專利名稱：疫苗接種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來講涉及給哺乳動物接種疫苗的方法，具體地講，涉及可用于加強免疫應(yīng)答的疫苗接種方法以及可用于治療疾病的方法。
背景技術(shù)：
雖然許多成功的疫苗接種方案根除或完全控制了感染性疾病，例如天花和脊髓灰質(zhì)炎，但是越來越明顯的是，現(xiàn)有的疫苗接種方法不容易控制某些病原體。例如HIV、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和瘧原蟲等病原體全都抵抗由傳統(tǒng)疫苗特別產(chǎn)生的體液免疫。已對開發(fā)可促進對這些病原體和相關(guān)病原體的有效細胞免疫的疫苗做出了相當(dāng)?shù)呐ΑＭ瑯?，用腫瘤抗原的免疫接種主要依靠T細胞(尤其是CD8+CTL)識別和破壞癌細胞，因為許多腫瘤相關(guān)抗原是胞內(nèi)蛋白質(zhì)。然而，細胞免疫的誘導(dǎo)很復(fù)雜，給疫苗學(xué)家提出了大量問題。這些包括產(chǎn)生具有足夠強度和壽命的細胞免疫的困難?？朔@些問題的一種潛在方法是通過使用異源載體序貫給予疫苗。雖然典型的初免-加強免疫方案包括DNA型疫苗和牛痘型疫苗，但是也已在動物模型中對使用細菌-病毒或兩種不同病毒的其它組合進行了研究。用于疫苗接種最常使用的痘病毒是牛痘病毒， 其用于針對天花的疫苗接種。重組牛痘可將外源抗原遞送至哺乳動物細胞的胞質(zhì)中，從而使它們直接進入抗原加工途徑，這會導(dǎo)致與MHC I類和II類分子締合的抗原衍生肽呈遞到細胞表面上。這種性質(zhì)使牛痘可用作重組疫苗，特別是用于刺激⑶8+和⑶4+ T細胞免疫應(yīng)答。有關(guān)對牛痘病毒在哺乳動物細胞中復(fù)制的能力的顧慮限制了其臨床應(yīng)用，并導(dǎo)致了對更安全替代品的尋找。至于利用病毒治療疾病例如癌癥，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果溶瘤病毒(OV)感染腫瘤并大量復(fù)制以介導(dǎo)徹底破壞，則可治愈動物模型的癌癥。然而，大量的臨床應(yīng)用需要治療可具有部分完整抗病毒機制的有免疫能力的荷惡性腫瘤宿主。針對病毒的快速清除病毒復(fù)制的活躍的宿主免疫應(yīng)答(這導(dǎo)致不完全或短暫腫瘤破壞)，代表了通往成功的重大障礙。研究表明在幼稚動物中，獲得性免疫應(yīng)答的發(fā)生通常需時不到一周，給溶瘤載體發(fā)揮作用留下了小的機會窗。為了使所給予的病毒或再次給予的病毒的復(fù)制最大化，已測試了從徹底的免疫抑制到使用傳遞細胞(所謂的“特洛伊木馬”)和病毒掩蔽的多種方法。盡管前面提到的克服與現(xiàn)行疫苗接種方法有關(guān)問題的努力，但是仍需要開發(fā)在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的更有效的方法。發(fā)明概述目前正在開發(fā)新的疫苗接種方法。因此，本發(fā)明的一個方面，提供治療哺乳動物的癌癥的方法，所述方法包括給予哺乳動物溶瘤載體，其中所述載體表達哺乳動物對之具有預(yù)存免疫力的腫瘤抗原。另一方面，提供用于治療癌癥的藥盒，所述藥盒包括適于誘導(dǎo)哺乳動物的免疫應(yīng)答的量的腫瘤抗原或表達腫瘤抗原的載體以及適于提高免疫應(yīng)答的量的表達腫瘤抗原的溶瘤載體。本發(fā)明的另一個方面，提供加強對抗原具有預(yù)存免疫力的哺乳動物的免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括靜脈內(nèi)給予哺乳動物表達所述抗原的載體，其中所述載體能夠感染B 細胞。又一方面，提供加強對抗原具有預(yù)存免疫力的哺乳動物的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括靜脈內(nèi)給予哺乳動物荷載抗原的B細胞。再一方面，提供用于加強哺乳動物的免疫應(yīng)答的藥盒。所述藥盒包括呈合適給藥形式的抗原或表達抗原的載體和呈適于靜脈內(nèi)給藥的形式的表達抗原的載體。在下面的詳細描述中以及通過參考附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將會是顯而易見的。附圖簡述

圖1闡述體內(nèi)VSV-GFP (A)、AchhDCT (B和C)和VSV_hDCT對腫瘤的作用；圖2表示用Ad-hDCT和VSV-hDCT進行組合治療的時間線㈧、⑶8+T細胞概況⑶ 和對存活的作用(C)；圖3表示在用Ad-hDCT和VSV-hDCT組合治療后DCT特異性⑶8+T細胞概況(A)、 存活與腫瘤抗原特異性T細胞頻率的相關(guān)性(B)、DCT T細胞數(shù)目(C)和gplOO T細胞的頻率⑶；圖4表示在Ad-hDCT疫苗接種隨后用VSV-hDCT治療后荷瘤小鼠的病毒滴度(A) 和腦重⑶；圖5表示在Ad-hDCT致敏宿主進行VSV-hDCT治療后血液(A)、脾(B)和頸部淋巴結(jié)(C)中DCT特異性CD8+T細胞擴繁的時程；圖6概括了短間隔和長間隔治療方案的時程㈧及在短間隔⑶和長間隔⑶時程免疫接種和治療方案后小鼠肺和腦的VSV滴度；圖7表示在Ad-hDCT免疫接種后14天或100天用VSV-hDCT治療時血液的DCT特異性CD8+ T細胞的百分比(A)和數(shù)目(B)；圖8闡述用Ad-hDCT疫苗接種和溶瘤Maraba-hDCT組合治療對腫瘤治療后的免疫分析㈧和存活數(shù)據(jù)⑶；圖9闡述使用樹突細胞載體遞送DCT抗原(DChDCT)的組合治療的存活數(shù)據(jù)(A) 和生存中值⑶；圖10闡述組合治療中利用雙缺失牛痘載體遞送DCT抗原(ddVV-hDCT)對腫瘤體積㈧和存活⑶的作用；圖11表示初免加強免疫方案遞送途徑的比較；圖12表示不同間隔的加強免疫能力；圖13表示靜脈內(nèi)給予VSV和牛痘病毒在加強免疫應(yīng)答中的能力之間的比較；圖14表示G-Iess (突變體)形式的VSV加強免疫應(yīng)答的能力；圖15表示由初免加強免疫方案誘導(dǎo)的T細胞的質(zhì)量；圖16表示與用牛痘載體加強免疫相比，用VSV加強免疫誘導(dǎo)的T細胞的質(zhì)量；圖17表示使用不同抗原和宿主品系的加強免疫方案的T細胞應(yīng)答；圖18表示由靜脈內(nèi)VSV介導(dǎo)的加強免疫作用不依賴于⑶4+ T細胞；圖19表示二次免疫應(yīng)答的耐久性和轉(zhuǎn)化成記憶細胞的效應(yīng)細胞的比例；圖20表示減毒的干擾素誘導(dǎo)突變型VSV疫苗等同于野生型VSV地加強免疫；
圖21對利用基于VSV的載體和基于Maraba的載體遞送DCT抗原時所加強的免疫應(yīng)答進行比較；圖22闡述當(dāng)使用Ad載體和Maraba載體遞送抗原以及使用Maraba載體和VSV載體加強抗原免疫力時，血液(A與B)和脾(C)中的免疫應(yīng)答；圖23闡述用不同劑量的抗原㈧以建立預(yù)存免疫力的免疫應(yīng)答以及VSV加強免疫對每一種的作用(B)；圖M對野生型與B細胞缺陷型小鼠中對抗原的初次免疫應(yīng)答㈧以及抗原加強免疫后血液和脾中的免疫應(yīng)答(B)進行比較；和圖25闡述B細胞重建㈧對抗原加強免疫⑶的作用。發(fā)明詳述本發(fā)明提供可用于治療哺乳動物的癌癥的疫苗接種方法，其中將表達哺乳動物對之具有預(yù)存免疫力的腫瘤抗原的溶瘤載體給予哺乳動物。本發(fā)明提供一種方法，其中哺乳動物對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答勝過哺乳動物對溶瘤病毒的免疫應(yīng)答，因此產(chǎn)生對癌癥的有效治療。本發(fā)明的疫苗接種方法可用于治療哺乳動物的癌癥。本文使用的術(shù)語“癌癥”包括任何癌癥，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如腦癌、乳癌、肝癌、胃癌和結(jié)腸癌) 及白血病。術(shù)語“哺乳動物”是指人以及非人類哺乳動物。所述方法包括將表達哺乳動物對之具有預(yù)存免疫力的腫瘤抗原的溶瘤載體給予哺乳動物。本文使用的術(shù)語“預(yù)存免疫力”意指包括通過用抗原接種誘導(dǎo)的免疫力以及哺乳動物內(nèi)天然存在的免疫力。因此，在一個實施方案中，為了建立預(yù)存免疫力，本發(fā)明的方法包括用適于誘導(dǎo)針對目標(biāo)癌細胞的免疫反應(yīng)的腫瘤抗原給哺乳動物接種疫苗的步驟。例如，腫瘤抗原可以是腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，例如在引發(fā)哺乳動物的免疫應(yīng)答的腫瘤細胞中產(chǎn)生的物質(zhì)。這類抗原的實例包括癌胚抗原(oncofetal antigen)(例如甲胎蛋白(AFP))和癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen，CEA)、表面糖蛋白(例如 CA 125)、癌基因(例如 Her2)、 黑素瘤相關(guān)抗原(例如多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT))、GP100和MART1、癌-睪丸抗原 (cancer-testes antigen)(例如 MAGE 蛋白和 NY-ES01)、病毒癌基因(例如 HPV E6 和 E7)、 在通常限于胚胎組織或胚外組織的腫瘤中異位表達的蛋白質(zhì)(例如PLAC1)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的一樣，可根據(jù)待采用本發(fā)明的方法治療的癌癥的類型選擇抗原，因為一種或多種抗原可能特別適用于治療某些癌癥。例如對于治療黑素瘤，可以使用黑素瘤相關(guān)抗原，例如DCT。可以給予抗原本身，或者優(yōu)選通過載體給予抗原，例如腺病毒(Ad)載體、痘病毒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體、質(zhì)?；蚝奢d的抗原呈遞細胞，例如樹突細胞。將抗原引入載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。一般而言，可對載體進行修飾以表達抗原。在這一方面，使用廣為接受的重組技術(shù)，將編碼選定抗原的核酸整合到選定載體上。用以下若干方法的任一種將抗原給予哺乳動物，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或鼻內(nèi)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的一樣，可在合適的溶媒(例如鹽水或其它合適的緩沖液) 中給予抗原或摻有抗原的載體。在用選定腫瘤抗原接種后，在免疫應(yīng)答間隔期內(nèi)例如約4天內(nèi)并延長達數(shù)月、數(shù)年或可能終身，哺乳動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。建立對抗原的免疫應(yīng)答，采用廣為接受的技術(shù)，進行使用抗原的疫苗接種。因此， 可以足以產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量將選定抗原或表達抗原的載體給予哺乳動物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的一樣，產(chǎn)生免疫應(yīng)答所需要的量將隨多種因素而變化，包括例如選定抗原、遞送抗原所使用的載體和待治療的哺乳動物，例如品種、年齡、體型等。在這一方面，例如，肌內(nèi)給予小鼠腺病毒載體至少約IO7PFU的最低量足以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。對于給予人，相應(yīng)的量應(yīng)足夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在另一個實施方案中，對抗原的免疫應(yīng)答可在哺乳動物內(nèi)天然發(fā)生，不需要第一疫苗接種步驟以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。對抗原的天然存在的免疫應(yīng)答可由任何既往暴露于抗原而產(chǎn)生。一旦在適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答間隔期內(nèi)在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，例如至少約M小時，優(yōu)選至少約2-4天或更久，例如至少約1周，則以適于溶瘤病毒療法的量將表達腫瘤抗原的溶瘤病毒給予哺乳動物，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的一樣，這可隨選定的溶瘤病毒和待治療的哺乳動物而變化。例如，靜脈內(nèi)給予小鼠IO8PFU溶瘤VSV的最低量足以用于溶瘤療法。相應(yīng)的量可足以用于人?？赏ㄟ^采用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)，將編碼抗原的轉(zhuǎn)基因整合到病毒中來制備表達選定腫瘤抗原的溶瘤病毒。例如，可將轉(zhuǎn)基因整合到病毒基因組，或者可采用整合轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒將轉(zhuǎn)基因整合到病毒中。本發(fā)明的方法對于可利用的溶瘤病毒沒有特別限制，可包括能夠破壞腫瘤同時適于給予哺乳動物的任何溶瘤病毒?？捎糜诒景l(fā)明方法的溶瘤病毒的實例包括棒狀病毒，例如水泡性病毒，例如水泡性口炎病毒(VSV)和Maraba病毒、短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)病毒、質(zhì)型彈狀病毒屬(Cytorhabdovirus)病毒、核型彈狀病毒屬(Nucleorhabdovirus)病毒和狂犬病病毒屬(Lyssavirus)病毒以及麻疹病毒、牛痘病毒、皰疹病毒、粘液瘤病毒、細小病毒(parvoviral)、新城疫病毒、腺病毒和semliki病毒 (semliki forest virus)。這種組合疫苗接種方法通過將目標(biāo)腫瘤抗原給予哺乳動物，從而刺激對靶抗原的免疫應(yīng)答，接著通過將也表達該腫瘤抗原的溶瘤病毒給予哺乳動物以加強免疫應(yīng)答，從而對哺乳動物癌癥提供有效治療。還發(fā)現(xiàn)這種方法大大降低哺乳動物抗病毒反應(yīng)，使溶瘤病毒成為有關(guān)腫瘤退化的有用的促進因素。本發(fā)明的另一個方面還提供可用于治療癌癥的藥盒。藥盒包括適于誘導(dǎo)哺乳動物的免疫應(yīng)答的量的腫瘤抗原或表達腫瘤抗原的載體以及適于提高免疫應(yīng)答的量的表達腫瘤抗原的溶瘤載體。上文描述了適合包括在藥盒中的腫瘤抗原和溶瘤載體。本發(fā)明的另一個方面，提供加強對抗原具有預(yù)存免疫力的哺乳動物的免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括靜脈內(nèi)給予哺乳動物抗原，優(yōu)選通過能夠感染B細胞的載體。術(shù)語“預(yù)存免疫力”如上定義，并且可按照上述方法實現(xiàn)。可利用這種方法加強對任何抗原的免疫力，包括例如腫瘤抗原、病毒抗原和特別是來源于病毒性致病生物(例如111￥、《印(、？1￥、^1^、依波拉病毒)以及細菌病原體(例如結(jié)核分枝桿菌)的抗原。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的一樣，可采用廣為接受的重組技術(shù)制備載體以表達選定抗原。用于將抗原遞送到哺乳動物中的合適載體是能夠感染B細胞的載體，包括例如上文給出的棒狀病毒，包括水泡性病毒和Maraba型病毒。突變型病毒載體也適用于本發(fā)明的方法。突變型減毒病毒(包括無能力復(fù)制形式)對用于本發(fā)明的方法是特別有利的。還可將荷載于抗原呈遞細胞(例如B細胞)中的抗原給予哺乳動物。 一旦制備表達選定抗原的載體，便將其靜脈內(nèi)給予哺乳動物用于最佳免疫強化。 所給予的載體的量也隨所選擇的載體以及哺乳動物而變化。有關(guān)預(yù)存免疫力，可在預(yù)存免疫力的峰值免疫應(yīng)答之前或同時，將抗原表達載體給予哺乳動物。最好在初免預(yù)存免疫力的效應(yīng)期之后，將抗原表達載體給予哺乳動物以加強預(yù)存免疫力。與包括肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和鼻內(nèi)在內(nèi)的其它給予途徑相比，抗原表達載體(例如加強免疫載體)的這種靜脈內(nèi)給予導(dǎo)致對抗原的免疫應(yīng)答顯著加強。與其它給予途徑相比，該方法提供的免疫應(yīng)答增加至至少約4倍。本發(fā)明還提供用于加強哺乳動物的免疫應(yīng)答的藥盒。該藥盒包括適于誘導(dǎo)對抗原的免疫應(yīng)答的量的抗原或表達抗原的載體。本發(fā)明以合適的給藥形式提供抗原或載體，例如適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或鼻內(nèi)給予的形式。藥盒還包括表達相同抗原的載體，其呈適于靜脈內(nèi)給予的形式，例如在鹽水或緩沖溶液中。上文描述了適合包括在藥盒中的抗原和載體。又一方面，提供加強對抗原具有預(yù)存免疫力的哺乳動物的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括靜脈內(nèi)給予哺乳動物荷載抗原的B細胞。如所表明的，靜脈內(nèi)給予荷載抗原的B 細胞導(dǎo)致對抗原的預(yù)存免疫應(yīng)答顯著加強。在不得解釋為限制性的下列具體實施例中描述了本發(fā)明的實施方案。實施例1材料與方法小鼠。把雌性年齡相當(dāng)?shù)男∈?研究開始時8-10周齡)，包括C57BL/6 (H_2b) 和 BalB/c (H-2d)小鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)關(guān)養(yǎng)在特殊的無病原體的設(shè)施中。動物研究遵守加拿大動物管理委員會(Canadian Council on Animal Care)準(zhǔn)則，并經(jīng)麥克馬斯特大學(xué)動物研究倫理理事會(McMaster University' s Animal Research Ethics Board)批準(zhǔn)。細胞。使B16-F10鼠黑素瘤細胞和CT26結(jié)腸癌細胞在含有10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、ImM丙酮酸鈉、維生素溶液、0. OlmM非必需氨基酸、50 μ M 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素和 100yg/mL 鏈霉素(全部得自 Invitrogen, Grand Island, NY, USA)的 Fll-極限必需培養(yǎng)基中生長。使HEK293T細胞在D-MEM加10% FBS中生長，而使Vero細胞在α-MEM 加10% FBS中生長。載體。Ad-hDCT是表達全長hDCT基因的E1/E3缺失的人5型Ad，AdBHG是不含轉(zhuǎn)基因的 E1/E3 缺失的病毒(Lane，C 等，Cancer Res 64，1509-1514 (2004) ；Ng 等，Mol Ther 3，809-815 (2001))。按照 Stojdl，D. F.等，Cancer Cell 4，263-275 (2003)中所述，通過將 hDCT PCR 片段亞克隆至質(zhì)粒 pVSV-XN(由 John Rose, Yale University, New Haven, Connecticut提供)以及在基質(zhì)基因中攜帶Δ M51突變的病毒基因組的G和L基因之間的 XhoI和NheI位點，對印第安納血清型的重組VSV進行改造以表達hDCT。采用相同策略構(gòu)建類似的Maraba載體。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)拯救重組基因組(Lawson等，Proc Natl Acad Sci U S A 1995年9月12日；92 (19) 9009)以產(chǎn)生有復(fù)制能力的hDCT表達VSV (VSV-hDCT)。對于一些實驗，拯救不含轉(zhuǎn)基因的親本VSV作為對照病毒(VSV-MT)。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的VSV之前披露于Stojdl，D. F.等，Cancer Cell 4，263-275 (2003)，并在本研究中用于監(jiān)測感染(VSV-GFP)。表達SIFNFEKL-螢光素酶融合物的病毒也用來誘導(dǎo)針對這種卵清蛋白衍生表位的應(yīng)答。還構(gòu)建了表達LCMV表位的病毒以針對該病毒接種疫苗。由HEK 293T細胞產(chǎn)生VSV儲備液，并通過蔗糖梯度離心純化。通過Vero細胞的噬斑測定法測定病毒滴度。 肽。與H-2Kb結(jié)合的DCT的免疫顯性肽(DCT180-188，SVYDFFVffL ；人和鼠DCT共有)通過P印Scan系統(tǒng)(Lelystad，Netherlands)合成。來源于VSV的N蛋白的H_2Kb 限制性表位(RGYVYQGL)和 Db 結(jié)合鼠 gplOO 肽(mgpl0025-33 ；EGSRNQDffL)購自 Biomer Technologies(Hayward, CA)。立體定位外科。為了建立腦腫瘤，小鼠接受顱內(nèi)注射含IxlO3個B16-F10細胞的 2μ 1 PBS。將小鼠置于立體定位儀(Xymotech Biosystems Inc，Quebec，Canada)上,在麻醉下切開頭皮暴露顱骨。將裝在10 μ 1 Hamilton注射器(Hamilton Company, Reno, NV) 上的針定位在大腦前因外側(cè)2. 25mm的右半球處。經(jīng)由顱骨鉆出一個小鉆孔，將針斜面插入 3mm深的腦實質(zhì)中。在1分鐘時間內(nèi)注射細胞。將針留在原處2分鐘后抽出以使沿注射道的回流減到最低。頭皮切口用不銹鋼夾子閉合，7-10天后取下夾子。BalB/c小鼠的肺轉(zhuǎn)移性腫瘤。通過尾靜脈注射，給BalB/c小鼠接種2xl05個CT26 細胞的200 μ 1 PBS溶液。所有未治療小鼠在24天內(nèi)達到終點。疫苗接種方案。通過肌內(nèi)(i.m.)注射IxlO8Pfu Ad載體的ΙΟΟμΙ PBS溶液 (50 μ 1/胭繩肌腱)或注射2-10xl08pfu VSV的200 μ 1 PBS溶液到尾靜脈(i. v.)，給經(jīng)麻醉的小鼠免疫接種。組織勻漿物中的病毒滴定。為了測定腫瘤內(nèi)的病毒復(fù)制，在靜脈內(nèi)接種VSV載體后3天收集腦或肺，稱重，勻漿后滴定。通過Vero單層培養(yǎng)物上的噬斑測定法定量測定病毒滴度，用每克組織的噬斑形成單位(PFU)表示?？贵w。在流式細胞術(shù)測定法中使用下列單克隆Ab 抗⑶16/⑶32 (克隆2. 4G2)以封閉Fc受體、用于檢測細胞表面標(biāo)記的抗CD3(克隆145-2C11)、抗CD8(克隆53-6. 7)和用于胞內(nèi)染色的抗IFN- γ (克隆XMG1. 2)(全部試劑得自BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)。T細胞制備和胞內(nèi)染色。對于PBMC(外周血單核細胞)收集，從眶周竇采集血液， 使紅細胞裂解。對于TIL(腫瘤浸潤性淋巴細胞)分離，從腦中切取CNS瘤，稱重，切碎， 隨后在含有 0. 1 %膠原酶 I 型(Invitrogen Life Technologies)和 DNA 酶(0. lmg/ml, Sigma-Aldrich，St. Louis, MO)的Hank緩沖鹽水中，于37°溫育1小時。在消化后，將釋出的細胞通過70-μ M濾器過濾，采用EasyS印CD90-PE系統(tǒng)(STEMCELL Technologies, Vancouver, BC)對 TIL 進行純化。在布雷菲德菌素 A (GolgiPlug，BD Pharmingen, 1 μ g/ml, 溫育1小時后加入)存在下，將得自血液的單核細胞和得自腦腫瘤的TIL用肽(lyg/ml) 刺激。在總共5小時的溫育時間后，細胞用抗⑶16/⑶32處理，并通過加入Ab對表面標(biāo)記進行熒光標(biāo)記。然后使細胞透化，用Cytofix/Cytoperm(BD Pharmingen)固定，并對胞內(nèi)細胞因子進行染色。采用備有FACSDiva 5. 0. 2軟件(BD Pharmingen)的FACSCanto流式細胞儀獲得數(shù)據(jù)后，用FlowJo Mac 6. 3. 4版軟件(Treestar)進行分析。四聚體染色和BrdU摻入測定法。收獲前24小時，經(jīng)免疫接種的小鼠接受Img BrdU 的腹膜內(nèi)注射。不同器官的淋巴細胞先用APC綴合的四聚體H-2Kb/SVYDFFVWL染色，然后按照生產(chǎn)商的說明書，使用BrdU染色試劑盒(BD Pharmingen)進行BrdU染色。組織染色。對于腦石蠟切片的染色，將組織在10%福爾馬林中固定過夜，轉(zhuǎn)移到 70%乙醇中，用石蠟包埋，并切成5μπι的厚度。切片用蘇木精和伊紅(Sigma)染色。統(tǒng)計分析。對于所有作圖和統(tǒng)計分析均采用適用Windows的GraphPad Prism 4. 00 版(GraphPad Software, San Diego, California, USA)。通過斯氏雙尾 t 檢驗 (Student' s two-tailed t-test)或單向或雙向ANOVA分析，對T細胞應(yīng)答進行分析。平均值間的差異為P <0.05時視為顯著。顯示了平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差棒。應(yīng)用Kaplan-Meier 方法和趨勢Iogrank檢驗，對存活數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果幼稚宿主中溶瘤作用和腫瘤疫苗接種的影響C57BL/6小鼠接受IxlO3個B16-F10細胞的顱內(nèi)注射。一周后，小鼠用靜脈內(nèi)注射 IxlO9Pfu VSV-GFP治療。熒光顯微鏡顯示VSV治療后3天收獲的腦有腫瘤內(nèi)GFP表達的證據(jù)。感染后4天收獲的腦的肉眼檢查顯示VSV-GFP治療腦中的腫瘤負荷大大降低。這些腦的蘇木精和伊紅染色切片也表明這種降低。如圖IA所示，存活研究未能檢出溶瘤VSV-GFP 治療(5只小鼠，2組，如上治療并重復(fù)3次，結(jié)果類似)后延長的存活?；蛘撸谝浦埠蟮?5天，小鼠用一次肌內(nèi)劑量的IxlO8PFU Ad-hDCT或Ad-BHG治療。在疫苗接種后第14天進行了外周血的免疫學(xué)分析。圖IB給出了在用DCT的優(yōu)勢表位刺激后，對胞內(nèi)IFNy呈陽性的CD8+T細胞的百分比。收集存活數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表明了 Ad-hDCT疫苗接種的小鼠中存活的顯著延長，見圖1C。實驗重復(fù)了 3次，給出了代表性數(shù)據(jù)。在另一項實驗中，在移植后第5天， 荷有顱內(nèi)B16腫瘤的小鼠用一次靜脈內(nèi)劑量的IxIO9PFU VSV_hDCT治療。在給予VSV后第 14天對外周血進行了免疫學(xué)分析。圖ID給出了在用DCT的優(yōu)勢表位和VSV核衣殼的優(yōu)勢表位刺激后，對胞內(nèi)IFNy呈陽性的⑶8+ T細胞的百分比。在溶瘤VSV-hDCT治療(5只小鼠，2組，重復(fù)3次，結(jié)果相似)后，存活研究未能檢出存活延長，見圖1E。將針對溶瘤病毒(OV)的免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)橛幸婷獾囊邞?yīng)答。圖2A中給出了用Ad-hDCT和VSV-hDCT組合治療的時間線，其中在移植后第5天， 給荷瘤小鼠接種疫苗以在第19天遞送溶瘤病毒前產(chǎn)生抗DCT應(yīng)答。VSV治療后6天收集外周血，進行了響應(yīng)DCT的優(yōu)勢表位和VSV-N的優(yōu)勢表位的IFN γ的ICS。幼稚小鼠顯示針對 VSV-hDCT的抗病毒應(yīng)答占優(yōu)勢的應(yīng)答，而接種疫苗的小鼠顯示抗DCT應(yīng)答占優(yōu)勢的應(yīng)答， 且抗VSV應(yīng)答降低(參見圖2B)。圖2C給出了 3次獨立實驗的匯總存活數(shù)據(jù)，其中小鼠用空Ad載體(Ad-BHG)治療、僅Ad-hDCT治療或用Ad-hDCT接著VSV-hDCT治療(分別為η = 19、η = 18和η = 15)，清楚表明后一組合延長存活。溶瘤病毒免疫加強的免疫學(xué)特征。

在VSV治療后應(yīng)答的高峰，荷瘤(TB)和無腫瘤(TF)C57BL/6小鼠外周血中DCT特異性IFN γ+⑶8+ T細胞數(shù)的比較(TB η = 7, TF η = 5)見圖3Α。表明外周血中抗DCT應(yīng)答的幅度與存活之間的相關(guān)性的匯總數(shù)據(jù)見圖3Β。數(shù)據(jù)包括模擬接種疫苗(Ad-BHG，x)、接種Ad-hDCT疫苗(□)或用Ad-hDCT+VSV-hDCT組合(·)治療的小鼠。水平線表示無腫瘤小鼠中獲得的平均應(yīng)答+/_SEM(短劃線)。大多數(shù)與存活> 45天有關(guān)的應(yīng)答只可在荷瘤動物中達到，這就表明了使用溶瘤病毒作為加強免疫載體的重要性。接種Ad-hDCT疫苗的荷有顱內(nèi)B16-F10腫瘤的C57BL/6小鼠隨后用PBS、VSV-MT (無轉(zhuǎn)基因)或VSV-hDCT治療。7天后收集腫瘤，并對DCT180-188肽產(chǎn)生應(yīng)答的IFN γ +腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)計數(shù)， 見圖3C。通過IFNy的ICS，對GplOO應(yīng)答的⑶8+T細胞計數(shù)，表明荷瘤(TB)動物的組合療法誘導(dǎo)表位擴展(圖3D)。接種疫 苗對OV復(fù)制的影響。用Ad載體給無腫瘤(TF)或B16-F10荷瘤(TB)C57BL/6小鼠肌內(nèi)免疫接種。Ad 治療后14天，通過靜脈內(nèi)注射給予小鼠VSV-hDCT，VSV接種后3天，將腦稱重，并勻漿。在 Vero單層培養(yǎng)物上通過噬斑測定法，定量測定病毒滴度，用PFU/克腦組織表示(圖4A)。腦重概括于圖4B。匯總每組5只小鼠兩次實驗的數(shù)據(jù)。VSV-hDCT治療后T細胞復(fù)制的動力學(xué)。在VSV-hDCT接種前，無腫瘤C57BL/6小鼠用AchhDCT免疫接種14天。收獲前24 小時，經(jīng)免疫接種的小鼠接受Img BrdU的腹膜內(nèi)注射。在7天內(nèi)每24小時收獲組織，監(jiān)測T細胞增殖。通過用BrdU的抗體和四聚體H-2Kb/SVYDFFVWL共同染色來測定血液(圖 5A)、脾(圖5B)和頸部淋巴結(jié)(圖5C)中抗原特異性CD8+T細胞的增殖。各符號代表5只小鼠，實驗重復(fù)兩次，結(jié)果相似。肺轉(zhuǎn)移模型中疫苗接種對溶瘤作用的影響。在時間線(圖6A)所示CT26腫瘤植入(2xl05個細胞，靜脈內(nèi)注射)的前14天(長間隔期)或同一天(短間隔期)，將BalB/c小鼠用IO8PFUAchhDCT肌內(nèi)免疫接種。腫瘤接種后14天，小鼠通過尾靜脈注射，用2x108PFU VSV-hDCT或VSV-GFP治療。在VSV治療后4 天，收獲整個肺并勻漿。在Vero單層培養(yǎng)物上通過噬斑測定法定量測定病毒滴度，用PFU/ 克組織表示(分別見圖6B和圖6C)。從每組5只小鼠的兩次實驗中匯總數(shù)據(jù)。初免和加強免疫之間間隔期的延長提高應(yīng)答幅度。C57BL/6小鼠最初用IO8PFU Ad-hDCT的肌內(nèi)劑量免疫接種。14或100天后，通過尾靜脈注射給予小鼠IO9PFU的VSV-hDCT。VSV治療后7天，通過FACS分析定量測定血液中DCT特異性分泌IFN γ的⑶8+T細胞的百分比(圖7A)或數(shù)目(圖7B)。各個條代表5 只小鼠。Maraba型溶瘤疫苗載體荷有顱內(nèi)B16F10腫瘤的C57/B6小鼠用Ad-BHG (空載體，陰性對照)或Ad-hDCT(IxlO8PFU肌內(nèi))接種疫苗。一組隨后接受一次靜脈內(nèi)劑量的 Maraba-hDCT(2xl09PFU)。5天后對外周血T細胞進行了免疫分析(每種治療3個條，左邊的條為IFN γ +，中為TNF α +，右邊的條為每種情況的雙陽性)(圖8Α)，記錄了存活數(shù)據(jù)(圖 8Β)。用荷載抗原的樹突細胞進行疫苗接種靜脈內(nèi)給C57/B6小鼠植入B16F10細胞。用單獨或與隨后靜脈內(nèi)遞送VSV-hDCT 組合的Ad-hDCT或荷有hDCT的樹突細胞(DC)給小鼠接種疫苗。收集存活數(shù)據(jù)，見圖9A。 用DChDCT+VSVhDCT的組合治療的2只小鼠是長期存活者(植入后100天處死，肺部健全)。 相對于PBS治療組，Ad-接種疫苗組和DC-接種疫苗組全都具有顯著較大的生存中值，而組合DC-hDCT+VSV-hDCT治療組具有最大生存中值。(圖9B)。用荷有抗原的牛痘病毒載體進行的疫苗接種第10天，皮下bl6F10黑素瘤腫瘤用PBS、僅雙缺失牛痘-hDCT (ddVV-hDCT,IxlO8PFU IT)或ddVV-hDCT接著4天后用VSV-hDCT(2xl09PFU靜脈內(nèi))治療。提供了腫瘤體積(圖10A)和存活數(shù)據(jù)(圖10B)，并說明組合療法的應(yīng)答增加。討論
在使用黑素瘤相關(guān)抗原的有免疫能力的宿主中利用攻擊性顱內(nèi)(i.c.)B16黑素瘤模型。在該模型中，通過顱內(nèi)注射將IxlO3個B16-F10細胞植入C57BL/6小鼠，腫瘤遞送后的中位生存時間為15天(未治療對照的積累數(shù)據(jù)，η = 41)。為了評價VSV治療的功效， 攜帶5天大的Β16腫瘤的小鼠用IxIO9VSV-GFP的一次靜脈內(nèi)(i. v.)劑量治療。與預(yù)期一樣，用VSV感染腫瘤導(dǎo)致腫瘤體積明顯下降。然而，這種效果是短暫的，不能解釋為存活益處(圖la)。在另一種方法中，對通過腫瘤疫苗接種治療顱內(nèi)B16黑素瘤進行了試驗。給 C57BL/6小鼠植入IxlO3個B16細胞的顱內(nèi)劑量，植入后5天，將這些小鼠用IxlO8PFU Ad-hDCT肌內(nèi)(i.m.)進行治療。疫苗接種后一周，外周血中針對優(yōu)勢免疫表位 DCT180-188(人與小鼠之間相同)的⑶8+T細胞應(yīng)答顯而易見，在第12-14天達到最大值 (約3. 5% IFN- y +CD8+T細胞，圖lb)。與VSV治療相比，Ad-hDCT疫苗接種顯著延長存活 (中位死亡時間32天相對于19天，P = 0. 0044)(圖Ic)，但是不能治愈任一小鼠。用對照載體Ad-BHG或PBS免疫接種的小鼠中未測到DCT特異性T細胞或保護。在又一種方法中，對VSV進行改造以表達hDCT(VSV-hDCT)，且將荷有顱內(nèi)B16-F10 腫瘤的小鼠用VSV-hDCT載體治療。該載體誘導(dǎo)小規(guī)模抗DCT⑶8+ T細胞應(yīng)答(0.26%，圖 Id)，這為Ad-hDCT誘導(dǎo)的應(yīng)答(3.2%，圖1B)的1/12。然而，在VSV_hDCT治療后，檢測到針對VSV核蛋白的表位的高水平CD8+T細胞(14. 0%，圖Id)，這就表明抗病毒應(yīng)答在免疫成果中占優(yōu)勢。與VSV-GFP的觀察結(jié)果(圖1A)類似，用VSV-hDCT治療不提供任何存活益處(圖Ie)。因此，由溶瘤病毒誘導(dǎo)的強效抗病毒免疫應(yīng)答不僅僅引起載體的溶瘤影響為短暫的，而且還在直接誘導(dǎo)針對腫瘤相關(guān)抗原(TAA)轉(zhuǎn)基因的免疫應(yīng)答的嘗試中占優(yōu)勢。在又一種方法中，誘導(dǎo)針對所規(guī)定的腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，接著用表達該同一抗原的溶瘤病毒治療。通過IxlO8PFU Ad-BHG或Ad-hDCT的肌內(nèi)注射來治療荷有7天大的顱內(nèi) B16腫瘤的C57BL/6小鼠。14天后，將一次靜脈內(nèi)劑量的VSV-GFP或IxlO9PFU VSV-hDCT給予小鼠(圖2a)。如圖2b所概述，荷瘤小鼠中，Ad-hDCT免疫接種接著VSV-hDCT導(dǎo)致22% 血液衍生的⑶8+ T細胞呈DCT特異性；為僅載體治療的7倍(與圖IB相比)或85倍(與圖Id相比)。此外，與在幼稚小鼠暴露于這種OV后所觀察到的相比，這種組合不僅確實顯著提高對TAA的免疫應(yīng)答，而且實際上還降低抗VSV⑶8+ T細胞應(yīng)答的幅度(14%至4. 7% 血液衍生的CD8+ T細胞；圖2b)，這就表明針對溶瘤疫苗病毒的免疫應(yīng)答的逆轉(zhuǎn)，其中抗腫瘤應(yīng)答此時的優(yōu)勢超過抗病毒免疫力。最重要的是，在僅僅一次劑量的各載體后，組合療法導(dǎo)致生存中值進一步延長，即協(xié)同效應(yīng)(僅用Ad-BHG為15天生存中值，僅用Ad-hDCT為 30. 5天生存中值，用組合治療為54天生存中值)，且20%以這種方式治療的小鼠表現(xiàn)出長期持久的治愈(圖2c)。荷瘤動物中的抗DCT T細胞應(yīng)答的幅度比無腫瘤動物中的大，這就表明有腫瘤時利用復(fù)制的OV遞送轉(zhuǎn)基因的優(yōu)勢(圖3a)。此外，存活與DCT特異性⑶8+ T細胞水平直接相關(guān)，其中當(dāng)該免疫應(yīng)答的幅度超過無腫瘤宿主可產(chǎn)生的幅度時，才能達到存活的最大延長(圖3b)。因此最佳治療效果通過加強腫瘤內(nèi)的溶瘤載體復(fù)制而介導(dǎo)。同樣，與用VSV-MT對照病毒治療的動物相比，VSV-hDCT治療的動物中，對DCT有特異性的腫瘤浸潤性 CD8+ T細胞的頻率顯著較高，這就表明用VSV-hDCT進行治療不僅僅導(dǎo)致外周抗原特異性 CD8+ T細胞數(shù)目的整體提高，而且還提高其募集到腫瘤中(圖3c)。有趣的是，檢測到針對 GPlOO (未用其給小鼠接種疫苗的另一種TAA)的CD8+ T細胞應(yīng)答，這就提供了很可能由抗 DCT CTL和病毒溶瘤作用兩者增強的腫瘤破壞引起的表位擴展的證據(jù)，因為單獨用任一治療不能測得抗GP100應(yīng)答(圖3d)。
雖然上述觀察結(jié)果表明，在針對載體轉(zhuǎn)基因的免疫應(yīng)答存在時VSV-hDCT保持溶瘤性，但是仍對這種預(yù)存免疫力對VSV復(fù)制的影響進行了評價。無腫瘤小鼠和荷有顱內(nèi) B16-F10腫瘤的小鼠用Ad-hDCT或Ad-BHG治療。14天后，給予小鼠IxlO9PFU VSV-hDCT的靜脈內(nèi)劑量。VSV遞送后42小時，收獲腦，并測定病毒滴度。在模擬接種疫苗小鼠中，無腫瘤和荷瘤腦兩者均顯示大量的VSV-hDCT復(fù)制，其中荷瘤腦的病毒滴度較高，為無腫瘤腦的50 倍(圖4a)。由于模擬疫苗接種不阻止腫瘤生長，因此這些小鼠具有大量腫瘤負荷(圖4b)， 并且非常接近安樂死時的終點。在Ad-hDCT接種疫苗的小鼠中，VSV滴度低得多，然而荷瘤腦仍然顯示較高的VSV-hDCT滴度(圖4a)，盡管在該時間點時這些腦具有最低的腫瘤負荷 (圖4b)。因此，盡管對載體轉(zhuǎn)基因的預(yù)存免疫力，VSV在這種殘留腫瘤中仍然能夠感染和復(fù)制。為了測定DCT特異性⑶8+ T細胞經(jīng)由VSV-hDCT的擴繁的時滯，將小鼠用VSV-hDCT 加強免疫，并在包括脾和淋巴結(jié)在內(nèi)的組織收獲前24小時接受BrdU。圖5中概括的數(shù)據(jù)表明，直到VSV-hDCT治療后第3天才檢出⑶8+ T細胞的擴繁。這些數(shù)據(jù)表明，在治療后觀察到的TAA特異性T細胞大量擴繁前，在針對TAA轉(zhuǎn)基因的初次免疫應(yīng)答存在時，溶瘤疫苗載體具有至少3天來復(fù)制。由于Ad-hDCT對腫瘤負荷有大的影響，因此難以定量分析B16模型中針對轉(zhuǎn)基因的預(yù)存免疫應(yīng)答對病毒復(fù)制的影響。因此，在DCT不是腫瘤抗原的不同腫瘤模型中測定了這種影響。這允許在小鼠具有與疫苗接種無關(guān)的類似腫瘤負荷的情況下進行比較，而且還提供有關(guān)疫苗接種和病毒溶瘤作用之間的間隔期的機動性。為此，選擇了其中DCT是不相關(guān)的CT26結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移模型。在同一天，給小鼠靜脈內(nèi)接種CT26細胞和用Ad-hDCT肌內(nèi)接種疫苗。14天后，小鼠通過靜脈內(nèi)注射接受2x108PFU VSV-hDCT或VSV-GFP。為了測定病毒復(fù)制，在給予VSV后96小時，使小鼠安樂死，收集肺和腦用于通過噬斑測定法測定VSV 滴度(圖6a)。與VSV-GFP對照相比，用VSV-hDCT治療動物的肺和腦兩者中觀察到病毒滴度降低約1. 51og(圖6b)。然而，有趣的是，如果在植入CT26前14天(VSV-hDCT治療前27 天)給小鼠免疫接種，則VSV-hDCT肺滴度的降低較少(圖6c)，這就表明這兩種治療之間的間隔期延長可潛在地使溶瘤作用的減損降到最小。在VSV-DCT腦滴度中也觀察到顯著降低 (圖6c)，這就表明既往針對由溶瘤病毒(OV)編碼的非結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因的疫苗接種在正常組織中降低OV復(fù)制，因此提高OV的安全特性?？赏ㄟ^延長疫苗接種和給予OV之間的間隔期，使溶瘤作用的降低減到最小，因為抗原特異性效應(yīng)物的頻率隨時間降低。如果Ad-hDCT后100天給予VSV-hDCT，則在無腫瘤動物中可證實，延長疫苗接種和病毒溶瘤作用之間的間隔期有更多益處，其中對DCT優(yōu)勢免疫表位有特異性的CD8+ T細胞的平均頻率達到37% (是在14天時間點進行時觀察到的水平的兩倍)(圖7)。鑒于上文所述，證實了這樣的治療策略，即有效利用腫瘤疫苗接種以按使得允許短暫的病毒溶瘤作用的這類方式改進針對工程改造的溶瘤病毒載體的免疫應(yīng)答，所述短暫的病毒溶瘤作用直接引起大量的抗腫瘤免疫應(yīng)答。通過操作系統(tǒng)，使得針對溶瘤病毒的占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答也碰巧是抗腫瘤免疫應(yīng)答功能，以延長病毒載體通過這種免疫反應(yīng)的影響。因此，對溶瘤病毒進行改造以表達天然腫瘤抗原可誘導(dǎo)針對腫瘤抗原的弱的T細胞應(yīng)答，但是這種應(yīng)答被針對病毒抗原的免疫應(yīng)答完全遮蔽。雖然既往針對溶瘤載體轉(zhuǎn)基因的免疫接種可能看上去是反直覺的，因為其可消弱病毒遞送或復(fù)制，但是本發(fā)明的結(jié)果表明， 溶瘤疫苗在這些情況下變得更有效，因為其極大地放大了預(yù)存的抗腫瘤免疫力，同時保持溶瘤活性，導(dǎo)致臨床結(jié)果得到顯著改善。出乎意料的是，預(yù)存免疫力不防止瘤內(nèi)病毒復(fù)制， 這種方法的眾多免疫學(xué)益處使之合理平衡。雖然這種提高的抗原特異性應(yīng)答還可降低OV 的復(fù)制，但得自BrdU標(biāo)記的小鼠的數(shù)據(jù)表明，對于病毒溶瘤作用至少有3天機會窗。實際上，在該點上將CTL募集至腫瘤中是需要的，并且提高病毒和腫瘤兩者的清除率。 這種方法的其它益處是由溶瘤疫苗載體顯示的安全特性得到提高。數(shù)據(jù)證實了靜脈內(nèi)遞送后由VSV引起的顱內(nèi)感染，然而，在免疫接種的動物的腦內(nèi)，病毒滴度較低，最引人注目的是，即使使用野生型VSV，已針對病毒轉(zhuǎn)基因疫苗接種的任何小鼠中都沒有后肢麻痹。還用表達hDCT的VSV的干擾素誘導(dǎo)突變體對這種組合療法進行了測試，在顱內(nèi)B16模型中引起相當(dāng)?shù)拇婊?未顯示)，這就表明這種方法可與其它病毒尋靶和減毒方法成功結(jié)
I=I O本發(fā)明的組合治療方法可利用產(chǎn)生預(yù)存抗原免疫應(yīng)答的各種方法(病毒、質(zhì)粒和細胞)，并且還可利用各種溶瘤疫苗載體，包括VSV和Maraba。實施例2材料與方法病毒-所使用的VSV載體使用攜帶野生型M基因(pVSV-XN)或印第安納血清型的M蛋白突變體( M51-VSV)的質(zhì)粒基因組構(gòu)建，并通過亞克隆質(zhì)粒pVSV-XN或ρ ΔΜ5的 XhoI和NheI位點之間的PCR片段產(chǎn)生。VSV/SIINFEKL-Luc (VSV/SIIN)含有螢光素酶的改進形式，其攜帶N端加標(biāo)簽的OVA(SIINFEKL)的優(yōu)勢免疫I類表位。VSV/hDCT攜帶人黑素瘤相關(guān)抗原多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)。VSV/GFP帶有綠色熒光蛋白，對照病毒VSV/MT不含轉(zhuǎn)基因。使VSV載體在293T細胞培養(yǎng)物中增殖，并通過蔗糖梯度離心純化。雙缺失牛痘病毒-hDCT(ddVV-hDCT)是重組的胸苷激酶，牛痘生長因子雙缺失牛痘病毒被工程改造以表達hDCT。使牛痘在CVl細胞中生長。肽-通過P印Scan 系統(tǒng)(Lelystad, Netherlands)，合成與 H_2Kb (DCT18。-188， SVYDFFVffL ；人和鼠DCT共有)結(jié)合的DCT的免疫顯性肽(Parkhurst等，1998)和OVA的Kb 結(jié)合肽(SIINFEKL)。疫苗接種方案_通過肌內(nèi)注射Ix 108pfu Ad載體的100 μ 1 PBS溶液(50 μ 1/胭繩肌腱)，接著通過靜脈內(nèi)注射l-2x 109pfu VSV的200 μ 1 PBS溶液到尾靜脈，給經(jīng)麻醉的小鼠免疫接種。間隔期為8-233天?？贵w-在流式細胞術(shù)測定法中使用下列單克隆Ab 抗⑶16/⑶32 (克隆2. 4G2) 以封閉Fc受體、用于測定細胞表面標(biāo)記的抗CD3(克隆145-2C11)、抗CD4(克隆RM4-5)、 抗⑶8(克隆53-6. 7)和用于胞內(nèi)染色的抗IFN-Y (克隆XMG 1.2)和抗TNF-α (克隆 MP6-XT22)(全部試劑得自 BD Biosciences, San Diego, CA, USA)。用來源于 ATCC 的 mAbGK1.5(抗CD4)和/或2.43(抗CD8)進行了免疫耗竭研究。隔兩天腹膜內(nèi)注射純化的 mAb (250 μ g，在500 μ 1鹽水中)，此后以200 μ g/治療的維持劑量一周兩次注射。通過流式細胞術(shù)測定，淋巴細胞亞類的特異性耗竭的效率> 98%。 T細胞制備和胞內(nèi)染色-由眶周竇收集血液，并使紅細胞裂解。將脾和淋巴結(jié)在含有 0. 05mg/ml 膠原酶 I 型(Invitrogen Life Technologies)的 Hank 緩沖鹽溶液 (HBSS)中于37°溫育30分鐘，然后在顯微鏡玻片間擠壓以產(chǎn)生單細胞懸液。對于TIL分離，從PBS-灌注小鼠腦上切取CNS瘤，然后稱重，切碎，隨后在含有0. 5mg/ml膠原酶I型、 0. 2mg/ml DNA 酶和 0. 02mg/ml 透明質(zhì)酸酶(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)的 HBSS 中于 37°溫育45分鐘。消化后，將釋出的細胞通過70- μ M濾器過濾，采用EasyS?、?0. 2-ΡΕ 系統(tǒng)(STEMCELL Technologies, Vancouver, BC)，對TIL進行純化。在布雷菲德菌素 A(GolgiPlug，BD Pharmingen, 1 μ g/ml，溫育 1 小時后加入)存在下，用肽(1 μ g/ml)刺激制備的單核細胞。在總共5小時的溫育時間后，細胞用抗⑶16/⑶32處理，通過加入Ab對表面標(biāo)記進行熒光標(biāo)記。然后使細胞透化，用Cytofix/Cytoperm(BD Pharmingen)固定，并對胞內(nèi)細胞因子進行染色。采用配有FACSDiva 5. 0. 2軟件(BD Pharmingen)的FACSCanto 流式細胞儀獲取數(shù)據(jù)，并用FlowJo Mac 6. 3. 4版軟件(Treestar)進行了分析。B細胞分離和培養(yǎng)_通過采用MACS試劑盒(Miltenyi)的陰性選擇以除去ηο0_Β 細胞，來分離出脾B細胞。將B細胞在IMDM加FCS和muIL2中培養(yǎng)4天后，用Ad或VSV載體以25的MOI感染2小時，然后洗滌，并通過尾靜脈給予受體小鼠。結(jié)果在第0天，C57BL/6小鼠(n = 5/組)接受lxl08pfu Ad-hDCT的肌內(nèi)注射，接著在第 14天接受通過不同途徑(i.m.:肌內(nèi)，s. c:皮下，i. p.腹膜內(nèi)，i. η.:鼻內(nèi)，i.v.:靜脈內(nèi)) 注射的IxlO9Pfu VSV-hDCT。7天后，在用肽9重新刺激后，通過對干擾素-γ胞內(nèi)染色的流式細胞分析，測定了對黑素瘤相關(guān)抗原多巴色素互變異構(gòu)酶的優(yōu)勢免疫表位(DCT180-188) 的血液衍生的T細胞應(yīng)答(參見圖11)。在第0天，C57BL/6小鼠(η = 5/組)接受lxl08pfu Ad-hDCT的肌內(nèi)注射，接著在第14天初次免疫應(yīng)答的高峰(圖12a)或高峰前第8天(圖12b)接受lxl09pfu VSV-hDCT 的靜脈內(nèi)注射(注意Ad誘導(dǎo)的高峰為第12-14天)。7天后，在用肽重新刺激后，通過干擾素-Y胞內(nèi)染色的流式細胞分析，測定了對黑素瘤相關(guān)抗原多巴色素互變異構(gòu)酶的優(yōu)勢免疫表位(DCT180-188)的血液衍生的T細胞應(yīng)答。這種策略在無腫瘤(圖12a)和荷瘤(圖 12b ；在這種情況下，顱內(nèi)B16-F10黑素瘤，已知是免疫抑制的)兩種情況下均產(chǎn)生效果。在第0天，C57BL/6小鼠(η = 5/組)接受lxl08pfu Ad-hDCT的肌內(nèi)注射，接著在第232天接受IxlO7Pfu VSV-hDCT或ddVV-hDCT的靜脈內(nèi)注射。在用肽重新刺激后，通過干擾素-Y胞內(nèi)染色的流式細胞分析，測定了對黑素瘤相關(guān)抗原多巴色素互變異構(gòu)酶的免疫顯性(SVY)(圖13a)和第二最顯性(VIT)(圖13b)表位的血液衍生的T細胞應(yīng)答。在第0天，C57BL/6小鼠(η = 5/組)接受lxl08pfu Ad-hDCT的肌內(nèi)注射，接著在第35天接受IxlO7Pfu VSV-hDCT或VSV-deltaG-hDCT (導(dǎo)致非生產(chǎn)性感染的載體形式；被認為極其安全)的靜脈內(nèi)注射。在用肽重新刺激后，通過干擾素-Y胞內(nèi)染色的流式細胞分析，測定了對黑素瘤相關(guān)抗原多巴色素互變異構(gòu)酶的免疫顯性(SVY)、第二最顯性(VIT) 和第三最顯性(STF)表位的血液衍生的T細胞應(yīng)答(圖14)。
在第0天，C57BL /6小鼠(η = 5/組)接受lxl08pfu Ad-hDCT的肌內(nèi)注射，接著在第8天接受IxlO9Pfu VSV-hDCT的靜脈內(nèi)注射。在Ad后第8、15、22和29天，在用肽重新刺激后，通過干擾素-Y胞內(nèi)染色的流式細胞分析，測定了對黑素瘤相關(guān)抗原多巴色素互變異構(gòu)酶的免疫顯性(SVY)表位的血液衍生的T細胞應(yīng)答。與在B16-F10腦黑素瘤存在或不存在時僅Ad-hDCT或Ad+對照VSV載體(VSV-GFP)相比，更多的T細胞響應(yīng)VSV-hDCT 加強免疫產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)-Ci (圖15a)(用雙細胞因子產(chǎn)生細胞與單細胞因子產(chǎn)生細胞的比率表示)。另外，來源于VSV-hDCT加強免疫的小鼠的各T細胞產(chǎn)生更多的干擾素-Y (圖 15b)。在第0天，C57BL/6小鼠(η = 5/組)接受lxl08pfu Ad-hDCT的肌內(nèi)注射，接著在第232天接受IxlO7Pfu VSV-hDCT或ddVV-hDCT的靜脈內(nèi)注射。在用肽重新刺激后，通過干擾素-Y胞內(nèi)染色的流式細胞分析，測定了對黑素瘤相關(guān)抗原多巴色素互變異構(gòu)酶的免疫顯性(SVY)(圖16a、c)和第二最顯性(VIT)(圖16b、d)表位的血液衍生的T細胞應(yīng)答。對在每個細胞基礎(chǔ)上產(chǎn)生的干擾素(IFN) Y的量(圖16a、b)和同時分泌腫瘤壞死因子(TNF) α的產(chǎn)IFN-Y細胞的比例(圖16c、d)進行了評價。在第0 天，C57BL/6(圖 17a、b)或 BALB/c (圖 17c)小鼠(η = 5/組)接受 lxl08pfu Ad-hDCT的肌內(nèi)注射，接著17天(圖17a)或35天(圖17b、c)后接受lxl09pfu VSV-SIIN(圖 14a)或 VSV-hDCT (圖 17b、c)或 VSV-鼠 DCT (VSV-mDCT)(圖 17b)的靜脈內(nèi)注射。VSV 后 5 天，在用肽重新刺激后，通過干擾素-Y胞內(nèi)染色的流式細胞分析，測定了對SIINFEKL(圖 17a)或黑素瘤相關(guān)抗原多巴色素互變異構(gòu)酶(圖17b、c)的血液衍生的T細胞應(yīng)答。在第0天，C57BL/6小鼠(η = 5/組)接受lxl08pfu Ad-SIIN的肌內(nèi)注射，接著在第17天接受IxlO9Pfu VSV-SIIN的靜脈內(nèi)注射。Ad后10天(1°應(yīng)答)和VSV后5天 (2°應(yīng)答)，通過四聚體染色法，測定了對SIINFEKL的血液衍生的T細胞應(yīng)答。結(jié)果表示這些應(yīng)答的頻率(圖18a)、數(shù)目(圖18b)和倍數(shù)增加。在第0天，C57BL/6小鼠(η = 5/組)接受lxl08pfu Ad-SIIN的肌內(nèi)注射，接著在第14天接受IxlO9Pfu VSV-SIIN的靜脈內(nèi)注射。在第10、19、51和233天，通過四聚體染色法，測定了對SIINFEKL的血液衍生的T細胞應(yīng)答。應(yīng)答的壽命見(圖19a)。在第51天，對效應(yīng)記憶(定義為 CD127+CD62L-)(圖 19b)和中樞記憶(CD127+CD62L+)(圖 19c) SIINFEKL 特異性細胞的比例進行了評價。在第0天，C57BL/6小鼠(η = 5/組)接受lxl08pfu Ad-SIIN的肌內(nèi)注射，接著在第14天接受IxlO9Pfu wtVSV-hDCT或deltaM51 VSV-hDCT的靜脈內(nèi)注射。VSV后5天，在用肽重新刺激后，通過干擾素-Y胞內(nèi)染色的流式細胞分析，測定了血液衍生T應(yīng)答(圖20)。C57/B6小鼠用Ad-hDCT初次免疫，然后14天后，用VSV-hDCT或Maraba_hDCT的靜脈內(nèi)劑量加強免疫。對外周血中的CD8+T細胞應(yīng)答進行了免疫分析。在相等劑量下，由 Maraba疫苗接種誘導(dǎo)的應(yīng)答是相對于轉(zhuǎn)基因的VSV誘導(dǎo)應(yīng)答的3_8倍(圖21)。在又一個實驗中，C57/B6小鼠用Maraba-hDCT(2x109PFU靜脈內(nèi))初次免疫或用Ad-hDCT(IxlO8PFU IM)初次免疫，并用Maraba-hDCT(2xl09PFU靜脈內(nèi))加強免疫。5天后，測定了血液和脾中的免疫應(yīng)答(每種治療三個條，左邊的條為IFN γ+，中為TNF α+，右邊的條為每種情況的雙陽性)，見圖22Α。Ad初次免疫后9或12天(在Ad誘導(dǎo)的效應(yīng)期高峰)，靜脈內(nèi)給予的 Maraba-hDCT仍可加強免疫應(yīng)答(圖22B)。在BalB-C小鼠(、鼠如A所述治療，條對于各種治療從左到右表示IFN γ +、TNF α +和雙+)中，靜脈內(nèi)給予的Maraba_hDCT和VSV_hDCT兩者顯著加強免疫應(yīng)答，見圖22C。C57/B6小鼠用不同劑量的表達SIINFEKL-螢光素酶的VSV和牛痘初免，以引發(fā)對于該OVA表位的應(yīng)答(圖23A)，隨后用靜脈內(nèi)給予的VSV-hDCT加強免疫。測定了 SIINFEKL 特異性T細胞應(yīng)答，圖23中顯示，該T細胞應(yīng)答被隨后的VSV加強免疫顯著加強。給予C57/B6小鼠一次靜脈內(nèi)劑量的2xl09PFU VSV-GFP, 24小時后，收集脾用于流式細胞分析。61. 3%的大量脾細胞為表示B細胞的B220+⑶19+。50. 8%的GFP陽性細胞為 B220+⑶19+，并在B細胞部分中測出用Ad-hDCT給野生型C57-B6和B細胞-/-小鼠疫苗接種以引發(fā)抗DCT免疫應(yīng)答， 其通過血液中的DCT特異性⑶8+ T細胞測定(圖24A)。在靜脈內(nèi)給予VSV-hDCT后測定了二次應(yīng)答。通過胞內(nèi)染色法測定的IFN γ+⑶8+ T細胞的數(shù)目表示為+/-SEM。(圖24B)表示加強免疫對B細胞的依賴。野生型小鼠和/或免疫血清的B細胞過繼地轉(zhuǎn)移到B細胞缺陷型小鼠中。測定下列中的B細胞，用外周血淋巴細胞的百分比表示1)野生型對照，2)B-/_加VSV，3)B-/_加 VSV加血清，4) B-/-加B細胞VSVJP 5) B-/-加B細胞加血清加VSV，見圖25A。在VSV加強免疫后，測定了重建的B細胞-缺陷型小鼠中的抗DCT T細胞應(yīng)答。IFN γ+⑶8+ T細胞數(shù)表示為+/-SEM。顯示B細胞中應(yīng)答提高的柱l)B-/_加VSV，2) B-/-加VSV加血清，3) B-/"加B細胞VSV,和4) B-/"加B細胞加血清加VSV (圖25B)。給C57/B6小鼠靜脈內(nèi)注射VSV-SIIN(2xl09pfu)，24小時后，收獲脾，從全部脾細胞中純化出CD19陽性細胞。使CD19+細胞與DKL細胞系共培養(yǎng)。T細胞的活化在SIIN肽(陽性對照)和陰性對照存在下，與得自VSV-SIIN免疫接種小鼠的⑶19+細胞、得自VSV-SIIN 免疫接種小鼠的CD19-細胞、與DKL共培養(yǎng)的得自VSV-SIIN免疫接種小鼠的CD19+細胞共培養(yǎng)來進行。結(jié)果表明，病毒感染的B細胞可刺激T細胞產(chǎn)生IFN- γ。將脾B細胞從C57/B6小鼠中分離，并在muIL2中培養(yǎng)4天，然后荷載 VSV-SIINFEKL/螢光素酶或Ad-SIINFEKL/螢光素酶(2小時感染、洗滌和收集)。將這些荷載的B細胞靜脈內(nèi)給予幼稚或初免受體。5天后測定了 T細胞應(yīng)答。用牛痘-SIINFEKL/螢光素酶初免的小鼠的T細胞顯示對SIINFEKL肽的應(yīng)答。用荷載VSV-SIINFEKL/螢光素酶的B細胞初免的小鼠的T細胞顯示對SIINFEKL肽的應(yīng)答。用荷載vAd-SIINFEKL/螢光素酶的B細胞初免的小鼠的T細胞顯示對SIINFEKL肽的最小應(yīng)答。用牛痘-SIINFEKL/螢光素酶初免，然后用荷載VSV-SIINFEKL/螢光素酶的B細胞加強免疫的小鼠的T細胞顯示對 SIINFEKL肽的應(yīng)答。用牛痘-SIINFEKL/螢光素酶初免，然后用荷載Ad-SIINFEKL/螢光素酶的B細胞加強免疫的小鼠的T細胞顯示對SIINFEKL肽的應(yīng)答(每種情況下，TNFa為Y 軸，IFNy為X軸)。討論用腺病毒通過肌內(nèi)注射14天給小鼠免疫接種。將單劑量的重組VSV通過肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑遞送至小鼠作為初免加強免疫疫苗接種方案的加強免疫部分。7天后測定了抗原特異性T細胞應(yīng)答，注意到當(dāng)VSV經(jīng)靜脈內(nèi)遞送時，有顯著較大的T 細胞應(yīng)答(參見圖11)。在這個初免加強免疫疫苗接種模型中，測定了由VSV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答加強的時機。在初次免疫應(yīng)答高峰時(第14天)或在高峰前的第8天(在效應(yīng)期)靜脈內(nèi)給予加強免疫。7天后測定的T細胞應(yīng)答顯示，VSV加強免疫能夠在初次免疫應(yīng)答高峰時和之前加強免疫應(yīng)答。在無腫瘤小鼠和荷瘤小鼠及由此的免疫抑制環(huán)境中證實了這一點(參見圖 12)。值得注意的是，在效應(yīng)期內(nèi)加強免疫是有效的。效應(yīng)T細胞一般在這類加強免疫載體起作用前減少。VSV的免疫加強能力與對照牛痘病毒的相當(dāng)。初次免疫后232天進行了加強免疫 (這種長間隔期允許VSV低至1/100的劑量便達到上述T細胞加強免疫的同一水平)，并測試了對2種不同的 抗原特異性肽的T細胞應(yīng)答。通過血液衍生的T細胞應(yīng)答測定，發(fā)現(xiàn)對于所測試的2種抗原肽，VSV的加強免疫的能力明顯大于牛痘病毒的加強免疫能力(參見圖 13)。測定了 VSV的突變體形式加強免疫應(yīng)答的能力，所述突變體形式可在最初被感染的細胞內(nèi)復(fù)制其基因組和表達基因，但無法產(chǎn)生感染性子代。用于初免加強免疫方案的抗原的3個優(yōu)勢表位的血液衍生的T細胞應(yīng)答表明，突變型VSV與野生型形式一樣有效地加強免疫應(yīng)答(參見圖14)。這就表明不能傳播的病毒的更安全形式可用來加強免疫應(yīng)答。對于VSV加強免疫，通過對多種細胞因子的產(chǎn)生以及每個細胞產(chǎn)生的細胞因子的量的測定，對用VSV加強免疫誘導(dǎo)的T細胞的質(zhì)量進行了評價。將該質(zhì)量與僅初次疫苗接種或VSV對照載體(無插入的Ag轉(zhuǎn)基因)加強免疫誘導(dǎo)的T細胞的質(zhì)量進行了比較。由抗原特異性VSV加強免疫產(chǎn)生的T細胞產(chǎn)生多種細胞因子和較大量的干擾素-Y (參見圖 15)。還將含抗原的VSV加強免疫誘導(dǎo)的T細胞的質(zhì)量與牛痘病毒加強免疫的質(zhì)量進行了比較。VSV加強免疫群的T細胞也產(chǎn)生較大量的干擾素Y，并也分泌較大量的腫瘤壞死因子α (參見圖16)。用初免加強免疫VSV方案測試了兩種不同的小鼠品系，按兩種不同的抗原的方式。在所有情況下，在給予VSV后觀察到大規(guī)模免疫加強(參見圖17)。測定了在VSV介導(dǎo)的免疫加強中對CD4+輔助T細胞的需要。在有和沒有CD4細胞耗竭兩種情況下，對加強免疫后的T細胞應(yīng)答進行了分析。正如通過CD8+ T細胞的百分比、數(shù)目和倍數(shù)增加測定的一樣，耗竭對初次免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響，但對二次應(yīng)答無影響(參見圖18)。因此，VSV初免加強免疫方法為治療無免疫應(yīng)答的患者(例如患有AIDS/HIV感染的患者)提供了希望。在加強免疫后10、19、51和233天測定了加強的免疫應(yīng)答的耐久性。在這些時間點測定的T細胞應(yīng)答表明，免疫應(yīng)答長期保持。對第51天的效應(yīng)記憶和中樞記憶細胞的比例的評價表明，與僅初免的應(yīng)答相比，有較高比例的效應(yīng)細胞轉(zhuǎn)換成記憶表型(參見圖19)。 一旦抗原被清除，則不再需要效應(yīng)細胞。在這點上，較大量的記憶細胞，尤其中樞記憶細胞， 在再次遇到該抗原時，可確保更好的重新擴繁?？梢允褂脭y帶在基質(zhì)蛋白中賦予其不能阻斷干擾素產(chǎn)生的deltaM51突變的VSV 載體(因此稱為干擾素誘導(dǎo)性突變體)來產(chǎn)生類似的加強免疫效果。小鼠用Ad-hDCT初免， 其隨后用野生型 VSV-hDCT(wtVSV-hDCT)或 deltaM51 VSV-hDCT (dM51VSV_hDCT)加強免疫， 并且測定血液中的DCT特異性T細胞(參見圖20)。deltaM51VSV載體通過體內(nèi)引入干擾素而減毒，因此既是更安全的載體，又具有相關(guān)溶瘤性質(zhì)。這就表明在靜脈內(nèi)遞送后，可采用各種方法使VSV減毒，同時保持加強免疫應(yīng)答的能力。
載有VSV的疫苗在靜脈內(nèi)給予時是特別有效的免疫加強劑。該方法獨特顯著的特征包括應(yīng)答幅度、記憶耐久性、優(yōu)選的遞送途徑、CD4T細胞獨立性、早期加強免疫應(yīng)答的能力(在效應(yīng)期內(nèi))、誘導(dǎo)T細胞的一流質(zhì)量的能力、加強對亞優(yōu)勢表位的應(yīng)答和更安全的減毒載體的順應(yīng)性?？蓪⑦@個策略應(yīng)用于所需要的任何抗原中，包括例如來源于病原體的外源抗原以及自身抗原、靶向腫瘤的癌胚抗原和新抗原。對于預(yù)防性和治療性疫苗接種兩者， 加強免疫可與任何初免策略聯(lián)用以加強T細胞和抗體應(yīng)答。 同樣，可使用水泡性病毒或棒狀病毒科的其它成員替換VSV作為加強免疫載體。這些加強免疫病毒的各種非復(fù)制或突變體形式亦可用作加強免疫載體。靜脈內(nèi)給予的VSV感染脾的B細胞。靜脈內(nèi)給予的VSV載體的加強免疫能力依賴于B細胞。靜脈內(nèi)給予的VSV感染脾中的B細胞。當(dāng)在給予VSV后分離這些細胞時，它們表現(xiàn)為離體將轉(zhuǎn)基因抗原呈遞給特異性T細胞。荷載有VSV疫苗的B細胞離體是給幼稚和致敏動物疫苗接種的良好的疫苗接種平臺。還可使用具有B細胞向性的其它病毒達到這些效果。本文提及的參考文獻的相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動物的癌癥的方法，所述方法包括給予哺乳動物溶瘤載體，其中所述載體表達哺乳動物對之具有預(yù)存免疫力的腫瘤抗原。
2.權(quán)利要求1限定的方法，其中所述載體經(jīng)修飾以表達所述腫瘤抗原。
3.權(quán)利要求1限定的方法，其中所述腫瘤抗原是腫瘤相關(guān)抗原。
4.權(quán)利要求1限定的方法，其中所述腫瘤抗原選自癌胚抗原、表面糖蛋白、細胞表面標(biāo)記、黑素瘤相關(guān)抗原、癌-睪丸抗原、癌基因和病毒癌基因。
5.權(quán)利要求4限定的方法，其中所述腫瘤抗原選自多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)、GP100、 MARTI、甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)。
6.權(quán)利要求1限定的方法，其中所述溶瘤載體是病毒。
7.權(quán)利要求6限定的方法，其中所述病毒選自棒狀病毒、麻疹病毒、牛痘病毒、皰疹病毒、粘液瘤病毒、細小病毒、新城疫病毒、腺病毒和semliki病毒。
8.權(quán)利要求7限定的方法，其中所述棒狀病毒選自水泡性病毒、短暫熱病毒屬、質(zhì)型彈狀病毒屬、核型彈狀病毒屬和狂犬病病毒屬。
9.權(quán)利要求8限定的方法，其中所述水泡性病毒選自水泡性口炎病毒(VSV)和Maraba 病毒。
10.權(quán)利要求1限定的方法，其中所述癌癥是黑素瘤。
11.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括在給予所述溶瘤載體前用腫瘤抗原給哺乳動物接種疫苗以對該抗原產(chǎn)生預(yù)存免疫力的步驟。
12.權(quán)利要求11限定的方法，其中以足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量給予所述抗原。
13.權(quán)利要求11限定的方法，其中在給予所述溶瘤載體前，有至少約4天的產(chǎn)生免疫應(yīng)答的間隔期。
14.一種在對抗原具有預(yù)存免疫力的哺乳動物中加強免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括靜脈內(nèi)給予哺乳動物表達所述抗原的載體，其中所述載體能夠感染B細胞。
15.權(quán)利要求14限定的方法，其中所述預(yù)存免疫力是天然免疫力。
16.權(quán)利要求14限定的方法，其中所述預(yù)存免疫力是既往疫苗接種的結(jié)果。
17.權(quán)利要求14限定的方法，其中所述載體是選自以下的棒狀病毒水泡性病毒、短暫熱病毒屬、質(zhì)型彈狀病毒屬、核型彈狀病毒屬和狂犬病病毒屬。
18.權(quán)利要求17限定的方法，其中所述水泡性病毒選自水泡性口炎病毒和Maraki病
19.權(quán)利要求14限定的方法，其中所述抗原選自腫瘤抗原、病毒抗原和細菌抗原。
20.權(quán)利要求19限定的方法，其中所述病毒抗原來源于致病生物。
21.權(quán)利要求20限定的方法，其中所述致病生物選自HIV、HepC,FIV、LCMV、依波拉病毒和結(jié)核分枝桿菌。
22.權(quán)利要求16限定的方法，其中所述腫瘤抗原選自多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)、 GP100、MART1、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、PLACl、MAGE 成員和 NY-ES01。
23.權(quán)利要求16限定的方法，其包括在靜脈內(nèi)給予所述載體前用抗原給哺乳動物接種疫苗以對該抗原產(chǎn)生預(yù)存免疫力的步驟。
24.權(quán)利要求14限定的方法，其中在預(yù)存免疫力的高峰免疫應(yīng)答時或之前給予所述載體。
25.—種在對抗原具有預(yù)存免疫力的哺乳動物中加強免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括靜脈內(nèi)給予哺乳動物荷載抗原的B細胞。
26.一種用于治療癌癥的藥盒，所述藥盒包括適于誘導(dǎo)哺乳動物的免疫應(yīng)答的量的腫瘤抗原或表達腫瘤抗原的載體以及適于提高免疫應(yīng)答的量的表達所述腫瘤抗原的溶瘤載體。
27.一種用于在哺乳動物中加強免疫應(yīng)答的藥盒，所述藥盒包括呈合適給藥形式的抗原或表達所述抗原的載體，以及呈適于靜脈內(nèi)給藥形式的表達所述抗原的載體。
28.—種在CD4+ T細胞缺陷型哺乳動物中加強免疫力的方法，所述方法包括靜脈內(nèi)給予棒狀病毒疫苗載體。
全文摘要
一方面，本文提供治療哺乳動物的癌癥的方法。所述方法包括給予哺乳動物溶瘤載體，所述溶瘤載體表達哺乳動物對之具有預(yù)存免疫力的腫瘤抗原。另一方面，本文提供加強哺乳動物的免疫應(yīng)答的方法，所述哺乳動物對抗原具有預(yù)存免疫力，所述方法包括靜脈內(nèi)給予哺乳動物表達抗原的感染B細胞的載體。
文檔編號A61K39/00GK102448487SQ201080022270
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者B·利奇蒂, B·布里德爾, J·布拉姆森, 萬永紅 申請人:麥克馬斯特大學(xué)