專利名稱：用于治療疾病的三環(huán)dna反義寡核苷酸、組合物和方法
用于治療疾病的三環(huán)DNA反義寡核苷酸、組合物和方法發(fā)明背景技術(shù)領(lǐng)域 總的來說，本公開涉及合成的反義寡核苷酸(AON)，以及使用反義寡核苷酸改變在pre-mRNA加工期間發(fā)生的剪接事件、或下調(diào)含有重復(fù)序列例如3 ’或5 ’ CUG、CAG和/或CCUG的突變mRNA的表達(dá)的方法。更具體來說，本文公開了三環(huán)DNA(tc-DNA)A0N，其能夠有效促進(jìn)pre-mRNA加工期間的外顯子跳躍、掩蔽pre-mRNA中的內(nèi)含子沉默序列和/或莖-環(huán)序列、以及引導(dǎo)RNase介導(dǎo)的mRNA破壞。本文描述了這樣的tc_DNA A0N，通過跳過肌養(yǎng)蛋白基因內(nèi)突變的外顯子、例如突變的外顯子23或外顯子51以恢復(fù)肌養(yǎng)蛋白的功能性，可用于杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne Muscular Dystrophy)的治療方法中。還描述了這樣的tc-DNAAON,其通過掩蔽SMN2基因內(nèi)的內(nèi)含子沉默序列和/或末端莖-環(huán)序列，以產(chǎn)生能夠至少部分補(bǔ)償無功能SMNl蛋白、包含由外顯子7編碼的氨基酸序列的修飾的功能性SMN2蛋白，從而可用于脊髓性肌萎縮的治療方法中。此外本文還描述了這樣的tc-DNA A0N，其通過引導(dǎo)對包含3’ -末端CUG重復(fù)序列的突變DMl mRNA的破壞，可用于Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的治療方法中。因此，tc-DNA AON以及一種或多種上述方法可用于恢復(fù)與肌病相關(guān)的蛋白的功能性?，F(xiàn)有技術(shù)描述杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)是最常見的遺傳性肌病，3，500名男性中約有I人患有此病，與種族無關(guān)。盡管不太常見，在顯性攜帶者中，女孩和婦女也可表現(xiàn)出類似杜氏肌營養(yǎng)不良的癥狀。DMD的最主要后果是肌纖維變得特別脆，并且自然的肌肉活動就會激起肌肉組織的普遍損傷。在DMD以及許多肌營養(yǎng)不良中觀察到的終點，是緩慢退化導(dǎo)致幾乎完全纖維變性并伴有脂肪浸潤。由于脊柱變形和呼吸困難，在I960年代時的預(yù)期壽命約為15歲。在不存在心臟并發(fā)癥的情況下，現(xiàn)代在管理方法上的改進(jìn)(即關(guān)節(jié)固定術(shù)和氣管切開術(shù)通氣)已經(jīng)將預(yù)期壽命提高至30歲。DMD的臨床癥狀在18個月至三歲時變得明顯，包括行走和爬行能力滯后、難以從地板上起立和小腿肚異常增大。在約5至6歲時，在足、膝和髖關(guān)節(jié)中發(fā)生肌肉收縮。疾病發(fā)展的特征是持續(xù)性肌肉消耗，導(dǎo)致在約9至12歲時喪失行走能力。此外，一些杜氏肌營養(yǎng)不良男孩表現(xiàn)出智力遲鈍，表明缺失的蛋白也與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。杜氏肌營養(yǎng)不良是X染色體連鎖的隱性病。1986年，通過定位克隆方法鑒定到DMD基因座位于X染色體上(Xp21. 2-0MIMid :310200)，在編碼被稱為肌養(yǎng)蛋白的蛋白的基因中。肌養(yǎng)蛋白基因中的突變導(dǎo)致在橫紋肌中不能產(chǎn)生肌養(yǎng)蛋白?；疾∧泻⒌哪赣H有三分之二的幾率攜帶肌養(yǎng)蛋白突變，而接近三分之一的雙親具有新生突變。一半以上的DMD男孩表現(xiàn)出涵蓋一至幾個外顯子的大基因組缺失；他們中極少數(shù)具有大的序列重復(fù)。其他人具有難以鑒定的點突變或非常小的缺失或重復(fù)。然而，突變的程度與表型的嚴(yán)重性不直接相關(guān)。產(chǎn)生提前終止密碼子的框外缺失或無義突變以及隨后翻譯的失敗，導(dǎo)致以嚴(yán)重表型為特征的肌養(yǎng)蛋白缺乏?？騼?nèi)缺失造成較輕的肌病，被稱為貝克肌營養(yǎng)不良(Becker muscular dystrophy, BMD)。
DMD基因座具有接近250萬個堿基對，是曾經(jīng)檢測到的最長的基因，但是只有約14，000個堿基對含有編碼序列，其分布在79個外顯子中。全長肌養(yǎng)蛋白(DP 427)是在所有肌肉中表達(dá)的427kDa的細(xì)胞骨架蛋白，但通過分別位于內(nèi)含子29、43、55和62中的四個內(nèi)部啟動子的組織特異性的差異使用(在視網(wǎng)膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和非肌肉組織中)，產(chǎn)生了各種蛋白質(zhì)同工型(DP 260、DP 140、DP 116、DP 71)。全長肌養(yǎng)蛋白是肌纖維膜糖蛋白復(fù)合物(SGC)的必要組分，所述復(fù)合物通過將肌纖維細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)相連而參與維持肌纖維膜的完整性。序列分析預(yù)測肌養(yǎng)蛋白需要幾個結(jié)構(gòu)域和重復(fù)序列。大體上說，在N-端存在肌動蛋白雜交位點(N-ABD);含有可以賦予柔性的4個鉸鏈區(qū)段(H)的中央桿結(jié)構(gòu)域(RD ;具有24個血影蛋白樣重復(fù)序列)；以及靠近C-端(CT)的富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)，其與DPC的其他成員結(jié)合。結(jié)構(gòu)/功能分析已經(jīng)鑒定了對于蛋白質(zhì)功能關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域。其以在某些患有輕度疾病的患者中發(fā)生的內(nèi)部缺失為例證，在這些患者中所述缺失涵蓋了外顯子17至48 (編碼序列的 46%)。England 等，Nature343 (6254) : 180-2 (1990)。這產(chǎn)生了在過去 10 年中廣泛用于基因轉(zhuǎn)移實驗中的功能性“微小肌養(yǎng)蛋白”的概念?，F(xiàn)在確定，移除N-ABD和CT結(jié)構(gòu)域引起功能的中度喪失，而CRD是必需的。RD的改變根據(jù)截短的程度和性質(zhì)引起多種多樣的表型。例如，RD缺失的肌養(yǎng)蛋白(AR1-R24)是無功能的，然而(AH2-R19)截短的肌養(yǎng)蛋白，其保留了 24個血影蛋白樣重復(fù)序列中的8個完整重復(fù)序列，產(chǎn)生具有完全活性的蛋白。 對于杜氏肌營養(yǎng)不良,存在兩種充分表征的遺傳動物模型。Mdx小鼠在肌養(yǎng)蛋白基因的外顯子23中帶有無義突變，其阻止了全長的野生型肌養(yǎng)蛋白的合成。Mdx小鼠顯示出對抗退化的代償性機(jī)制，其可以維持再生過程以恢復(fù)機(jī)械損傷。Mdx小鼠不表現(xiàn)出DMD的癥狀，其生命跨度幾乎是正常的。GRMD(金毛獵犬肌營養(yǎng)不良)狗由于內(nèi)含子6中的剪接位點突變破壞了閱讀框而缺乏功能性肌養(yǎng)蛋白。在GRMD中，與人類DMD相同，纖維的進(jìn)行性退化不可避免地導(dǎo)致骨骼肌肉系統(tǒng)消耗，并伴有顯著的肌內(nèi)膜和肌束膜纖維變性。由于其類似DMD的表型，GRMD —直是可獲得的用于評估DMD潛在療法的最佳模型。盡管已經(jīng)鑒定和表征了肌養(yǎng)蛋白基因中與DMD發(fā)作相關(guān)的突變并已有適合的動物模型系統(tǒng)來測試有希望的治療藥劑，但在本技術(shù)領(lǐng)域中對于治療這種疾病的組合物和方法，仍存在著需求。在過去10年中進(jìn)行的幾項研究支持了類固醇療法(強(qiáng)的松和地夫可特)在杜氏肌營養(yǎng)不良男孩中的益處，盡管廣泛的統(tǒng)計評估還沒有完全完成。利用慶大霉素藥物治療進(jìn)行提前終止密碼子突變的藥物誘導(dǎo)的通讀，在高達(dá)5%的DMD患者中可能也是有效的。盡管在mdx小鼠模型中進(jìn)行的臨床前研究的結(jié)果是有爭論的，但目前正在美國和意大利進(jìn)行臨床試驗。由PTC Therapeutics開發(fā)的新藥(PTC124)似乎非常有希望。使用藥物
上調(diào)utrophin基因的研究也在進(jìn)行之中，所述基因的產(chǎn)物-肌養(yǎng)蛋白樣蛋白utrophin,
能夠補(bǔ)償失去的肌養(yǎng)蛋白的功能。還存在許多其他研究途徑；例如，最近顯示，通過使用阻斷性抗體而拮抗肌生成抑制素，能夠在mdx小鼠中提高肌肉強(qiáng)度。這種方法最初是基于將正常成肌細(xì)胞多次注入患病肌肉中。Partridge 等，Nature337 (6203) : 176-9 (1989)。隨后的臨床試驗(1991-98)失敗，盡管改進(jìn)的細(xì)胞制造和遞送程序使得在加拿大進(jìn)行新的I期試驗(2002)成為可能。最近的發(fā)展還提供了證據(jù)，表明來自骨髓或血管來源的干細(xì)胞能夠通過全身途徑靶向骨骼肌，盡管遺傳校正的程度仍然不足。用于DMD的基因治療依賴于使用基因載體作為介質(zhì)，將肌養(yǎng)蛋白微小基因原位遞送到骨骼纖維中。使用質(zhì)粒載體中的裸露全長cDNA的第一個探索性研究在法國進(jìn)行(2000-03)。在已試驗過的用于肌肉基因治療的不同載體類型中，腺相關(guān)病毒(AAV)衍生的載體似乎最有希望。AAV載體具有大量優(yōu)點(i)它們能夠感染種類廣泛的細(xì)胞類型，包括肌纖維；(ii)因為它們?nèi)鄙偎胁《净?，并且野生型病毒還沒有與人類中的任何疾病相關(guān)聯(lián)，因此它們顯得安全；(iii)與整合到宿主細(xì)胞的基因組中的野生型AAV相反，復(fù)制缺陷型AAV載體一般保持為游離體，從而限制了插入誘變或激活癌基因的風(fēng)險；并且(iv)與其他載體系統(tǒng)相反，AAV載體不引發(fā)顯著的免疫應(yīng)答，因此允許長期表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因(只要它們的基因產(chǎn)物不被排斥)。AAV載體也能夠以高滴度生產(chǎn)，并且強(qiáng)制性動脈內(nèi)注射使它 們能夠通過單次注射實現(xiàn)向重要肌肉區(qū)域的基因轉(zhuǎn)移，至少在嚙齒動物中如此。盡管AAV載體缺少所有病毒基因，但它們的裝載量限于4. 5kb。因此，選擇AAV導(dǎo)致開發(fā)了約4kb的
肌養(yǎng)蛋白變體來代替全長肌養(yǎng)蛋白(14kb)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因轉(zhuǎn)移，這些變體中的幾種已經(jīng)在mdx模型中得到了有利的檢驗。已報道，在許多DMD患者以及在mdx小鼠和GRMD狗中，肌養(yǎng)蛋白陽性纖維很少。盡管回復(fù)體纖維的比例隨時間增加，但不幸的是它們的數(shù)量太低，不能產(chǎn)生顯著的臨床益處。引發(fā)這些回復(fù)體纖維的機(jī)制尚不清楚，盡管有研究表明閱讀框可能通過外顯子跳躍得以恢復(fù)。這種自然現(xiàn)象喚起了設(shè)計基因修復(fù)/調(diào)節(jié)策略的研究，其基于使用2’ -0-甲基反義寡核糖核苷酸以及嗎啉干擾剪接，從而誘導(dǎo)外顯子跳躍。事實上，這種方法已在體外成功用于mdx,GRMD和DMD肌肉細(xì)胞中，并在體內(nèi)成功使用(對2’_0_甲基的I期臨床試驗在荷蘭獲得成功，使用嗎啉的I期正在英國進(jìn)行)。然而，這種方法的弱點在于它需要定期給藥合成的A0，并且還沒有完全實現(xiàn)全身遞送。備選的方法是從載體原位合成作為反義RNA分子的目標(biāo)序列。即使如此，在體內(nèi)生產(chǎn)“治療性”反義RNA分子仍提出許多問題，例如穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位。已知參與剪接反應(yīng)的小核RNA(snRNA)可用作載體以克服這些限制。最近的報道顯示，U7snRNA攜帶針對肌養(yǎng)蛋白基因的外顯子23或外顯子51的剪接接點處的反義序列，在體外以及在體內(nèi)分別在mdx和A48-50DMD細(xì)胞中誘導(dǎo)了肌養(yǎng)蛋白合成。已經(jīng)對具有框外缺失的所有DMD患者進(jìn)行了計算機(jī)搜索，所述患者理論上將從與缺失相鄰(任一側(cè))的單個外顯子的跳躍中獲益。有趣的是，據(jù)預(yù)測，跳過外顯子51將在22%的病例中恢復(fù)微小肌養(yǎng)蛋白(即A 45-50、A 47-50、A 48-50、A 49-50、A 50和A 52) 預(yù)期得到的截短蛋白至少有部分功能，因為它們所對應(yīng)的缺失已在一些BMD患者中發(fā)現(xiàn)。此外，鑒定到一些帶有A51-52和A48-51框內(nèi)缺失的健康男性。在所選患者中，跳過外顯子51將導(dǎo)致產(chǎn)生有功能的較短肌養(yǎng)蛋白，從而改善表型。智力遲鈍是經(jīng)常與DMD相伴的癥狀，可能是由于神經(jīng)元細(xì)胞中缺少肌養(yǎng)蛋白。因此，在腦中挽救半功能性肌養(yǎng)蛋白能夠矯正或改善認(rèn)知損害。脊髓性肌萎縮(SMA)總的來說是指各種源自于運動神經(jīng)元生存(SMN)基因中的常見遺傳缺陷的病患，所述基因在1990年被作圖于染色體5qll. 2-13. 3。人類5號染色體含有大量重復(fù)，因此存在兩個SMN基因拷貝SMNl和SMN2。SMA是遺傳決定的新生兒死亡的最常見原因。SMN相關(guān)SMA的所有形式的合并發(fā)病率約為每6000人中I人?；蝾l率約為I : 80，幾乎40人中有I人是攜帶者。作為攜帶者沒有已知的健康后果。人們可能知道的考慮這種可能性的唯一方式是是否有親屬患病。SMA的特征是脊髓和腦干運動神經(jīng)元的喪失。一般來說，癥狀出現(xiàn)越早，預(yù)期壽命越短。一旦癥狀出現(xiàn)后，運動神經(jīng)元細(xì)胞快速退化。所有形式的SMA具有由去神經(jīng)支配所引起的共同的虛弱癥、即肌肉萎縮，因為肌肉由于支配性神經(jīng)的喪失而失去收縮信號。脊髓性肌萎縮只影響運動神經(jīng)。引起由運動神經(jīng)元去神經(jīng)支配造成的虛弱癥和由感覺神經(jīng)元去神經(jīng)支配造成的感覺損害這兩種可遺傳的病癥，總稱為Charcot-Marie-Tooth或遺傳性運動感覺神經(jīng)病來稱呼。
SMA的過程與虛弱的嚴(yán)重性直接相關(guān)?；加兄匦蚐MA的嬰兒常常由于支持呼吸的肌肉的虛弱而死于呼吸疾病?；加休^輕型SMA的兒童自然活得長得多，盡管他們可能需要大量醫(yī)療支持，特別是處于該病譜的更嚴(yán)重一端的兒童。I型SMA、也稱為嚴(yán)重嬰兒期SMA或Werdnig Hoffmann病，是最嚴(yán)重的，并在生命的第一年中就顯現(xiàn)。這種類型一般在出生后很快并且出人意料地發(fā)作；被診斷患有I型SM的嬰兒一般不會活過一歲。由于運動神經(jīng)元生存的退化，肺炎被認(rèn)為是最終死因；運動神經(jīng)元死亡引起主要身體器官系統(tǒng)、特別是呼吸系統(tǒng)(例如肺內(nèi)合并分泌物的呼出和除去)功能不足。II型SMA或中間型SMA，描述那些永遠(yuǎn)不能站立和行走、但是至少在他們生命中的某些時間能夠維持坐姿的兒童。虛弱的發(fā)生通常在6至18個月之間的某個時間被意識到。在個體的整個生命期間，虛弱緩慢逐漸地增加。III型SMA患者有時能夠行走。SMA典型使用運動神經(jīng)元生存(SMN)基因測試來診斷，這種測試確定是否存在至少一個有功能的SMNl基因的拷貝，所述基因通過在完全加工過的mRNA中外顯子7和8的存在，與高度相似的SMN2基因區(qū)分開。SMN2基因也含有使其在制造蛋白時效率變降低的突變，但是這種效率變降低的水平低下。SMA由SMNl基因從兩條染色體中缺失并且SMN2蛋白不能補(bǔ)償功能性SMNl蛋白的缺失所引起。目前開發(fā)SMA療法的策略包括鑒定增加SMN2水平、增強(qiáng)殘留SMN2功能或以其它方式補(bǔ)償SMNl活性喪失的藥物。藥物例如丁酸鹽、丙戊酸、羥基脲和利魯唑(Rilutek ，Sanofi Aventis)正在或已經(jīng)進(jìn)行治療SMA的臨床調(diào)查。盡管基因替代策略正在動物中進(jìn)行試驗，但目前對SMA的治療由防止和管理慢性運動單元喪失的繼發(fā)作用構(gòu)成。目前沒有已知能夠改變SMA病程的藥物，可能對SMA的基因替代在能夠應(yīng)用于人類之前還需要許多年的研究。肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良(DM)是一種慢性、漸進(jìn)性、高度可變的遺傳性多系統(tǒng)疾病，其可以在從出生到老年的任何年齡時顯現(xiàn)。肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良是最常見形式的成年發(fā)作性肌營養(yǎng)不良，是僅次于杜氏肌營養(yǎng)不良的第二常見的骨骼肌疾病形式。DM的特征是肌肉消耗(肌營養(yǎng)不良)、后囊下虹彩白內(nèi)障(眼晶狀體混濁)、心臟傳導(dǎo)缺陷、內(nèi)分泌改變和肌強(qiáng)直(肌肉難以松弛)。目前存在兩種已知類型的成年發(fā)作性DM，二者都可通過DNA分析鑒定1型肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良(DMl)通常被稱為Steinert病，其具有可能嚴(yán)重影響嬰兒的先天性形式和兒童期發(fā)作形式。2型肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良(DM2)被稱為PROMM或近端肌強(qiáng)直性肌病。還懷疑其他的肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良(例如DM3、DM4、DMX)，但是它們的存在仍未被證明。雖然DMl和DM2都被認(rèn)為是緩慢退化性病癥，但認(rèn)為DM2 —般比DMl輕。癥狀的表現(xiàn)隨著形式(DM1/DM2)、嚴(yán)重性乃至不常見的D M2表型而有相當(dāng)大的變化。DMl患者常表現(xiàn)出肌強(qiáng)直、不能性遠(yuǎn)端虛弱和嚴(yán)重的認(rèn)知困難。DM2患者通常表現(xiàn)出肌肉疼痛、僵直、疲勞或發(fā)生近端下肢虛弱。Day等，Neurology 60(4) :657-64(2003)。虛弱的特征性模式對于DMl和DM2來說是不同的。在DMl中，在面部和下顎肌肉中觀察到，眼瞼下垂(下垂癥)，頸部肌肉、手和小腿虛弱。在DM2中，虛弱在那些更接近身體軀干的近端肌肉、頸部、肩部、髖屈肌和大腿中更加明顯。DMl癥狀包括睡眠過度(白天嗜睡)、肌肉消耗、吞咽困難和呼吸不足。DMl患者可能比DM2患者經(jīng)歷范圍更分散的認(rèn)知困難。取決于他們所患疾病的形式和嚴(yán)重性程度，DMl認(rèn)知困難的范圍可以包括發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)困難、語言、講話、行為、淡漠或睡眠過度。DM2的認(rèn)知表現(xiàn)包括執(zhí)行功能(即組織、凝練、喚詞等)問題和睡眠過度。在DMl中，受影響的基因被稱為DMPK (肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良蛋白激酶)，并編碼在骨骼肌中表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。該基因位于19號染色體的長臂上。在DMl中，DMPK基因的特征為胞嘧啶-胸腺嘧啶-鳥嘌呤(CTG)的三聯(lián)體重復(fù)序列。重復(fù)的數(shù)量在不同人中有很大變化，但是在健康人中平均數(shù)在5至37之間。有時，當(dāng)DNA的重復(fù)序列在細(xì)胞分裂期間被修復(fù)或復(fù)制時，細(xì)胞機(jī)制滑移，三聯(lián)體重復(fù)序列的額外拷貝被添加到序列中。一旦DMPK基因中存在超過37個三聯(lián)體重復(fù)序列，序列變得不穩(wěn)定并且滑移現(xiàn)象變得更加常見。患有DMl的人具有超過50個、并可能具有多達(dá)2000個CTG重復(fù)序列。結(jié)果是由于配子發(fā)生過程中的滑移，患有DMl的個體的重復(fù)序列大小通常在配子發(fā)生或早期胚胎發(fā)育期間將變得更大，使得患病成年人的孩子典型地表現(xiàn)出比他們的雙親更大的擴(kuò)增(這種現(xiàn)象被稱為早現(xiàn)遺傳)。具有更大擴(kuò)增的個體具有更早的疾病發(fā)作和更嚴(yán)重的表型。DM2同樣由染色體3q21上的ZNF9基因缺陷引起。DM2的重復(fù)序列擴(kuò)增遠(yuǎn)大于DMl，在75至超過11，000個重復(fù)序列的范圍內(nèi)，并且包含4個核苷酸的重復(fù)序列。然而，與DMl不同，重復(fù)DNA擴(kuò)增的大小沒有顯示出造成DM2發(fā)作年齡或疾病嚴(yán)重性的差異。早現(xiàn)遺傳在DM2中表現(xiàn)得不太顯著。目前不存在能夠治愈或特異性針對肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的療法。與病癥相伴的心臟問題、白內(nèi)障和其他異常情況可以治療但不能治愈。然而，存在可以緩解一些癥狀例如肌強(qiáng)直、疼痛和過度嗜睡的醫(yī)學(xué)干預(yù)和藥物。在例如高通量篩選和反義治療領(lǐng)域中進(jìn)行的研究，為將來更有效的定向治療保留了希望。肌肉特異性氯通道I(ClC-I)的剪接改變引起DMl的肌強(qiáng)直表型，并且在小鼠模型中可以使用修改ClC-ImRNA剪接的嗎啉代反義寡核苷酸來逆轉(zhuǎn)。Wheeler 等，J. Clin. Invest. 117(12) :3952-7 (2007)。盡管對于杜氏肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮和Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的治療模式正在進(jìn)行研究，但對治療這些疾病的有效的化合物和治療方法，仍存在著迫切需求。發(fā)明概述本公開通過提供三環(huán)DNA (tc-DNA)反義寡核苷酸(AON)以及使用tc_DNA AON治療疾病例如杜氏肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮和Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的方法，滿足了這些以及其他相關(guān)的需求。
總的來說，本發(fā)明還涉及在對象的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中矯正異常基因表達(dá)的方法，所述方法包含向?qū)ο蠼o藥tc-DNA反義寡核苷酸，其中所述tc-DNA反義寡核苷酸與所述基因編碼的RNA的一部分互補(bǔ)，并且其中tc-DNA反義寡核苷酸以足以矯正所述異常表達(dá)的量外周給藥于對象。本發(fā)明還涉及治療由對象中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異?；虮磉_(dá)引起的遺傳疾病的方法，所述方法包含向?qū)ο蠼o藥tc-DNA反義寡核苷酸，其中所述tc-DNA反義寡核苷酸與所述基因編碼的RNA的一部分互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNA反義寡核苷酸以有效矯正所述異常表達(dá)的量外周給藥于對象。本發(fā)明還涉及包含tc-DNA反義寡核苷酸的藥物組合物，其中所述tc-DNA反義寡核苷酸與人類基因編碼的RNA的一部分互補(bǔ)，并且其中所述組合物還包含藥用賦形劑。本發(fā)明還涉及tc-DNA反義寡核苷酸，其用于治療由對象中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異常 基因表達(dá)引起的遺傳疾病，所述tc-DNA反義寡核苷酸與所述基因編碼的RNA的一部分互補(bǔ)，并且所述tc-DNA反義寡核苷酸以有效矯正所述異常表達(dá)的量外周給藥于對象。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“外周給藥”包括但不限于任何沒有暗示直接注射到需要治療的對象的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的給藥途徑。更具體來說，外周給藥包括全身注射，例如肌肉內(nèi)(i.m.)、靜脈內(nèi)(i.v.)、腹膜內(nèi)(i. p.)、動脈內(nèi)、皮下或透皮注射。本發(fā)明還涉及用于治療神經(jīng)肌肉或肌肉骨骼疾病的tc-DNA反義寡核苷酸。所使用的tc-DNA反義寡核苷酸如本文下面所進(jìn)一步詳細(xì)描述的。更具體來說，tc-DNA反義寡核苷酸可以是本文中提出的具體tc-DNA之一。神經(jīng)肌肉或肌肉骨骼疾病可以源自于基因的改變，其中所述改變是外顯子的框內(nèi)突變，破壞基因的翻譯閱讀框的突變，可以通過在由所述基因編碼的mRNA中包含非典型外顯子加以補(bǔ)償?shù)挠泻ν蛔?，并且所述tc-DNA與所述基因編碼的pre-mRNA中存在的ISS或TSL互補(bǔ)并促進(jìn)非典型外顯子的包含，或者導(dǎo)致在所述基因編碼的mRNA中出現(xiàn)有害的3' CUG擴(kuò)增序列的突變。在具體實施方案中，當(dāng)改變是外顯子的框內(nèi)突變時，所述tc-DNA能夠促進(jìn)所述外顯子的跳躍。在另一個實施方案中，當(dāng)改變是破壞基因的翻譯閱讀框的突變時，所述tc-DNA能夠促進(jìn)外顯子的跳躍以便恢復(fù)基因的閱讀框。在另一個實施方案中，當(dāng)改變是導(dǎo)致在所述基因編碼的mRNA中出現(xiàn)有害的3丨CUG擴(kuò)增序列的突變時，所述tc_DNAA0N能夠破壞含有所述擴(kuò)增序列的mRNA。本文中提出的tc-DNA AON是受限的DNA A0N，其與利用例如更常規(guī)的2’ _0_甲基-硫代磷酸酯或嗎啉代化學(xué)品的DNA AON相比，顯示出與互補(bǔ)的pre-mRNA的增加的雜交性質(zhì)。盡管2’-0_甲基-硫代磷酸酯或嗎啉代DNA AON典型地需要20至24個核苷酸來實現(xiàn)與pre-mRNA靶的特異性雜交，但本文公開的tc-DNA AON能夠與長度在10至18個核苷酸之間、更寬泛在約6至約22個核苷酸之間、尤其是8至20個核苷酸之間的pre-mRNA靶特異性雜交。正如下文更詳細(xì)描述的，外顯子跳躍在pre-mRNA的成熟加工過程中在核中實現(xiàn)。它包括使用與pre-mRNA內(nèi)外顯子限定序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(AON)來掩蔽參與祀外顯子的剪接的關(guān)鍵序列。本文提供的tc-DNA A0N，通過掩蔽肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA內(nèi)內(nèi)含子/外顯子接點處的剪接位點、或者更普遍來說用于外顯子限定的位點，從而促進(jìn)在pre-mRNA向成熟mRNA的加工過程中刪除有害外顯子，因而可以適用于外顯子跳躍。這樣的tc-DNAAON，通過在包含含有無義、終止、移碼突變的外顯子或含有有害隱蔽外顯子的內(nèi)含子序列的突變肌養(yǎng)蛋白基因中恢復(fù)開放閱讀框，將在杜氏肌營養(yǎng)不良的治療中發(fā)現(xiàn)用途。
例如，肌養(yǎng)蛋白基因的外顯子23或外顯子51中的無義或移碼突變，產(chǎn)生了羧基端截短的無功能肌養(yǎng)蛋白。通過分別與內(nèi)含子23或內(nèi)含子51中包含肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA剪接供體位點的核苷酸、以及外顯子23或外顯子51的相鄰5’核苷酸雜交，本文公開的tc-DNAAON能夠阻止將突變的外顯子23或外顯子51包含在成熟的mRNA轉(zhuǎn)錄本中。該成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)產(chǎn)生有功能的肌養(yǎng)蛋白，其缺失由外顯子23或外顯子51編碼的氨基酸，但是包含那些缺失的氨基酸的N-端和C-端兩側(cè)的肌養(yǎng)蛋白氨基酸，因此構(gòu)成了半功能性的“準(zhǔn)肌養(yǎng)蛋白”。本文公開的用于在肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA加工期間跳過外顯子的tc_DNA A0N，含有約6至約22個核苷酸、特別是約8至20個三環(huán)核苷酸、特別是約10至18個三環(huán)核苷酸，其中tc-DNA AON的8-16個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ)，其中tc-DNA AON的2-8個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子區(qū)互補(bǔ)，并且其中內(nèi)含子剪接供體位點與外顯子區(qū)鄰接并位于其5’端。在某些情況中，tc-DNA AON具有12至16個核苷酸或13至15個核苷酸，并包含與內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ)的6至14個核苷酸和與外顯子區(qū)互補(bǔ)的2至5個核苷酸。然而，應(yīng)該理解，更長的tc-DNA AON可以適用于在肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的加工期間實現(xiàn)外顯子跳躍。本文中示例了被設(shè)計用于跳過肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA內(nèi)突變的外顯子23的tc_DNAAON。所述 tc-DNA AON 包含核苷酸序列 5’-AACCTCGGCTTACCT-3’(M23D(+02-13)，SEQ ID NO:I)，并與位于肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA內(nèi)含子23的3’末端的核苷酸和位于肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA外顯子23的鄰接5’末端的核苷酸特異性雜交。還提供了被設(shè)計用于跳過肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA內(nèi)突變的外顯子51的tc-DNA AON。所述tc-DNA AON包含選自5’-AGAAATGCCATCTTC-3’(H51 (+68+82)，SEQ ID N0:2)、5，-AAATGCCATCTTCCT-3’(H51 (+70+84)，SEQ ID NO :3)和5’-TGCCATCTTCCTTGA-3’(H51 (+73+87)，SEQ ID NO :4)的核苷酸序列，并與位于肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA內(nèi)含子51的3’末端的核苷酸和位于肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA外顯子51的5’末端的核苷酸特異性雜交。在本文中使用了下列命名法“M”是指小鼠，“H”是指人類，“23”和“51”是指特定外顯子，“D”是指供體位點，“A”是指受體位點，跟有數(shù)值的“ + ”表示外顯子序列中的核苷酸數(shù)量，跟有數(shù)值的表示側(cè)翼外顯子中的核苷酸數(shù)量。因此，例如M23D(+02-13)表示tc-DNA AON涵蓋了外顯子23的兩個3’ -端核苷酸和內(nèi)含子23的13個5’ -端核苷酸，所述AON能夠掩蔽小鼠肌養(yǎng)蛋白外顯子23的供體剪接位點，而H51 (+68+82)表示tc-DNA AON跨越人類肌養(yǎng)蛋白外顯子51中的從68號核苷酸至82號核苷酸。本公開的其他方面提供了可以適用于掩蔽運動神經(jīng)元生存蛋白2 (SMN2)pre-mRNA內(nèi)的內(nèi)含子沉默序列(ISS)或末端莖-環(huán)(TSL)的tc-DNA AON。這樣的tc-DNA AON促進(jìn)在SMN2pre-mRNA加工成成熟mRNA過程中包含非典型外顯子。得到的修飾的功能性SMN2蛋白含有由被包含的非典型外顯子編碼的氨基酸序列。這種修飾的功能性SMN2蛋白能夠補(bǔ)充無功能的SMNl蛋白，并且當(dāng)在體內(nèi)表達(dá)時，能夠至少部分逆轉(zhuǎn)由SMNl基因中的突變引起的脊髓性肌萎縮。例如，盡管SMN2的外顯子7典型通過相應(yīng)preiRNA的加工被排除在成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本之外，但加入外顯子7產(chǎn)生了修飾的功能性SMN2蛋白，其能夠在功能上補(bǔ)償突變的SMNl蛋白。通過與SMN2pre-mRNA內(nèi)包含SMN2ISS或TSL的核苷酸雜交，tc-DNA AON能夠促進(jìn)將外顯子7包含在成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本中。該成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)產(chǎn)生修飾的功能性SMN2蛋白，其包含由外顯子7編碼的氨基酸以及位于所包含的氨基酸的N-端和C-端兩側(cè)的所有其他SMN2氨基酸。因此，本公開提供了在SMN2 pre-mRNA加工期間促進(jìn)包含外顯子7的tc_DNAA0N，其中所述tc-DNA AON長度為6_22個三環(huán)核苷酸、特別是8_20個三環(huán)核苷酸、更特別長度為10-18個三環(huán)核苷酸，并且其中所述tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的內(nèi)含子沉默序列(ISS)或末端莖-環(huán)(TSL)互補(bǔ)。這樣的tc-DNA AON可以具有13至17個核苷酸、12至16個核苷酸或13至15個核苷酸。本文中不例了包含15 個核苷酸的序列5’-CUUUCAUAAUGCUGG-3’ (SMN2i7(10 ；25) ,SEQ ID NO 5)的 tc-DNA A0N，所述 tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的ISS互補(bǔ)，并且可用于促進(jìn)將外顯子7包含在加工過的SMN2 mRNA中。本文中還示例了包含13個核苷酸的序列5’-UUAAUUUAAGGAA-3’ (SMN2e7 (39 ；51), SEQ IDNO 6)的tc-DNA AON,所述tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的TSL2互補(bǔ)，并且也可用于促進(jìn)將外顯子7包含在加工過的SMN2 mRNA中。應(yīng)該理解，也可以使用本文提出的tc-DNA AON的組合。本公開的其它方面提供了可以適用于促進(jìn)突變DMl mRNA的破壞的tc-DNA AON。這樣的tc-DNA AON包含9-27個三環(huán)核苷酸，其中tc-DNA AON與包含有害3’ CUG擴(kuò)增序列(n>50)的突變DMl mRNA互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNA AON能夠促進(jìn)所述DMl mRNA的RNase介導(dǎo)的破壞。Tc-DNA AON可以包含3至9個、4至8個或5、6或7個連續(xù)重復(fù)的核苷酸序列5’-CAG-3’ (SEQ ID NO :7)。用于促進(jìn)突變DMl的破壞的示例性tc-DNA AON包含 15 個核苷酸的序列 5’-CAGCAGCAGCAGCAG-3’(DM1 (CAG5)，SEQ ID NO :8)。用于促進(jìn)突變DMl的破壞的另一個示例性tc-DNA AON包含21個核苷酸的序列5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’ (DM1(CAG7)，SEQ ID NO :9)。在其它方面中，本公開提供了在細(xì)胞中用于從肌養(yǎng)蛋白mRNA中消除突變外顯子的方法、用于將非典型外顯子包含在SMN2 mRNA內(nèi)的方法、以及用于破壞包含病理數(shù)量的3’CUG擴(kuò)增序列的DMl mRNA的方法。這些方法的每一種都包括將細(xì)胞與本文中公開的tc-DNA AON進(jìn)行接觸的步驟。在某些實施方案中提供了用于從肌養(yǎng)蛋白mRNA中消除突變外顯子的方法，所述方法包含將表達(dá)肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的細(xì)胞與含有長度為6_22個三環(huán)核苷酸、特別是8_20個三環(huán)核苷酸、更特別是10至18個三環(huán)核苷酸的tc-DNA AON進(jìn)行接觸的步驟，其中所述tc-DNA AON的8-16個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ)，其中所述tc-DNA AON的2-8個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子區(qū)互補(bǔ)，并且其中外顯子區(qū)與內(nèi)含子剪接供體位點鄰接并位于其3’端。示例性方法包括將細(xì)胞與12至16個核苷酸或13至15個核苷酸的tc-DNA AON進(jìn)行接觸的步驟。適合用于這種方法的tc-DNA AON包含核苷酸序列 5’ -AACCTCGGCTTACCT-3’(M23D (+02-13)，SEQ ID NO 1)、5’ -AGAAATGCCATCTTC-3，(H51 (+68+82)，SEQ ID N0:2)、5，-AAATGCCATCTTCCT-3’(H51 (+70+84)，SEQ ID NO 3)和5，-TGCCATCTTCCTTGA-3’ (H51 (+73+87)，SEQ ID NO :4)。
在其他實施方案中提供了用于將非典型外顯子包含在SMN2mRNA內(nèi)的方法，所述方法包含將表達(dá)SMN2 pre-mRNA的細(xì)胞與含有長度為6_22個三環(huán)核苷酸、特別是8_20個三環(huán)核苷酸、更特別是10至18或11至18個三環(huán)核苷酸的tc-DNA AON進(jìn)行接觸的步驟，其中所述tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的內(nèi)含子沉默序列(ISS)、例如內(nèi)含子7內(nèi)的ISS-Nl互補(bǔ)。示例性方法包括將細(xì)胞與12至16個核苷酸或13至15個核苷酸的tc-DNA AON進(jìn)行接觸的步驟。適合用于這種方法的tc-DNA AON包含15個核苷酸的序列5’ -CUUUCAUAAUGCUGG-3’ (SMN2i7(10 ;25)，SEQ ID NO :5)。在相關(guān)的方法中，tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的末端莖-環(huán)(TSL)、例如外顯子7內(nèi)的TSL-2互補(bǔ)。適合用于這種方法的 tc-DNA AON 包含 13 個核苷酸的序列 5’ -UUAAUUUAAGGAA-3’ (SMN2e7 (39 ；51) ,SEQ IDNO 6)。在另外的其他實施方案中提供了用于破壞細(xì)胞中包含一個或多個3’ CUG擴(kuò)增序列的DMl mRNA的方法，所述方法包含將細(xì)胞與包含9_27個三環(huán)核苷酸的tc-DNA AON進(jìn)行接觸的步驟，其中所述tc-DNA AON與包含一個或多個3’ CUG擴(kuò)增序列的突變DMl mRNA互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNA AON能夠促進(jìn)DMl mRNA的RNase介導(dǎo)的破壞。適合用于這種方法的tc-DNA AON包含3至9個、4至8個或5、6、7個連續(xù)重復(fù)的核苷酸序列5’ -CAG-3’ (SEQID NO :7)，其實例是包含 15 個核苷酸的序列 5’ -CAGCAGCAGCAGCAG-3’ (DM1 (CAG5)，SEQ IDNO 8)的tc-DNA AON。促進(jìn)突變DMl的破壞的另一個示例性tc-DNA AON包含21個核苷酸的序列 5’ -CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’ (DM1 (CAG7)，SEQ ID NO 9)。在其它方面中，本公開提供了用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)的方法、用于治療脊髓性肌萎縮(SMA)的方法和用于治療Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良(SD)的方法。這些方法的每一種都使用了向患者給藥本文中公開的tc-DNA AON的步驟，分別用于從肌養(yǎng)蛋白mRNA中消除突變的外顯子、用于將非典型外顯子包含在SMN2 mRNA內(nèi)或用于破壞包含一個或多個3’ CUG擴(kuò)增序列的DMl mRNA。從下文中提出的詳細(xì)描述和隨附的權(quán)利要求書，本公開的這些以及其他實施方案、特點和優(yōu)點將變得明顯。附圖簡述圖I是用于生產(chǎn)反義寡核苷酸的各種合成核苷酸的表。圖2是三環(huán)DNA (tc-DNA)的結(jié)構(gòu)圖。圖3的圖顯示了 mdx小鼠在肌養(yǎng)蛋白基因的外顯子23中攜帶無義突變，其阻止合成有功能的肌養(yǎng)蛋白。外顯子23部分編碼重復(fù)序列R6和R7，其中C到T的突變產(chǎn)生了終止密碼子(TAA)。用于在外顯子23的下游供體剪接位點處進(jìn)行外顯子跳躍的15個核苷酸的 tc-DNAAON 被命名為 M23D(+02-13)，具有核苷酸序列 5’ -AACCTCGGCTTACCT-3 ’ (SEQ IDNO : I)，并與靶肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子23/內(nèi)含子23接點互補(bǔ)，所述接點由序列5’-外顯子 23. . . TCAGgtaagccgaggtttggcc...內(nèi)含子 23-3，(SEQ ID NO 2)限定，其中大寫字母表不外顯子的核苷酸，小寫字母表不內(nèi)含子的核苷酸。圖4是巢式RT-PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠,顯示了在利用或不利用oligofectamine下用1、2和10 ii g tc-DNA AON M23D (+02-13)轉(zhuǎn)染的mdx肌管中肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子23的跳過。在48小時后，收獲培養(yǎng)物并進(jìn)行處理以提取mRNA。
圖5是巢式RT-PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠,顯示了在oligofectamine存在下用0. 5、1、2、5和IOiig tc-DNA AON M23D (+02-13)轉(zhuǎn)染的mdx肌管中肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子23的跳過。在48小時后，收獲培養(yǎng)物并進(jìn)行處理以提取mRNA。圖6是巢式RT-PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠,顯示了在oligofectamine存在下用5 ii gtc-DNA AON M23D(+02-13)轉(zhuǎn)染的mdx肌管中肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子23的跳過。在轉(zhuǎn)染后從第0日至第15日收獲培養(yǎng)物并進(jìn)行處理以提取mRNA。圖7是巢式RT-PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠，顯示了在用含有100、80、40、20、10和5 ii gtc-DNA AON M23D (+02-13)的50 PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)進(jìn)行脛前肌注射的8周齡mdx小鼠中，肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子23的跳過。在3周后處死動物并對肌肉樣品進(jìn)行處理用于mRNA分析。圖8是RT-PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠，顯示了在用含有10 ii g tc-DNA AONM23D (+02-13)的50iil PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)進(jìn)行脛前肌注射的8周齡mdx小鼠中，肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子23的跳過。在4、10和20周后處死動物并對肌肉樣品進(jìn)行處理用于mRNA分析。圖9 是來自在 8 周齡時用含有 IOii g tc-DNA AON M23D (+02-13)的 50 PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)注射的mdx小鼠的脛前肌組織橫切片中，肌養(yǎng)蛋白的免疫染色的光學(xué)顯微照片。在4、10和20周后處死動物并對肌肉樣品進(jìn)行處理用于免疫染色。

圖10是用tc-DNA AON M23D (+02-13)注射到海馬或腦脊液中的正常和mdx小鼠的CNS中肌養(yǎng)蛋白的免疫染色。A-B-C切片是單次鞘內(nèi)注射后I個月時，正常、mdx和用20 y gtc-DNA M23D (+02-13)處理的mdx的海馬水平處。D-E-F切片是在腦脊液中遞送后I個月時，正常、mdx和用200 u g tc-DNA M23D (+02-13)處理的mdx的小腦水平處。圖11是pre-mRNA到成熟mRNA的總體加工的示意圖。圖12是巢式RT-PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠，顯示了在用含有各種tc-DNA AON的50 ii IPBS (磷酸鹽緩沖鹽水)進(jìn)行脛前肌注射的8至10周齡hDMD小鼠中，肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子51的跳過。圖13是SMNl和SMN2基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)和染色體位置的示意圖。圖14是SMN2中的點突變(C6T)的示意圖，所述SMN2明顯缺少外顯子7，影響了mRNA剪接。圖15是通過改進(jìn)內(nèi)含子6-外顯子7邊界處的剪接受體(“SA”)7和外顯子7_內(nèi)含子7邊界處的剪接供體(SD)7的使用，來增加外顯子7在SMN2中的包含的示意圖。圖16是SMNl和SMN2中的外顯子7的結(jié)構(gòu)示意圖。圖17 是 tc-DNA AON SMN2e7 (39 ；51) (SEQ ID NO :6)的靶序列及其對 SMNl和SMN2外顯子7結(jié)構(gòu)的推斷作用的示意圖。Tc-DNA AON SMN2e7 (39 ；51)具有序列5’ -UUAAUUUAAGGAAUGUG-3’，可能破壞SMN2中末端莖環(huán)2的結(jié)構(gòu)，從而增加了外顯子7在S麗I和S麗2中的包含。圖18 是 tc-DNA AON SMN2i7(10 ；25) (SEQ ID NO :5)的靶序列及其對 SMNl和SMN2外顯子7包含的推斷作用的示意圖。Tc-DNA AON SMN2i7(10 ；25)具有序列5’-CACUUUCAUAAUGCUGG-3’，可能阻止內(nèi)含子沉默序列(“ISS”)_N1的識別，允許識別外顯子7-內(nèi)含子7邊界處的5’剪接位點。EXINCT是指擴(kuò)展抑制背景(Extended INhibitoryContexT)。基于擴(kuò)展突變分析，已顯示出C6U產(chǎn)生了影響外顯子7限定的擴(kuò)展抑制背景。圖19RT-PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠(圖B)和歸一化圖(圖A)，顯示了在來自SMA患者的成纖維細(xì)胞(G03813細(xì)胞系)中外顯子7在SMN2中的包含。48小時后，收獲培養(yǎng)物并進(jìn)行處理以提取mRNA。實線對應(yīng)于模擬物處理的對照細(xì)胞，不連續(xù)線對應(yīng)于tc-DNA AONSMN2i7(10 ；25)(被稱為tc_I7)處理的細(xì)胞，點線對應(yīng)于tc-DNA AON SMN2e7 (39 ；51)(被稱Stc-TSL)處理的細(xì)胞。圖已經(jīng)按照每道中SMN1+SMN2(全長)+SMN2(A7)的總量進(jìn)行歸一化。圖C是Western印跡圖，顯示了用標(biāo)明的tc-DNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染的G03813細(xì)胞中SMN的水平。顯示了肌動蛋白作為上樣對照。值得注意的是tc-DNA AON SMN2i7(10 ;25)(被稱為 tc-ISS7)和 tc-DNA AON SMN2e7 (39 ；51)(被稱為 tc-TSL)對 SMN2 生產(chǎn)的累加效應(yīng)。圖D是光學(xué)顯微照片，顯示了 SMN在tc-TSL處理的細(xì)胞中的核定位(暗點)。核用DAPI復(fù)染。圖20(圖A)是Northern印跡圖，顯示了在體外，隨著轉(zhuǎn)染到DMl成肌細(xì)胞中的tc-DNA AON DMl (CAG7)(被稱為tc-DNA (CAG) 7)的量的增力口，突變的人類DMPK mRNA的水平 降低。在3天后收獲培養(yǎng)物并進(jìn)行處理以提取mRNA并進(jìn)行Northern印跡分析。圖B是反映了突變體DMPK與正常DMPK mRNA的比率的定量圖。圖21(圖A)是Northern印跡圖，顯示了隨著注射到表達(dá)具有700個CUG重復(fù)序列的人類DMPK mRNA的DMl小鼠的TA肌肉中的具有序列5，-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3，(SEQID NO 9)的 tc-DNA AON DMl (CAG7)(被稱為 tc-DNA (CAG) 7)的量的增力口，突變的人類 DMPKmRNA的水平降低。圖C是Northern印跡圖，顯示了當(dāng)30或60 y g tc-DNA AON DMl (CAG7)被注射到DMl小鼠(n = 4)的TA肌肉中時，突變的人類DMPK mRNA的水平降低。圖B和D分別是反映了圖A和C的Northern印跡中突變的人類DMPK與小鼠DMPK mRNA的比率的定量圖。詳細(xì)描述本公開是基于意外發(fā)現(xiàn)三環(huán)DNA (tc-DNA)反義寡核苷酸(AON)可以適用于掩蔽肌養(yǎng)蛋白基因內(nèi)的pre-mRNA剪接位點，用于掩蔽SMN2基因內(nèi)的內(nèi)含子沉默序列或末端莖-環(huán)序列，或用于破壞包含一個或多個3’CUG擴(kuò)增序列的DMl mRNA。這些發(fā)現(xiàn)將在總的來說遺傳疾病的治療中，更具體來說在杜氏肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮和Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的治療中發(fā)現(xiàn)廣泛應(yīng)用。三環(huán)DNA (tc-DNA)屬于一類新的受限D(zhuǎn)NA類似物，其表現(xiàn)出與互補(bǔ)RNA的改進(jìn)的雜交能力。Ittig 等，Nucleic Acids Res. 32 :346-353(2004) ;Ittig 等，Prague, Academyof Sciences of the Czech Republic. 7 :21-26 (Coll. Symp. Series, Hocec, M. ,2005)；Ivanova 等，Oligonucleotides j_7 :54-65 (2007) ;Renneberg 等，Nucleic Acids Res. 30 2751-2757 (2002) ;Renneberg 等，Chembiochem. 5 1114-1118 (2004);以及 Renneberg 等,JACS. 124 :5993-6002(2002)。本文公開的 pre-mRNA/tc-DNA AON 異源雙鏈體對 RNase H 具有抗性，并由此阻止所靶向的pre-mRNA被破壞。三環(huán)DNA化學(xué)品的優(yōu)點在于其骨架的結(jié)構(gòu)性質(zhì)允許減小AON的長度并同時保留與互補(bǔ)核苷酸序列的高親和性和高特異性雜交。出人意料的是，利用肌肉內(nèi)施用，tc-DNA AON可以有利地以微克劑量用于體內(nèi)環(huán)境，這比常規(guī)反義寡核苷酸技術(shù)所需的劑量低至少10倍。此外，tc-DNA在減小反義寡核苷酸長度的同時保留了全部活性。因此，例如，在本公開所示例的離體和體內(nèi)應(yīng)用中，13至15個核苷酸的tc-DNA AON非常高效。
本文描述的tc-DNA AON與現(xiàn)有的反義寡核苷酸化學(xué)品例如2’ _0_甲基-硫代磷酸酯或嗎啉代化學(xué)品相比，還表現(xiàn)出增加的體內(nèi)穩(wěn)定性。因此，例如，單次肌肉內(nèi)注射本公開的tc-DNA AON,能在給藥后保留體內(nèi)效能20周以上。此外以及非常意外的是，本公開的tc-DNA A0N，以被稱為M23D (+02-13)的tc-DNAAON為例，可以通過腦實質(zhì)內(nèi)或腦室內(nèi)給藥或通過給藥到蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)來遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，以恢復(fù)海馬CAl的神經(jīng)元內(nèi)或大腦或小腦皮層的神經(jīng)元內(nèi)突變的基因，例如突變的肌養(yǎng)蛋白基因。因此，這證實了本文描述的tc-DNA AON能夠有效跨過室管膜屏障。通過參考下面的定義，將最好地理解本公開定義
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“三環(huán)DNA (tc-DNA)”是指一類受限的DNA類似物，其中通過引入環(huán)丙烷環(huán)對每個核苷酸進(jìn)行修飾，以限制骨架的構(gòu)象靈活性并優(yōu)化骨架的扭轉(zhuǎn)角Y的幾何學(xué)。含有高腺嘌呤和胸腺嘧啶堿基的tc-DNA與互補(bǔ)RNA形成超常穩(wěn)定的A-T堿基對。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“反義寡核苷酸(AON) ”是指能夠與pre-mRNA或具有互補(bǔ)核苷酸序列的mRNA相互作用和/或雜交，由此修改基因表達(dá)的寡核苷酸。酶依賴性反義寡核苷酸包括依賴于RNase H活性來降解靶mRNA的形式，并包括單鏈DNA、RNA和硫代磷酸酯反義寡核苷酸?？臻g阻斷型(Steric blocking)反義寡核苷酸(RNase-H不依賴性反義寡核苷酸)通過與mRNA的靶序列結(jié)合來干擾基因表達(dá)或其他mRNA依賴性細(xì)胞過程?？臻g阻斷型反義寡核苷酸包括2' -0-烷基反義寡核苷酸、嗎啉代反義寡核苷酸和三環(huán)DNA反義寡核苷酸。正如本文中所述，在某些應(yīng)用中，可以將tc-DNA反義寡核苷酸應(yīng)用在酶依賴性應(yīng)用中，例如RNase介導(dǎo)性破壞包含一個或多個3’ CUG擴(kuò)增序列的DMlmRNA。當(dāng)在本文中使用時，“互補(bǔ)”是指核酸分子能夠與另一個核酸分子通過互補(bǔ)的核苷或核苷酸之間的常規(guī)Watson-Crick堿基配對或其他非常規(guī)類型的配對(例如Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵形成)而形成氫鍵。對于本公開的tc_DNA AON來說，tc_DNA AON與其互補(bǔ)序列的結(jié)合自由能足以允許tc-DNA AON執(zhí)行相關(guān)功能，并具有足夠的互補(bǔ)性程度以避免tc-DNA AON與非靶序列在需要特異性結(jié)合的條件下、即離體或體內(nèi)治療情形中的生理條件下發(fā)生非特異性結(jié)合。核酸分子結(jié)合自由能的確定在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的(參見例如 Turner 等，CSH Symp. Quant. Biol. LII : 123-133 (1987) ；Frier 等，Proc. Nat. Acad. Sci.USA 83 :9373-77(1986);以及 Turner 等，I. Am. Chem. Soc. 109 :3783-3785 (1987))。因此，“互補(bǔ)”(或“可特異性雜交”)這種術(shù)語是表明存在足夠程度的互補(bǔ)性或精確配對，使得在tc-DNA AON與pre-mRNA或mRNA靶之間能夠發(fā)生穩(wěn)定和特異結(jié)合。在本技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)該理解，核酸分子不是必需與靶核酸序列100%互補(bǔ)才能特異性雜交。也就是說，兩個或多個核酸分子可以低于完全互補(bǔ)?；パa(bǔ)性由核酸分子中能夠與第二個核酸分子形成氫鍵的毗連殘基的百分率表示。例如，如果第一個核酸分子具有10個核苷酸并且第二個核酸分子具有10個核苷酸,那么第一與第二個核酸分子之間5、6、7、8、9或10個核苷酸發(fā)生堿基配對分別表示50%、60%、70%、80%、90%和100%的互補(bǔ)性?！巴耆被颉叭俊被パa(bǔ)的核酸分子是指其中第一個核酸分子的所有毗連殘基都將與第二個核酸分子中相同數(shù)量的毗連殘基形成氫鍵的核酸分子，其中兩個核酸分子具有相同數(shù)量的核苷酸(即具有相同長度)，或者兩個分子具有不同長度。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“前體mRNA”或“pre-mRNA”是指含有一個或多個居間序列(內(nèi)含子)的信使核糖核酸(mRNA)的未成熟的單鏈。pre-mRNA由RNA聚合酶從細(xì)胞核中的DNA模板轉(zhuǎn)錄而來，并由內(nèi)含子和編碼區(qū)(外顯子)的交替序列構(gòu)成。一旦pre-mRNA通過剪掉內(nèi)含子并連接外顯子而被完全加工后，它被稱為“信使RNA”或“mRNA”，其是完全由外顯子構(gòu)成的RNA。真核生物的pre-mRNA在被完全加工成mRNA之前只短暫地存在。當(dāng)pre-mRNA已被適當(dāng)加工成mRNA序列后,它被輸出到核外,并最終被細(xì)胞質(zhì)中的核糖體翻譯成蛋白質(zhì)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“剪接”和“加工”是指pre-mRNA在轉(zhuǎn)錄后的修飾，其中內(nèi)含子被移除，外顯子被連接。(參見圖11)。剪接發(fā)生在由5個小核核糖核蛋白(snRNPs)構(gòu)成的被稱為剪接體的大的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體所催化的一系列反應(yīng)中。在內(nèi)含子中，3’剪接位點、5’剪接位點和分支位點為剪接所需。snRNP的RNA組分與內(nèi)含子相互作用，并可能
參與催化。Pre-mRNA剪接包含兩個依次的生物化學(xué)反應(yīng)。兩個反應(yīng)都涉及RNA核苷酸之間的剪接體轉(zhuǎn)酯作用。在第一個反應(yīng)中，內(nèi)含子內(nèi)在剪接體裝配期間限定的特定分支點核苷酸的2’ -0H，對內(nèi)含子5’剪接位點處的第一個核苷酸執(zhí)行親核攻擊，形成套索中間體。在第二個反應(yīng)中，釋放出的5’外顯子的3’ -OH在內(nèi)含子3’剪接位點處的最后一個核苷酸處執(zhí)行親核攻擊，由此連接外顯子并釋放出內(nèi)含子套索。pre-mRNA剪接受到內(nèi)含子沉默序列(ISS)和末端莖環(huán)(TSL)序列的調(diào)控。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“內(nèi)含子沉默序列(ISS) ”和“末端莖環(huán)(TSL) ”分別是指內(nèi)含子和外顯子內(nèi)的序列元件，其通過結(jié)合反式作用蛋白因子控制pre-mRNA內(nèi)的可變剪接，由此導(dǎo)致剪接位點的不同用法。典型地，內(nèi)含子沉默序列為8至16個核苷酸，并且與外顯子-內(nèi)含子接點處的剪接位點相比保守性較低。末端莖環(huán)序列典型為12至24個核苷酸，并由于互補(bǔ)性而在12-24個核苷酸的序列內(nèi)形成二級環(huán)結(jié)構(gòu)并因此結(jié)合。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“脊髓性肌萎縮(SMA) ”是指不同臨床類型的5號染色體連鎖的SMA，每種具有共同的遺傳病因和由于脊髓與腦干的運動神經(jīng)元喪失而造成的虛弱表現(xiàn)。脊髓性肌萎縮由運動神經(jīng)元生存基因SMNl內(nèi)的突變引起。對于正常功能來說，需要SMNl基因的至少一個正常等位基因。5號染色體含有SMN(運動神經(jīng)元生存)基因的區(qū)域具有大的復(fù)制序列。含有幾個基因的大序列在相鄰區(qū)段中出現(xiàn)兩次。因此SMNl和SMN2存在兩個基因拷貝。SMN2基因多一個突變，使得它制造蛋白的效率降低，但是這種效率降低的水平低。SM由兩條染色體的SMNl基因喪失造成。SMA的嚴(yán)重性從SMA I至SMA 3，與殘留的SMN 2基因能夠彌補(bǔ)SMN I喪失的程度部分相關(guān)。經(jīng)常還存在SMN2的更多拷貝，并且SMN2拷貝數(shù)的增加與疾病嚴(yán)重性較低有關(guān)。“對象”是指作為外植細(xì)胞的供體或受體的生物體或細(xì)胞本身。“對象”也指可以給藥本公開的核酸分子的生物體。在一個實施方案中，對象是哺乳動物或哺乳動物細(xì)胞。在另一個實施方案中，對象是人類或人類細(xì)胞。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“治療有效量”是指在其所給藥的對象(例如人類)中足以治療或預(yù)防所陳述的疾病、障礙或病癥的tc-DNAAON的量。本公開的tc-DNA A0N，可以單獨或組合或與其他藥物聯(lián)合用于治療本文中討論的疾病或病癥。例如，為了治療特定疾病、障礙或病癥，tc-DNA AON可以在適合于治療的情況下單獨或與一種或多種藥物組合給藥于患者，或可以給藥于對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說顯而易見的其他適合細(xì)胞。
當(dāng)在本文中使用時，詞組“可藥用”是指分子實體或組合物，當(dāng)給藥于人類時是生理上可耐受的，并且典型不產(chǎn)生過敏或類似的不利反應(yīng)，例如胃不適、頭暈等。優(yōu)選，當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“可藥用”是指得到聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或被列于《美國藥典》(u. S. Pharmacopeia)或其他廣泛認(rèn)可的藥典中，供用于動物、更具體為人類。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“分離的”是指所提到的材料從其本源環(huán)境例如細(xì)胞中移出。因此，分離的生物材料可以不含一些或所有細(xì)胞組分，即天然存在本源材料的細(xì)胞中的組分(例如細(xì)胞質(zhì)或膜組分)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“純化的”是指材料已經(jīng)在減少或消除無關(guān)材料的存在的條件下被分離，所述無關(guān)材料即污染物，包括從中獲得材料的本源材料。例如，純化的tc-DNA AON優(yōu)選基本上不含細(xì)胞或培養(yǎng)組分，包括組織培養(yǎng)組分、污染物等。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“基本上不含”在操作上用在材料分析測試的情形中。優(yōu)選，基本上不含污染物的純化材料至少為50%純；更優(yōu)選至少90%純，更加優(yōu)選至少99%純。純度可以通過層析、凝膠電泳、免疫測定、組成分析、生物測定和本技術(shù)領(lǐng)域已知的其他方法來評估。在本發(fā)明的說明書中，除非另有指明，否則任何濃度范圍、百分率范圍、比率范圍或整數(shù)范圍應(yīng)被理解為包括所述范圍內(nèi)的任何整數(shù)值，以及在適合情況下的其分?jǐn)?shù)(例如整數(shù)的十分之一和百分之一)。此外，除非另有指明，否則本文中所述的與任何物理特性例如聚合物亞基、大小或厚度相關(guān)的任何數(shù)字范圍，應(yīng)該被理解為包括所述范圍內(nèi)的任何整數(shù)。當(dāng)在本文中使用時，除非另有指明，否則“約”或“基本上由……構(gòu)成”是指所指范圍、值或結(jié)構(gòu)的±20%。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“包括”和“包含”同義使用。應(yīng)該理解，本文中沒有數(shù)量指示的組分是指“一個或多個”所列舉的組分。替換詞(例如“或”)的使用應(yīng)該被理解為是指替換項中的任一個、兩者或其任何組合。術(shù)語“約”或“近似于”是指在值的有統(tǒng)計學(xué)意義的范圍之內(nèi)。這樣的范圍可以在一定幅度級內(nèi)，優(yōu)選在給定的值或范圍的50 %以內(nèi)、優(yōu)選20 %以內(nèi)、更優(yōu)選10 %以內(nèi)、更加優(yōu)選5%以內(nèi)。術(shù)語“約”或“近似于”所涵蓋的容許偏差取決于所研究的具體系統(tǒng)，并可以被本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員容易地認(rèn)識到。用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良的三環(huán)DNA反義寡核苷酸正如上面指出的，在某些實施方案中，本公開提供了可以適用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)的tc-DNA A0N，所述杜氏肌營養(yǎng)不良是一種嚴(yán)重的隱性X染色體連鎖的肌營養(yǎng)不良形式，其特征為肌肉退化的快速發(fā)展，最終導(dǎo)致喪失步行能力、癱瘓和死亡。DMD由位于人類X染色體上的肌養(yǎng)蛋白基因內(nèi)的突變例如無義或移碼突變引起。肌養(yǎng)蛋白基因編碼肌養(yǎng)蛋白，其是肌肉組織中的重要結(jié)構(gòu)組分，為肌纖維肌膜以及位于細(xì)胞膜處的肌養(yǎng)蛋白聚糖復(fù)合體(DGC)提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。無義或移碼突變引起翻譯的過早終止，因此產(chǎn)生了 C-端截短的肌養(yǎng)蛋白。由一個或多個終止突變或框外突變引起的DMD，可以通過切除一個或幾個外顯子以便恢復(fù)翻譯閱讀框并由此恢復(fù)突變下游的mRNA序列來緩解。為了實現(xiàn)這一點，作為本公開的一部分，開發(fā)了靶向pre-mRNA內(nèi)能夠掩蔽一個或多個外顯子的剪接體識別的區(qū)域的tc-DNA AON。通過用tc-DNA AON靶向這些區(qū)域，可以通過可變剪接移除外顯子，以獲得成熟的、功能性肌養(yǎng)蛋白mRNA。因此，本文描述的tc-DNA AON有效地促進(jìn)肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA加工期間肌養(yǎng)蛋白基因中的一個或多個突變外顯子的跳過，從而恢復(fù)所得到的肌養(yǎng)蛋白mRNA的正確閱讀框，其在翻譯時產(chǎn)生功能性肌養(yǎng)蛋白。因此，本文公開的tc-DNA AON可治療性用于患有DMD的患者。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“外顯子跳躍”是指通過用一種或多種互補(bǔ)的反義寡核苷酸(AON)靶向pre-mRNA內(nèi)的剪接供體和/或受體位點來修改pre-mRNA剪接。通過阻斷剪接體與一個或多個剪接供體或受體位點的接近，AON能夠阻止剪接反應(yīng)，由此引起一個或多個外顯子從完全加工的mRNA中缺失。外顯子跳躍在pre-mRNA成熟加工期間在核中實現(xiàn)。它包括使用與pre-mRNA內(nèi)的剪接供體序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(AON)來掩蔽參與被靶外顯子剪接的關(guān)鍵序列。本文提供的tc-DNA A0N，通過掩蔽肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA中內(nèi)含子/外顯子接點處的剪接位點，由此促進(jìn)pre-mRNA向成熟mRNA的加工過程中突變外顯子的缺失，可以適用于外顯子跳躍。例如肌養(yǎng)蛋白基因的外顯子23或外顯子50內(nèi)的無義或移碼突變產(chǎn)生羧基端截短的無功能肌養(yǎng)蛋白。通過與分別包含內(nèi)含子23或內(nèi)含子51中的肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA剪接供體位點的核苷酸、以及外顯子23或外顯子51的相鄰5’核苷酸雜交，本文公開的tc-DNAAON能夠阻止突變的外顯子23或外顯子51包含在成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本中。該成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)產(chǎn)生功能性肌養(yǎng)蛋白，其缺失了由外顯子23或外顯子50和51編碼的氨基酸，但是包括那些缺失氨基酸的N-端和C-端兩側(cè)的肌養(yǎng)蛋白氨基酸。本文公開的用于在肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA加工期間跳過外顯子的tc-DNA AON,典型地含有6-22個毗連的三環(huán)核苷酸、特別是8-20個三環(huán)核苷酸、特別是10-18個毗連的三環(huán)核苷酸，其中tc-DNA AON的6-16個核苷酸、特別是8_16個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ)，其中tc-DNA AON的2-8個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子區(qū)互補(bǔ)，并且其中內(nèi)含子剪接供體位點與外顯子區(qū)毗連并位于其5’端。取決于所設(shè)想的具體應(yīng)用，tc-DNA AON可以具有12至16個核苷酸或13至15個核苷酸，并可以包含與內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ)的6至14個核苷酸和與外顯子區(qū)互補(bǔ)的2至5個核苷酸。本文中示例了被設(shè)計用于跳過肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA內(nèi)突變的外顯子23的tc-DNAAON。所述 tc-DNA AON 包含核苷酸序列 5’ -AACCTCGGCTTACCT-3’ (M23D (+02-13)，SEQID NO 1),并與位于肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子23的3’末端的核苷酸和位于肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子23的毗連5’末端的核苷酸特異性雜交。還提供了被設(shè)計用于跳過肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA內(nèi)突變的外顯子51的tc-DNA AON。所述tc-DNA AON包含選自5’_AGAAATGCCATCTTC-3’ (H51(+68+82),SEQ ID NO :2)、5’-AAATGCCATCTTCCT-3’ (H51(+70+84),SEQID NO 3)和 5’-TGCCATCTTCCTTGA-3’ (H51 (+73+87), SEQ ID NO :4)的核苷酸序列，并與位于肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子51的3’末端的核苷酸和位于肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子51的5’末端的核苷酸特異性雜交。用于治療脊髓性肌萎縮的三環(huán)DNA反義寡核苷酸在其他實施方案中，本公開提供了可以適用于治療脊髓性肌萎縮(SMA)的tc-DNAAON。SMA由SMNl基因的兩個拷貝中的突變引起，所述基因在正常細(xì)胞中以在完全加工的mRNA中存在外顯子7和8為特征。因為正常加工的SMN2 mRNA不含外顯子7或8，因此SMN2蛋白不能補(bǔ)償功能性SMNl蛋白的喪失。通過掩蔽SMN2 pre-mRNA內(nèi)的內(nèi)含子沉默序列
(ISS)和/或末端莖環(huán)(TSL)，本文描述的tc-DNA AON能夠促進(jìn)在加工后的SMN2 pre-mRNA中包含非典型外顯子7或外顯子8,所述pre-mRNA被翻譯成修飾的功能性SMN2蛋白，其能夠補(bǔ)償功能性SMNl蛋白的喪失，并且當(dāng)在體內(nèi)表達(dá)時，修飾的功能性SMN2能夠至少部分逆轉(zhuǎn)由SMNl基因中的突變引起的脊髓性肌萎縮。因此，本公開提供了用于促進(jìn)在SMN2 pre-mRNA加工期間包含非典型外顯子的tc-DNA A0N，其中所述tc-DNA AON長度為6_22個三環(huán)核苷酸、特別是8_20個三環(huán)核苷酸、更特別長度為10-18個三環(huán)核苷酸，并且其中tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的內(nèi)含子沉默序列(ISS)或末端莖-環(huán)(TSL)互補(bǔ)。這樣的tc-DNA AON可以具有13至17個核苷酸、12至16個核苷酸或13至15個核苷酸。本文中示例了包含15 個核苷酸的序列 5’-CUUUCAUAAUGCUGG-3’ (SMN2i7(10 ；25)，SEQ ID NO 5)的 tc-DNA AON,所述 tc-DNA AON 與 SMN2 pre-mRNA 的 ISS 互補(bǔ)，并且可用于促進(jìn)將非典型外顯子7包含在加工過的SMN2 mRNA中。本文中還示例了包含13個核苷酸的序列 5’-UUAAUUUAAGGAA-3’ (SMN2e7 (39 ；51) ,SEQ ID NO 6)的 tc-DNA A0N，所述 tc-DNAAON與SMN2 pre-mRNA的TSL2互補(bǔ)，并且也可用于促進(jìn)將外顯子7包含在加工過的SMN2mRNA 中。用于治療Steinert肌強(qiáng)肓性營養(yǎng)不良的三環(huán)DNA反義寡核苷酸在其他實施方案中，本公開提供了可以適用于治療由編碼DMl的mRNA的3’末端處的CUG擴(kuò)增序列所引起的Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的tc-DNA AON。據(jù)認(rèn)為，含有過多CUG擴(kuò)增序列的突變DMlmRNA被隔絕在核中并積累以形成核灶點(nuclear foci)。這些灶點是穩(wěn)定的，并被認(rèn)為與參與剪接機(jī)制的因子結(jié)合，從而廣泛地影響轉(zhuǎn)錄組。作為本公開的一部分，通過使用U7 snRNA系統(tǒng)，證實了 tc-DNA AON可用于靶向CUG序列并促進(jìn)突變的DMl mRNA的破壞，從而引起剪接因子的釋放和核灶點的移除。不受具體機(jī)制理論的束縛，還相信本文公開的tc-DNA AON能夠促進(jìn)含有過量CUG擴(kuò)增序列的mRNA的破壞，這是相當(dāng)出乎意料的。因此，描述了可以適用于促進(jìn)包含過量CUG擴(kuò)增序列的突變DMl mRNA的破壞的tc-DNA AON。這樣的tc-DNA AON包含9-27個三環(huán)核苷酸，其中所述tc-DNA AON與包含一個或多個3’ CUG擴(kuò)增序列的突變DMl mRNA互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNA AON能夠促進(jìn)DMlmRNA的破壞。取決于所設(shè)想的具體應(yīng)用，tc-DNA AON可以包含3至9個、4至8個或5、6或7個連續(xù)重復(fù)的核苷酸序列5’-CAG-3’ (SEQ ID NO :7)。用于促進(jìn)突變DMl的破壞的示例性 tc-DNA AON 包含 15 個核苷酸的序列 5’ -CAGCAGCAGCAGCAG-3 ’ (DM1 (CAG5)，SEQ ID NO 8)。用于促進(jìn)突變DMl的破壞的另一個示例性tc-DNA AON包含15個核苷酸的序列5’_CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’(DM1(CAG7)，SEQ ID NO :9)。三環(huán)DNA反義寡核苷酸的合成和分離
Tc-DNA AON可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的方案來合成，例如在下述文獻(xiàn)中所描述的Caruthers 等，Methods in EnzymoI. 211 :3-19 (1992) ；Thompson 等，PCT 公布 No. WO99/54459 ;Wincott 等，Nucleic Acids Res.23 :2677-2684 1995) ;Wincott 等，MethodsMol. Bio. 74 59 (1997) ;Brennan等，Biotechnol Bioeng. 61:33-451998);以及Brennan,美國專利 No. 6，001，311。 用于合成tc-DNA和tc-DNA AON的方法已被描述，并且在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。參見例如 Steffens 和 Leumann，J. Am. Chem. Soc. 121(14) :3249-3255(1999) ；Steffens 和Leumann, J. Am. Chem. Soc. 119 :11548-11549(1997);以及 Wengel，美國專利 No. 7，034，133。Tc-DNA可以在商用DNA合成儀上由常規(guī)固相氰乙基亞磷酰胺化學(xué)品產(chǎn)生的亞磷酰胺來合成。Tc-DNA亞憐酸胺構(gòu)造單?？梢园凑誗teffens和Leumann, C. Helv. Chim. Acta 80 2426-2439(1997)中的描述來合成。鏈延伸循環(huán)可以與用于天然寡脫氧核糖核酸合成的鏈延伸循環(huán)基本上相同。參見Pharmacia LKB用戶手冊(56-1111-56) (Gene AssemblerSpecial/4 Primers)。例如，tc-DNA AON的合成可以通過固相亞磷酰胺方法，使用與個人計算機(jī)相連的 Pharmacia LKB Gene Assembler Special 儀器或 Applied Biosystems PCR-MATE EPDNA合成儀(391型)來實現(xiàn)。試劑溶液可以按照制造商的方案來制備。參見AppliedBiosystems PCR_MATE EP DNA合成儀(391 型)用戶手冊(1989)，以及Pharmacia LKB用戶手冊(56-1111-56) (Gene Assembler Special/4 Primers) IH-四唑(在 MeCN 中的 0. 45M溶液)可以從Fluka獲得。三環(huán)DNA AON的裝配可以按照標(biāo)準(zhǔn)的合成循環(huán)來進(jìn)行，不同之處在于連接時間延長(例如6分鐘)，11倍過量的亞磷酰胺，以及0. IM的三環(huán)腺苷構(gòu)造單元溶液由于溶解性不良可以使用0. 07M來代替。LCAA-CPG(Sigma)或聚苯乙烯(Pharmacia)結(jié)合的天然核苷可用作起始單元。合成可以在去掉三苯甲基(trityl off)的模式下執(zhí)行，以5’-去三苯甲基化寡聚物結(jié)束。連接效率可以通過在線三苯甲基測定來監(jiān)測，并且其典型在90至99%之間。在合成后，可以將固相載體懸浮在濃NH3溶液中，并在55°C下放置15小時或在室溫下放置2小時。粗制tc-DNA AON可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的許多方法中的任一種來純化，例如超濾、凝膠電泳或?qū)游?。可以在Nucleogen DEAE 60-7 (125x4mm)柱上實現(xiàn)離子交換HPLC。分離的寡核苷酸可以在SP-PAK C-18柱(Waters)上脫鹽,如Sambrook等《分子克隆實驗指南》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)11. 29(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Plainview, NY, 1989)中所述?？梢詫⒓兓?tc-DNA AON 溶解在 150mM NaCl, IOmMTris-HCl,pH 7.0中，并與堿性磷酸酶(lmg/ml)和磷酸二酯酶(2mg/ml)在37°C下溫育。5小時后，可以對溶液進(jìn)行HPLC純化。具有取代或修飾(堿基、糖或磷酸)的化學(xué)合成的核酸分子可以防止它們被血清核糖核酸酶降解，這可以增加它們的效能。參見例如Eckstein等，PCT公布No. WO92/07065 ；Perrault 等，Nature 344 :565(1990) ；Pieken 等，Science 253 :314(1991)；Usman 和 Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17 :334(1992) ；Usman 等，PCT 公布 No. WO93/15187 ;以及 Rossi 等，PCT 公布 No. WO 91/03162 ;Sproat，美國專利 No. 5，334，711 ；Gold等，美國專利No. 6，300, 074。所有上述參考文獻(xiàn)描述了可以對本文描述的tc-DNA AON的堿基、磷酸或糖部分做出的各種化學(xué)修飾。用于體內(nèi)給藥的三環(huán)DNA的配制本文描述的Tc-DNA AON可以與適合用于制造水性懸液的賦形劑混合。這樣的賦形劑是懸浮劑例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散或潤濕劑可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物例如聚氧化乙烯硬脂酸酯，或氧化乙烯與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物例如十七氧化乙烯鯨蠟醇，或氧化乙烯與源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚氧化乙烯山梨糖醇單油酸酯，或氧化乙烯與源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚氧化乙烯失水山梨糖醇酐單油酸酯。水性懸液也可以包含一種或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或正丙酯。適合通過添加水來制備水性懸液的可分散粉末和顆粒，提供了活性成分與分散或潤濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑的混合。Tc-DNA AON組合物可以是無菌可注射水性或油性懸液的形式。懸液可以按照已知 技術(shù)，使用上面提到的適合的分散或潤濕劑和懸浮劑來配制。無菌可注射制劑也可以是在無毒的可腸胃外使用的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸液，例如作為在1，3_ 丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的介質(zhì)和溶劑是水、林格氏(Ringer' s)溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)油被常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。對于這種目的來說，可以使用任何品牌的不揮發(fā)油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，發(fā)現(xiàn)脂肪酸例如油酸可用于制備注射劑。本公開還包括被制備用于儲存或給藥的tc-DNA AON組合物，其在可藥用載體或稀釋劑中包含藥物有效量的所需化合物。治療用的可接受載體或稀釋劑在制藥技術(shù)領(lǐng)域中是公知的，并描述在例如《Remington藥物學(xué)》(Remington, s Pharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Co. ,A. R. Gennaro主編，1985)中。例如，可以提供防腐劑和穩(wěn)定劑。它們包括苯甲酸鈉、山梨酸、和對羥基苯甲酸的酯。此外，可以使用抗氧化劑和懸浮劑。本公開提供了 tc-DNA AON組合物，以及用于促進(jìn)pre-mRNA中的外顯子跳躍或掩蔽內(nèi)含子沉默或末端莖環(huán)或者用于靶向破壞細(xì)胞或生物體中的mRNA的方法。在相關(guān)實施方案中，本公開提供了用于治療患有上文中所述疾病或具有發(fā)生所述疾病的風(fēng)險的對象，包括人類細(xì)胞、組織或個體的方法和tc-DNA AON組合物。在一個實施方案中，方法包括向細(xì)胞或生物體例如哺乳動物給藥本公開的tc-DNA AON或含有所述tc-DNA AON的藥物組合物，以便改變pre-mRNA的加工或定向破壞mRNA。適合使用本公開的組合物和方法治療的哺乳動物對象，包括患有適合接受這樣的治療的一種或多種病癥例如杜氏肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮或Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的對象。本公開的tc-DNA AON組合物可以有效地用作可藥用制劑。可藥用制劑對于患者中的疾病狀態(tài)或其他不利狀況起到預(yù)防、改變其發(fā)生或嚴(yán)重性或治療(以可檢測或可測量的程度減輕一種或多種癥狀)的作用?？伤幱弥苿┌ㄉ鲜龌衔锏柠}，例如酸加成鹽例如鹽酸、氫溴酸、乙酸和苯磺酸的鹽。藥物組合物或制劑是指適合于給藥、例如全身給藥到細(xì)胞或患者例如人類中的形式的組合物或制劑。適合的形式部分取決于用法或進(jìn)入途徑，例如透皮或通過注射。這樣的形式應(yīng)該不阻止所述組合物或制劑到達(dá)靶細(xì)胞(即希望將tc-DNA AON遞送給它的細(xì)胞)。例如，注射到血流中的藥物組合物應(yīng)該是可溶的。其他因素在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，包括諸如毒性和阻止組合物或制劑行使其效應(yīng)的形式的考慮。本公開的藥物組合物也可以采取水包油乳液的形式。油性相可以是植物油或礦物油或這些的混合物。適合的乳化劑可以是天然存在的樹膠例如阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠、天然存在的磷脂例如大豆、卵磷脂以及源自于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯例如失水山梨糖醇單油酸酯，以及所述偏酯與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物例如聚氧化乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。本公開的tc-DNA AON可以使用或不使用穩(wěn)定劑、緩沖劑等形成適合用于治療的組合物，以任何標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行給藥。當(dāng)需要使用脂質(zhì)體遞送機(jī)制時，可以遵照形成脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)方案。因此，本公開的tc-DNA AON可以用任何方式給藥，例如透皮或通過局部、全身或鞘內(nèi)注射。本公開還描述了包含表面修飾脂質(zhì)體的tc-DNA AON組合物的使用，所述脂質(zhì)體含有聚(乙二醇)脂類(PEG修飾或長循環(huán)脂質(zhì)體或隱形脂質(zhì)體)。這些制劑提供了用于增加tc-DNA AON在靶組織中的積累的方法。這類藥物載體能夠抵抗調(diào)理作用以及單核細(xì)胞吞噬系統(tǒng)(MPS或RES)的消除，從而能夠獲得囊化的tc-DNA AON的更長血液循環(huán)時間并增加組織對其的暴露(Lasic等，Chem. Rev. 95 =2601-2 627(1995)，以及Ishiwata等，Chem. Pharm. Bull. M :1005-1011 (1995))。長循環(huán)脂質(zhì)體改進(jìn)了 tc-DNA AON 的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)，特別是與已知在MPS組織中積累的常規(guī)陽離子脂質(zhì)體相比(Liu等，J.Biol.Chem. 42 :24864-24870 (1995) ；Choi 等，PCT 公布 No. WO 96/10391 ；Ansell 等，PCT 公布No. WO 96/10390 ;Holland等，PCT公布No. WO 96/10392)。在其避免在代謝上具有攻擊性的MPS組織例如肝臟和脾臟中積累的基礎(chǔ)上，長循環(huán)脂質(zhì)體與陽離子脂質(zhì)體相比，還可能更大程度地保護(hù)tc-DNA AON免于核酸酶降解。藥物有效劑量是預(yù)防疾病狀態(tài)、抑制其發(fā)生或?qū)ζ溥M(jìn)行治療(在一定程度上減輕癥狀，優(yōu)選所有癥狀)所需的劑量。藥物有效劑量取決于疾病類型、所使用的組合物、給藥途徑和所治療的哺乳動物類型、所考慮的具體哺乳動物的身體特征以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會意識到的其他因素。例如，取決于本公開的tc-DNA AON的效能，活性成分的給藥量介于0. lmg/kg至100mg/kg體重/天之間。每天每千克體重約0. Img至約140mg量級的劑量水平可用于治療上面指出的病癥(每位患者每天約0. 5mg至約7g)?？梢耘c載體材料合并以生產(chǎn)單劑量形式的活性成分的量，取決于所治療的宿主和具體的給藥方式。劑量單位形式一般含有約Img至約500mg活性成分。應(yīng)該理解，任何特定患者的具體劑量水平取決于各種因素，包括所使用的具體化合物的活性、年齡、體重、總體健康、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速率、藥物組成以及正在治療的具體疾病的嚴(yán)重性。在根據(jù)本公開的配方和方法給藥tc-DNA AON組合物后，測試對象與安慰劑治療的或其他適合的對照對象相比，與被治療疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀將表現(xiàn)出約10%直至約99%的減輕。Tc-DNA AON可以通過本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的各種方法給藥到細(xì)胞，包括在只包含tc-DNA AON的制劑中或在還包含一種或多種其他組分例如可藥用載體、稀釋劑、賦形劑、佐劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等的制劑中給藥。在某些實施方案中，tc-DNAAON可以囊封在脂質(zhì)體中、通過離子電滲給藥、或摻入到其他介質(zhì)例如水凝膠、環(huán)糊精、生物可降解納囊、生物黏附性微球或蛋白質(zhì)載體中(參見例如PCT公布No. WO 00/53722)。本公開的tc-DNA AON的直接注射，不論是皮下、肌肉內(nèi)還是真皮內(nèi)，都可以使用標(biāo)準(zhǔn)的針頭和注射器方法來進(jìn)行，或者可以通過無針技術(shù)，例如在Conry等，Clin. CancerRes. 5 :2330-2337(1999)和 PCT 公布 No. WO 99/31262 中所描述的。
用于遞送核酸分子、例如本公開的tc-DNA AON的其他方法，描述在例如下列文獻(xiàn)中Boado 等，J. Pharm. Sci. 87 1308-1315 (1998) ；Tyler 等，F(xiàn)EBS Lett. 421 280-284(1999) ;Pardridge 等，Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 92 :5592-5596(1995) ；Boado,Adv. Drug Delivery Rev. 15 :73-107(1995) ;Aldrian-Herrada等，Nucleic Acids Res. 26 4910-4916(1998) ;Tyler 等，Proc. Nat ' I A cad. Sci. USA 96 :7053-7058(1999) ；Akhtar等，Trends Cell Bio. 2 :139 (1992);《用于反義寡核苷酸治療的遞送策略》(DeliveryStrategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics) (Akhtar 主編，1995)；Maurer 等，Mol. Membr. Biol. 16 :129-140 (1999) ；Hof land 和 Huang, Handb. Exp. Pharmacol137 :165-192(1999);以及 Lee 等，ACS Symp. Ser. 752 184-192 (2000) 這些方案可用于增補(bǔ)或補(bǔ)充本公開中實際考慮的任何tc-DNA AON的遞送。
實施例上面的公開內(nèi)容對本公開進(jìn)行了一般性描述，其將通過下面的實施例進(jìn)行進(jìn)一步示例說明。描述這些具體實施例僅僅是出于說明的目的，而不打算限制本公開的范圍。盡管在本文中使用了具體的靶、項和值，但這些靶、項和值同樣應(yīng)該被理解為是示例性的，而不對本公開的范圍構(gòu)成限制。。實施例I使用三環(huán)DNA反義寡核苷酸挽救營養(yǎng)不良的肌纖維中的肌養(yǎng)蛋白杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)是X染色體連鎖的隱性病，其源自于編碼肌養(yǎng)蛋白的基因中的突變。肌養(yǎng)蛋白基因內(nèi)的框外缺失編碼了截短型肌養(yǎng)蛋白缺陷，其引起嚴(yán)重的DMD表型。開發(fā)了使用三環(huán)DNA(tc-DNA)反義寡核苷酸(AON)的外顯子跳躍技術(shù)以允許有效挽救肌養(yǎng)蛋白基因的框外突變，由此恢復(fù)翻譯閱讀框并因此生產(chǎn)有功能活性的肌養(yǎng)蛋白。描述了 Tc-DNA AON例如與外顯子23/內(nèi)含子23接點雜交并干擾pre-mRNA加工，使得外顯子23在得到的加工后mRNA中被剪掉?；蛘?，tc-DNA AON與外顯子51/內(nèi)含子51接點雜交，同樣地干擾pre-mRNA加工，使得外顯子51在加工后mRNA中被剪掉。因此，得到的肌養(yǎng)蛋白缺失了分別由外顯子23或外顯子51編碼的氨基酸序列，但仍然保有足夠的功能性，使得嚴(yán)重DMD表型得到逆轉(zhuǎn)。實施例2mdx小鼠樽型mdx小鼠是鼠類DMD模型，其缺少全長肌養(yǎng)蛋白，但是保留了所有較小的肌養(yǎng)蛋白同種型。Bulfield 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 :1189-1192 (1984)。mdx 小鼠在肌養(yǎng)蛋白基因的外顯子23中帶有無義突變，其組織了功能性肌養(yǎng)蛋白合成(參見圖3)。外顯子23部分編碼重復(fù)序列R6和R7，其中C到T的突變產(chǎn)生了終止密碼子(TAA)。實施例3體外研究本實施例證實了用被稱為M23D (+02-13)的具有核苷酸序列5’ -AACCTCGGCTTACCT-3’的15個核苷酸t(yī)c-DNA AON轉(zhuǎn)染的mdx肌管，在外顯子23的下游供體剪接位點處經(jīng)歷外顯子跳躍，使得肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA被加工成缺失外顯子23的mRNA。設(shè)計了被稱為M23D (+02-13)的tc_DNA A0N，使其與外顯子23/內(nèi)含子23剪接接點處的革巴序列內(nèi)含子 22-ttttgag[GCTC...外顯子 23. . . TCAG] gtaagccgaggtttggcc-內(nèi)含子23雜交。使用或不使用oligofectamine，將 Mdx 肌管用 tc-DNA AON M23D (+02-13) (1、2 和10 U g)轉(zhuǎn)染。留下一個樣品不作處理，作為陰性對照。48小時后，收獲培養(yǎng)物并使用RNeasy小型試劑盒(Qiagen)提取mRNA。然后如下所述將mRNA反轉(zhuǎn)錄。將8微升提取的RNA (500ng至I U g)與I U L dNTP和I ii L隨機(jī)六聚物混合，并將混合物在65°C下溫育5分鐘。然后將混合物在冰上冷卻。向混合物加入25mMMgCl2 (4 u L) ,0. IM DTT (2 u L) U U L RNase out核糖核酸酶抑制劑(40U/ u L) > IX Tampon (2 y L的IOX儲液)和50U SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶，使反應(yīng)的終體積為20 u L0然后將反應(yīng)在25°C下溫育10分鐘,然后在42°C下溫育50分鐘。接下來，通過在70°C下加熱15分鐘使反應(yīng)失活。然后將反應(yīng)置于冰上并渦旋。然后向反應(yīng)加入I y L RNase H，并在37°C下溫育20分鐘。接下來，使用下列條件，通過巢式PCR測定外顯子23的跳過。將25 PCR主混 合物(Taq 聚合酶 50U/ii L，400iiM dNTP, 3mMMgCl2)與 3 y L cDNA,22u L H2O 和下列兩種引物(儲液濃度為100 ii M)各I ii L合并Ex 20 Fo 5’ -CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG-3 ’Ex 26 Ro 5’ -TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3 ’然后按照下列熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行反應(yīng)。94°C 5分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)的94°C 30秒、55°C I分鐘和72 °C 2分鐘。最后，將反應(yīng)在72°C下進(jìn)行5分鐘溫育。將2微升PCR產(chǎn)物加入到另一個PCR反應(yīng)中作為模板，使用I U L下列引物(儲液濃度為100 U M)。反應(yīng)還包含25 i! L PCR主混合物和23 y L H2O0Ex 20 Fi 5’ -CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3 ’Ex 26 Ri 5’ -CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3 ’按照下列熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行反應(yīng)-94°C 5分鐘，然后進(jìn)行25個循環(huán)的94°C 30秒、55 0C I分鐘和72 °C 2分鐘。最后，將反應(yīng)在72°C下進(jìn)行5分鐘溫育。圖4中顯示的數(shù)據(jù)證明(I) 15個核苷酸的tc-DNA AON M23D (+02-13)能夠在離體條件下實現(xiàn)mdx的肌養(yǎng)蛋白mRNA的突變外顯子23的跳過，以及(2) oligofectamine增加了 tc-DNA AON的離體攝取。在oligofectamine存在下將Mdx肌管用tc-DNA AON M23D (+02-13) (0. 5、1、2、5和IOu g)轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)物如上所述進(jìn)行處理。圖5中顯示的數(shù)據(jù)證明在存在2 ii g tc-DNA AONM23D(+02-13)的情況下有明顯的跳過。在oligofectamine 存在下將 Mdx 肌管用 5 ii g tc-DNA AON M23D (+02-13)轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后不同時間點(從第0日到第15日)如上所述對培養(yǎng)物進(jìn)行處理。圖6中顯示的數(shù)據(jù)證明(I)在第3日(D3)觀察到跳過，以及(2)在第15日(D15)仍可檢測到跳過，但是從第7日(D7)起減少。實施例4體內(nèi)研究本實施例證實了用被稱為M23D (+02-13)的具有核苷酸序列5’ -AACCTCGGCTTACCT-3’的15個核苷酸t(yī)c-DNA AON注射的mdx小鼠，在外顯子23的下游供體剪接位點處經(jīng)歷外顯子跳躍，使得肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA被加工成缺失外顯子23的mRNA。
對8周齡mdx小鼠在脛前肌中用含有100、80、40、20、10和5ii gtc-DNA AONM23D(+02-13)的50iil PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)進(jìn)行注射。3周后處死動物。對肌肉樣品進(jìn)行處理，使用上面實施例3給出的相同參數(shù)進(jìn)行mRNA分析，結(jié)果提供在圖7中。圖7中顯示的數(shù)據(jù)證明在所有測試條件下發(fā)生了外顯子跳躍。此外，在橫切片中檢測到顯著水平的肌養(yǎng)蛋白(未顯示)。注射2iig tc-DNA AON M23D (+02-13)與5 y gtc-DNA AON M23D (+02-13)等效(未顯示)。對8 周齡 mdx 小鼠用含有 IOii g tc-DNA AON M23D (+02-13)的 50 PBS 進(jìn)行肌肉內(nèi)注射。在注射后第4、10和20周時處死動物。如上所述測定肌肉樣品和橫切片的肌養(yǎng)蛋白mRNA。結(jié)果顯不在圖8中。如下所述使用免疫染色測定肌肉橫切片的肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。使用M. 0. M.(小鼠對小鼠)試劑盒，向樣品加入第一單克隆抗體NCL-Dys2 (I 100稀釋)。然后將樣品在PBS中清洗3次。然后將樣品與Alexa Fluor 488 (Molecular Probes)標(biāo)記的第二抗體山羊抗小鼠IgG抗體溫育2小時，隨后進(jìn)行PBS清洗、0. 01% TritonX清洗和最終的PBS清洗。該實驗的結(jié)果提供在圖9中。圖8和9中顯示的數(shù)據(jù)證明(I)在第4和10周時外顯子跳躍明顯，但是在第20周時沒有觀察到；(2)從4周至20周可以清楚地檢測到肌養(yǎng)蛋白；以及(3)tc-DNA AONM23D(+02-13)在體內(nèi)似乎比離體更有效。實施例5腦免疫染色對8周齡mdx小鼠在海馬或腦脊液(鞘內(nèi)注射)中用含有20iig(海馬)或200 ii g (鞘內(nèi))tc-DNA AON M23D (+02-13)的50 PBS進(jìn)行注射。在注射后一個月處死動物。如上面實施例4中所述測定腦切片(圖A、B、C)和小腦切片(圖D、E、F)的肌養(yǎng)蛋白。結(jié)果顯示在圖10中。圖A和D對應(yīng)于陰性對照，其中小鼠沒有進(jìn)行處理。圖B和E對應(yīng)于來自mdx小鼠的未處理的切片。圖C對應(yīng)于海馬處理的mdx小鼠(C)，圖(F)顯示了來自mdx小鼠的鞘內(nèi)處理的小腦的結(jié)果。用DAPI對核進(jìn)行復(fù)染。實施例6遞送(預(yù)示件的)Tc-DNA AON M23D (+01-13)可以通過腹膜內(nèi)和皮下注射來遞送(從lg/kg及更低劑量開始)。實施例7用于DMD小鼠肌養(yǎng)蛋白援救的三環(huán)DNA反義寡核苷酸本實施例證實了針對肌養(yǎng)蛋白的外顯子51/內(nèi)含子51接點設(shè)計的、具有序列 5’ -AGAAATGCCATCTTC-3’( “tc-DNA AON H51 (+68+82) ” ；SEQ ID NO:2)、5，-AAATGCCATCTTCCT-3，、( “tc-DNA AON H51 (+70+84) ” ；SEQ ID NO :3)和5，-TGCCATCTTCCTTGA-3’ ( “tc-DNA AON H51 (+73+87) ” ；SEQ ID NO :4)的 tc-DNA AON，在來自于表達(dá)全長人類肌養(yǎng)蛋白基因的小鼠(“hDMD小鼠”)的肌肉細(xì)胞中有效地介導(dǎo)外顯子51的跳過。對于8至10周齡的hDMD小鼠，在脛前肌中注射含有IOii g也稱為Tc-DNA ex51ESEa 的 tc-DNA AON H51 (+68+82)、也稱為 Tc-DNA ex51 ESEb 的 tc-DNA AON H51 (+70+84)或也稱為 Tc-DNA ex51 ESEc 的 tc-DNA AON H51 (+73+87)的 50 y I PBS。4 周后處死動物。對肌肉樣品進(jìn)行處理，使用上面實施例3給出的相同參數(shù)進(jìn)行mRNA分析，結(jié)果提供在圖12中。使用下列條件,通過巢式PCR測定外顯子51的跳過。使用Access RT-PCR系統(tǒng)(Promega)，使用500納克總RNA，在含有下列外部引物的50 y L反應(yīng)中進(jìn)行RT-PCR Hex 49F2(5’ -AAACTGAAATAGCAGTTCAAGC-3 ’ )Hex 53R2(5’-TTGCCTCCGGTTCTGAAGG-3’)cDNA合成在45°C下進(jìn)行45分鐘，然后使用下列參數(shù)直接進(jìn)行20個循環(huán)的初級PCR 20 個循環(huán)的 94°C 40 秒、60°C 40 秒和 72°C 40 秒。將2微升PCR產(chǎn)物加入到另一個PCR反應(yīng)中作為模板，使用下列引物(儲液濃度為 100 u M)。Hex 50F 5，-AGGAAGTTAGAAGATCTGAGC-3，Hex 52R2 5’ -TTCTTCCAACTGGGGACGC-3 ’按照下列熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行反應(yīng)94°C 5分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)的94°C 40秒、60 0C 40秒和72 °C 40秒。最后，將反應(yīng)在72°C下進(jìn)行5分鐘溫育。圖12中顯示的數(shù)據(jù)證明，測試的每種tc-DNA AON H51構(gòu)建物(tc_DNA AONH51 (+68+82)、tc-DNA AON H51 (+70+84)和 tc-DNA AON H51 (+73+87))都引起外顯子 51 跳過的增加。實施例8定向到SMN外顯子7/內(nèi)含子7接點和內(nèi)含子7ISS的三環(huán)DNA反義寡核苷酸促進(jìn)外顯子7包含在SMN2中本實施例證明了針對SMN外顯子7/內(nèi)含子7接點處和內(nèi)含子7ISS設(shè)計的tc-DNAAON(分別為 “tc-DNA AON SMN2e7 (39 ;51) ” 和 “tc-DNA AON SMN2i7 (10 ;25) ”)，在從 SMA患者分離的成纖維細(xì)胞(G03813細(xì)胞系)中有效介導(dǎo)外顯子7包含在SMN2中。tc-DNA AON SMN2i710 ；25) :5，-CUUUCAUAAUGCUGG-3’ (SEQ ID NO 5)tc-DNA AON SMN2e7(39 ；51) :5，-UUAAUUUAAGGAA-3’ (SEQ ID NO 6)G03813細(xì)胞系源自于具有兩個SMN2拷貝的3歲的I型SMA患者。將GM03813細(xì)胞培養(yǎng)在含有20%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素(100U/ml)的Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。tcDNA AON (tc-DNA AON SMN2i7(10 ；25)和 tc-DNA AON SMN2e7 (39 ;51))轉(zhuǎn)染使用Oligofectamine(Invitrogen),在無血清和抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行48小時。在轉(zhuǎn)染后48 小時，使用 TRIzol 試劑(Invitrogen)提取總 RNA,并使用 SuperScript II (Invitrogen)和隨機(jī)六聚體進(jìn)行第一鏈cDNA合成。使用Master Mix 2X Phusion GC(Finnzymes)在50 y L總體積中進(jìn)行PCR，其中含有11 u L cDNA和SMN_Ex6_FW與SMN_Ex8_Re引物各10 y M。然后在3%瓊脂糖凝膠上通過電泳分離PCR產(chǎn)物。SMN-Ex6-Fw 5’ -GCTGATGCTTTGGGAAGTATGTA-3’SMN-Ex8-Re 5’ -ATTCCAGATCTGTCTGATCG-3’圖19 中給出的數(shù)據(jù)顯示了 tc-DNA AON SMN2e7 (39 ；51)和 tc-DNA AONSMN2i7(10 ；25)兩者都促進(jìn)外顯子7包含在SMN2mRNA中。圖A顯示了來自用所指示的tc-DNA寡核苷酸處理的GM03813細(xì)胞的RNA的RT-PCR分析。使用這兩種tc-DNA寡核苷酸(第3和4道)時，對應(yīng)于不含外顯子7的SMN2( “SMN2(A7)”)的條帶強(qiáng)度比未處理道(第2道)中的條帶低。圖B是凝膠的歸一化定量圖，顯示出在tc-DNA AON轉(zhuǎn)染后，對應(yīng)于SMNl+全長SMN2的上部條帶增強(qiáng)，而對應(yīng)于SMN2 ( A 7)的下部條帶明顯減弱。圖C顯示了來自野生型成纖維細(xì)胞和用所指示的tc-DNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染的GM03813細(xì)胞的裂解液的Western印跡。在裂解緩沖液(10mmol/l HEPES pH 7. 9,00mmol/I KCl, lmmol/1 EDTA, lmmol/1 1,4-二硫蘇糖醇，I X完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche),0.5% NP-40)中獲得蛋白提取物。將同等量的蛋白(通過Bradford蛋白測定(BradfordProtein Assay, Pierce)測定)與 2X 載樣緩沖液(125mmol/l Tris pH 6. 8, 2%十二燒基硫酸鈉，10%甘油,0. 01%溴酹藍(lán)，10% ￠-巰基乙醇)混合，并使用Bradford蛋白測定(Pierce)測定蛋白質(zhì)濃度。將10微克每種蛋白樣品通過SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜用含有10%奶的PBS-Tween緩沖液阻斷，用識別SMN1、SMN2和截短形式的SMN2的兔多克隆SM N抗體(I 500稀釋；h_195，Santa Cruz)探測,然后與辣根過氧化物酶接合的山羊抗兔第二抗體(I 50，000)溫育。使用SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光試劑盒(ThermoScientific)檢測信號。為了證實蛋白的相等載樣量，將膜清洗，重新阻斷，并用小鼠單克隆抗肌動蛋白抗體探測，然后與辣根過氧化物酶接合的綿羊抗小鼠第二抗體(I 15，000)溫育。如上所述檢測信號。第I道用tc-DNA AON SMN2i7(10 ；25)轉(zhuǎn)染的 GM03813 細(xì)胞；第2 道用 tc-DNA AON SMN2e7 (39 ；51)轉(zhuǎn)染的 GM03813 細(xì)胞；第 3 道用 tc-DNA AON SMN2i7(10 ；25)和 tc-DNA AON SMN2e7 (39 ；51)兩者轉(zhuǎn)染的GM03813細(xì)胞；第4道野生型成纖維細(xì)胞 ’第5道未轉(zhuǎn)染的GM03813細(xì)胞。圖C中的數(shù)據(jù)表明，用tc-DNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染由于將外顯子7包含在SMN2mRNA中，挽救了 GM03813細(xì)胞中的SMN水平。由于外顯子7在SMN2中的散發(fā)性自然包含，對照GM03813細(xì)胞表現(xiàn)出一些SMN蛋白。圖D顯示了用30iig tc-TSL轉(zhuǎn)染、隨后用SMN抗體染色的GM03813細(xì)胞的光學(xué)顯微照片。將載片上轉(zhuǎn)染的GM03813細(xì)胞用丙酮/甲醇(體積/體積)固定。將固定的細(xì)胞在PBS+5% BSA中阻斷I小時，然后與兔多克隆SMN抗體(I 100，在PBS+1 % BSA中；h-195，Santa Cruz)溫育I小時。將細(xì)胞在PBS中清洗，并與Alexa 594接合的抗兔第二抗體溫育I小時。然后將細(xì)胞在PBS中清洗，并與DAPI (I 50，000)溫育5分鐘。使用Fluoromount-G(SouthernBiotech)將載片蓋片配合，并在4°C下溫育過夜。光學(xué)顯微照片顯示，在用tc-DNA TSL轉(zhuǎn)染的GM03813細(xì)胞的核(藍(lán)色)中，SMN(紅色)水平增加。實施例9定向于CUG重復(fù)序列的三環(huán)DNA反義寡核苷酸降低了 DMl成肌細(xì)胞中突變DMPKmRNA的表達(dá)本實施例證明了針對突變DMPK mRNA中的CUG重復(fù)序列設(shè)計的具有序列5’_CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’(“tc-DNA AON DMl (CAG7) ”;SEQ ID NO :9)的 tc-DNA AON，在從“肌庫”研究用組織庫(Tissue Bank for Research “Myobank”)獲得的肌肉活檢樣品分離到的人類DMl成肌細(xì)胞中，有效降低了具有800個CUG重復(fù)序列的突變DMPK mRNA的表達(dá)。使用Lipofectamine (Invitrogen),將 DMl 成肌細(xì)胞用量漸增的 tc-DNA AONDMl (CAG7) (0、3. g、10ii g和20 u g)轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后三天，通過Northern印跡檢測野生型和突變型DMPK mRNA的表達(dá)。簡單來說，將5_10 u g總RNA在含有0. 66M甲醛的I. 3%瓊脂糖MOPS凝膠上分離，并通過用IOX SSC進(jìn)行毛細(xì)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜(AmershamPharmacia Biotech)上。將斑點與隨機(jī)引發(fā)的32P標(biāo)記的(DMPK cDNA的Bgl II-Sac I片段)探針，在雜交緩沖液(2% SDS，10%硫酸葡聚糖，IX SSPE，100iig/ml鮭魚精子DNA，2%Denhart' s)中在68°C下雜交過夜。信號在感光成像儀(Molecular Imager FX, Bio-Rad)上分析，并使用Quantity One (Bio-Rad)定量。
圖20的圖A顯示出隨著轉(zhuǎn)染的tc-DNA AON DMl (CAG7)的量的增加，突變型DMPK降低。重要的是，野生型DMPK水平不變。使用18S RNA作為載樣對照。圖B是來自圖A的Northern印跡的定量圖。通過測量突變型DMPK與野生型DMPK的條帶強(qiáng)度比率來進(jìn)行定量。實施例10定向于CUG重復(fù)序列的Tc-DNA在DMl小鼠中降低突變DMPK mRNA的表達(dá)本實施例證實了 tc-DNA AON DMl (CAG7)有效降低在DMl小鼠的TA肌肉中表達(dá)的具有700個CUG重復(fù)序列的突變型人類DMPK mRNA的水平。用量漸增的tc-DNA AON DMl (CkQl)注射到表達(dá)具有700個CUG重復(fù)序列的人類DMPK mRNA的DMl小鼠的TA肌肉中。一周后，使用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA。通過Northern印跡檢測人類DMPK和小鼠DMPK mRNA。簡單來說，將8_10 y g總RNA在含有0. 66M甲醛的I. 3%瓊脂糖MOPS凝膠上分離，并通過用10XSSC進(jìn)行毛細(xì)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotech)上。將斑點與隨機(jī)引發(fā)的32P標(biāo)記的(DMPK cDNA的Bgl II-Sac I片段)探針，在雜交緩沖液(2% SDS，10%硫酸葡聚糖，IXSSPE，100ii g/ml鮭魚精子DNA，2% Denhart' s)中在68°C下雜交過夜。信號在感光成像儀(Molecular Imager FX, Bio-Rad)上分析，并使用 Quantity One (Bio-Rad)定量。圖21的圖A和C顯示出隨著轉(zhuǎn)染的tc-DNA AON DMl (CkQl)的量的增加，突變型人類DMPK的水平降低。圖B和D是分別來自圖A和C的Northern印跡的定量圖。通過測量突變體人類DMPK與野生型小鼠DMPK的條帶強(qiáng)度比率來進(jìn)行定量。盡管已經(jīng)在本公開的各種實施方案的每個中對本公開內(nèi)容進(jìn)行了描述，但預(yù)計本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員可以對其進(jìn)行和執(zhí)行某些修改，而不背離在前面的說明書中提出的并在下面的權(quán)利要求書中進(jìn)一步體現(xiàn)的本公開的真實精神和范圍。本公開的范圍不受本文描述的具體實施方案的限制。事實上，對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，根據(jù)上述說明書和隨附的圖，在本文所描述的之外對本公開內(nèi)容進(jìn)行各種修改將是顯而易見的。這樣的修改旨在屬于隨附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。還應(yīng)該理解，所有值都是近似值，提供它們是出于說明的目的。在本說明書中提到的所有美國專利、美國專利申請公開、美國專利申請、外國專利、外國專利申請、非專利出版物、圖、表格和網(wǎng)址，在此明確以其全文引為參考。序列表SEQ ID NO 1人工序列DNA長度15
tc-DNA AON M23D (+02-13)aacctcggcttacctSEQ ID NO 2人工序列DNA長度15tc-DNA AON H5I(+68+82)agaaatgccatcttcSEQ ID NO :3人工序列DNA長度15tc-DNA AON H5I(+70+84)aaatgccatcttcctSEQ ID NO :4人工序列DNA長度15tc-DNA AON H5I(+73+87)tgccatcttccttgaSEQ ID NO :5人工序列DNA長度15tc-DNA AON SMN2i7(10 ；25)cuuucauaaugcuggSEQ ID NO :6人工序列DNA長度13tc-DNA AON SMN2e7 (39 ；51)uuaauuuaaggaaSEQ ID NO 7人工序列DNA長度12-21 tc-DNA AON DMlCAGn)(cag)n n = 4-7SEQ ID NO :8
人工序列DNA長度15tc-DNA AON DMl(CAG5)cagcagcagcagcagSEQ ID NO 9人工序列DNA長度21tc-DNA AON DMl(CAG7)cagcagcagcagcagcagcag
權(quán)利要求
1.一種三環(huán)DNA反義寡核苷酸(tc-DNA AON)，其用于促進(jìn)肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA加工期間外顯子的跳躍，所述tc-DNA AON含有10至18個三環(huán)核苷酸，其中所述tc-DNA AON的8_16個或6-14個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ),其中所述tc-DNAAON的2-8個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子區(qū)互補(bǔ)，并且所述內(nèi)含子剪接供體位點與所述外顯子區(qū)毗連并位于其5’端。
2.權(quán)利要求I的tc-DNAA0N，其中所述tc-DNA AON的長度選自⑴12至16個核苷酸之間；(ii)13至15個核苷酸之間；以及(iii)15個核苷酸。
3.權(quán)利要求I的tc-DNAA0N，其中所述tc-DNA AON包含6至14個與所述內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ)的核苷酸。
4.權(quán)利要求I的tc-DNAA0N，其中所述tc-DNA AON包含2至5個與所述外顯子區(qū)互補(bǔ)的核苷酸。
5.權(quán)利要求I的tc-DNAA0N，其中在所述肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA加工期間被跳過的外顯子是外顯子23或外顯子51。
6.權(quán)利要求5的tc-DNAA0N，其中當(dāng)被跳過的外顯子是外顯子23時，所述tc-DNAAON 包含核苷酸序列 5’ -AACCTCGGCTTACCT-3，(SEQ ID NO :I)，或者是 M23D (+02-13)(SEQ ID NO :1)，并且當(dāng)被跳過的外顯子是外顯子51時，所述tc-DNA AON包含選自5’ -AGAAATGCCATCTTC-3’ (SEQ ID NO :2)、5’ -AAATGCCATCTTCCT-3’ (SEQ ID NO 3)和5’ -TGCCATCTTCCTTGA-3’ (SEQ ID NO 4)的核苷酸序列，或者是 H51 (+68+82) (SEQ ID NO:2)或 H51(+70+84)(SEQ ID NO 3)或 H51 (+73+87)(SEQ ID NO 4)。
7.一種三環(huán)DNA反義寡核苷酸(tc-DNA AON)，其用于促進(jìn)SMN2pre_mRNA加工期間包含非典型外顯子，所述tc-DNA AON含有10至18個三環(huán)核苷酸，其中所述tc-DNA AON與SMN2pre-mRNA的內(nèi)含子沉默序列(ISS)互補(bǔ)。
8.權(quán)利要求7的tc-DNAA0N，其中所述tc-DNA AON的長度選自⑴12至16個核苷酸之間；(ii)13至15個核苷酸之間；以及(iii)15個核苷酸。
9.權(quán)利要求7的tc-DNAA0N，其中所述SMN2pre_mRNA中的所述非典型外顯子是外顯子7，并且所述內(nèi)含子沉默序列是ISS-N1。
10.權(quán)利要求9的tc-DNAAON,其中所述tc-DNA AON包含核苷酸序列5’ -CUUUCAUAAUGCUGG-3’ (SEQ ID NO :5)，或者是 SMN2i7(10 ；25) (SEQ ID NO 5)。
11.一種三環(huán)DNA反義寡核苷酸(tc-DNA A0N)，其用于促進(jìn)SMN2 pre-mRNA加工期間包含非典型外顯子，所述tc-DNA AON由10-18個三環(huán)核苷酸構(gòu)成，其中所述tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的末端莖-環(huán)(TSL)互補(bǔ)。
12.權(quán)利要求11的tc-DNAA0N，其中所述tc-DNA AON的長度選自⑴12至16個核苷酸之間；(ii) 13至15個核苷酸之間；以及(iii) 13個核苷酸。
13.權(quán)利要求11的tc-DNAA0N，其中所述SMN2 pre-mRNA中的所述非典型外顯子是外顯子7，并且所述末端莖-環(huán)是TSL2。
14.權(quán)利要求13的tc-DNAAON,其中所述tc-DNA AON包含核苷酸序列5’ -UUAAUUUAAGGAA-3’ (SEQ ID NO :6)，或者是 SMN2e7 (39 ；51) (SEQ ID NO 6)。
15.一種組合物，其用于促進(jìn)肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA加工期間外顯子的跳躍，所述組合物包含(a)含有10至18個三環(huán)核苷酸的三環(huán)DNA反義寡核苷酸(tc-DNAAON)，其中所述tc-DNA AON的8-16個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ)，其中所述tc-DNA AON的2-8個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子區(qū)互補(bǔ)，并且其中所述外顯子區(qū)與所述內(nèi)含子剪接供體位點毗連并位于其3’端；以及 (b)細(xì)胞遞送劑。
16.一種組合物，其用于促進(jìn)SMN2pre-mRNA加工期間包含非典型外顯子，所述組合物包含 (a)含有10至18個三環(huán)核苷酸的三環(huán)DNA反義寡核苷酸(tc-DNAAON)，其中所述tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的內(nèi)含子沉默序列(ISS)互補(bǔ)；以及 (b)細(xì)胞遞送劑。
17.一種組合物，其用于促進(jìn)SMN2 pre-mRNA加工期間包含非典型外顯子，所述組合物包含 (a)含有10至18個三環(huán)核苷酸的三環(huán)DNA反義寡核苷酸(tc-DNAA0N)，其中所述tc-DNA AON與SMN2 pre-mRNA的末端莖-環(huán)(TSL)互補(bǔ)；以及 (b)細(xì)胞遞送劑。
18.一種用于從肌養(yǎng)蛋白mRNA中消除突變的外顯子的方法，所述方法包含將表達(dá)肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的細(xì)胞與三環(huán)DNA反義寡核苷酸(tc-DNA AON)相接觸的步驟,所述tc-DNA AON含有10至18個三環(huán)核苷酸，其中所述tc-DNA AON的8_16個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子剪接供體位點互補(bǔ)，其中所述tc-DNA AON的2_8個核苷酸與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的外顯子區(qū)互補(bǔ)，并且其中所述外顯子區(qū)與所述內(nèi)含子剪接供體位點毗連并位于其3’端。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述tc-DNAAON的長度選自(i) 12至16個核苷酸之間；(ii) 13至15個核苷酸之間；以及(iii) 15個核苷酸。
20.權(quán)利要求18的方法，其中在所述肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA加工期間被跳過的外顯子是外顯子23。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述tc-DNAAON包含核苷酸序列5，-AACCTCGGCTTACCT-3，(SEQ ID NO : I)，或者是 M23D (+02-13) (SEQ ID NO :1)。
22.權(quán)利要求18的方法，其中在所述肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA加工期間被跳過的所述外顯子是外顯子51。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述tc-DNAAON包含選自5’-AGAAATGCCATCTTC-3’ (SEQID NO :2)、5’-AAATGCCATCTTCCT-3’ (SEQ ID NO :3)和 5’ -TGCCATCTTCCTTGA-3’ (SEQ IDNO 4)的核苷酸序列，或者是 H51 (+68+82) (SEQ ID NO :2)或 H51 (+70+84) (SEQ ID NO :3)或 H51 (+73+87)(SEQ ID NO :4)。
24.—種用于在SMN2 mRNA內(nèi)包含非典型外顯子的方法，所述方法包含將表達(dá)SMN2pre-mRNA的細(xì)胞與含有11至18個核苷酸的tc-DNA AON相接觸的步驟，其中所述tc-DNAAON與SMN2pre-mRNA的內(nèi)含子沉默序列(ISS)互補(bǔ)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述tc-DNAAON的長度選自(i) 12至16個核苷酸之間；(ii) 13至15個核苷酸之間；以及(iii) 15個核苷酸。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述SMN2pre-mRNA中的所述非典型外顯子是外顯子7。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述內(nèi)含子沉默序列是ISS-N1。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述tc-DNAAON包含核苷酸序列5’ -CUUUCAUAAUGCUGG-3’ (SEQ ID NO :5)，或者是 SMN2i7 (10 ；25) (SEQ ID NO :5)。
29.一種用于在SMN2 mRNA內(nèi)包含非典型外顯子的方法，所述方法包含將表達(dá)SMN2pre-mRNA的細(xì)胞與含有11至18個核苷酸的tc-DNA AON相接觸的步驟，其中所述tc-DNAAON與SMN2pre-mRNA的末端莖-環(huán)(TSL)互補(bǔ)。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述tc-DNAAON的長度選自(i) 12至16個核苷酸之間；(ii) 13至15個核苷酸之間；以及(iii) 13個核苷酸。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述SMN2pre-mRNA中的所述非典型外顯子是外顯子7。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述末端莖-環(huán)是TSL2。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述tc-DNAAON包含核苷酸序列5’ -UUAAUUUAAGGAA-3’ (SEQ ID NO :6)，或者是 SMN2e7 (39 ；51) (SEQ ID NO :6)。
34.一種用于治療患者的杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)的方法，所述方法包含向所述患者給藥三環(huán)DNA (tc-DNA)反義寡核苷酸(AON)的步驟； 其中所述tc-DNA AON包含與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子-外顯子接點互補(bǔ)的核苷酸序列； 其中所述內(nèi)含子-外顯子接點包含位于外顯子5’端的內(nèi)含子剪接供體位點； 其中所述外顯子與具有野生型核苷酸序列的外顯子相比，包含無義或移碼突變； 其中所述tc-DNA AON在所述肌養(yǎng)蛋白的pre-mRNA加工為成熟mRNA期間促進(jìn)所述外顯子的跳躍。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述tc-DNAAON的長度選自(i) 11至18個核苷酸之間，或(ii) 15個核苷酸。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述三環(huán)DNA寡核苷酸包含與內(nèi)含子內(nèi)的剪接供體位點互補(bǔ)的6至10個核苷酸。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述三環(huán)DNA寡核苷酸包含與所述外顯子內(nèi)的5’核苷酸互補(bǔ)的6至10個核苷酸。
38.權(quán)利要求34的方法，其中所述外顯子中的所述突變是無義突變或移碼突變。
39.一種用于治療患者的杜氏肌營養(yǎng)不良的方法，所述方法包含向所述患者給藥三環(huán)DNA寡核苷酸的步驟； 其中所述三環(huán)DNA寡核苷酸包含與肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA內(nèi)的內(nèi)含子-外顯子接點互補(bǔ)的核苷酸序列， 其中所述內(nèi)含子-外顯子接點包含所述肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA的內(nèi)含子51內(nèi)的剪接供體位點和相鄰?fù)怙@子51內(nèi)的5’核苷酸， 其中所述肌養(yǎng)蛋白pre-mRNA在所述外顯子51中包含突變，并且 其中所述三環(huán)DNA寡核苷酸能夠介導(dǎo)所述外顯子51的跳躍。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述內(nèi)含子-外顯子接點包含SEQID NO :1的序列。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述三環(huán)DNA寡核苷酸包含12至20個核苷酸。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述三環(huán)DNA寡核苷酸為15個核苷酸。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述外顯子51中的所述突變是無義突變或移碼突變。
44.權(quán)利要求39的方法，其中所述三環(huán)DNA寡核苷酸包含SEQID NO 2的序列。
45.一種三環(huán)DNA反義寡核苷酸(tc-DNA AON)，其用于促進(jìn)突變的DMl mRNA的破壞，所述tc-DNA AON包含12-21個三環(huán)核苷酸，其中所述tc-DNA AON與包含一個或多個3’CUG擴(kuò)增序列的突變的DMl mRNA互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNA AON能夠促進(jìn)所述DMlmRNA的RNaseH介導(dǎo)的破壞。
46.權(quán)利要求45的tc-DNAA0N，其中所述tc-DNA AON包含核苷酸序列5’ -CAG-3’的4至7個連續(xù)重復(fù)序列(SEQ ID NO :7)。
47.權(quán)利要求46的tc-DNAAON,其中所述tc-DNA AON包含核苷酸序列5，-CAGCAGCAGCAGCAG-3，(SEQ ID NO :8)。
48.權(quán)利要求47 的 tc-DNA A0N，其中所述 tc-DNA AON 是 DMl (CAG5) (SEQ ID NO 8)。
49.權(quán)利要求46的tc-DNAAON,其中所述tc-DNA AON包含核苷酸序列5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’ (SEQ ID NO :9)，或者是 DMl (CAG7) (SEQ ID NO :9)。
50.一種用于破壞細(xì)胞中包含一個或多個3’ CUG擴(kuò)增序列的DMl mRNA的方法，所述方法包含將所述細(xì)胞與含有12-21個三環(huán)核苷酸的tc-DNA AON相接觸的步驟，其中所述tc-DNA AON與包含一個或多個3’CUG擴(kuò)增序列的突變DMl mRNA互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNAAON能夠促進(jìn)所述DMl mRNA的RNAse H介導(dǎo)的破壞。
51.一種用于治療患者的Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的方法，所述方法包含向所述患者給藥包含12-21個三環(huán)核苷酸的tc-DNA AON的步驟，其中所述tc-DNA AON與包含一個或多個3’ CUG擴(kuò)增序列的突變DMl mRNA互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNA AON能夠促進(jìn)所述DMlmRNA的RNAse H介導(dǎo)的破壞。
52.一種用于矯正對象的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中異?；虮磉_(dá)的方法，所述方法包含向?qū)ο蠼o藥tc-DNA反義寡核苷酸，其中所述tc-DNA反義寡核苷酸與所述基因編碼的RNA的一部分互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNA反義寡核苷酸以足以矯正所述異常表達(dá)的量外周給藥于對象。
53.一種用于治療由對象中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異?；虮磉_(dá)引起的遺傳疾病的方法，所述方法包含向?qū)ο蠼o藥tc-DNA反義寡核苷酸，其中所述tc-DNA反義寡核苷酸與所述基因編碼的RNA的一部分互補(bǔ)，并且其中所述tc-DNA反義寡核苷酸以有效矯正所述異常表達(dá)的量外周給藥于對象。
54.一種包含tc-DNA反義寡核苷酸的藥物組合物，其中所述tc-DNA反義寡核苷酸與人類基因編碼的RNA的一部分互補(bǔ)，并且其中所述組合物還包含可藥用的賦形劑。
55.—種包含tc-DNA反義寡核苷酸的藥物組合物，其用于治療由對象中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異?；虮磉_(dá)引起的遺傳疾病，所述tc-DNA反義寡核苷酸與所述基因編碼的RNA的一部分互補(bǔ)，并且所述tc-DNA反義寡核苷酸以有效矯正所述異常表達(dá)的量外周給藥于對象。
56.權(quán)利要求52的方法，其中所述異?；虮磉_(dá)導(dǎo)致神經(jīng)肌肉或肌肉骨骼病癥。
57.權(quán)利要求53的方法，其中所述疾病是神經(jīng)肌肉或肌肉骨骼病癥。
58.—種tc-DNA A0N，其用于神經(jīng)肌肉或肌肉骨骼疾病的治療。
59.權(quán)利要求58的tc-DNAA0N，其中神經(jīng)肌肉或肌肉骨骼疾病源自于基因的改變，其中所述改變是 外顯子的框內(nèi)突變；破壞基因的翻譯閱讀框的突變，并且所述tc-DNA促進(jìn)外顯子的跳躍以便恢復(fù)閱讀框； 能夠通過在由所述基因編碼的mRNA中包含非典型外顯子來補(bǔ)償?shù)挠泻ν蛔?，并且所述tc-DNA與所述基因編碼的pre-mRNA中存在的ISS或TSL互補(bǔ)并促進(jìn)非典型外顯子的包含；或者 導(dǎo)致在所述基因編碼的mRNA中出現(xiàn)有害的3 ’ CUG擴(kuò)增序列的突變。
60.權(quán)利要求59的tc-DNAAON，其中所述改變是外顯子的框內(nèi)突變，所述tc-DNA促進(jìn)所述外顯子的跳躍。
61.權(quán)利要求59的tc-DNAAON，其中所述改變是破壞基因的翻譯閱讀框的突變，所述tc-DNA促進(jìn)外顯子的跳躍以便恢復(fù)所述基因的閱讀框。
62.權(quán)利要求59的tc-DNAAON，其中所述改變是能夠通過在由所述基因編碼的mRNA中包含非典型外顯子來補(bǔ)償?shù)挠泻ν蛔?，并且所述tc-DNA AON(i)與所述基因編碼的pre-mRNA中存在的ISS或TSL補(bǔ)，并且(ii)促進(jìn)非典型外顯子的包含。
63.權(quán)利要求59的tc-DNAA0N，其中所述改變是導(dǎo)致在所述基因編碼的mRNA中出現(xiàn)有害的3' CUG擴(kuò)增序列的突變，并且所述tc-DNA AON破壞含有所述擴(kuò)增序列的mRNA。
64.權(quán)利要求52至54任一項的方法,其中所述異?；虮磉_(dá)源自于 外顯子的框內(nèi)突變； 破壞基因的翻譯閱讀框的突變，并且tc-DNA促進(jìn)外顯子的跳躍以便恢復(fù)閱讀框； 能夠通過在由所述基因編碼的mRNA中包含非典型外顯子來補(bǔ)償?shù)挠泻ν蛔?，并且所述tc-DNA與所述基因編碼的pre-mRNA中存在的ISS或TSL補(bǔ)并促進(jìn)非典型外顯子的包含；或者 導(dǎo)致在所述基因編碼的mRNA中出現(xiàn)有害的3 ’ CUG擴(kuò)增序列的突變。
65.權(quán)利要求52或53的方法或權(quán)利要求58的應(yīng)用，其中所述tc-DNA反義寡核苷酸如權(quán)利要求I至14和45至49任一項所限定。
全文摘要
本發(fā)明提供了三環(huán)DNA(tc-DNA)AON以及利用tc-DNA AON調(diào)節(jié)pre-mRNA加工期間發(fā)生的剪接事件的方法。描述了三環(huán)DNA(tc-DNA)AON，其可用于在pre-mRNA加工期間促進(jìn)外顯子跳躍或掩蔽內(nèi)含子沉默序列和/或末端莖-環(huán)序列，并引導(dǎo)RNase介導(dǎo)的加工后mRNA的破壞。本文描述的Tc-DNA AON，通過跳過肌養(yǎng)蛋白基因內(nèi)突變的外顯子23或外顯子51以恢復(fù)肌養(yǎng)蛋白的功能性，可用于杜氏肌營養(yǎng)不良的治療方法中；通過掩蔽SMN2基因中的內(nèi)含子沉默序列和/或末端莖-環(huán)序列，以產(chǎn)生包含由外顯子7編碼的氨基酸序列的修飾的功能性SMN2蛋白，能夠至少部分補(bǔ)充無功能SMN1蛋白，從而可用于脊髓性肌萎縮的治療方法中；并且通過引導(dǎo)對包含3’-末端CUG重復(fù)序列的突變DM1 mRNA的破壞，可用于Steinert肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的治療方法中。
文檔編號A61K31/712GK102625840SQ201080022376
公開日2012年8月1日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者丹尼爾·舒佩利, 丹尼斯·弗靈, 克里斯蒂安·盧曼, 托馬斯·沃伊特, 路易斯·加西亞 申請人:伯爾尼大學(xué), 巴黎第六大學(xué), 法國國家科學(xué)研究中心, 肌肉學(xué)研究協(xié)會