長進行自發(fā)熒光的檢測。術語“FL4通道，，是諸如在 Practical Flow Cytometry，Shapiro 等，第四版，2003， Wiley & Sons，Inc.中描述的熒光的側向檢測通道。典型地，對于632nm或約632nm的或者546nm或約546nm的激發(fā)波長，在FL4通道中以> 630nm的波長進行自發(fā)熒光的檢測。術語“正常腦細胞”是指具有正常生理功能未患有任何疾病或病癥如腫瘤的健康腦細胞。術語“正常腦細胞的存活是可持續(xù)的和可恢復的”是指在暴露于本發(fā)明的抑制劑期間或之后，正常腦細胞保持其正常的生理功能并且不被削弱。術語“FL1+細胞”或“FL1-H細胞”或“GIC”或“CIC”是指通過本發(fā)明所述的方法由熒光活化細胞分選法所分選的細胞，尤其是通過選擇性檢測和分選表現(xiàn)特定形態(tài)(高FSC 和低/中SSC)的細胞以及在用激光束激發(fā)細胞亞樣品時在FLl通道中檢測的自發(fā)熒光發(fā)射。這種亞樣品存在于當以488納米(例如藍色激光束，如氬)激發(fā)時表現(xiàn)出在FLl通道中以約520nm的波長檢測的自發(fā)熒光發(fā)射的細胞亞群中。更具體而言，可以在FLl通道中用530nm+/-15分光鏡，或更緊密地用515nm+/-5分光鏡檢測FLl自發(fā)熒光，這證實FLl自發(fā)熒光發(fā)射光譜的特異性。術語“FL1°細胞”或“非FLl-H細胞”或“無自發(fā)熒光細胞”是指通過本發(fā)明所述的方法由熒光活化細胞分選法所分選的細胞，尤其是通過選擇性地檢測和分選表現(xiàn)特定形態(tài)(低/中FSC和中/高SSC)、在FLl通道中不是熒光性的并且表現(xiàn)在FL3或FL4通道中檢測到的熒光中輕微的正偏移的細胞。術語“FL1_細胞”或“原代神經膠質瘤細胞”或“FBS培養(yǎng)的神經膠質瘤細胞”是指在10%的FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的、附著性的、不是通過本發(fā)明所述的方法由熒光活化細胞分選法所分選的細胞。這些細胞表現(xiàn)特定形態(tài)(中FSC和高SSC)、高的細胞質/細胞核比例 (> 1)并且在FLl通道或F13或FL4通道中都不是熒光性的。術語“高FSC”或“高FSC-H”或“高FSC-A”是指前向散射并對應于粒徑和速率的測定(細胞直徑在5至7 μ m之間)。術語“低/中FSC”或“低/中FSC-H”或“低/中FSC-A”是指前向尺寸散射并對應于細胞尺寸(細胞直徑< 5至7 μ m)。術語“中/高SSC”或“中/高SSC-H”或“中/高SSC-A”是指側向或直角散射并對應于細胞復雜性或粒度(具有大的細胞質和顆粒的細胞)。術語“低/中SSC”或“低/中SSC-H”或“低/中SSC-A”是指側向或直角散射并對應于細胞復雜性或粒度(具有無顆粒的且限定在細胞核周圍的細胞質的細胞)。典型地，F(xiàn)Ll+或FLl-H細胞結合了 “高FSC”或“高FSC-H”或“高FSC-A”與“低/ 中SSC”或“低/中SSC-H”或“低/中SSC-A”，并因此細胞核/細胞質直徑比> 1。典型地，F(xiàn)Ll0或非FLl-H細胞結合了 “低/中FSC”或“低/中FSC-H”或“低/中 FSC-A”與“中/高SSC”或“中/高SSC-H”或“中/高SSC-A”，并因此細胞核/細胞質直徑比< 1。術語“干細胞培養(yǎng)基”是適用于干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。典型地，干細胞培養(yǎng)基包括例如促細胞分裂原(堿性FGF-2，EGF)和無補充培養(yǎng)基(B27或BIT9500)。術語“球原性(spherogenicity)，，包括單個干細胞對稱或不對稱的分裂形成克隆體的能力。這種克隆體被稱為球體，更準確的說，當所述球體是衍生自神經膠質瘤時，其被稱為神經膠質瘤球。這種能力可以通過無性繁殖分析法來檢測，所述無性繁殖分析法也稱為自我更新分析法，例如在PCT/IB2008/0M872中所描述的。自我更新分析法確實可以檢測出單個細胞形成克隆體的能力，但不是所有的克隆體都會形成球體。只有干細胞或正常發(fā)育中的早期先祖細胞或某些癌癥類型表現(xiàn)球原性的潛力，并且這種特性存在于神經和神經膠質瘤干細胞中。術語“多潛能性”包括細胞分化為若干細胞類型的能力，例如，對于來自中樞神經系統(tǒng)的細胞而言，多潛能性是指分化為諸如GFAP (星形膠質細胞)>NESTIN(神經祖細胞)、 TUJl (神經元)的細胞的能力。術語“恢復階段”包括在處理之后，F(xiàn)Ll+細胞和FLltl細胞被轉移回干細胞培養(yǎng)基中。術語“復發(fā)”是指在用試劑處理之后，癌癥干細胞存活以保持其固有性質(在FLl 通道中的自發(fā)熒光、球原性)、其分裂能力以及任選地保持其他性質(例如通過分化標記物的表達檢測的分化能力、通過干性標記物的表達檢測的干性性質以及使用氧化-還原比色法(MTS)通過NAD/NADPH+酶的活性和比率測定的代謝特性)的能力。復發(fā)的檢測通過本發(fā)明所述的篩選分析法來進行，并包括在處理之后分析FLl+和FL1°細胞的存在及比例，如圖5所總結的。復發(fā)水平將以在恢復期期間存活的處理后的癌癥干細胞的比例為基礎并根據(jù)未觀察到癌癥干細胞復發(fā)的恢復期的長度來評價。本文所用術語“有效量”是指根據(jù)本發(fā)明的至少一種化合物或其藥學制劑的量，所述能夠在目標組織、系統(tǒng)、動物或人體產生所要求的生物學或醫(yī)學響應。在一個實施方案中，所述有效劑量是用于緩解要被治療的疾病或病癥的癥狀的“治療有效量”。這一術語在本文中還包括足以減輕疾病發(fā)展，特別是指緩解或抑制復發(fā)過程(例如妨礙復發(fā)的發(fā)生， 或降低復發(fā)過程的頻率或程度)，和/或引起并由此產生目標所要求的響應的活性化合物的量(例如“抑制有效量”)。根據(jù)本發(fā)明，術語治療的“效用”，可以根據(jù)相應于本發(fā)明的用法或方法的疾病過程中的變化來檢測。例如，根據(jù)本發(fā)明的治療的效用依賴于兩個條件-殺死FLl+細胞的能力，其通過10或20天后存活的FLl+細胞至少降低50%來測定；-FLl+細胞沒有恢復(r < 0. 2)，其通過治療后至少20天后存活的FLl+細胞的數(shù)量來測定。本發(fā)明治療的效用可通過患者狀況的改善以及本發(fā)明的治療對患者的積極影響來測定。術語“抑制癌癥干細胞復發(fā)的能力”是指試劑在處理之后以及處理后的恢復期的觀察之后能夠減少癌癥干細胞樣品中癌癥干細胞數(shù)量的性質。優(yōu)選地，抑制癌癥干細胞復發(fā)的能力是指根除癌癥干細胞樣品中的癌癥干細胞并且在恢復期觀察之后避免這些細胞復發(fā)的能力。本文中可互換使用的術語“抗腫瘤試劑”或“治療試劑”或“試劑”包括易于具有腫瘤治療活性例如在腫瘤治療中有效的分子或化合物，所述治療如降低或停止腫瘤的生長、 預防、降低或停止腫瘤的復發(fā)。其包括已知的對癌癥具有治療活性的試劑或研究發(fā)現(xiàn)對腫瘤具有治療活性的試劑。術語“抗腫瘤試劑”或“治療試劑”或“試劑”還包括任何分子(如化學的，生物學的)或任何外部/環(huán)境因素(如機械的，輻射)。本文所用“治療”和“進行治療”等一般表示獲得了期望的藥理學或生理學效果。 這些效果在防止或部分地防止諸如癌癥(神經膠質瘤)的疾病、其癥狀和病癥方面可以是預防性的，和/或在部分或完全治愈疾病、病癥、癥狀或歸因于所述疾病的副作用方面可以是治療性的。本文所用術語“治療”覆蓋哺乳動物特別是人類中的所有治療，包括(a)防止疾病例如癌癥(神經膠質瘤)在受試者中發(fā)生，所述受試者已經進行過治療，例如手術(切除或部分切除)、放療和/或化療，或可能有傾向患有疾病但還未被確診；(b)抑制疾病，例如癌癥(神經膠質瘤)，即阻止其發(fā)展；或緩解疾病，即引起疾病和/或其癥狀或病癥的復原。在本發(fā)明的情況下使用的術語“抑制劑”被定義為完全或部分抑制生物分子活性的分子。術語“線粒體活性抑制劑”被定義為氧化細胞能量制造過程的抑制劑，典型地，是有氧細胞代謝的抑制劑。氧化細胞能量制造過程抑制劑包括細胞三羧酸(TCA)或檸檬酸循環(huán)(碳水化合物、脂肪和蛋白質化學轉化為二氧化碳和水產生可使用形式的能量)的抑制劑，或細胞氧化(有氧)糖酵解(在細胞質中由葡萄糖代謝為丙酮酸根)的抑制劑，或糖酵解底物(丙酮酸根)氧化磷酸化的抑制劑。典型地，線粒體活性抑制劑是在體外和體內復發(fā)分析法中顯示阻斷電子傳輸鏈或氧化磷酸化導致產生活性氧物質(R0Q的能力的試劑。如本文所使用的，電子傳輸鏈活性的抑制劑，例如可以是二亞苯基碘氯化物(DPI) 或其衍生物。二亞苯基碘氯化物(DPI)與黃素蛋白牢固地結合，因此是若干重要的酶，包括一氧化氮合成酶(N0Q、NADPH-泛醌氧化還原酶、NADPH氧化酶和NADPH細胞色素P450氧化還原酶，的強力的特異性的抑制劑。優(yōu)選地，電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的抑制劑是二亞苯基碘氯化物(DPI) 和其衍生物。更有選地，電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的抑制劑是線粒體電子傳輸鏈的復合物(I)和/或復合物(III)活性的抑制劑。術語“線粒體電子傳輸鏈的復合物(I)活性的抑制劑”包括抑制線粒體復合物I 活性的試劑。例如，氧化磷酸化復合物(I)的抑制劑包括在NADH脫氫酶結合位點與線粒體復合物 I 結合的試劑(Hogan & Singer，1967，Biochem. Biophys. Res. Commun.，27 (3) 356-60)，如魚藤酮，一種已知的殺蟲劑，及其衍生物。魚藤酮衍生物包括芳基疊氮紫穗槐素(arylazidoamorphigenin)、螺留酮型擬魚藤酮、灰葉素、紫穗槐素、12a-羥基紫穗槐素、 12a-羥基達潘醇和6’ -O-D-吡喃葡萄糖基達潘醇(6’ -O-D-glucopyranosyldalpanol)?！熬€粒體電子傳輸鏈復合物(III)活性的抑制劑”包括抑制線粒體復合物III活性的試劑。例如，氧化磷酸化復合物(III)的抑制劑包括抑制復合物III催化活性的抑制劑，如抗霉素A，一種已知的抗真菌劑，及其衍生物?？姑顾谹衍生物包括黏噻唑菌醇、標樁菌素的十三燒基類似物(Hu 等，2008，^Tetrahedron letters, 49 (35) :5192-5195)。氧化磷酸化復合物(III)的抑制劑的其他實例包括任何二本西平衍生物，其是已知的抗抑郁藥，例如氯丙咪嗪，一種雙重血清素-去甲腎上腺素再攝入抑制劑(Anafranil )或其衍生物及類似物，如丙咪嗪和氯丙嗪。丙咪嗪及其鹽酸鹽公開于美國專利2，554，736，其噻嘧啶鹽公開于在美國專利3，326，896。丙咪嗪及其鹽是口服活性的二本西平三環(huán)抗抑郁藥。 氧化磷酸化復合物(III)的抑制的其他劑實例有甘草查耳酮A、殼二孢氯素和嗜球果傘素 B(Strobilirubin B)0雙重血清素-去甲腎上腺素再攝入抑制劑(DSNRI)，其抑制血清素和去甲腎上腺素的再攝入，包括文拉法辛(Effexor )、文拉法辛代謝物0-去甲文拉法辛、氯丙咪嗪(Anafranil )、氯丙咪嗪代謝物去甲氯丙咪嗪(Cymbalta )、米那普侖和丙咪嗪 (Tofranil ⑧或 Janimine )。他們的化學名稱、商品名稱、結構、治療學和藥理學信息以及治療種類可以在文獻中找至IJ，例如 Merck Index，第九版 1976，Goodman & GiIman，The Pharmacological Basis of Therapeutics,第九版 1996,禾口 the Physician' s Desk Reference 2004。通常根據(jù)本發(fā)明，抑制劑抑制線粒體氧化磷酸化復合物(I)的活性或線粒體氧化磷酸化復合物(III)的活性。然而，一些抑制劑如標樁菌素、黏噻唑菌醇、殺粉蝶菌素或其衍生物和類似物可以同時抑制線粒體氧化磷酸化復合物(I)和復合物(III)的活性。上述雙重抑制劑可以是更強力的抑制劑，因此可以是需要較低濃度的更強的抗Gic試劑。表1列出了放療和化療或臨床試驗中所使用的經典試劑、所引用的文獻出處以及在體外復發(fā)分析法中所使用的計量。表2和3列出了靶向有氧/無氧途徑的試劑、所引用的文獻出處以及在體外復發(fā)分析法中所使用的計量。優(yōu)選地，線粒體電子傳輸鏈復合物(I)和/或(III)活性的抑制劑選自魚藤酮、 抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、標樁菌素、嗜球果傘素b、甘草查爾酮A、殼二孢氯素、殺粉蝶菌素和/或它們的組合和/或它們的衍生物和/或它們的藥學可接受的鹽。例如，線粒體電子傳輸鏈復合物(I)和(III)活性的抑制劑的所述組合包括魚藤酮與抗霉素A組合或者魚藤酮與氯丙咪嗪組合。最優(yōu)選地，線粒體電子傳輸鏈復合物(I)和/或(III)活性的抑制劑選自黏噻唑菌醇、標樁菌素、殺粉蝶菌素和/或它們的衍生物和/或它們的藥學可接受的鹽。術語“線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑”包括通常由底物可用性、內源性和/或外源性的終產物來確定的化合物。線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑例如有NADH和ATP、檸檬酸鹽、 乙酰輔酶A、TCA的鈣抑制關鍵酶，例如異檸檬酸脫氫酶、α -酮戊二酸脫氫酶以及檸檬酸合成酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，線粒體TCA循環(huán)的活性可以由電子傳輸鏈的抑制劑間接地抑制，諸如選自魚藤酮、抗霉素Α、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、標樁菌素、嗜球果傘素b、甘草查爾酮A、殼二孢氯素、殺粉蝶菌素和/或它們的組合和/或它們的衍生物和/或它們的藥學可接受的鹽的線粒體電子傳輸鏈復合物(I)和復合物(III)的抑制劑。
1權利要求
1.神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，所述抑制劑用于在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時間里， GIC的存活降低超過50% ；2)在最多20天的恢復階段的時間里，GIC的恢復低于0.2倍；3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制期間和之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的；并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑阻止由GIC產生能量。
2.如權利要求1所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中神經膠質瘤實體的所述移除是神經膠質瘤實體的部分切除。
3.如權利要求2所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述抑制劑以相當于10倍IC2劑量的劑量施用。
4.如權利要求1或3所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述IC2劑量在0. 157mg/kg至0. 315mg/kg的范圍。
5.如權利要求1至4所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述抑制劑是二亞苯基碘氯化物(DPI)及其衍生物。
6.如權利要求1至5所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述抑制劑是線粒體電子傳輸鏈的復合物(I)和/或復合物 (III)的活性抑制劑。
7.如權利要求6所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述線粒體電子傳輸鏈的復合物(I)和/或復合物(III)的活性抑制劑選自魚藤酮、抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、標樁菌素、嗜球果傘素b、甘草查耳酮A、殼二孢氯素、殺粉蝶菌素和/或它們的組合和/或它們的衍生物和/或它們的藥學可接受的鹽。
8.如權利要求7所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所組合包括將魚藤酮與抗霉素A組合，或者將魚藤酮與氯丙咪嗪組I=I O
9.如權利要求6所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述線粒體電子傳輸鏈的復合物(I)和/或復合物(III)的活性抑制劑選自黏噻唑菌醇、標樁菌素、殺粉蝶菌素和/或它們的衍生物和/或它們的藥學可接受的鹽。
10.如權利要求1至9所述的神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤選自神經膠質瘤、 神經鞘瘤、轉移到腦組織的腫瘤、腦膜瘤、室管膜細胞瘤、星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、少突星形細胞瘤、復發(fā)性癌癥和轉移性癌癥。
11.用于在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種如權利要求1至10 中任一項所述的電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，以及一種或多種藥學可接受的稀釋劑或載體。
12.如權利要求11所述的用于在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/ 或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含一種線粒體電子傳輸鏈復合物(I)的活性抑制劑和一種線粒體電子傳輸鏈復合物(III)的活性抑制劑的組合，以及一種或多種藥學可接受的稀釋劑或載體。
13.在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，所述方法包括施用治療有效量的電子傳輸鏈和/或線粒體TCA 循環(huán)的活性抑制劑，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時間里， GIC的存活降低超過50% ；2)在最多20天的恢復階段的時間里，GIC的恢復低于0.2倍；3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制期間和之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的；并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑阻止由GIC產生能量。
14.如權利要求13所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中神經膠質瘤實體的所述移除是神經膠質瘤實體的部分切除。
15.如權利要求13至14所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和 /或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述治療有效量為最多10倍 IC2劑量。
16.如權利要求15所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述IC2劑量在0. 157mg/kg至 0. 315mg/kg 的范圍。
17.如權利要求13至16所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和 /或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述方法還包括，在施用治療有效劑量的所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑之前或之后用標準放療和 /或化療治療的步驟。
18.如權利要求13至17所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和 /或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑是二亞苯基碘氯化物(DPI)及其衍生物。
19.如權利要求13至18所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和 /或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑是線粒體電子傳輸鏈的復合物⑴和/或復合物(III)的活性抑制劑。
20.如權利要求19所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述線粒體電子傳輸鏈的復合物 (I)和/或復合物(III)的活性抑制劑選自魚藤酮、抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、標樁菌素、嗜球果傘素b、甘草查耳酮A、殼二孢氯素、殺粉蝶菌素和/或它們的組合和/ 或它們的衍生物和/或它們的藥學可接受的鹽。
21.如權利要求20所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述組合包括將魚藤酮與抗霉素 A組合，或者將魚藤酮與氯丙咪嗪組合。
22.如權利要求20所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述線粒體電子傳輸鏈的復合物 (I)和/或復合物(III)的活性抑制劑選自黏噻唑菌醇、標樁菌素、殺粉蝶菌素和/或它們的衍生物和/或它們的藥學可接受的鹽。
23.如權利要求13至22所述的在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和 /或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤選自神經膠質瘤、神經鞘瘤、轉移到腦組織的腫瘤、腦膜瘤、室管膜細胞瘤、 星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、少突星形細胞瘤、復發(fā)性癌癥和轉移性癌癥。
24.用于識別神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑的篩選方法，所述方法包括使從腫瘤的細胞樣本中分離的FLl+細胞和正常腦細胞與帶篩選的抑制劑接觸，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述抑制劑最多20天的時間里，F(xiàn)Ll+細胞的存活降低超過50%；2)在最多20天的恢復階段的時間里，F(xiàn)Ll+細胞的恢復低于0.2倍；3)在暴露于所述抑制劑期間和之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的。
25.用于識別神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑的篩選方法，所述方法包括使原代神經膠質瘤細胞與所述待篩選的抑制劑接觸。
26.用于篩選神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑的試劑盒，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述抑制劑最多20天的時間里，F(xiàn)Ll+細胞的存活降低超過50%；2)在最多20天的恢復階段的時間里，F(xiàn)Ll+細胞的恢復低于0.2倍；3)在暴露于所述抑制劑期間和之后，正常腦細胞的存活是可持續(xù)和可恢復的；并且所述抑制劑在表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞的腫瘤的治療中有用，其中所述試劑盒包含原代CIC培養(yǎng)物、原代附著的神經膠質瘤細胞、正常細胞以及選自魚藤酮和抗霉素A中至少一種線粒體電子傳輸鏈的復合物(I)或復合物(III)的活性的標準抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預防和/或治療腫瘤的化合物。更具體而言，本發(fā)明涉及神經膠質瘤起始細胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，所述抑制劑用于在進行過神經膠質瘤實體先期移除的受試者中預防和/或治療表現(xiàn)神經膠質瘤起始細胞(GIC)的腫瘤的方法。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的抑制劑的藥物組合物，以及識別本發(fā)明的抑制劑的篩選方法。
文檔編號A61K31/352GK102439453SQ201080022077
公開日2012年5月2日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權日2009年5月20日
發(fā)明者伊萬·拉多萬諾維奇, 維吉妮·克萊門特 申請人:日內瓦大學, 日內瓦大學醫(yī)院