專利名稱：：抗病毒免疫的方法和組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明通常涉及部分糖基化的病毒多肽，其用于產(chǎn)生可有效抗病毒的有效的、廣泛反應性的免疫原性組合物。具體而言，本發(fā)明涉及利用單糖基化的流感病毒血凝素(HA)肽產(chǎn)生的疫苗，該疫苗表現(xiàn)出抗流感病毒的有效活性。本發(fā)明涉及包含糖蛋白的藥物組合物和由其產(chǎn)生的疫苗，以及涉及利用去糖基化的HA多肽預防和治療流感病毒感染的方法。
背景技術：
：在真核生物中，糖殘基通常與四種不同的氨基酸殘基連接。這些氨基酸殘基被分成0-連接的(絲氨酸、蘇氨酸和羥基賴氨酸)和N-連接的(天冬酰胺)。0-連接的糖在高爾基體或糙面內(nèi)質網(wǎng)(ER)中由核苷酸糖合成。N-連接的糖由共同的前體合成，然后被加工。已知添加N-連接的碳水化合物鏈對于糖蛋白的折疊穩(wěn)定、防止在內(nèi)質網(wǎng)中降解、寡聚化、生物學活性和運輸至關重要。將N-連接的寡糖添加到特定的Asn殘基在調節(jié)病毒成熟蛋白的活性、穩(wěn)定性或抗原性中起著重要作用(OpdenakkerG.etalFASEBJournal7,1330-13371993)。還認為N-連接的糖基化是糖蛋白的折疊、運輸、細胞表面表達、分泌(Helenius,A.,MolecularBiologyoftheCell5,253-2651994)、保護免受蛋白水解降解和增加糖蛋白溶解性(Domsetal.,Virology193,545-5621993)所必需的。病毒的表面糖蛋白不僅是蛋白正確折疊所必需的，而且還作為“聚糖盾牌”提供針對中和抗體的保護。因此，強烈的宿主特異性選擇通常與可能的N-連接糖基化的密碼子位置相關。因此N-連接的糖基化位點在菌株和進化枝間趨向于保守。有三種主要類型的流感病毒:甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒菌株能導致嚴重的疾病，并且是能導致人類流行性的唯一類型。H5N1菌株是甲型流感病毒。乙型菌株導致偶發(fā)的人類病癥和小規(guī)模的爆發(fā)。丙型菌株僅很少導致人類感染，并且不會導致大規(guī)模的爆發(fā)。在甲型流感病毒中，只有H1、H2和H3亞型易于在人類之間傳播。甲型流感病毒的爆發(fā)持續(xù)引起世界范圍內(nèi)的廣泛的發(fā)病率和死亡率。僅美國，估計每年就有5%至20%的人口受到甲型流感病毒的感染，導致大約200，000人住院和36，OOO人死亡。廣泛的疫苗接種策略的建立是限制流感發(fā)病率的有效措施。然而，病毒頻繁的遺傳漂移需要每年都要重新配制疫苗，這可能會導致疫苗中存在的病毒菌株和流通的病毒菌株之間發(fā)生錯配。因此，針對流感病毒的抗病毒療法是限制疾病嚴重性和傳播的重要工具。自從2003年至今，高致病性H5N1流感病毒已在家禽和野生禽類中引起爆發(fā)(LiKSetal.(2004)Nature430:209-213)。自2010年2月起，這些病毒不僅感染了禽類而且還感染了超過478個人,其中286例被證實是致命的(www.who,int/csr/disease/avianinfluenza/country/casestable20100217/en/index,html)。高致病性H5N1和2009豬源性甲型流感(HlNl)病毒導致全球爆發(fā)，并引起對病毒中可能發(fā)生的其他改變會導致致命的流行性的強烈關注(GartenRJ,etal.(2009)Science325:197-201,NeumannG，etal.(2009)Nature459:931-939)。更關注流感病毒可能會獲得在人之間有效傳播的能力，進而成為流行性威脅。流感疫苗因而一定是任何流行性應對計劃不可或缺的部分。流感病毒被劃分為負鏈RNA病毒，且屬于正粘病毒家族。甲型流感病毒由9種結構蛋白組成，并額外編碼一種具有調節(jié)功能的非結構NSl蛋白。非結構NSl蛋白在生殖周期過程中大量合成，并定位在受感染細胞的胞液和細胞核中。在不同的病毒菌株混合感染細胞的過程中，病毒基因組的節(jié)段性特性允許發(fā)生遺傳重組機制(基因組節(jié)段的交換)。根據(jù)展示在其表面上的不同的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)病毒蛋白，可進一步將甲型流感病毒分類成不同的亞型。甲型流感病毒亞型通過兩種病毒表面糖蛋白來鑒定，即血凝素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N)。每種流感病毒亞型通過其H和N蛋白的組合來鑒定。有16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。甲型流感病毒可以感染人、禽、豬、馬和其他動物，但是野生禽類是這些病毒的天然宿主。目前只有一些甲型流感亞型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人之間傳播，但是16種H亞型和9種NA亞型的所有組合均在禽類中，尤其在野生水鳥和濱鳥中鑒定到。此外，越來越多的證據(jù)表明H5和H7流感病毒還可以弓I起人類疾病。甲型流感病毒的HA包含兩段結構不同的區(qū)域，即球狀頭區(qū)和莖區(qū)。球狀頭區(qū)包含受體結合位點，其負責病毒附著于靶細胞和參與HA的血細胞凝集活性。莖區(qū)包含融合肽，其是病毒包膜和細胞內(nèi)體膜之間的膜融合所必需的，并因此涉及融合活性(Wileyetal.，Ann.Rev.Biochem.，56:365-394(1987))。對了解流感感染的重要貢獻來自對血凝素(HA)的研究，血凝素是與呼吸道中的特定唾液酸化的聚糖受體結合，從而允許病毒進入細胞的病毒衣殼糖蛋白(KuikenT，etal.(2006)Science312:394-397；MainesTR,etal.(2009)Science325:484-487；SkeheIJJ,WileyDC(2000)AnnRevBiochem69:531-569；vanRielD,etal.(2006)Science312:399-399)。為了跨越物種障礙和感染人群，禽類HA必須改變其受體結合偏好性，從包含a2，3(禽類)-連接的唾液酸基序的末端唾液酸化的聚糖變成包含a2，6(人類)-連接的唾液酸基序(ConnorRJ,etal.(1994)Virology205:17-23)，并且如同在1918年的流行性中(TumpeyTM,etal.(2007)Science315:655-659),該轉變可能僅通過兩次突變而發(fā)生。因此，了解影響流感病毒與聚糖受體結合的因素是開發(fā)控制具有流行性潛能的流感菌株在將來可發(fā)生任何轉型的方法的關鍵。為了滿足制備能誘導抗H5N1流感病毒不同菌株的有效中和抗體的候選流感疫苗的需要，基于共有H5N1血凝素(HA)序列的疫苗能誘發(fā)中和一組已用多種H5N1進化枝的HA進行假性處理的病毒體的抗體。(ChenMW,etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:13538-13543)。HA是同源三聚體跨膜蛋白，具有由球狀頭區(qū)和莖區(qū)組成的胞外結構域(KuikenT,etal.(2006)Science312:394-397)。兩個區(qū)域均攜帶N-連接的寡糖(KeilW，etal.(1985)EMBOJ4:2711-2720)，該寡糖影響HA的功能特性(ChenZY,etal.(2008)Vaccine26:361-371；OhuchiR,etal.(1997)JVirol71:3719-3725)。在甲型流感病毒的不同亞型中，頭區(qū)的糖基化位點有廣泛的變異，而莖區(qū)的寡糖更保守，且為融合活性所需(OhuchiR，etal.(1997)JVirol71:3719-3725)?？乖谋砦桓浇木厶歉蓴_抗體識別(SkehelJJ,etal.(1984)ProcNatlAcadSciUSA81:1779-1783)，HA的蛋白水解激活位點附近的聚糖調節(jié)切割，并影響流感病毒的感染力(DeshpandeKL,etal.(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:36-40)。HA糖基化位點的突變?nèi)笔苡绊懖《镜氖荏w結合(GuntherI，etal.(1993)VirusRes27:147-160)。糖基化位點處或附近的肽序列的改變可以改變HA的3D結構，并因此改變其受體結合特異性和親和力。的確，來自不同H5N1亞型的HA具有不同的聚糖結合模式(StevensJ，etal.(2008)JMolBiol381:1382-1394)。在整個病毒系統(tǒng)中研究了Hl和H3上的糖基化位點的誘變(ChandrasekaranA,etal.(2008)NatBiotechnol26:107-113；DeomCM,etal.(1986)ProcNatlAcadSciUSA83:3771-3775)。然而，還不了解糖基化的改變?nèi)绾斡绊懯荏w結合特異性和親和力，尤其對于大多數(shù)致病性H5N1HA來說。自從制備出來開始，流感疫苗必須每年都改變，因為，血凝素的非高糖基化區(qū)域或非糖基化區(qū)域一直在突變以逃避宿主的免疫系統(tǒng)。針對異源病原體的疫苗設計的目標是鑒定和設計有效且廣泛保護性的抗原。就流感而言，過去大量的工作針對保守線性序列和區(qū)域的實驗測定，但是成績較小。導致這些失敗的可信服的理由是有關這方面知識的缺乏，即在真正感染的條件下，針對抗原性測試顆粒的集中應答是用于中和病原體上的抗原的真正有效的位點。發(fā)明概述具體而言，需要可在疫苗產(chǎn)生過程的設計和確認中使用的交叉中和單克隆抗體，所述設計和確認維持或增強目前和將來制備的疫苗中的交叉中和表位的質量和抗原性。假設與疫苗結合的抗體反映出結構完整性和抗原潛能，可以評價交叉中和抗體，例如去糖基化的HA多肽與這種疫苗加工衍生物的結合，從而定量地評價它們的交叉中和潛能。為了使對這些通用表位的應答最大化，可以制備衍生物，以增強對這些通用表位的免疫原性。按照本發(fā)明，公開了利用這些原理的疫苗。抗原通過以下產(chǎn)生:從病毒糖蛋白部分地去除糖以暴露糖基化位點(其是高度保守的，并且不會突變或不會激烈突變)，同時保留足夠的糖，以保持所述糖蛋白的三級結構。部分糖基化的病毒糖蛋白通過所述糖蛋白的部分去糖基化，使得特定糖基化位點保留一個、兩個或三個糖單元而產(chǎn)生。在某些方面，可以通過在一個或多個特定糖基化位點提供去糖基化的蛋白或多肽，并使該糖基化位點連接一個、兩個或三個糖來產(chǎn)生部分糖基化的糖蛋白。公開了包含至少一種部分糖基化的HA、NA或M2糖蛋白和藥物可接受的載體的疫苗。在一些實施方案中，所述部分糖基化的HA糖蛋白選自部分糖基化的流感病毒H1、H3和H5。在一些實施方案中，所述部分糖基化的HA糖蛋白是在H5HA的第39位、第127位、第170位、第181位、第302位、第495位和第500位的一個或多個位置中的天冬酰胺殘基處糖基化。在一些實踐中，所述天冬酰胺殘基位于第177位。公開了包括向易患流感的個體給予疫苗的方法，所述疫苗包含至少一種去糖基化的HA糖蛋白和藥物可接受的載體。在一些實施方案中，所述去糖基化的HA糖蛋白選自H1、H3和H5。在一些實施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一個或多個糖基化位點保留單糖基化(留下I個糖)。在一些實施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一個或多個糖基化位點保留二糖基化(留下2個糖)。在一些實施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一個或多個糖基化位點保留三糖基化(留下3個糖)。在一些實施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的至少一個糖基化位點保留單糖基化、二糖基化和三糖基化中的至少一種。本發(fā)明涉及用于引發(fā)對病毒、細菌、真菌或其他來源的病原體的免疫應答的免疫原性組合物，所述組合物包含:來自病毒、細菌、真菌或其他來源的病原體的抗原糖蛋白，其中所述糖蛋白是部分糖基化的。在一些方面中，所述病原體是病毒，且所述部分糖基化的抗原是病毒、病毒樣顆粒、病毒肽、蛋白、多肽、或來自病毒的片段、或部分包含病毒蛋白序列的融合蛋白。所述病毒選自流感病毒、呼吸道合胞體病毒(RSV)、衣原體、腺病毒科、哺乳動物腺病毒屬、禽腺病毒屬、皰疫病毒科、單純皰疫病毒1、單純皰疫病毒2、單純皰疫病毒5、單純皰疫病毒6、光滑病毒科、輕小病毒屬、腸桿菌曬菌體MS2、allolevirus、痘病毒科、脊椎動物痘病毒亞科、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬、軟疣痘病毒屬、昆蟲痘病毒亞科、乳頭多瘤空病毒科、多瘤病毒屬、乳頭多瘤空病毒屬、副粘病毒科、副粘病毒屬、副流感病毒1、麻疹病毒屬、麻疹病毒、腮腺炎病毒屬、腮腺炎病毒、肺病毒亞科、肺病毒屬、偏肺病毒屬、禽肺病毒屬、人類偏肺病毒屬、小核糖核酸病毒科、腸病毒屬、鼻病毒屬、肝病毒屬、人類甲型肝炎病毒、心病毒屬、andapthovirus>呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬、環(huán)狀病毒屬、輪狀病毒屬、質型多角體病毒屬、斐濟病毒屬、植物呼腸孤病毒屬、水稻病毒屬、逆轉錄病毒科、B型哺乳動物逆轉錄病毒屬、C型哺乳動物逆轉錄病毒屬、C型鳥逆轉錄病毒屬、D型逆轉錄病毒組、BLV-HTLV轉錄病毒屬、慢病毒屬、人類免疫缺陷病毒1、人類免疫缺陷病毒2、HTLV-1和HTLV-1I病毒、SARS冠狀病毒屬、單純皰疹病毒、EB病毒、巨細胞病毒屬、肝炎病毒(HCV、HAV、HBV、HDV、HEV)、剛地弓形蟲病毒、梅毒螺旋體病毒、人類T淋巴細胞病毒、腦炎病毒、西尼羅病毒、登革病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、麻疹、腮腺炎、風疹、泡沫病毒屬、黃病毒屬科、丙型肝炎病毒、肝DNA病毒科、乙型肝炎病毒、披膜病毒科、甲病毒屬辛德比斯病毒、風疫病毒屬、風疫病毒、彈狀病毒科、水皰性病毒屬、狂犬病病毒屬、短暫熱病毒屬、質型彈狀病毒屬、核型彈狀病毒屬、沙粒病毒科、沙粒病毒屬、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、伊派病毒、拉沙病毒、冠狀病毒科、冠狀病毒屬和凸隆病毒屬。病毒肽、蛋白、多肽或其片段選自流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒血凝素、人類呼吸道合胞體病毒(RSV)病毒蛋白、RSVF糖蛋白、RSVG糖蛋白、單純皰疹病毒(HSV)病毒蛋白、單純皰疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE、衣原體MOMP和PorB抗原、登革病毒的核心蛋白、基質蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素、單純皰疹病毒2型糖蛋白gB、脊髓灰質炎病毒IVPUHIVl的包膜糖蛋白、乙型肝炎表面抗原、白喉毒素、鏈球菌24M表位、淋球菌菌毛蛋白、偽狂犬病病毒g50(gpD)、偽狂犬病病毒II(gpB)、偽狂犬病病毒III(gpC)、偽狂犬病病毒糖蛋白H、偽狂犬病病毒糖蛋白E、傳染性胃腸炎糖蛋白195、傳染性胃腸炎基質蛋白、豬輪狀病毒屬糖蛋白38、豬細小病毒衣殼蛋白、豬密螺旋體痢疾保護性抗原、牛病毒性腹瀉糖蛋白55、新堡病病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶、豬流感血凝素、豬流感神經(jīng)氨酸酶、口蹄疫病毒、豬霍亂病毒、豬流感病毒、非洲豬瘟病毒、豬肺炎支原體、傳染性牛鼻氣管炎病毒、傳染性牛鼻氣管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白1、拉克羅斯病毒的糖蛋白、新生犢牛腹瀉病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、龐塔托魯病毒、鼠白血病病毒、小鼠乳腺瘤病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或以上蛋白的片段或衍生物、馬流感病毒或馬皰疹病毒的抗原(包括甲型馬流感病毒/阿拉斯加株91神經(jīng)氨酸酶、甲型馬流感病毒/邁阿密株63神經(jīng)氨酸酶、甲型馬流感病毒/肯塔基株81神經(jīng)氨酸酶、馬皰疹病毒I型糖蛋白B和馬皰疹病毒I型糖蛋白D)、牛呼吸道合胞體病毒或牛副流感病毒的抗原、牛呼吸道合胞體病毒附著蛋白(BRSVG)、牛呼吸道合胞體病毒融合蛋白(BRSVF)、牛呼吸道合胞體病毒核殼體蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3型融合蛋白、牛副流感病毒3型血凝素神經(jīng)氨酸酶、牛病毒腹瀉病毒糖蛋白48和糖蛋白53、登革病毒糖蛋白E和人類丙型肝炎病毒的糖蛋白El或E2。在一些方面中，所述去糖基化的病毒抗原是單、二或三糖基化的流感病毒血凝素。在一些實施方案中，所述去糖基化的病毒抗原是選自流感病毒H1、H3和H5的單糖基化的血凝素。在一些實施方案中，所述單糖基化的流感病毒血凝素包含N-糖基化位點，所述N-糖基化位點包含天冬酰胺-Xaa-絲氨酸和天冬酰胺-Xaa-蘇氨酸的的氨基酸序列，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。在一些方面中，在糖基化位點包含單個GlcNAc糖的單糖基化的血凝素對于HA-受體結合展現(xiàn)出特異性降低，但是親和力增高。在一些實施方案中，所述去糖基化的病毒抗原是用N-乙酸匍糖胺(GlcNAc)和/或甘露糖二糖基化或三糖基化的流感病毒血凝素。在一些方面中，所述去糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)糖基化的單糖基化的流感病毒血凝素。在一些方面中，所述單糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQIDN0:4)的多肽。在一些實施方案中，所述單糖基化的共有H5HA序列(SEQIDNO:4)在第39位、第170位、第181位、第302位和第495位的一個或多個天冬酰胺殘基處糖基化。在其他方面中，所述單糖基化的流感病毒血凝素包含選自NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)序列(SEQIDNO:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1_C(SEQIDNO:10)序列的Hl多肽序列。在一些實施方案中，所述HA序列被修飾，以便能在合適的真核細胞中表達。在一實施方案中，所述單糖基化的流感病毒血凝素包含季節(jié)性Hl(布里斯班株)多肽。本發(fā)明還涉及包含免疫原性多肽并任選地包含佐劑的疫苗，所述免疫原性多肽包含去糖基化至單糖基化、二糖基化或三糖基化狀態(tài)的病毒糖蛋白，其中所述疫苗能誘發(fā)抗呼吸病毒的免疫應答。在一些實施方案中，所述呼吸病毒是流感病毒，且病毒糖蛋白是血凝素(HA)。在一些方面中，所述流感病毒選自禽流感病毒和季節(jié)性流感病毒。在一些實施方案中，所述禽流感病毒是H5N1。在一些實施方案中，所述流感病毒是甲型流感病毒。一方面，所述病毒是呼吸道合胞體病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的單糖基化、二糖基化或三糖基化的RSVF(融合)，G(附著)，或其免疫原性片段。在一些實施方案中，所述單糖基化的RSVG蛋白序列(SEQIDNO:12)是在表6所示的一個或多個可能的N-糖基化位點的天冬酰胺殘基處被部分糖基化。—方面，所述病毒是黃病毒屬，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。在一些實施方案中，所述單糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQIDNO:13)是在表7所示的N-糖基化位點N67和N153中的一個或多個的天冬酰胺殘基處被部分糖基化。一方面，所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。在一些實施方案中，所述單糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白El(SEQIDNO:14)是在表8所示的N-糖基化位點N196、N209、N234、N305和N325中的一個或多個的天冬酰胺殘基處被部分糖基化。一方面，其中所述病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。在一些實施方案中，所述單糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20(SEQIDNO:15)是在表9所示的一個或多個可能的N-糖基化位點的天冬酰胺殘基處被部分糖基化。本發(fā)明還涉及包含流感HA多肽和藥物可接受的載體的疫苗組合物，其中所述流感HA多肽被去糖基化至單糖基化狀態(tài)，并且其中一旦將所述單糖基化的HA多肽引入個體，所述多肽誘導所述個體產(chǎn)生與流感病毒結合的抗體。在一些方面中，將單糖基化的HA多肽引入個體導致所述個體產(chǎn)生中和季節(jié)性流感病毒和禽流感病毒兩者的抗體。在一實施方案中，所述單糖基化的流感病毒血凝素包含季節(jié)性Hl(布里斯班株)HA多肽，并且一旦將所述單糖基化的HA多肽引入個體，所述Hl(布里斯班株)HA多肽誘導所述個體產(chǎn)生中和NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)流感病毒的抗體。在另一施方案中，所述單糖基化的流感病毒血凝素包含NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)多肽，并且一旦將所述單糖基化的HA多肽引入個體，所述NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)多肽誘導所述個體產(chǎn)生中和季節(jié)性Hl(布里斯班株)HA流感病毒的抗體。在一些方面中，所述疫苗還包含佐劑，其可以選自氫氧化鋁、磷酸鋁、氫氧化鋁和磷酸鋁兩者、弗氏不完全佐劑(IFA)、角鯊烯、角鯊烷、明礬和MF59。本發(fā)明涉及對哺乳動物進行抗病毒呼吸道感染免疫的方法，所述方法包括:向易受呼吸病毒感染的哺乳動物給予包含免疫原性多肽的疫苗，所述免疫原性多肽包含去糖基化至單糖基化、二糖基化或三糖基化狀態(tài)的病毒糖蛋白，其中所述疫苗能誘發(fā)抗呼吸病毒的免疫應答。在一些實施方案中，所述呼吸病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是血凝素(HA)?？梢酝ㄟ^腸胃外給藥、吸入方式、鼻內(nèi)給藥、且有時通過預防性給藥來給予所述疫苗。在一些方面中，所述疫苗引起抗流感病毒菌株的免疫應答，所述流感病毒菌株與從中選擇去糖基化的病毒糖蛋白的來源流感病毒菌株不同。在一些實施方案中，所述去糖基化的病毒糖蛋白是單糖基化的流感血凝素(HA)。本發(fā)明提供了有效抗甲型流感病毒的疫苗。在一實施方案中，所述疫苗包含在功能上模擬本文所述分子的中和表位的肽或多肽。在另一實施方案中，所述疫苗有效抗包含肽或多肽的病毒抗原，所述肽或多肽在功能上模擬本文所述分子的中和表位。在一實施方案中，所述病毒抗原來自流感病毒或HIV-1或HIV-2病毒或諸如登革病毒或丙型肝炎病毒的黃病毒屬。在另一實施方案中，所述疫苗是有效抗甲型流感病毒的疫苗，包含在功能上模擬本文所述分子的中和表位的肽或多肽。在一實施方案中，所述分子是抗體。在另一實施方案中，所述抗體結合HA抗原。在另一實施方案中，所述HA抗原是H5亞型。在另一實施方案中，所述HA抗原是Hl亞型。在另一實施方案中，所述抗原展示在甲型流感病毒的表面。在另一實施方案中，所述肽或多肽包含引發(fā)中和抗體的抗原決定簇。這些和其他方面從下面對優(yōu)選實施方案的描述中結合下列附圖變得明顯，但是其中的各種改變和修改都可以的，只要不脫離本公開的新概念的實質和范圍。附圖簡要說明以下的附圖形成本說明書的一部分，并且被包括以進一步展示本公開的某些方面，通過參考一幅或多幅這些圖片并結合本文提供的具體實施方案的詳細描述可以更好地理解本發(fā)明。圖1A-1C顯示不同糖基化的HA的圖解概述和圓二色光譜。(圖1A)不同糖基化的HA的四種變體:HAfg，在HEK293E細胞中表達的具有典型復合型N-聚糖的HA(共有序列(ChenMW,etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:13538-13543)；HAds,NA處理的導致從HAfg去除唾液酸的HA-Mhm,在GnT1-HEK293S細胞中表達的具有高甘露糖型N-聚糖的HA；以及HAmg，EndoH處理的在N-糖基化位點僅具有GlcNAc的HA。(圖1B)在其N-糖基化位點連接不同N-聚糖的HAfPHAdPHAhl^PHAmg的結構代表。蛋白結構用ProteinDataBankIDcode2FK0(Viet04HA)產(chǎn)生，顏色為灰色，并且N-連接的聚糖顯示為綠色。所有的N-聚糖均通過GlyProt(Bohne-LangA,etal.(2005)NucleicAcidsRes33:W214-ff219)被模式化，并且圖形由PyMOL(www.pymol.0rR)生成。(圖1C)HAfg、HAds、HAhm和HAmg的圓二色性光譜顯示，不同糖基化的四種HA蛋白的二級結構是相似的。圖2A-2B顯示不同糖基化的HA的聚糖微陣列分析。(圖2A)顯示HA變體HAfg、HApHAta^PHAmg的聚糖微陣列譜型。聚糖的相關連接按顏色進行分組，主要為17種a2，3唾液酸苷(黃色)或7種a2，6唾液酸苷(藍色)。陣列上聚糖的結構顯示在圖2B中。用HA變體響應a2，3唾液酸苷1-15的Ka,surf值來顯示HA變體HAfg、HAds,HAhm和HAmg的締合常數(shù)。圖3顯示自從2000年開始，最近的HAHl、H3和H5的布里斯班株Hl，加利福尼亞株H1、H3和H5的序列比對。季節(jié)性流感HA來自A/布里斯班株/59/2007。流行性流感HA來自A/加利福尼亞株/07/2009。H5來自A/越南株/1203/2004。H3來自A/布里斯班株/10/2007。以紅框顯示H5HA上的N-糖基化位點。比較顯示Hl和H5HA在其N-糖基化位置之間的相似性，而H3具有保守性較小的糖基化位置，且不同于Hl和H5。圖4A-4F顯示來自于HA聚糖相互作用的糖或修飾的結合能貢獻，所述HA聚糖相互作用響應于不同糖基化的HA。這些值通過減去所示的參照聚糖(以紅框突出；參見表S3)的AG值得到。(圖4A)聚糖2、3、6和8-10具有與二糖聚糖I相同的主鏈，而僅在非還原末端的第三個糖不同。計算出AAG值以顯示由于改變第三個糖而結合能的差異。(圖4B)聚糖10-12和15具有與二糖聚糖8相同的主鏈，但是由于線性延長糖結構上或增加分支糖而不同。(圖4C)聚糖4和5具有與三糖聚糖3相同的主鏈，但是在非還原末端第三位的分支海藻糖或硫酸鹽基團上不同。(圖4D)聚糖6和7在聚糖7的非還原末端第三位的硫酸鹽基團上不同。(圖4E)聚糖13和14是a2，3二天線唾液酸苷，但是在內(nèi)部糖的改變上不同。(圖4F)聚糖16和17和a2，6唾液酸苷(第21-27號)對HA表現(xiàn)出很少的結合或不結合圖5A-顯示HAfg和HAmg作為疫苗的比較。(圖5A)用ELISA分析來自HAfg和HAmg的抗血清與各種HA之間的結合。與HAfg抗血清相比，HAmg抗血清表現(xiàn)出更好地對H5(越南株1194/2004和CHA5)的結合。此外，HAmg抗血清還與Hl(加利福尼亞株07/2009和WSN)結合。(圖5B)用HAfg和HAmg抗血清對H5N1(NIBRG-14)病毒的微量中和。與HAfg抗血清相t匕，HAmg抗血清表現(xiàn)出更好的對MDCK細胞抗流感病毒感染的中和活性(P<0.0001)。(圖5C)對H5N1病毒致死劑量激發(fā)的疫苗保護。用HA蛋白疫苗HAfg、HAmg和對照PBS的兩次注射免疫BALB/c小鼠。免疫的小鼠用致死劑量的H5N1(NIBRG-14)病毒通過鼻內(nèi)激發(fā)。激發(fā)后，記錄存活持續(xù)14天。(圖5D)通過ELISA進行的來自HAmg的兔抗血清與不同HA的結合?？笻Amg的兔抗血清表現(xiàn)出與H5(CHA5和越南株/1194)的強烈結合。此外，還觀察到與H5(安徽株和ID5/2005)和Hl(新喀里多尼亞株/1999)的相互作用。圖6A-6C顯示H5HA蛋白的構建、純化和凝膠過濾色譜分析。(圖6A)將編碼具有改變切割位點的HA的胞外域的DNA克隆進哺乳動物表達載體，pTT(DuroCherY，etal.(2002)NucleicAcidsRes30:E9)中，從而允許從HEK293細胞培養(yǎng)物有效分泌HA蛋白。HA的原始蛋白酶切割位點被突變成PQRERG，以避免HAO加工成HAl和HA2。為了穩(wěn)定HA蛋白的三聚體構象，將噬菌體三聚片段“折疊子(foldon)”序列工程改造進質粒構建體，并將組氨酸標簽添加到COOH末端，用于純化目的。用表達載體的瞬轉進行HA蛋白的表達。(圖6B)用SDS/PAGE分析純化的HA蛋白。Mindicates標志物。泳道1:HAfg，從293E細胞純化的HA;泳道2=HAds,通過NA消化的HAfg;泳道3=HAhm,從293S細胞純化的HA(ReevesPJ,etal.(2002)ProcNatlAcadSciUSA99:13419-13424);泳道4=HAnig，通過EndoH消化的HAta。(圖6C)通過凝膠過濾色譜法分析HA純化的蛋白。凝膠過濾后的洗脫峰顯示HAfg三聚體>200kDa(紅線)，HAds三聚體>200kDa(黑線)，HAhm三聚體>200kDa(藍線)和HAnig三聚體>180kDa(綠線)。圖顯示了覆蓋有蛋白標志物(虛線)的HA蛋白的疊加洗脫圖譜。圖7A-7C顯示來自不同HA蛋白的過甲基化的N-聚糖的質譜分析。來自不同HA蛋白的過甲基化的N-聚糖的MS分析。(圖7A)MALD1-MS圖譜顯示，HEK293E所表達的HA的N-聚糖主要包含核心巖藻糖化的、二天線、三天線和四天線復合型N-聚糖結構，這解釋了所檢測到的主峰并列于表SI。分配基于組成，僅有有限的幾個進一步通過MS/MS分析來證實。不同程度的唾液酸化是主要特征。(圖7B)用NA處理，指定為唾液酸化N-聚糖的所有的信號(例如m/z2605、3054、3503、3864、4226)都不再能檢測到，伴隨非唾液酸化的三天線和四天線結構(m/z2693,3142)的信號強度增加，這與唾液酸的完全去除完全相符。(圖7C)來源于GnTIn缺陷型HEK293S菌株所表達的HA的N-聚糖的MALD1-MS圖譜顯著性地顯示出，對應于m/z1579處的Man5GlcNAc2的信號，伴隨糖基化途徑中不完全平衡的高甘露糖型N-聚糖(m/z1783至2396；Hex6HexNAc2-Hex9HexNAc2)的最小峰。圖8A-8D顯示對HA變體的MALD1-T0F分析。(圖8A)HAfg的分子量是75186.343，(圖8B)HAds是75290.023，(圖SOHAhm是69314.645和(圖8D)HAmg是63314.761。圖9顯示在HA三聚體的過甲基化N-聚糖的MALDI光譜中所觀察到的主要分子離子的分配。ND表不未確定。圖10顯示對應于a2，3唾液酸苷1-15的HA糖基化變體的AAG。值表示AAG，kcal/mol。最左欄的項目通過前面的HA的-G值減去后面的HA的-G值得到(例如，AAG(HAfg->HAds)=AG(HAds)-AG(HAfg))。ND表示未確定。圖11顯示響應于HA變體的不同唾液酸苷配體的結合自由能變化差異。值表示AAG，kcal/mol。最左欄的項目通過前面的HA的AG值減去后面的HA的AG值得到(例如，AAG(1->2)=AG⑵-AG(I)。ND表示未確定。圖12顯示從完全糖基化、高甘露糖和單糖基化的H5HA產(chǎn)生的抗血清抑制越南株1203HA假型病毒轉導進入HEK293細胞中的能力。高甘露糖和單糖基化的HA抗血清兩者均抑制病毒進入，但是完全糖基化的HA抗血清則不會抑制。圖13A-13B顯示利用兔HAfg和HAnig抗血清進行血細胞凝集測定的結果。圖13A顯示血細胞凝集測定中完全糖基化的共有H5HA抗血清對H1、H3和H5的結果。圖13B顯示利用單糖基化的H5HA抗血清的結果。單糖基化的H5HA抗血清不僅對H5表現(xiàn)出良好的血細胞凝集抑制活性，而且對Hl也表現(xiàn)出良好的血細胞凝集抑制活性。H3血細胞凝集不受兩種抗血清的影響。圖14顯示H5和Hl的蛋白結構(0.9A的均方根偏差(RMSD))彼此之間比與H3的蛋白結構(2.5A的均方根偏差RMSD))更相似。圖15A-15C顯示使用單糖基化的Hl(布里斯班株)HA作為抗原所產(chǎn)生的抗血清對NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)的抑制。圖15A顯示對NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)病毒凝集紅細胞能力的抑制。圖15B顯示對NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)病毒感染MDCK細胞能力的抑制。圖15C顯示對BALB/c小鼠免受NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)流感病毒感染的保護。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5iig)免疫的小鼠，并且用于激發(fā)的病毒是NIBRG-121(IOOXLD5q)。圖16A-16C顯示使用單糖基化的Hl(布里斯班株)HA作為抗原所產(chǎn)生的抗血清對WSN(HlNl)1933的抑制。圖16A顯示對WSN(HlNl)1933病毒凝集紅細胞能力的抑制。圖16B顯示對WSN(HlNl)1933病毒感染MDCK細胞能力的抑制。圖16C顯示對BALB/c小鼠免受WSN(HlNl)1933流感病毒感染的保護。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5yg)免疫的小鼠，并且用于激發(fā)的病毒是WSN(HlNl)1933(100XLD50)。圖17A-17C顯示使用單糖基化的Hl(布里斯班株)HA作為抗原所產(chǎn)生的抗血清對A/波多黎各/8/34(HlNl):PR8的抑制。圖17A顯示對PR8病毒凝集紅細胞能力的抑制。圖17B顯示對PR8病毒感染MDCK細胞能力的抑制。圖17C顯示對BALB/c小鼠免受PR8流感病毒的保護。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5iig)免疫的小鼠，并且用于激發(fā)的病毒是(IOOXLD5ci)。圖18A-18B顯示使用單糖基化的Hl(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株；在圖中顯示為加利福尼亞株/2009)HA作為抗原所產(chǎn)生的抗血清對WSN(HlNl)的抑制。圖18A顯示對WSN(HlNl)病毒凝集紅細胞能力的抑制。圖18B顯示對WSN(HlNl)病毒感染MDCK細胞能力的抑制。圖19顯示對HlHA蛋白上的糖基化位點的結構比較。圖20顯示3型登革病毒包膜糖蛋白E二聚體的完全糖基化形式(圖20A)和單糖基化形式(圖20B)。模型由PDB代碼2BF1產(chǎn)生，利用GlyProt服務器具有4個可能的復合型N-聚糖。圖21顯示人類免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gpl20三聚體的完全糖基化形式(圖21A)和單糖基化形式(圖21B)。模型由PDB代碼2BF1產(chǎn)生，每個單體具有13個可能的復合型N-聚糖。發(fā)明的詳細描述在下面參照附圖對本公開的實施方案的詳細描述中，其中相似的參考數(shù)字表示相似的元件，并且其中以列舉可實施本公開的具體實施方案的方式顯示。對這些實施方案的詳述足以使本領域技術人員能實施本公開，并且應當理解，可以使用其他實施方案，且只要不脫離本公開的范圍，可以作出合理的、結構的、功能的和其他的改變。以下詳細描述因而不應被理解為限制性含義。流感病毒的血凝素(HA)是同源三聚體跨膜蛋白，具有由球狀頭區(qū)和莖區(qū)組成的胞外結構域。兩個區(qū)域均攜帶N-連接的寡糖，這些寡糖的生物合成按照N糖基化的常規(guī)途徑。HA的功能特性受特定位點的糖基化影響?？乖谋砦恢車奶妓衔锔蓴_抗體接近，并且該影響可導致流感病毒的抗原性漂移。之前對HA的研究還揭示，具有糖基化的肽序列是高度保守的，并且HA受體結合特異性由于受體結合位點附近復合聚糖鏈的缺失而受到影響。此外，HA的蛋白水解活性還受到切割位點附近的聚糖的調節(jié)，從而影響流感病毒的感染力。頭區(qū)糖基化位點的結構和數(shù)量的廣泛變異已在甲型流感病毒的不同亞型中得到顯示，而莖區(qū)寡糖更保守，且為融合活性所需。所有這些發(fā)現(xiàn)均表明HA糖基化對其活性的重要性。病毒傳播從血凝素(HA)糖蛋白和含有聚糖的唾液酸(SA)之間的重要相互作用開始，所述血凝素糖蛋白是流感病毒衣殼，所述唾液酸位于宿主細胞表面。為了闡明HA糖基化在該重要的相互作用中的作用，制備了各種確定的HA糖型，并利用合成的SA微陣列研究它們的結合親和力和特異性。截斷HA上的N-聚糖結構增加SA結合親和力，但降低了對不同SA配體的特異性。SA配體結構中每種單糖和硫酸鹽基團對HA結合能的貢獻在數(shù)量上均是可分析的。發(fā)現(xiàn)硫酸鹽基團對完全糖基化的HA的結合能增加將近100倍(2.04kcal/mol)，并且二天線的聚糖對單糖基化的HA糖型的結合能同樣增加將近100倍。僅在每個糖基化位點攜帶一個N-連接的GlcNAc的由HA蛋白引發(fā)的抗體比完全糖基化的HA所激發(fā)的抗體對流感病毒亞型表現(xiàn)出更好的結合親和力和中和活性。因此，去除病毒表面糖蛋白上的結構上非必需的聚糖對于針對流感病毒和其他人類病毒的疫苗設計來說是非常有效且常用的方法。除非另外定義，本文所用的技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域技術人員所通常理解的相同的含義。Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2nded.,J.ffiley&Sons(NewYork,N.Y.1994)為本領域技術人員提供了對本申請所用的諸多術語的通用指導。本領域技術人員應當意識到，與本文所描述的相似或等同的諸多方法和材料可用于實施本發(fā)明。確實，本發(fā)明絕非限制于所述的方法和材料。為了本發(fā)明的目的，下面定義以下術語。術語“甲型流感亞型”或“甲型流感病毒亞型”可交替使用，是指用血凝素⑶病毒表面蛋白表征的甲型流感病毒變體，并因此用H的數(shù)量來標記，諸如例如H1、H3和H5。此夕卜，亞型可進一步用神經(jīng)氨酸酶(N)病毒表面蛋白表征，用N的數(shù)量表示，諸如例如NI和N2。同樣，亞型可以通過H和N的數(shù)量兩者來表征，諸如例如H1N1、H5N1和H5N2。本術語具體包括每種亞型內(nèi)的所有菌株(包括滅絕的菌株)，這些菌株通常由突變產(chǎn)生，并表現(xiàn)出不同的病原譜。這類菌株還被稱為病毒亞型的各種“隔離體”，包括所有過去的、當今的和未來的隔離體。因此，在該語境下，術語“菌株”和“隔離體”可交替使用。亞型含有基于甲型流感病毒的抗原。所述抗原可以基于血凝素病毒表面蛋白，并可被稱為“HA抗原”。在某些情況下，這類抗原基于特定亞型的蛋白，諸如例如Hl亞型和H5亞型，其可以分別被稱為Hl抗原和H5抗原。如本公開中所用的，術語“去糖基化的”或“部分糖基化的”蛋白是指從完全糖基化狀態(tài)的蛋白的聚糖結構去除一個或多個糖的蛋白，并且其中所述蛋白基本保持其天然的構象/折疊?！叭ヌ腔摹钡鞍装ú糠痔腔牡鞍?，其中去糖基化過程在糖蛋白上存在的一個或多個糖基化位點處保留單糖基化、二糖基化或三糖基化?！安糠痔腔摹钡鞍装ㄆ渲性诿總€糖基化位點處保留一個或多個糖的“去糖基化的”蛋白，并且每個部分糖基化位點與完全糖基化狀態(tài)的糖蛋白相比包含較小的聚糖結構(包含較少的糖單元)，并且部分糖基化的蛋白基本保持其天然的構象/折疊。“部分糖基化的”蛋白通過在完全糖基化狀態(tài)的糖蛋白的至少一個糖基化位點的聚糖結構處部分去糖基化來產(chǎn)生。“部分糖基化的”蛋白還通過在蛋白的非糖基化位點導入糖基化，使得添加的糖基化序列小于完全糖基化狀態(tài)的糖蛋白該位點處的聚糖結構來產(chǎn)生?！安糠痔腔摹钡鞍走€通過合成病毒糖蛋白序列或其片段，在該序列的糖基化位點處導入糖基化的氨基酸單元(例如，GlcNAc-精氨酸部分)，使得添加的聚糖結構小于完全糖基化狀態(tài)的糖蛋白該位點處的聚糖結構來產(chǎn)生。術語“核酸”和“多核苷酸”在本文可交替使用，是指單鏈或雙鏈RNA、DNA或混合的多聚體。多核苷酸可以包括基因組序列、基因組外序列和質粒序列，以及表達多肽或可適合表達多肽的較小的工程化基因節(jié)段。“分離的核酸”是基本上從天然伴隨天然序列的其他基因組DNA序列以及蛋白或諸如核糖體或多聚酶的復合體分離的核酸。該術語包括從其天然存在的環(huán)境移出的核酸序列，并包括重組的或克隆的DNA分離體和化學合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物?；炯兊暮怂岚ê怂岬姆蛛x形式。當然，這是指原始分離的核酸，并且不排除之后通過人工添加到該分離的核酸的基因或序列。術語“多肽”以其常規(guī)含義使用，即氨基酸序列。所述多肽并不限制于特定長度的產(chǎn)物。肽、寡肽和蛋白均包括在多肽的定義內(nèi)，并且這類術語在本文可交替使用，除非具有指出不是這樣。該術語還不是指或排除翻譯后修飾的多肽，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本領域內(nèi)已知的天然存在的和非天然存在的其他修飾。多肽可以是完整的蛋白或其子序列。本發(fā)明背景下的特定目的多肽是包含CDR并能與抗原或HIV感染的細胞結合的氨基酸子序列?！胺蛛x的多肽”是從其天然環(huán)境組分中鑒定并分離和/或回收到的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，所述分離的多肽可被純化至(I)如通過Lowry方法所測定的大于95%重量比的多肽，并且最優(yōu)選至大于99%的重量比，(2)純化至足以通過使用旋杯式測序儀來獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)純化至通過使用考馬斯亮藍或優(yōu)選銀染在還原或非還原條件下的SDS-PAGE達到的均一性。分離的多肽包括重組細胞原位的多肽，因為所述多肽的天然環(huán)境的至少一種組分不再存在。然而通常，分離的多肽將通過至少一步純化步驟來制備?！疤烊恍蛄小倍嗪塑账崾桥c來自自然的多核苷酸具有相同核苷酸序列的多核苷酸?！疤烊恍蛄小倍嚯氖桥c來自自然(例如來自任何物種)的多肽(例如抗體)具有相同氨基酸序列的多肽。這類天然序列多核苷酸和多肽可以從自然分離得到，或可以通過重組或合成方式產(chǎn)生。如本文所用的術語多核苷酸“變體”是存在一個或多個取代、缺失、添加和/或插入而通常不同于本文所具體公開的多核苷酸的多核苷酸。這類變體可以是天然存在的或可以是合成產(chǎn)生的，例如通過修飾本發(fā)明的一種或多種多核苷酸序列，并按本文所述和/或使用本領域內(nèi)公知的多種技術中的任何一種評價所編碼的多肽的一種或多種生物學活性。如本文所用的術語多肽“變體”是存在一個或多個取代、缺失、添加和/或插入而通常不同于本文所具體公開的多肽的多肽。這類變體可以是天然存在的或可以是合成產(chǎn)生的，例如通過修飾本發(fā)明的一種或多種上述多肽序列，并按本文所述和/或使用本領域內(nèi)公知的多種技術中的任何一種評價所述多肽的一種或多種生物學活性。修飾可以在本發(fā)明的多核苷酸和多肽結構中進行，并且仍可獲得編碼具有所需特性的變體或衍生多肽的功能性分子。當希望改變多肽的氨基酸序列以產(chǎn)生本發(fā)明多肽的等同的或甚至是改進的變體或部分時，本領域技術人員通常改變編碼DNA序列的一個或多個密碼子。例如，在蛋白結構中，某些氨基酸可以被其他的氨基酸取代，而不會造成其與其他多肽(例如抗原)或細胞結合能力的明顯損失。由于是蛋白的結合能力和特性限定了該蛋白的生物功能活性，因此可以在蛋白序列和其基礎DNA編碼序列中進行某些氨基酸序列取代，并且仍能獲得具有相似特性的蛋白。因而應當考慮可以在所公開的組合物的肽序列或編碼所述肽的相應的DNA序列中進行各種改變，只要不會造成其生物學功能或活性的明顯損失。在進行這些改變時，還應當考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領域內(nèi)普遍理解親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用的生物學功能中的重要性(KyteandDoolittle，1982)。被接受的是氨基酸的相對親水特性與得到的蛋白的二級結構有關，而該二級結構隨之限定了該蛋白與諸如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等其他分子的相互作用?；诎被岬氖杷院碗姾商匦裕糠N氨基酸具有指定的親水指數(shù)(KyteandDoolittle，1982)。這些值是:異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。本領域內(nèi)已知，某些氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)或評分的其他氨基酸取代，而仍產(chǎn)生具有相似生物學活性的蛋白，即仍獲得生物學功能等同的蛋白。在進行這些改變時，親水指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，并且更特別優(yōu)選的是在±0.5以內(nèi)的那些氨基酸的取代。本領域內(nèi)還應當理解，可以基于親水性有效地進行相似氨基酸的取代。美國專利第4，554，101號陳述，蛋白的最局部的平均親水性，如通過其鄰近的氨基酸的親水性所控制，與所述蛋白的生物學特性相關。如美國專利第4，554，101號詳述，已將下述親水性值指定給氨基酸殘基:精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(O)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、売氨酸(-1.8)、異売氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。應當理解，氨基酸可以被具有相似親水性值的另一氨基酸取代，且仍獲得生物學上等同的尤其是免疫學上等同的蛋白。在這類改變中，親水性值在±2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，并且更特別優(yōu)選的是在±0.5以內(nèi)的那些氨基酸的取代。如上文所述，氨基酸取代因此通?；诎被醾孺溔〈南鄬Φ南嗨菩?，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。綜合考慮了上述各種特性的示例性取代是本領域技術人員所公知的，并且包括:精氨酸與賴氨酸、谷氨酸與天冬氨酸、絲氨酸與蘇氨酸、谷氨酰胺與天冬酰胺、以及纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸。多肽在蛋白的N末端可以包含信號(或前導)序列，其在翻譯的同時或在翻譯后指導蛋白的轉移。多肽還可以與連接物或其他序列綴合，以便于多肽的合成、純化或鑒定(例如，多聚組氨酸)，或用于增強多肽與固相支持物的結合。多肽的糖基化通常是N-連接的或0-連接的。N-連接的是指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側鏈連接。“序列子”是蛋白中的三個連續(xù)氨基酸序列，其可以充當與稱為N-連接的聚糖的多糖(糖)的連接位點。這是一種通過天冬酰胺(Asn)側鏈的氮原子與蛋白連接的多糖。序列子是Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr,其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中這些三肽序列中的任何一種的存在會產(chǎn)生可能的糖基化位點。0-連接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種與羥基氨基酸的連接，最常見的為絲氨酸或蘇氨酸，但是也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。盡管序列子Asn-X-Ser/Thr是N-連接的寡糖與糖蛋白連接所絕對必需的(MarshallRD,BiochemicalSocietySymposia40,17-261974),但是其存在并非總是導致糖基化,糖蛋白中的一些序列子可以保持非糖基化(CurlingEM,etal.,BiochemicalJournal272,333-3371990)。聚糖微陣列是研究碳水化合物-蛋白相互作用的有力工具，并為流感病毒亞分型提供新的平臺(Blixt0，etal.(2004)ProcNatlAcadSciUSAlOl:17033-17038;ChandrasekaranA,etal.(2008)NatBiotechnol26:107-113；LiangPH,etal.(2007)JAmChemSoc129:11177-11184；StevensJ,etal.(2008)JMolBiol381:1382-1394)。它們模擬細胞表面的聚糖，表現(xiàn)出高親和力和特異性的多價相互作用。利用該技術，對各種天然的和突變的HA的受體特異性進行表征，從而為區(qū)分流感病毒亞型提供新的平臺。盡管是有力的方法，但是通過聚糖陣列分析來理解HA-聚糖相互作用由于兩個問題而復雜化:第一，HA結合特異性受陣列聚糖的空間排列和組成以及所用的結合檢測方法影響(SrinivasanA，etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:2800-2805)。第二，糖基化位點處或附近的肽序列的改變可以改變HA的3D結構，并因此改變受體結合特異性和親和力。的確，來自不同H5N1亞型的HA具有不同的聚糖結合模式(StevensJ,etal.(2008)JMolBiol381:1382-1394)。在整個病毒系統(tǒng)中研究了Hl和H3上的糖基化位點的誘變(ChandrasekaranA,etal.(2008)NatBiotechnol26:107-113；DeomCM,etal.(1986)ProcNatlAcadSciUSA83:3771-3775)。然而，還不了解糖基化的改變?nèi)绾斡绊懯荏w結合特異性和親和力，尤其對于大多數(shù)致病性H5N1HA來說。為了解決這些問題，開發(fā)出了定量聚糖微陣列譜方法，以克服傳統(tǒng)HA結合實驗的限制。之前的研究使用昆蟲細胞表達的HA(ChandrasekaranA,etal.(2008)NatBiotechnol26:107-113)。但是昆蟲細胞中的糖基化與哺乳動物細胞不同，明顯的差異是昆蟲細胞中不產(chǎn)生以半乳糖和唾液酸為末端的復合型N-聚糖。從人類細胞表達的HA糖基化的變體為了在人類細胞中解決如何使糖基化發(fā)生影響受體結合特異性和親和力的改變，利用流感H5N1HA共有序列(ChenMW，etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:13538-13543)制備包含HA結合配體的廣泛結構類似物的聚糖微陣列和數(shù)種確定的HA糖型，用于進行定量結合分析。CHA5的密碼子用人類密碼子進行表達優(yōu)化。如表I所示，原始的病毒蛋白酶切割位點PQRERRRKKRG(SEQIDNO:1)被突變成PQRERG(SEQIDNO:2)，以便防止蛋白從酶促切割形成HAl和HA2。跨膜區(qū)(殘基:533-555)用HA構建體的C末端處的其他殘基LVPRGSP'GSGYIPEAPRDGQAYYRKDGEffYLLSTFLGHHHHHH(SEQIDNO:3)取代，其中凝血酶切割位點為斜體，噬菌體T4fibritin折疊子三聚序列用下劃線表示，并且組氨酸標簽為粗體(StevensJ.etal.(2006)Science312:404-410)。表1.共有H5血凝素序列以粗體顯示共有H5HA的氨基酸序列:信號序列；和下劃線:三聚序列和組氨酸標簽MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGSHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE~50KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN100PANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASSGVSSA150CPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA200AEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK250PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA300INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERGLFGAIAGF350IEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKM400NTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLD450FHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDY500PQYSEEARLKREEISGVDIRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW550權利要求1.用于引發(fā)對病毒、細菌、真菌或其他來源的病原體的免疫應答的免疫原性組合物，所述組合物包含:來自所述病毒、細菌、真菌或其他來源的病原體的抗原糖蛋白，其中所述糖蛋白包含至少一個糖基化位點，并且其中所述抗原糖蛋白在一個或多個糖基化位點被部分糖基化。2.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述病原體是病毒，而且其中所述部分糖基化的抗原是病毒、病毒肽、蛋白、多肽或來源于病毒的以上的片段。3.如權利要求2所述的免疫原性組合物，其中所述病毒選自流感病毒、呼吸道合胞體病毒(RSV)、衣原體、腺病毒科、哺乳動物腺病毒屬、禽腺病毒屬、皰疫病毒科、單純皰疫病毒1、單純皰疹病毒2、單純皰疹病毒5、單純皰疹病毒6、光滑病毒科、輕小病毒屬、腸桿菌噬菌體MS2、allolevirus、痘病毒科、脊椎動物痘病毒亞科、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬、軟撫痘病毒屬、昆蟲痘病毒亞科、乳頭多瘤空病毒科、多瘤病毒屬、乳頭多瘤空病毒屬、副粘病毒科、副粘病毒屬、副流感病毒1、麻疹病毒屬、麻疹病毒、腿腺炎病毒屬、腿腺炎病毒、肺病毒亞科、肺病毒屬、偏肺病毒屬、禽肺病毒屬、人類偏肺病毒屬、小核糖核酸病毒科、腸病毒屬、鼻病毒屬、肝病毒屬、人類甲型肝炎病毒、心病毒屬、andapthovirus、呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬、環(huán)狀病毒屬、輪狀病毒屬、質型多角體病毒屬、斐濟病毒屬、植物呼腸孤病毒屬、水稻病毒屬、逆轉錄病毒科、B型哺乳動物逆轉錄病毒屬、C型哺乳動物逆轉錄病毒屬、C型鳥逆轉錄病毒屬、D型逆轉錄病毒組、BLV-HTLV轉錄病毒屬、慢病毒屬、人類免疫缺陷病毒1、人類免疫缺陷病毒2、泡沫病毒屬、黃病毒屬科、丙型肝炎病毒、黃病毒屬、登革病毒、肝DNA病毒科、乙型肝炎病毒、披膜病毒科、甲病毒屬辛德比斯病毒、風疹病毒屬、風疹病毒、彈狀病毒科、水皰性病毒屬、狂犬病病毒屬、短暫熱病毒屬、質型彈狀病毒屬、核型彈狀病毒屬、沙粒病毒科、沙粒病毒屬、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、伊派病毒、拉沙病毒、冠狀病毒科、冠狀病毒屬和凸隆病毒屬。4.如權利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述病毒肽、蛋白、多肽或其片段是選自以下的表面糖蛋白:流感病毒神經(jīng)氨酸酶，流感病毒血凝素，流感病毒M2蛋白，人類呼吸道合胞體病毒(RSV)病毒蛋白，RSVF糖蛋白，RSVG糖蛋白，單純皰疹病毒(HSV)病毒蛋白，單純皰疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE，衣原體MOMP和PorB抗原，登革病毒的核心蛋白、基質蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素，單純皰疹病毒2型糖蛋白gB，脊髓灰質炎病毒IVP1，HIVI的包膜糖蛋白，乙型肝炎表面抗原，白喉毒素，鏈球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，偽狂犬病病毒g50(gpD)，偽狂犬病病毒II(gpB)，偽狂犬病病毒III(gpC)，偽狂犬病病毒糖蛋白H，偽狂犬病病毒糖蛋白E，傳染性胃腸炎糖蛋白195，傳染性胃腸炎基質蛋白，豬輪狀病毒屬糖蛋白38，豬細小病毒衣殼蛋白，豬密螺旋體痢疾保護性抗原，牛病毒性腹瀉糖蛋白55，新堡病病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶，豬流感血凝素，豬流感神經(jīng)氨酸酶，口蹄疫病毒，豬霍亂病毒，豬流感病毒，非洲豬瘟病毒，豬肺炎支原體，傳染性牛鼻氣管炎病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G，傳染性喉氣管炎病毒，傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I，拉克羅斯病毒的糖蛋白，新生犢牛腹瀉病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒，龐塔托魯病毒，鼠白血病病毒，小鼠乳腺瘤病毒，乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物，馬流感病毒或馬皰疹病毒的抗原，包括甲型馬流感病毒/阿拉斯加株91神經(jīng)氨酸酶、甲型馬流感病毒/邁阿密株63神經(jīng)氨酸酶、甲型馬流感病毒/肯塔基株81神經(jīng)氨酸酶、馬皰疹病毒I型糖蛋白B和馬皰疹病毒I型糖蛋白D，牛呼吸道合胞體病毒或牛副流感病毒的抗原，牛呼吸道合胞體病毒附著蛋白(BRSVG)，牛呼吸道合胞體病毒融合蛋白(BRSVF)，牛呼吸道合胞體病毒核殼體蛋白(BRSVN)，牛副流感病毒3型融合蛋白，牛副流感病毒3型血凝素神經(jīng)氨酸酶，牛病毒腹瀉病毒糖蛋白48和糖蛋白53，登革病毒糖蛋白E和人類丙型肝炎病毒的糖蛋白El或E2。5.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中來自病原體的所述部分糖基化的糖蛋白是通過使用化學或酶促方法中的一種或多種進行部分去糖基化而產(chǎn)生的。6.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原在O-糖基化位點或N-糖基化位點被部分糖基化。7.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原包含N-糖基化位點，所述N-糖基化位點包含天冬酰胺-Xaa-絲氨酸和天冬酰胺-Xaa-蘇氨酸的氨基酸序列，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。8.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的流感病毒血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)或M2蛋白，或以上的免疫原性片段。9.如權利要求8所述的免疫原性組合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或甘露糖糖基化的流感病毒血凝素。10.如權利要求8所述的免疫原性組合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是選自部分糖基化的流感病毒H1、H3和H5的單糖基化的血凝素。11.如權利要求9所述的免疫原性組合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)單糖基化的流感病毒血凝素。12.如權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含含有Sa區(qū)的N-糖基化位點。13.如權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含位于第177位的天冬酰胺殘基處的部分糖基化。14.如權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述單GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素對于HA-受體結合展現(xiàn)出降低的特異性和提高的親和力。15.如權利要求14所述的免疫原性組合物，其中所述單GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素結合唾液酸化的HA-受體。16.如權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQIDNO:4)的多肽。17.如權利要求16所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的共有H5HA序列(SEQIDNO:4)在第39位、第127位、第170位、第181位、第302位、第495位和第500位中的一個或多個位置的天冬酰胺殘基處糖基化。18.如權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含選自季節(jié)性NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)序列(SEQIDN0:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1_C(SEQIDNO:10)序列的Hl多肽序列。19.如權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素(HA)序列選自共有H5HA序列(SEQIDNO:4)、NIBRG_121(流行性2009A(HlNl)疫苗)序列(SEQIDNO:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1_C(SEQIDNO:10)序列，其中所述HA序列經(jīng)修飾從而能在合適的真核細胞中表達。20.如權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含季節(jié)性Hl(布里斯班株)多肽。21.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述病毒是呼吸道合胞體病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的單糖基化、二糖基化或三糖基化的RSVF(融合)、G(附著)或以上蛋白的免疫原性片段。22.如權利要求21所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的RSVG蛋白序列(SEQIDNO:12)是在表6所示的一個或多個可能的N-糖基化位點的天冬酰胺殘基處被部分糖基化。23.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述病毒是黃病毒屬，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。24.如權利要求23所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQIDNO:13)是在表7所示的N-糖基化位點N67和N153中的一個或多個的天冬酰胺殘基處被部分糖基化。25.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。26.如權利要求25所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白El(SEQIDNO:14)是在表8所示的N-糖基化位點N196、N209、N234、N305和N325中的一個或多個的天冬酰胺殘基處被部分糖基化。27.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20、跨月旲糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。28.如權利要求27所述的免疫原性組合物，其中所述單糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20(SEQIDNO:15)是在表9所示的一個或多個可能的N-糖基化位點的天冬酰胺殘基處被部分糖基化。29.疫苗，包含:(a)免疫原性多肽，所述免疫原性多肽包含在一個或多個糖基化位點部分糖基化至單糖基化、二糖基化或三糖基化狀態(tài)的病毒表面糖蛋白或其免疫活性片段。(b)任選地，佐劑，其中所述疫苗能誘發(fā)抗病毒的免疫應答。30.如權利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)或M2。31.如權利要求30所述的疫苗，其中所述流感病毒選自禽流感病毒、動物流感病毒和人類流感病毒。32.如權利要求31所述的疫苗，其中所述禽流感病毒是H5N1。33.如權利要求31所述的疫苗，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。34.如權利要求30所述的疫苗，其中一旦將單糖基化的流感HA多肽引入個體，所述多肽誘導所述個體產(chǎn)生與呼吸病毒結合的抗體。35.如權利要求34所述的疫苗，其中所述呼吸病毒是禽、動物和/或人類流感病毒或者RSV。36.如權利要求34所述的疫苗，其中所述部分糖基化的病毒抗原在O-糖基化或N-糖基化位點被部分糖基化。37.如權利要求34所述的疫苗，其中所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化的流感病毒HA多肽，所述單糖基化的流感病毒HA多肽包含具有天冬酰胺-Xaa-絲氨酸和天冬酰胺-Xaa-蘇氨酸的氨基酸序列的部分糖基化的N-糖基化位點，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。38.如權利要求34所述的疫苗，其中所述N-糖基化位點包含單GlcNAc糖基化的流感病毒HA多肽，并且對于HA-受體結合展現(xiàn)出降低的特異性和提高的親和力。39.如權利要求34所述的疫苗，其中所述單糖基化的流感HA多肽包含含有Sa區(qū)的N-糖基化位點。40.如權利要求34所述的疫苗，其中所述單糖基化的流感病毒HA多肽包含位于第177位的天冬酰胺殘基處的N-糖基化位點。41.如權利要求38所述的疫苗，其中所述單GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素與唾液酸化的HA-受體結合。42.如權利要求34所述的疫苗，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQIDNO:4)的多肽。43.如權利要求42所述的疫苗，其中所述單糖基化的共有H5HA序列(SEQIDNO:4)在第39位、第170位、第181位、第302位和第500位中的一個或多個位置的天冬酰胺殘基處糖基化。44.如權利要求34所述的疫苗，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含選自NIBRG-12U流行性2OO9A(HlNl)疫苗菌株)序列(SEQIDNO:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1-C(SEQIDNO:10)序列的Hl多肽序列。45.如權利要求34所述的疫苗，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含季節(jié)性Hl(布里斯班株)HA多肽，而且其中一旦將所述單糖基化的HA多肽弓I入個體，所述Hl(布里斯班株)HA多肽或誘導所述個體產(chǎn)生能中和NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)、WSN(HlNl)1933或A/波多黎各/8/34(HlNl):PR8菌株流感病毒的抗體。46.如權利要求34所述的疫苗，其中所述單糖基化的流感病毒血凝素包含NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)多肽，而且其中一旦將單糖基化的HA多肽引入個體，所述NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)多肽誘導所述個體產(chǎn)生能中和季節(jié)性Hl(布里斯班株)HA、WSN(HlNl)1933或A/波多黎各/8/34(HlNl):PR8菌株流感病毒的抗體。47.如權利要求34所述的疫苗，其中所述個體是哺乳動物、禽、動物、豬、馬或人。48.如權利要求34所述的疫苗，其中所述疫苗展現(xiàn)出抗一種或多種流感病毒菌株的顯著的抗病毒活性。49.如權利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是呼吸道合胞體病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的單糖基化、二糖基化或三糖基化的RSVF(融合)、G(附著)或以上蛋白的免疫原性片段。50.如權利要求49所述的疫苗，其中所述單糖基化的RSVG蛋白序列(SEQIDNO:12)是在表6所示的一個或多個可能的N-糖基化位點的天冬酰胺殘基處被部分去糖基化。51.如權利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是黃病毒屬，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。52.如權利要求51所述的疫苗，其中所述單糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQIDNO:13)是在表7所示的N-糖基化位點N67和N153中的一個或多個的天冬酰胺殘基處被部分去糖基化。53.如權利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。54.如權利要求53所述的疫苗，其中所述單糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白El(SEQIDNO:14)是在表8所示的N-糖基化位點N196、N209、N234、N305和N325中的一個或多個的天冬酰胺殘基處被部分去糖基化。55.如權利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。56.如權利要求55所述的疫苗，其中所述單糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20(SEQIDNO:15)是在表9所示的一個或多個可能的N-糖基化位點的天冬酰胺殘基處被部分去糖基化。57.如權利要求29所述的疫苗，其中所述佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁、氫氧化鋁和磷酸鋁兩者、弗氏不完全佐劑(IFA)、角鯊烯、明礬和MF59。58.對哺乳動物進行抗病毒感染免疫的方法，所述方法包括:向易受呼吸病毒感染的所述哺乳動物給予包含免疫原性多肽的疫苗，所述免疫原性多肽包含部分糖基化至單糖基化、二糖基化或三糖基化狀態(tài)的病毒糖蛋白，或其免疫活性片段，其中所述疫苗能誘發(fā)抗所述病毒的免疫應答。59.如權利要求58所述的方法，其中所述疫苗通過腸胃外給藥被給予。60.如權利要求58所述的方法，其中通過鼻內(nèi)給予所述疫苗。61.如權利要求58所述的方法，其中通過吸入給予所述疫苗。62.如權利要求58所述的方法，其中通過預防性給予所述疫苗。63.如權利要求58所述的方法，其中所述疫苗誘發(fā)抗病毒或抗同一病毒的不同菌株的免疫應答，所述同一病毒的不同菌株與從中選擇部分糖基化的病毒糖蛋白的來源病毒不同。64.如權利要求58所述的方法，其中所述病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是流感病毒血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)或M2糖蛋白。65.如權利要求64所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是包含含有共有H5HA序列(SEQIDNO:4)的多肽的單糖基化的流感血凝素(HA)。66.如權利要求64所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是單糖基化的流感血凝素(HA)，所述單糖基化的流感血凝素包含選自NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)序列(SEQIDNO:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1_C(SEQIDNO:10)序列的Hl多肽序列。67.如權利要求64所述的方法，其中所述疫苗誘發(fā)抗流感病毒菌株的免疫應答，所述流感病毒菌株與從中選擇部分糖基化的病毒糖蛋白的來源流感病毒菌株不同。68.如權利要求67所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是單糖基化的流感血凝素(HA)。69.如權利要求67所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是單糖基化的流感神經(jīng)氨酸酶(NA)或M2蛋白。70.如權利要求58所述的方法，其中所述病毒是呼吸道合胞體病毒(RSV)，所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的單糖基化、二糖基化或三糖基化的RSVF(融合)、G(附著)或以上蛋白的免疫原性片段。71.如權利要求70所述的方法，其中所述單糖基化的RSVG蛋白序列(SEQIDNO:12)是在表6所示的一個或多個可能的N-糖基化位點的天冬酰胺殘基處被部分去糖基化。72.如權利要求58所述的方法，其中所述病毒是黃病毒屬，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。73.如權利要求72所述的方法，其中所述單糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQIDNO:13)是在表7所示的一個或多個N-糖基化位點N67和N153的天冬酰胺殘基處被部分去糖基化。74.如權利要求58所述的方法，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。75.如權利要求74所述的方法，其中所述單糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1(SEQIDNO:14)是在表8所示的N-糖基化位點N196、N209、N234、N305和N325中的一個或多個的天冬酰胺殘基處被部分去糖基化。76.如權利要求58所述的方法，其中所述病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是單糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。77.如權利要求76所述的方法，其中所述單糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20(SEQIDNO:15)是在表9所示的一個或多個可能的N-糖基化位點的天冬酰胺殘基處被部分去糖基化。78.制備方法，包括:提供糖基化的病毒表面糖蛋白或其免疫活性片段；以及去除與所述蛋白上的一個或多個糖基化位點結合的至少一部分聚糖，從而形成部分糖基化的蛋白，其中至少一種聚糖仍然與所述蛋白上的部分糖基化的位點結合，并且其中所述蛋白保持免疫活性構象。79.如權利要求78所述的方法，還包括:提供包含構建體的真核宿主細胞，所述構建體適于表達重組多肽或其免疫活性片段，包括病毒糖蛋白的氨基酸序列；以及從所述真核宿主分離所述糖基化的重組病毒糖蛋白多肽。80.如權利要求78所述的方法，其中所述部分糖基化的蛋白保持病毒糖蛋白在其天然狀態(tài)的三級構象。81.如權利要求78所述的方法，其中使用糖苷酶、神經(jīng)氨酸酶、a-1-甘露糖苷酶、內(nèi)F-N聚糖酶或選擇性消化N-或O-連接的糖基化位點的碳水化合物的酶去除所述一部分聚糖。82.如權利要求78所述的方法，其中使用選擇性消化N-或0-連接的糖基化位點的碳水化合物的化學方法去除所述一部分聚糖。83.如權利要求79所述的方法，其中所述真核宿主選自酵母、昆蟲細胞、桿狀病毒、哺乳動物細胞和人細胞。84.如權利要求83所述的方法，其中所述真核宿主是HEK293E細胞。85.如權利要求78所述的方法，其中所述部分糖基化位點保留一個、兩個或三個聚糖。86.如權利要求78所述的方法，其中所述病毒表面糖蛋白選自:病毒肽、蛋白、多肽或其片段，所述病毒肽、蛋白、多肽或其片段選自以下的表面糖蛋白:流感病毒神經(jīng)氨酸酶，流感病毒血凝素，流感病毒M2蛋白，人類呼吸道合胞體病毒(RSV)病毒蛋白，RSVF糖蛋白，RSVG糖蛋白，單純皰疹病毒(HSV)病毒蛋白，單純皰疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE，衣原體MOMP和PorB抗原，登革病毒的核心蛋白、基質蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素，單純皰疹病毒2型糖蛋白gB，脊髓灰質炎病毒IVP1，HIVI的包膜糖蛋白，乙型肝炎表面抗原，白喉毒素，鏈球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，偽狂犬病病毒g50(gpD)，偽狂犬病病毒11(gpB)，偽狂犬病病毒111(gpC)，偽狂犬病病毒糖蛋白H，偽狂犬病病毒糖蛋白E，傳染性胃腸炎糖蛋白195，傳染性胃腸炎基質蛋白，豬輪狀病毒屬糖蛋白.38，豬細小病毒衣殼蛋白，豬密螺旋體痢疾保護性抗原，牛病毒性腹瀉糖蛋白55，新堡病病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶，豬流感血凝素，豬流感神經(jīng)氨酸酶，口蹄疫病毒，豬霍亂病毒，豬流感病毒，非洲豬瘟病毒，豬肺炎支原體，傳染性牛鼻氣管炎病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G，傳染性喉氣管炎病毒，傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I，拉克羅斯病毒的糖蛋白，新生犢牛腹瀉病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒，龐塔托魯病毒，鼠白血病病毒，小鼠乳腺瘤病毒，乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物，馬流感病毒或馬皰疹病毒的抗原，包括甲型馬流感病毒/阿拉斯加株91神經(jīng)氨酸酶、甲型馬流感病毒/邁阿密株63神經(jīng)氨酸酶、甲型馬流感病毒/肯塔基株81神經(jīng)氨酸酶、馬皰疹病毒I型糖蛋白B和馬皰疹病毒I型糖蛋白D，牛呼吸道合胞體病毒或牛副流感病毒的抗原，牛呼吸道合胞體病毒附著蛋白(BRSVG)，牛呼吸道合胞體病毒融合蛋白(BRSVF)，牛呼吸道合胞體病毒核殼體蛋白(BRSVN)，牛副流感病毒3型融合蛋白，牛副流感病毒3型血凝素神經(jīng)氨酸酶，牛病毒腹瀉病毒糖蛋白48和糖蛋白53，登革病毒糖蛋白E和人類丙型肝炎病毒的糖蛋白El或E2。全文摘要提供了用作抗病毒疫苗的包含部分糖基化的病毒糖蛋白的免疫原性組合物。用單糖基化、二糖基化或三糖基化病毒表面糖蛋白和多肽配制的疫苗提供了有效且廣泛的抗病毒保護，即使是跨越菌株。公開了包含單糖基化的血凝素多肽的藥物組合物和由其產(chǎn)生的疫苗以及使用它們來預防或治療病毒感染的方法。公開了用于流感病毒HA、NA和M2、RSV蛋白F、G和SH、登革病毒糖蛋白M或E、丙型肝炎病毒糖蛋白E1或E2以及HIV糖蛋白gp120和gp41的方法和組合物。文檔編號A61K39/12GK103200961SQ201080022917公開日2013年7月10日申請日期2010年3月26日優(yōu)先權日2009年3月27日發(fā)明者翁啟惠,馬徹,王正琪,陳俊叡申請人:中央研究院