專利名稱：用于癌癥治療的致敏樹突狀細胞的癌胚胎抗原/未成熟層粘連蛋白受體肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明大體上涉及癌胚胎抗原/未成熟層粘連蛋白受體蛋白(OFA/iLRP)。更具體來說，本發(fā)明提供可用于致敏樹突狀細胞的肽，其用于癌癥。
背景技術：
癌胚胎抗原/未成熟層粘連蛋白受體蛋白(OFA/iLRP)的初始鑒定由三個研究癌胚胎抗原或?qū)诱尺B蛋白受體的獨立的組完成[1-3]。OFA/iLRP是高度保守的蛋白質(zhì)，其在一系列不同癌癥中過表達并具有作為核糖體蛋白P40的雙重功能W-27]。OFA/iLRP蛋白包含295個氨基酸的單多肽鏈并具有約37-44KDa的分子量。OFA/iLRP的結構最近已被闡明至2.15A并顯示出OFA/iLRP的第112到140位氨基酸之間的區(qū)域涉及OFA/iLRP的二聚
化，所述二聚化用于形成層粘連蛋白受體蛋白(LRP)[觀]。層粘連蛋白受體的成熟形式似乎為乙?；奈闯墒霯RP的二聚體，其具有67kDa的分子量。盡管成熟的67kDa形式出現(xiàn)在許多正常細胞和腫瘤細胞中，似乎胚胎細胞和腫瘤細胞偏好表達OFA/iLRP。因此，該表達模式使OFA/iLRP成為致敏免疫系統(tǒng)的可能的候選蛋白質(zhì)，其用于治療癌癥和其他疾病[6]。 因此，特定OFA/iLRP肽在基于樹突狀細胞的治療中的用途是新的應用。樹突狀細胞(DC)是免疫細胞，其形成哺乳動物免疫系統(tǒng)的一部分。它們的主要功能為加工抗原物質(zhì)并將其呈遞于免疫系統(tǒng)其它細胞的表面。因此，它們起抗原呈遞細胞的功能。樹突狀細胞直接與非淋巴組織通信并調(diào)查非淋巴組織的損傷信號(如缺血、感染或炎癥)或腫瘤生長。一旦收到信號，樹突狀細胞就通過釋放IL-1、TNF α以及多種觸發(fā)淋巴細胞和骨髓細胞的其它炎癥細胞因子來啟動免疫應答。多種(如對腫瘤的)免疫缺陷被認為是由于樹突狀細胞功能缺失造成的。樹突狀細胞具有高的致敏MHC限制性T細胞的能力并提供了在原位呈遞抗原給T細胞的有效途徑，其既包括T細胞發(fā)育期間的自身抗原也包括免疫期間的外來抗原。因此，在將離體樹突狀細胞用作腫瘤或傳染病疫苗佐劑方面存在日益增長的興趣。樹突狀細胞可以源自一系列不同的來源(骨髓和淋巴)，其可指導免疫系統(tǒng)攻擊特定抗原。例如，其可源自以下來源單核細胞來源(CD 14+)、造血干細胞來源 (CD34+ 或 CD133+ 或 CDl 17+)、類漿細胞(CD303+/CD304+)、骨髓來源(CDlc+ 或 CD141+ 或 CD209+)或朗格漢斯細胞。一旦已致敏，無論離體、體內(nèi)或體外，樹突狀細胞將幫助個體自身免疫系統(tǒng)防止或治療所有類型的OFA/iLRP相關疾病或癌癥。樹突狀細胞的致敏或脈沖處理(pulse)是使樹突狀細胞暴露于靶蛋白質(zhì)來引起靶向免疫應答的方法。已顯示OFA/iLRP樹突狀細胞治療提高晚期癌癥患者存活，副作用最小[13，22]。 以前的實驗使用具有假定的MHC (主要組織相容性復合物)結合序列的肽致敏樹突狀細胞。 然而，假定的MHC結合位點由于其在肽上的位置或由于其跨多個肽，可能被免疫系統(tǒng)漏掉。 Siegel等人使用靶向于HLA-AM01的肽，但沒有考慮到肽溶解度和其它與肽相關的問題
4[22]。Rohrer等人分析了與小鼠來源的OFA/iLRP 12肽重疊的氨基酸的增殖譜[29]。該研究重點在分析Χ/η比，其中X為蛋白質(zhì)氨基酸長度而η為肽長度(

圖1)。然而，基于該連續(xù)(sequential)肽方法，假定的HLA (人白細胞抗原)位點由于多種原因仍可能被免疫系統(tǒng)漏掉或無法識別，所述原因包括但不限于肽可溶性、肽結構、HLA位點位于兩肽之間、 HLA位點側面與限制HLA結合的氨基酸相接以及不適當?shù)亩壗Y構。因此，盡管能提供信息，連續(xù)肽的使用具有高的可能性漏掉本可被識別(如果處理了全長蛋白質(zhì))的有用蛋白質(zhì)序列。事實上，之前的工作沒能顯示通過組合公開可用的HLA結合序列預測程序和使用尋找更可能產(chǎn)生免疫應答的區(qū)域的統(tǒng)計學方法已經(jīng)找到的若干假定HLA結合位點。此外，先前的基于OFA/iLRP細胞的治療使用了細菌表達的或小HLA特異性肽[13， 22]。細菌表達費時并難于以GMP認證的方式生產(chǎn)。因此，存在開發(fā)專門設計的肽的需要，所述肽帶有具有增加數(shù)目的假定MHC結合位點的區(qū)域，其用于刺激樹突狀細胞和免疫系統(tǒng)。 還存在開發(fā)使用肽的有效的OFA/iLRP樹突狀細胞治療的需要。發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了能夠致敏樹突狀細胞的分離的肽或其混合物。所述肽的實例包括但不限于VLQMKEEDV、QMKEEDVLK、QMEQYIYKR, GIYIINLKE、KLLLAARAI,、LLLAARAIVA、 LLAARAIVA, LAARAIVAI, AAATGATPI、TPGTFTNQI、RLLWTDPR、DPRADHQPL、QPLTEASYV、 PLTEASYVNL、MLAREVLRM、LRMRGTI SR. EIEKEEQAA、EKEEQAAAEK、KEEQAAAEK、EEQAAAEKA、 QAAAEKAVTK、AAAEKAVTK、VPSVPIQQF 和其混合物?？蓪㈩~外的氨基酸添加至所述肽或肽混合物的N-端和/或C-端。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽包括以下肽:PRADHQPLTEASYVNLPT(129), FREPRLLffTDPRADHQPLTEA(117)、 GRFTPGTFTNQIQAAFREPT(lOl)、 EEIEKEEQAAAEKAVTKEEFQG(208)、 TDPRADHQPLTEASYVNLPT(129-a)或 TTOKLLLAARAIVAIENPADV(54)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽源自OFA/iLRP的二聚化區(qū)域。所述肽能夠致敏樹突狀細胞。本發(fā)明的肽可以與提高所述肽的免疫刺激作用、穩(wěn)定性和/或可溶性的載體綴合。所述載體的實例包括但不限于，匙孔槭血藍蛋白(KLH)、血清白蛋白、生物學聚合物、抗體、化療、碳納米管、微電子/電流體裝置、分子機器、氨基酸MAP聚合物、生物學活性脂質(zhì)、 生物學活性糖分子/聚合物和膠體顆粒。本發(fā)明的肽也可被修飾以包括乙?；⒅舅峄?、肉豆蔻酸化、棕櫚?；⑵S氧羰基化、酰胺化(abidation)、對硝基苯胺、AMC、琥珀?；HS、CMK/FMK、D_氨基酸、二硝基苯甲?；?、甲基化、磷酸化、六狀、503!12、辛酸、生物素411^、6六11、丹磺?；? ^、附肌(、01卩八、 成環(huán)(cyclic formation)或多抗原肽系統(tǒng)(MAP)。本發(fā)明另一方面提供了包括本發(fā)明肽的組合物。該組合物可以是藥物組合物或疫苗。所述藥物組合物可以包含藥物學可接受的載體。該組合物也可以是由本發(fā)明的肽致敏的樹突狀細胞。本發(fā)明還提供了治療患有OFA/iLRP相關癌癥的對象的方法。該方法包括給對象以足夠減少OFA/iLRP相關癌癥發(fā)展的量施用本發(fā)明的肽(單獨地或作為混合物)的步驟。 在一個實施方案中，所述肽在對象中誘導減少OFA/iLRP相關癌癥發(fā)展的免疫應答。在另一個實施方案中，治療患有OFA/iLRP相關癌癥的對象的方法包括步驟(a)用本發(fā)明的肽致敏樹突狀細胞，(b)以足夠誘導免疫應答的量給對象施用已致敏的樹突狀細胞，所述免疫應答減少OFA/iLRP相關癌癥的發(fā)展。本發(fā)明的肽還可用于測定樣品中OFA/iLRP抗體的量的方法。該方法包括(a)在使得抗體與肽結合形成復合物的條件下使本發(fā)明的肽與樣品接觸，(b)測定樣品中形成的復合物的量。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽用于監(jiān)測對象中OFA/iLRP相關癌癥的疫苗接種治療的進展的方法。該方法包括步驟(1)向?qū)ο蟮牟课黄は禄蚱?nèi)施用本發(fā)明的肽，施用的量足以檢測對象對治療的免疫應答，(2)監(jiān)測在所述施用部位的反應直徑。在另外的實施方案中，本發(fā)明的肽用于離體檢測對象中OFA/iLRP相關癌癥治療的進展的方法。所述治療可誘導T細胞相關應答或B細胞相關應答。該方法包括步驟(1) 提供接受治療的對象的生物流體，(2)在使得肽與T細胞、B細胞或T細胞或B細胞產(chǎn)生的產(chǎn)物相互作用的條件下，使本發(fā)明的肽與所述生物流體接觸，( 通過ELISA、熒光偏振、共振或FACS方法測定相互作用的量。通過參考以下描述并結合附圖，本發(fā)明上述的和其它特征以及獲取和使用它們的方式將更顯而易見，并將被最好地理解。附圖僅描述了本發(fā)明的一般的實施方案并不因此限制其范圍。附圖簡述圖1. OFA/iLRP和HLA結合基序的計算機分析。㈧氨基酸數(shù)目作為預測的函數(shù)的圖。(B)氨基酸數(shù)目作為％ OPT的函數(shù)的圖。(C)分布位點數(shù)目作為5氨基酸分組(bin) 的函數(shù)的圖。圖2.所選擇的用于樹突狀細胞致敏的肽的Whisker圖。聚類的HLA結合肽作為％ OPT函數(shù)的圖。實心圓顯示了可歪曲結果并造成發(fā)現(xiàn)最強免疫原性區(qū)域的錯誤表示的離群值。圖3.脈沖處理的樹突狀細胞的熒光激活細胞分選(FACS)分析。(A)用全長重組人OFA脈沖處理的樹突狀細胞的FACS。(B)用肽混合物脈沖處理的樹突狀細胞的FACS。(C) 脈沖處理劑對樹突狀細胞識別1 肽的影響的圖。圖4.肽修飾對樹突狀細胞識別129區(qū)域的影響。㈧129肽的FACS。(B) 129a肽的FACS。(C) 1 和129a區(qū)域的平均熒光強度(MFI)。(D)脈沖處理劑對樹突狀細胞識別 129肽(相比于129a肽)的影響的圖。圖5. OFA/iLRP肽對細胞粘附的影響。(A)DU_145細胞粘附的圖。(B) SK-MEL細胞粘附的圖。圖6. OFA/iLRP肽對細胞活力的影響。㈧肽1的細胞活力圖，有或無層粘連蛋白。 (B)肽2的細胞活力圖，有或無層粘連蛋白。(C)肽3的細胞活力圖，有或無層粘連蛋白。發(fā)明詳述本發(fā)明一方面提供肽或肽混合物，其可用于針對OFA/iLRP脈沖處理樹突狀細胞。 所述肽(其指導免疫系統(tǒng)識別OFA/iLRP蛋白的特定區(qū)域)圍繞一系列獨特的蛋白質(zhì)區(qū)域進行設計，例如同型二聚體形成區(qū)域、層粘連蛋白結合區(qū)域、多藥耐藥區(qū)域、核糖體相互作用區(qū)域和其它具生物學意義的位點。所述肽基于全長蛋白質(zhì)進行設計，重點在于對OFA/ iLRP 二聚體形成、抗原性、MHC-I結合、MHC-2結合、蛋白酶體裂解、溶劑可接近性和蛋白序列具有特異性的肽。本發(fā)明使用計算機和統(tǒng)計學分析確定可用于OFA/iLRP相關疾病治療的最優(yōu)的肽。本方法使得可以進行X-n肽的計算分析以及加上多重肽長度的快速分析，增加了使用OFA/iLRP或任何其它用于相似治療/療法的可能的蛋白質(zhì)來開發(fā)用于樹突狀細胞或疫苗接種治療的最優(yōu)的肽的可能性。為測定不同OFA/iLRP 表位的分布，使用 SYFPEITHI (Hans-Georg Rammensee，Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic SYFPEITHI database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics(1999)50 213-219 (access via :www. syfpeithi. de))發(fā)掘 OFA/iLRP 蛋白序列所有已知的 HLA 結合基序。然而，將含有數(shù)據(jù)庫中所有已知HLA結合基序的序列、起始位點和％最優(yōu)結合(％匹配實驗HLA結合數(shù)據(jù))的表格存儲在Excel中，而不是逐個地分析HLA結合基序。一旦獲取了 HLA結合位點的數(shù)據(jù)，使用用于Mac OS X的I^rism 5. O (GraphPad軟件公司)進行分析。 為尋找具有增加的HLA結合位點的區(qū)域，完成了若干不同的分析。首先，繪制了預測的HLA 結合位點的起始位點以顯示具有增加的HLA結合可能性的潛在區(qū)域。然后，檢查最優(yōu)百分比(OPT)并對氨基酸的起始位點作圖。最后，為尋找具有增加的HLA結合位點數(shù)目的區(qū)域， 對位點的數(shù)目進行分組(binned) (5氨基酸)。這些分析共同表明存在擁有更多HLA結合位點分布的特定區(qū)域。一旦鑒定了具有高數(shù)目HLA結合位點的區(qū)域，從Excel表單中提取這些區(qū)域的數(shù)據(jù)并且將％ OPT對所有預測的HLA結合區(qū)域作圖。為分析與整個蛋白(所有HLA 位點)顯著差異的區(qū)域，使用單因素AN0VA，隨后進行Dimnets多重比較檢驗來分析所選擇的肽區(qū)域。該分析顯示了組間存在顯著的差異(P = 0. 0068)。Durmets事后(post-hoc)分析顯示了 132-134和211-217肽組與所有MHC肽的對照組有顯著差異= ρ < 0. 05)(圖 2)。使用在本文中描述的本發(fā)明的發(fā)掘方法，鑒定了可用于致敏免疫系統(tǒng)的肽。表1 提供了本發(fā)明的肽序列的實例列表。分析區(qū)域可假定地結合MHC蛋白的次數(shù)，可選擇和/或組合肽區(qū)域來開發(fā)生物活性肽(圖1)。使用對區(qū)域的分布分析和平均％ OPT分數(shù)，發(fā)現(xiàn)了五個區(qū)域具有更高的結合免疫系統(tǒng)適當組分的可能性。這使得可以用一系列不同的離體、 體外或體內(nèi)刺激作用致敏患者來治療OFA/iLRP相關的疾病。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的肽包括但不限于VLQMKEEDV、QMKEEDVLK、 QMEQYIYKR、GIYIINLKR、KLLLAARAI，、LLLAARAIVA、LLAARAIVA, LAARAIVAI, AAATGATPI、 TPGTFTNQI、RLLWTDPR、DPRADHQPL、QPLTEASYV、PLTEASYVNL、MLAREVLRM、LRMRGTI SR. EIEKEEQAA, EKEEQAAAEK、KEEQAAAEK、EEQAAAEKA、QAAAEKAVTK、AAAEKAVTK、VPSVPIQQF 和其混合物?？商砑宇~外的氨基酸到所述肽或肽混合物的η-端和/或c-端。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽源自OFA/iLRP的二聚化區(qū)域。為了免疫刺激作用、穩(wěn)定性和/或肽可溶性，本發(fā)明的肽可與適當?shù)妮d體綴合。綴合的類型包括但不限于匙孔槭血藍蛋白(KLH)、血清白蛋白、生物學聚合物、抗體、化療、 碳納米管、微電子/電流體裝置、分子機器、氨基酸MAP聚合物、樹枝狀聚合物、生物學活性脂質(zhì)、生物學活性糖分子/聚合物、膠體顆粒、其它肽序列以及包括一系列蛋白質(zhì)。用于綴合的半胱氨酸殘基的位置可根據(jù)需要出現(xiàn)在末端或內(nèi)部。綴合的目標是提高免疫系統(tǒng)抗癌癥治療活性或任意其它涉及OFA/iLRP肽的相關活性。本發(fā)明的肽序列可能略有變化以提供更高的免疫系統(tǒng)反應性、增加的可溶性和其它功能，并且這樣的肽序列變化被視為本發(fā)明肽的一部分。此外，本發(fā)明的一或多種免疫反應性肽序列可被放置在一起以形成新的免疫反應性肽。所述序列可來自免疫活性高度可預測的區(qū)域或來自若干其它位點或蛋白質(zhì)。此外，所述肽可用于阻斷或增強與免疫系統(tǒng)無關的特定功能?？芍圃煲换蚨鄠€重復肽的串聯(lián)肽以形成長的生物學活性聚合物。在制備期間，所述肽可以有一或多種修飾，包括但不限于乙?；?、制劑(formulation)、脂肪酸化、肉豆蔻酸化、棕櫚酰化、芐氧羰基化、酰胺化、對硝基苯胺、AMC、琥珀?；?、NHS、CMK/FMK、 D-氨基酸、二硝基苯甲?；⒓谆?、磷酸化、S03H2、辛酸、生物素、FITC、GAM、丹磺?；?、 MCA、HYNIC、DTPA、成環(huán)、多抗原肽系統(tǒng)(MAP)和/或影響OFA/iLRP肽功能的其它修飾，其包括增加可溶性、穩(wěn)定性、免疫反應性和/或生物學活性。本發(fā)明的肽可針對OFA/iLRP的特定區(qū)域，其在OFA/iLRP相關疾病或疫苗接種治療期間可降低非特異性影響。所述肽由表1所示的肽序列或肽序列的組合制成。為確定具有免疫系統(tǒng)刺激作用的可能性增加的區(qū)域，設計了成簇的假定HLA結合位點，并且將平均％ OPT (與共有序列相比時肽的分數(shù))[53，54]與OFA/iLRP中所有假定的HLA位點進行比較(圖2)。圖2中列出了用于比較的特別設計為包含多于一個假定HLA結合位點的肽的實例。單獨的或組合的本發(fā)明的肽可用于以其提供的OFA/iLRP序列致敏免疫系統(tǒng)。設計為誘導針對OFA/iLRP的免疫應答的肽也可用于提供額外的臨床應用，包括但不限于受體結合、阻斷層粘連蛋白功能和/或影響其它的OFA/iLRP細胞功能。終產(chǎn)物可以是綴合的以提高OFA/iLRP肽的免疫反應性。綴合可以通過本文中描述的或本領域已知的不同方法形成，包括添加半胱氨酸來與馬來酰亞胺(HiaIedioamide)KLH蛋白反應[55，56]。這些肽和其組合，可以在用于離體、體內(nèi)或體外針對癌癥的疫苗接種之前進行綴合或修飾。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，基于計算機的方法鑒定了若干可能的蛋白質(zhì)序列，其可用于樹突狀細胞和免疫系統(tǒng)治療。在一個實施方案中，計算了設計于第132、117和M位氨基酸周圍的3種肽的平均％ OPT (圖2)。將所設計的肽與平均％ OPT分數(shù)進行比較，它們都高于平均值，其中132區(qū)域是顯著差異的(圖幻。所述肽擁有至少3個氨基酸的側翼序列， 其不是HLA典型序列的部分并可被修飾(如果需要)以最優(yōu)化抗原加工和HLA結合。其它可能的肽起始于第104和211位氨基酸周圍并且可單獨地或與其它肽組合應用。本發(fā)明的肽可用于在樹突狀細胞離體誘導和致敏中替代細菌表達的OFA/iLRP。所述肽可綴合于多種大分子，條件是它們適合于人或獸醫(yī)學應用。 肽可通過化學合成或使用大腸桿菌等的生化合成制備。本領域技術人員熟知的方法可用于合成。當本發(fā)明的肽為化學合成時，可應用肽合成領域眾所周知的方法。例如，可例舉這樣的方法如疊氮化物法、酸氯法、酸酐法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、羰基二咪唑法和氧化還原法。可使用固相合成或液相合成。也可使用商業(yè)化的肽合成儀(如Siimadzu PSSM-8)。反應之后，本發(fā)明的肽可通過組合常規(guī)純化方法(如溶劑萃取、蒸餾、柱層析、液相色譜或重結晶)純化。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，肽可以包含在給對象施用的組合物中。該組合物可以是藥物組合物或疫苗。藥物組合物可以包含藥物學可接受的載體。該組合物也可以是由本發(fā)明的肽致敏的樹突狀細胞。如本文中所用的，樹突狀細胞(DC)是加工抗原物質(zhì)并將其呈遞至免疫系統(tǒng)其它細胞的表面的免疫細胞，因此其起抗原呈遞細胞的功能?？捎貌煌姆椒ㄊ箻渫粻罴毎麑乖旅?。在一個實施方案中，這些方法包括使樹突狀細胞與抗原肽接觸(“肽脈沖處理”) 的步驟。該方法包括將樹突狀細胞與一或多種抗原肽(即源自抗原的肽)溫育不同時間 (通常約30分鐘至約5小時)，使得用所述肽處理獲得抗原呈遞細胞，也稱為致敏的樹突狀細胞。用癌癥特異性抗原處理樹突狀細胞可通過任意方法(當疫苗組合物或包含肽的組合物施用于哺乳動物時，其導致樹突狀細胞呈遞抗原從而刺激宿主免疫)，例如通過在給哺乳動物施用疫苗組合物前在抗原存在下脈沖處理或培養(yǎng)樹突狀細胞。樹突狀細胞可通過可使樹突狀細胞到達適當?shù)募毎娜魏畏椒ńo哺乳動物施用。 這些方法包括，如，注射、輸注、沉積、植入、口服或局部施用，或其任意組合。注射可以為， 如，靜脈注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、皮下注射或腹腔注射。在給定時間段內(nèi)可以施用單一或多劑量，取決于癌癥，其無需過多的實驗即可由本領域技術人員確定。注射可在多部位進行。樹突狀細胞可單獨地或組合其它治療劑施用。如本文中所用，“疫苗”意指含有抗原的無害形式的生物體或物質(zhì)。疫苗被設計為觸發(fā)免疫保護性應答。疫苗可以為重組的或非重組的。當接種到非免疫宿主時，疫苗會引起對所述生物體或物質(zhì)的主動免疫，但不會引起疾病。疫苗可采取以下形式，例如，類毒素， 其定義為已脫毒但仍保持其主要免疫原性決定簇的毒素；或滅活的生物體，如傷寒、霍亂和脊髓灰質(zhì)炎病毒；或減毒生物體，其為活的但非毒力形式的病原體，或其可以是由該生物體編碼的抗原，或其可以是活的腫瘤細胞或腫瘤細胞上存在的抗原。雖然疫苗組合物的劑量取決于抗原、物種、接種疫苗或?qū)⒔臃N疫苗的宿主體重等等，在小鼠模型中，疫苗組合物藥物學有效量通常范圍為每千克體重每劑約50.mU. g到約 500. mu. g0作為一般規(guī)則，本發(fā)明的疫苗組合物方便地口服、胃腸外(皮下、肌肉、靜脈、 皮內(nèi)或腹腔)、口腔、鼻腔或透皮施用。本發(fā)明預期的施用途徑取決于抗原物質(zhì)和助劑 (co-formulant)0疫苗組合物的劑量取決于所選擇的抗原、施用途徑、物種、體重和其它標準因素。 預期本領域普通技術人員可以輕松并容易地滴定測量每種抗原的用于免疫原性應答的適當劑量以實現(xiàn)有效的免疫量和施用方法。本發(fā)明的組合物配制成與其預定施用途徑兼容。施用途徑的實例包括胃腸外，如靜脈、皮內(nèi)、皮下，口服(如吸入)，透皮(局部)，穿粘膜和直腸施用。用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下應用的溶液或懸浮液可包含以下組分無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖液，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調(diào)整張力的物質(zhì)，如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH。 胃腸外制備物可封閉在安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。適合于注射用途的組合物包括無菌水溶液(如果可溶于水)或分散體和用于即時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。對靜脈施用，合適的載體包括生理鹽水、無菌水、Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在任何情況下，組合物必須是無菌的并應為流體的(達到易于注射的程度)。組合物在生產(chǎn)和儲存的條件下應該是穩(wěn)定的，并且必須防止微生物(如細菌和真菌)的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)， 其包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)和其合適的混合物。通過例如使用涂層(如卵磷脂)、維持需要的顆粒尺寸(就分散體而言)以及使用表面活性劑可保持適當?shù)牧鲃有浴Ｎ⑸镒饔玫念A防可通過多種抗細菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，例如，對羥苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等等。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如，糖或多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。通過在組合物中包含延遲吸收的物質(zhì)(例如單硬脂酸鋁和明膠)可使得注射組合物的吸收延長。無菌注射溶液可通過在適當?shù)娜軇┲幸运璧牧恳牖衔锱c上述列舉成分的一種或組合而制備，根據(jù)需要，隨后過濾消毒。一般來說，分散體可通過引入化合物到無菌容器中制備，其含有基本分散介質(zhì)和所需的上述例舉的其它成分。就用于制備無菌注射溶液的無菌粉末來說，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其從預先無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分加上任意額外的所需成分的粉末?？诜M合物一般包含惰性稀釋劑或可食用的載體。為口服治療施用的目的，組合物可摻入賦形劑并以片劑、錠劑或膠囊(如明膠膠囊)的形式使用?？诜M合物也可以用流體載體制備，用作洗口藥?？砂幬飳W兼容的結合劑和/或佐劑物質(zhì)作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可包含任意下述成分，或具類似性質(zhì)的化合物粘合劑，如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖；崩解劑，如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或^erotes ；助流劑，如膠體二氧化硅；甜味劑，如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或柑橘香精。對吸入施用，組合物以氣霧噴霧的形式從包含合適的推進劑(例如，氣體如二氧化碳)的壓力容器或分配器或從噴霧器輸送。全身施用也可通過穿粘膜或透皮方法。為穿粘膜或透皮施用，在配方中使用了適合于待穿透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在本領域一般是已知的，并包括，例如對于穿粘膜施用而言，去污劑、膽鹽、夫西地酸衍生物。穿粘膜施用可通過使用鼻腔噴霧或栓劑實現(xiàn)。 對透皮施用，化合物配制成本領域一般已知的軟膏、油膏、凝膠或乳膏。本發(fā)明的制備物還可以制備為用于直腸輸送的栓劑(例如，與常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂和其它甘油脂類一起)或保留灌腸的形式。在一個實施方案中，組合物用保護化合物不會從身體迅速消除的載體制備，如控釋制劑，包括植入物和微膠囊輸送系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾摹⑸锛嫒莸木酆衔?，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這樣的制劑的方法將會是本領域技術人員所熟悉的。所述物質(zhì)還可以從Alza Corporation和 NovaPharmaceuticals, Inc.商購獲得。脂質(zhì)體懸浮物(包含靶向于被感染細胞的帶有針對病毒抗原的單克隆抗體的脂質(zhì)體)也可以用作藥物學可接受的載體。以易于施用和劑量一致的劑量單位形式配制口服或胃腸外組合物是有益的。本文中所用的“劑量單位形式”指物理上離散的單位，其適合作為用于待治療的對象的單位劑量，每個單位含有經(jīng)過計算以產(chǎn)生預期的治療效果的預定量的活性化合物以及所需的藥物學載體。
本發(fā)明的組合物，可包含在容器、包裝或分配器中，與施用指南一起形成包裝好的產(chǎn)品。其它活性化合物也可以并入組合物中。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的肽及藥物學可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。 藥物學可接受的賦形劑為本領域已知的，為有利于藥物學有效的物質(zhì)施用的相對惰性的物質(zhì)。例如，賦形劑可提供形狀或稠度或起稀釋劑的作用。合適的賦形劑包括但不限于，穩(wěn)定劑、潤濕和乳化劑、用于不同滲透壓的鹽、封裝劑、緩沖液和皮膚穿透增強劑。賦形劑和用于胃腸外及非胃腸外藥物輸送的制劑闡述于Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing(2000)。本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽檢測、診斷和監(jiān)測以及治療OFA/iLRP相關癌癥的方法。為了本發(fā)明的目的，OFA/iLRP相關癌癥指任何與OFA/iLRP表位表達(相對于正常樣本增加或減少，和/或不適當?shù)谋磉_，如出現(xiàn)在通常缺乏表位表達的組織和/或細胞中) 相關的疾病、紊亂或病變。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有OFA/iLRP相關癌癥的對象的方法。該方法包括以足夠減少OFA/iLRP相關癌癥發(fā)展的量給對象施用本發(fā)明的肽(單獨地或作為混合物)的步驟。所述肽可在對象中誘導減少OFA/iLRP相關癌癥發(fā)展的免疫應答。免疫應答可包括T細胞或B細胞相關的應答。該肽還可誘導不依賴于免疫應答的應答。這類應答的實例可以是，但不限于活力、粘附、轉(zhuǎn)移、血管化或其它可能不依賴于免疫應答的應答。在另一個實施方案中，治療患有OFA/iLRP相關癌癥的對象的方法包括步驟(a)用本發(fā)明的肽致敏樹突狀細胞，(b)以足夠誘導免疫應答的量給對象施用已致敏的樹突狀細胞，所述免疫應答減少OFA/iLRP陽性癌癥的發(fā)展。樹突狀細胞的致敏及施用在上文已討論，在此不再重復。樹突狀細胞的實例包括但不限于單核細胞來源的細胞(CD 14+)、造血干細胞來源的細胞(⑶34+或⑶133+或⑶117+)、類漿細胞(⑶303+/⑶304+)、骨髓來源的細胞(CDlc+或 CD141+或 CD209+)或朗格漢斯細胞(Langerhans cell)。本發(fā)明的肽還可用于測定樣品中針對OFA/iLRP的抗體的量的方法。該方法包括(a)在使得抗體與肽結合形成復合物的條件下使本發(fā)明的肽與樣品接觸，(b)測定樣品中形成的復合物的量?？捎贸Ｒ?guī)方法測定具有抗體的復合物的量。實例包括但不限于，ELISA、熒光偏振、 共振、FACS或任何已知的能檢測抗體的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽用于監(jiān)測對象中OFA/iLRP相關癌癥的疫苗接種治療的進展的方法。該方法包括步驟(1)向?qū)ο蟮牟课黄は禄蚱?nèi)施用本發(fā)明的肽，以施用的量足以檢測對象對所述治療的免疫應答，(2)監(jiān)測所述施用部位的反應直徑。在另外的實施方案中，本發(fā)明的肽用于離體監(jiān)測對象中OFA/iLRP相關癌癥治療的進展。所述治療能夠誘導T細胞相關應答或B細胞相關應答如抗體應答。該方法包括步驟(1)提供接受治療的對象的生物流體，( 在使得肽與T細胞或B細胞或由T細胞或 B細胞產(chǎn)生的產(chǎn)物相互作用的條件下，使本發(fā)明的肽與所述生物流體接觸，(3)通過ELISA、 熒光偏振、共振或FACS方法測定相互作用的量。為了本發(fā)明的目的，生物流體為任意的生物學流體或組織裂解液，其可被排泄、分泌、用針獲得或作為病理過程的結果而出現(xiàn)。生物流體的實例包括但不限于，血液、尿、組織裂解液、血清、血漿、膽汁、汗液、唾液、胞囊液、水皰液、膿腫液、腦脊液或其它。
T 細胞的產(chǎn)物包括但不限于，IL-2、IFN- y、TNF- α、IL-4、IL-6、IL-17A、IL-10、 T細胞受體、趨化因子、穿孔素、顆粒酶b、IL-9、IL-I β、GM-CSF, TGF- β、⑶4、⑶8、整合素、 MHC或其它。B細胞的產(chǎn)物包括但不限于，免疫球蛋白、BLAME、BTC、HVEM/TNFRSF14、IFNGR2、 IgG、IgM、IL-10、IL-13、整合素、DLF、LAX、白三烯、Lyn, LillrcU NFAMI、NTB-α、0X40L、 Pax5、PDCD6、WSX-1/L-27R、TER-119、TRA、TREML2、TSLP, Vav-UB 細胞受體、BAFF, CD79A、 CD40 配體、BCL-6、ADAM、IL-I1、IL-4、CD27、STAT 和其它。本發(fā)明的肽具有很多應用。下面列出一些應用作為實例。肽在樹突狀細胞治療中的用途本發(fā)明的肽可用作樹突狀細胞治療或離體免疫治療的一部分。OFA/iLRP肽，單獨地或聯(lián)合KLH或其它免疫系統(tǒng)刺激劑、佐劑或其它分子，可用于引起離體免疫應答?！懊}沖處理的”樹突狀細胞被注射回供體以提供可能能夠減少所有形式的OFA/iLRP陽性癌癥的發(fā)展的抗癌免疫應答。與KLH綴合的肽的初步效果可在細胞培養(yǎng)中利用細胞因子/趨化因子的表達測量。制備用于致敏的OFA/iLRP肽，并以分離自外周血、白細胞采集物細胞或棕黃層的單核細胞開始，從單核細胞產(chǎn)生樹突狀細胞[30，31]。單核細胞的分離和培養(yǎng)遵循標準方案，其使用完全RPMI-10 (含胎牛血清、15mM HEPES和IX抗生素/抗真菌溶液的RPMI 1640或類似物)[30-35]。單核細胞的分化和脈沖處理(暴露于抗原)將根據(jù)標準方法完成[13]?？稍诩毎囵B(yǎng)基中測量Y-干擾素(Y-IFN)的產(chǎn)量作為樹突狀細胞致敏和成熟的度量。細胞培養(yǎng)基中Y-IFN的提高(統(tǒng)計學地高于未刺激的對照細胞)被視為由OFA/ iLRP肽刺激的陽性樹突狀細胞。之前的研究使用了若干不同的細胞因子組合，可測定多細胞因子或趨化因子以提供完整的細胞因子全景(landscape)。可實施額外的使用分子表達差異聚類的分析來確定細胞刺激之前、細胞刺激期間和細胞刺激之后的免疫細胞亞組。動物模型可用于確定不同的肽在注射后對體內(nèi)細胞因子全景的確切效果。這也將為擴展到人類治療的設想提供證據(jù)。若干模型系統(tǒng)(即細胞培養(yǎng)、健康供體全血和動物模型)的組合將提供數(shù)據(jù)來使OFA/iLRP肽模型發(fā)展為人抗癌癥治療。之前已使用肽脈沖處理人樹突狀細胞[23]；然而，除了一個例外，所使用的區(qū)域是不同的。之前的工作使用了起始于第58位氨基酸的肽[23]，而這里的肽由于非常特殊的原因起始于氨基酸M。首先，為了更好的可溶性和其它與三個非極性疏水殘基有關的問題[23]而選擇該起始位點。其相鄰的氨基酸擁有非極性的側鏈，因此，選擇蘇氨酸作為起始氨基酸。此外，電荷的缺乏和序列的變化可能足以影響結合，其反過來可影響MHC結合潛力[53,54,57]ο肽作為樹突狀細胞患者免疫應答工具的用途根據(jù)本法明的另一個方面，本發(fā)明的肽，例如在表1中列出的肽，可用于監(jiān)測使用 OFA/iLRP的癌癥疫苗接種治療的進展。在一個實施方案中，單獨的片段可皮下或皮內(nèi)注射以監(jiān)測患者的免疫應答。注射后，監(jiān)測該部位的應答并測量反應直徑。如果多于一種肽用于致敏，可存在多個注射部位并且可對反應進行比較。如果所述肽綴合于KLH或類似的物質(zhì)，綴合物可單獨用作免疫應答的陽性對照。當存在多于2或3種致敏肽/試劑待測試時， 所述肽可用于修改的皮膚劃痕測試、皮膚點刺測試或皮膚斑貼測試(與Mantoux/PPD測試類似)[36]。用于皮膚點刺測試的肽可制備于一系列稀釋液中以及用一系列來自OFA/iLRP、 KLH (或其它綴合物)或任意其它用于樹突狀細胞/癌癥免疫治療的蛋白質(zhì)的不同的肽來制備[13，27]。稀釋度和/或不同的肽可用于反映(map)個體的免疫應答并用于致敏免疫系統(tǒng)。如果蛋白質(zhì)(代替肽)用于致敏患者，修改的皮膚斑貼/點刺測試可用于尋找該個體的免疫反應表位。合成來覆蓋蛋白質(zhì)假定的MHC-I或2的肽(6到30個氨基酸)可用于致敏 /疫苗接種患者?？梢耘c選擇OFA/iLRP肽類似的方式選擇該肽?？蛇x擇地，可合成覆蓋了蛋白質(zhì)序列的肽文庫并用于測定表位和反應的量。針對肽和對照溶液的免疫應答可通過可獲得的皮膚斑貼測試試劑盒施加器來劃傷/點刺皮膚而同時測定?；蛘?，可在針上“裝載” 適當?shù)碾幕驅(qū)φ杖芤翰⒖蓽y試一塊皮膚。免疫反應最快可在20分鐘內(nèi)出現(xiàn)。然而，反應可能在接種后1周期間發(fā)生，盡管最大的過敏反應傾向于在接種后M-72小時內(nèi)發(fā)生。一旦確定了肽的反應和最優(yōu)稀釋度，醫(yī)生可利用標準測試確定樹突狀細胞或疫苗治療的規(guī)模和等級。該測試與用于結核病的結核菌素或核菌素/PPD測試類似[36]。遲發(fā)過敏性反應提供的信息將表明樹突狀細胞或疫苗接種是有效的以及患者對靶表位有多敏感。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽可用于通過離體定量細胞因子應答來測定由樹突狀細胞或疫苗接種治療引起的免疫反應的程度。為了實施離體細胞因子應答的測量，抽取患者的血并通過甲泛葡胺梯度、Ficoll梯度或低滲裂解紅細胞來分離白血細胞。洗滌所得的WBC并置于適當?shù)纳L培養(yǎng)基中。所述細胞在含5%二氧化碳的濕潤環(huán)境下于37°C溫育。18-M小時之后，使細胞生長于單獨的平板或多孔平板上，其可用一系列來自OFA/iLRP 的肽稀釋液或任何其它樹突狀細胞或疫苗接種治療來“激發(fā)”(challenge)。如上述溫育至72小時后，分離細胞培養(yǎng)基并用標準ELISA或多重ELISA技術測定細胞因子/趨化因子的表達。一些可用于測定免疫活性的細胞因子表達包括但不限于GM-CSF、IFN- y , IL-4、 IL-10、TGF-a ,TNF-a、IL-6、IL-2和/或IL-12。若干其它常用的技術可應用于測定OFA/ iLRP和OFA/iLRP肽治療的免疫應答[37-40]。肽作為疫苗的用途本發(fā)明的肽，例如在表1中所列出的肽，可單獨地或以綴合狀態(tài)用作體內(nèi)疫苗。它們可直接注射進個體以提供針對癌癥的保護(包括預診)或幫助減慢現(xiàn)有癌癥的發(fā)展。所述肽與適當?shù)牡孜锞Y合以賦予適當?shù)捏w內(nèi)疫苗接種應答。個體通過肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、血管內(nèi)、 口服或通過任何其它常用的途徑/機制暴露于OFA/iLRP肽。一旦被注射，個體的免疫系統(tǒng)發(fā)起適當?shù)拿庖邞鹨缘钟鵒FA/iLRP陽性癌癥和可能的其它OFA/iLRP相關疾病。疫苗接種對以下是有用的(i)降低患OFA/iLRP陽性癌癥的可能性；(ii)對于局部化形式的OFA/iLRP陽性癌癥，在治療后降低復發(fā)率；(iii)幫助增強目前化療、放射同位素植入 (radionucleotide-seeding)或基于放射性的癌癥治療；(iv)幫助減慢晚期癌癥的發(fā)展； (ν)增強通過OFA/iLRP致敏的樹突狀細胞治療的免疫力。所述肽可注射進動物，以在一系列致敏和/或針對OFA/iLRP的最小效價后針對 OFA/iLRP致敏。作為非特異性免疫系統(tǒng)影響的對照，對照動物可針對匙孔槭血藍蛋白致敏。 在適當系列的致敏后，可通過注射OFA/iLRP陽性癌細胞到已致敏動物尾靜脈中對動物進行“激發(fā)”。所注射的癌細胞將定殖于動物的肺中。針對OFA/iLRP致敏的動物在肺中應該擁有相對未處理的動物更低數(shù)目的癌集落(colony)?；蛘撸墒褂闷渌鼊游锬Ｐ?度量。然而，使用免疫功能低下的動物的系統(tǒng)由于治療的性質(zhì)而可能無法工作。多數(shù)動物癌癥模型的問題是其使用SCID、血液學來源或缺乏完整功能的免疫系統(tǒng)的其它系統(tǒng)。然而，OFA/ iLRP癌癥治療先前已成功地在動物中建立模型W，9，11，18，23，41-43]。由于本治療的免疫性質(zhì)，需要有功能的免疫系統(tǒng)。存在可選擇的方法來測定這些肽針對OFA/iLRP陽性癌癥的治療價值?？蓱萌舾善渌Ｓ玫募夹g測定OFA/iLRP和OFA/iLRP肽治療的免疫應答 [37-40]，其中的相關內(nèi)容通過引用并入本文中。肽用于治療OFA/iLRP相關癌癥的用途本發(fā)明的肽，例如在表1中列出的肽，單獨地或組合地，可以綴合或非綴合形式用于通過可能不依賴于免疫系統(tǒng)或與免疫系統(tǒng)協(xié)同的作用改變涉及OFA/iLRP的疾病的發(fā)展。例如，OFA/iLRP的肽G區(qū)域已顯示為通過層粘連蛋白受體的穩(wěn)定化在轉(zhuǎn)移中發(fā)揮功能 [16，M，44]。表1中列出的肽，包括其突變和/或修飾的形式，可通過影響OFA/iLRP的活性而用作藥劑。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了測定對哺乳動物及非哺乳動物細胞的生長速率的藥理學效果測試。該測試包括以下步驟使細胞在有或無不同濃度的本發(fā)明的肽的條件下生長，測量對細胞凋亡、細胞壞死和細胞增殖的影響?？蓪FA/iLRP陽性癌細胞體外生長于具有多種劑量的本發(fā)明肽的不同基底膜上。肽的效果可通過不同的方法測量， 其包括但不限于，DNA梯形條帶、細胞死亡檢測ELISA、半胱天冬蛋白酶測量、TUNEL測定、 Annexin-V膜改變、DNA染色、FAS、p53、細胞毒性測定、細胞增殖和細胞活力。所述肽可用于提高或降低OFA/iLRP陽性癌細胞的侵襲性。這可通過在多種濃度， 有和無所述肽的條件下使OFA/iLRP陽性細胞生長，使用與若干涉及其它蛋白質(zhì)的研究類似的修改的Boyden-chamber來測量[45_48]。所述肽還可用于影響細胞粘附并可用標準方法測量。例如，粘附培養(yǎng)的OFA/iLRP陽性癌細胞在不同的胞外基質(zhì)蛋白(ECM)存在下和肽一起培養(yǎng)。然后通過標準方法測定細胞來確定肽存在時細胞系的相對附著W9-52]。若干其它常用的技術可應用于測定OFA/iLRP對細胞活力、細胞增殖、細胞死亡和細胞凋亡的影響[37-40]。肽用于監(jiān)測OFA/iLRP相關疾病的用途本發(fā)明的肽可用于監(jiān)測對OFA/iLRP相關疾病的離體或體外應答。例如，表1中列出的肽，單獨地或組合地，以綴合或非綴合的形式，可用于測定對疾病治療的身體應答的程度。在表1中列出的肽可包被在固體基質(zhì)上(單獨地或組合地)并且細胞應答、自體免疫抗體的存在、結合蛋白的出現(xiàn)和/或其它測試可用于測定對樹突狀細胞治療的應答。肽用于表位檢測和免疫球蛋白定量的用途所述肽可用作體外表位檢測及免疫球蛋白定量的底物。表1中列出的OFA/iLRP 表位可包被在乳膠珠或顆粒上并可用于使用凝集反應篩選患者血清。簡而言之，表1中所列出的肽可附著于顆粒如乳膠或膠體上。所述肽/顆?；旌衔锟膳c患者血清溫育來測量存在的與OFA/iLRP肽反應的免疫球蛋白相對量。如果只有一種肽試劑用于致敏樹突狀細胞， 那么該肽就是唯一所需的。如果全長蛋白質(zhì)試劑用于致敏樹突狀細胞，那么可預測如表1 所列出的肽的一系列肽。為降低聚類的肽區(qū)域的總數(shù)目，可如上述組合MHC肽預測。這些肽單獨地綴合于乳膠珠、膠體或顆粒，并用于凝集反應研究。為測定反應性，將稀釋或非稀釋狀態(tài)的患者血清轉(zhuǎn)移至具有約25mm直徑的蠟圈的血清學玻璃盤上，或轉(zhuǎn)移至特別設計為血清溫育模板的平臺上。血清可與適當量的肽/顆粒混合物溫育。血清、肽/顆?；旌衔飸谒狡脚_上不斷地旋轉(zhuǎn)以防止非特異性凝集反應。測試可包括陽性血清和陰性對照血清。在室溫旋轉(zhuǎn)并溫育15分鐘至2小時后，讀取凝集反應并根據(jù)凝集反應程度分級。在某些情況下，可加入額外的抗人抗體以提高非IgM分子的靈敏度和檢出率。這是上述凝集反應測試的擴展并稱為“間接凝集反應”。此外，IgM(直接凝集反應)對IgG(被動凝集反應)的比可提供患者疫苗接種狀態(tài)的臨床相關信息。這種技術可應用于任何樹突狀細胞治療或癌癥疫苗，其中患者對特定表位的免疫需要快速地測定并參考分級量表進行解釋。作為凝集反應評分的替代物，測試可采取分光光度計、化學發(fā)光、放射性、電子或熒光定量。若干其它常用的技術可應用于測定OFA/iLRP和OFA/iLRP肽治療的免疫應答[37-40]。肽在酶聯(lián)免疫測定(ELISA)中的用途本發(fā)明的肽可用于ELISA測定。ELISA測定可用于定量和/或檢測可溶性抗原或抗體。另外，使用不同的肽來制造針對不同的OFA/iLRP肽的特異性單獨應答。第一種應用是將所述肽用作針對接受OFA/iLRP治療的患者血清的抗原。該方法遵循標準方案[40]。 第二種方法將是所述肽的另一種新型的應用，其作為標準直接競爭性測定法來測定循環(huán)抗原。該方法遵循標準方法，但使用本發(fā)明的肽W0]。下面的實施例是為了說明而不是限制本發(fā)明的范圍。雖然這樣的實施例是那些可能被使用的典型實施例，仍可選擇地利用本領域技術人員已知的其它步驟。事實上，基于本文中的教導，本領域普通技術人員無需過多的實驗即可容易地設想并產(chǎn)生進一步的實施方案。實施例1肽預測及與OFA致敏的樹突狀細胞結合使用基于計算機的聚類方法預測了若干區(qū)域(圖幻。選擇了起始于第1 位氨基酸的區(qū)域(Ac-CADHQPLTEASYVNLPT-酰胺)，因為其可用于進一步顯示肽修飾的效果。此外， 1 位于已顯示為不含有表位并缺乏YVNLPTIAL表位的一半(以前的研究顯示為必須的) 的區(qū)域中{Rohrer，2006#l}。為確定1 區(qū)域是否具抗原性，用全長的重組人OFA脈沖處理樹突狀細胞，使其成熟并用熒光標記肽分析1 表位(圖3A和C)。⑶14+單核細胞以每毫升IXlO6個細胞生長于含有1000IU/ml GM-CSF和 1000IU/ml IL-4(細胞Genix Antioch，IL)的無血清樹突狀細胞培養(yǎng)基中。用100ng/ml的 rHu OFA或以下肽的等量混合物(20ng/ml)脈沖處理細胞36小時(129)CPRADH0PLTEASYVNLPT-0H ；(117) FREPRLLffTDPRADHQPLTEAC-酰胺；(101)CGRFTPGTFTNQIQAAFREPT-OH ；(208) Ac-EEIEKEEQAAAEKAVTKEEFQGC-酰胺(54) TffEKLLLAARAIVAIENPADVC-酰胺。用無血清的樹突狀細胞培養(yǎng)基使已脈沖處理的樹突狀細胞成熟，所述培養(yǎng)基含有 10ng/ml IL-lbetaU000IU/ml IL_6、5ng/ml TNF-α 和 1 μ m 前列腺素 Ε2 ；成熟 2 天。在兩天結束時，從平板刮下細胞并用流式細胞儀分析(圖3A-B)。遵循標準程序完成對起始于第1 位氨基酸的表位的熒光標記，例如，遵循標準方案加入首先標記于半胱氨酸的肽使得可以使用熒光素-5-馬來酰亞胺(Pierce/Thermo，Rockford, IL)綴合。使用標準染料去除柱(Pierce/thermo，Rockford, IL)去除未結合的熒光素。
為確定成熟是否成功，用⑶14、⑶80/86和Class II MHC(HLA-DR)遵循標準方案分析細胞(R&D系統(tǒng)；Minneapolis，MN)。簡單地說，每管5. OX IO5個左右的細胞重懸于含 2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水中。細胞放置于冰上并且將25μ 1的合適抗體、熒光素標記的肽或同種型對照抗體與細胞在冰上溫育1小時。一小時后每管加入細1含2% FCS的 PBS,并且通過以300X g離心10分鐘沉淀細胞。在400 μ 1含2% PCS的PBS中重懸細胞并分析(圖:3B)。如果不能立即分析細胞，在黑暗中于4°C將其固定在0.5%甲醛/PBS中。如果細胞為⑶14陰性并且為⑶83、⑶80/86和Class II MHC陽性，則被認為是樹突狀細胞。
圖3顯示了具代表性的樹突狀細胞FACS分析，所述細胞用全長重組人OFA/ iLRP(圖3A)或源自OFA/iLRP的HLA計算分析的肽的等量(質(zhì)量)混合物脈沖處理(圖 3B)。數(shù)據(jù)顯示rHu OFA/iLRP和所述肽都能有效地脈沖處理樹突狀細胞。ArHu OFA/iLRP 致敏的細胞識別為53. 90士3. 058 N = 4，而肽混合物脈沖處理識別為40. 43士2. 618 N = 4，差異為13. 48 士4. 025 (圖3C)。使用雙尾學生t_檢驗來確定識別OFA/iLRP的129區(qū)域的成熟樹突狀細胞的百分比之間是否存在顯著的差異。發(fā)現(xiàn)組之間的差異為顯著的(P = 0.0155)；平均值+/-SEM和顯著性O示于圖3C。
數(shù)據(jù)表明53. 9%的用rHu OFA/iLRP脈沖處理的樹突狀細胞識別了 1 區(qū)域表位 (圖3A)并且表明計算分析對于預測以前未鑒別的表位是準確的。作為該區(qū)域強度的額外證據(jù)，大部分脈沖處理的樹突狀細胞識別了該區(qū)域。所述肽刺激樹突狀細胞的能力示于圖 3C，有40. 43%的細胞識別1 區(qū)域?？深A期將有約40%的樹突狀細胞應識別1 區(qū)域，因為117肽具有重疊序列，其用下劃線區(qū)域表明。這表明用OFA/iLRP肽脈沖處理樹突狀細胞可用于調(diào)節(jié)對全長蛋白特異區(qū)域的免疫應答。此外，這些實驗表明熒光形式的肽可用作致敏和診斷試劑。
實施例2
肽修飾對樹突狀細胞結合129區(qū)域的影響
使用基于計算機的聚類方法預測了若干區(qū)域(圖幻。選擇了起始于第1 位氨基酸的區(qū)域(Ac-CADHQPLTEASYVNLPT-酰胺)，因為其可用于進一步顯示肽修飾的效果。為確定1 區(qū)域是否可提高其與樹突狀細胞的相對結合，對肽序列進行了修飾，在羧基端包括4 個額外的氨基酸并在氨基端包括6-氨基己酰作為間隔物以最小化結合障礙。與標準1 肽相比，這些修飾應當增加平均熒光強度。
CD 14+單核細胞以1x106個細胞每毫升生長于含有1000IU/ml GM-CSF和1000IU/ ml IL-4(細胞Genix Antioch，IL)的無血清樹突狀細胞培養(yǎng)基中。用100ng/ml的rHu OFA 脈沖處理細胞36小時。用無血清的樹突狀細胞培養(yǎng)基使脈沖處理的樹突狀細胞成熟，所述培養(yǎng)基含有 10ng/mlIL-lbeta, 1000IU/ml IL_6、5ng/ml 的 TNF-α 和 Ιμπι 前列腺素 Ε2 ；成熟2天。在兩天結束時，從平板刮下細胞并用流式細胞儀分析。
肽129 和 129-a (Ac-TDPRADHQPLTEASYVNLPT-Ahx-C-酰胺)的熒光標記遵循標準步驟完成。簡而言之，加入標記于半胱氨酸的肽使得可以遵循標準方案使用熒光素-5-馬來酰亞胺(Pierce/Thermo，Rockford, IL)綴合。使用標準染料去除柱(Pierce/Thermo， Rockford, IL)去除未結合的熒光素。半胱氨酸也可用于將肽與一系列不同的產(chǎn)物綴合。16
為確定成熟是否是成功的，用⑶14、⑶83、⑶80/86和Class II MHC(HLA-DR)遵循標準方案分析細胞(R&D系統(tǒng)；Minneapolis，MN)。簡而言之，將每試管0. 5X IO5個細胞懸浮于25μ 1含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水中。細胞放置于冰上并且將25μ 1的合適抗體、熒光素標記的肽或同種型對照抗體與細胞在冰上溫育1小時。一小時后每管加入細1 含2% FCS的PBS，并且細胞通過以300Xg離心試管10分鐘沉淀。在400 μ 1含2% PCS的 PBS中重懸細胞并分析。如果不能立即分析細胞，黑暗中于4°C在0. 5%甲醛/PBS中將其固定。用BD LSR II分析儀分析至少2000個事件并且用FACSDiva軟件版本6. 1. 3顯示(圖 4A-B)。如果細胞為⑶14陰性并且為⑶83、⑶80/86和HLA-DR陽性，則被認為是樹突狀細胞。
圖4D顯示，用重組人OFA/iLRP脈沖處理的樹突狀細胞具有針對1 表位的活性并且有更高的與修飾的結合的可能性。1 肽具有11，390+/-500. 6的平均熒光強度 (MFI)，而129-a肽顯示了 38，670+/-5067的MFI或熒光強度3. 4倍的提高。代表性的FITC 標記的1 和肽分別顯示于圖4A和B中，通過t-檢驗確定是否具有與1 不同的結合譜(P = 0.0032)，表明對肽的修飾(通過使用接頭殘基(Ahx)或額外的肽)提高了其熒光強度(圖4D)。提高的MFI表明了增加的結合能力。
該數(shù)據(jù)表明，輕微的變化可影響肽的結合及熒光強度。所述肽可用于致敏樹突狀細胞和測定樹突狀細胞脈沖處理的效率。該數(shù)據(jù)表明，針對OFA/iLRP蛋白質(zhì)設計的肽的用途可通過一系列不同的方法輕微地修改以改善脈沖處理效率、結合活性、免疫刺激作用和免疫細胞定量。肽可單獨地或在混合物中用于測定免疫細胞/蛋白針對特異的OFA抗原的反應性。
實施例3
hnocyte 96孔細胞粘附實驗
本實驗的目的是測定針對OFA/iLRP設計的肽對粘附細胞系對細胞外基質(zhì)組分的細胞粘附是否具有任何影響。期望的應答是不存在粘附的變化，因為降低的粘附可提高轉(zhuǎn)移潛力。
所有細胞在37°C的濕潤室中(Mediatech，Inc. Manassas, VA)生長于含L-谷氨酰胺、1001. U.青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素和 10%胎牛血清的 RPMI 1640。DU-145 和 SK-MEL-28 細胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC，Manassas，VA)并遵循標準流程在培養(yǎng)基中生長。細胞生長至75到85%密度之間，遵循標準方案收集并用修改的Neubauer brightline 血球計計數(shù)，以400，000細胞/ml懸浮。
將肽溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ或DMSO中，然后加入PBS至最高含20 % DMS0， 制得2X溶液，并放入完全培養(yǎng)基中。肽稀釋至適當濃度后，將50μ 1連同50μ 1細胞 (20, 000細胞/孔)一起分裝到試劑盒提供的96孔測定板，所述測定板以2X8孔條提供，其包被了層粘連蛋白、纖維連接蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白III和膠原蛋白 IV(EMD，Gibbst0Wn，NJ)，然后在細胞培養(yǎng)溫育器中37°C溫育2小時?；纬鰞?nèi)容物至生物廢物容器中，向每孔中加入200 μ 1 PBS輕輕洗滌，晃出內(nèi)容物到廢物容器中，重復該步驟至共洗滌2次。下一步，向每孔加入100 μ 1 Calcein-AM工作溶液并在溫育器中于37°C溫育1 小時。遵循標準熒光方案使用DTX880 (Beckman公司)在485nm激發(fā)以及520nm發(fā)射波長下測量每個孔的熒光。
圖5顯示層粘連蛋白I和膠原蛋白I的孔的數(shù)據(jù)。沒有看到所述肽在以生物學活性濃度存在時這些細胞的粘附有顯著差異。所有基質(zhì)的數(shù)據(jù)是類似的(沒有顯示)。
該數(shù)據(jù)表明所設計的OFA/iLRP肽不影響細胞粘附。因此，由于不影響粘附，它們不應通過降低癌細胞的粘附而增加轉(zhuǎn)移負荷。這意味著所述肽能夠具有體內(nèi)臨床/治療用途，其不應增加患者的轉(zhuǎn)移負荷。
實施例4
OFA/iLRP肽對細胞活力的影響
本實驗的目的是測定針對OFA/iLRP設計的肽是否對細胞活力有任何影響。由于 OFA/iLRP的性質(zhì)，預期所述肽設計為破壞OFAlOFA至LR轉(zhuǎn)換或抑制其它蛋白|蛋白相互作用。
所有細胞在37°C的濕潤室中(Mediatech，Inc. Manassas, VA)生長于含L-谷氨酰胺、1001. U.青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640。DU-145細胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)獲得并遵循標準方案在培養(yǎng)基中生長。DU145 細胞生長至75到85%密度之間，遵循標準方案收集，并用修改的Neubauer brightline血球計計數(shù)，以400，000細胞/ml懸浮。
將肽溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ或DMSO中，然后加入PBS至最高含20 % DMS0， 制得2X溶液，并放入完全培養(yǎng)基中。肽稀釋至適當濃度后，將50μ 1連同50μ 1細胞 (20, 000細胞/孔)一起分裝到96孔檢測板中，所述檢測板用層粘連蛋白/巢蛋白復合物 (50μ 1/ml)包被或未處理(黑色帶透明底)(Corning Life Sciences, Corning, NY)，過夜生長。然后細胞加入 20 μ ICellTiter-Blue (Promega, Madison, WI)并在 37°C額外溫育 2 個小時。遵循標準熒光方案使用DTX880 (Beckman公司)在0. 001秒的積分時間下讀取細胞。為確定半胱天冬蛋白酶活性是否被誘導，使用ApoOne測定法(ftOmega，Madison, WI) 測定半胱天冬蛋白酶3/7活性。數(shù)據(jù)輸出至Excel并隨后輸出至I^rism 5. 0 (GraphPad軟件公司)中作圖，并使用單因素ANOVA來分析其與背景對照(用于肽的稀釋劑)之間的統(tǒng)計學差異。
所有的DU145細胞生長于未包被或包被了層粘連蛋白/巢蛋白的96孔板。在肽 1或肽3(表幻存在時，在未包被組(無層粘連蛋白)或包被組(層粘連蛋白)中，對照與處理組之間都沒有統(tǒng)計學差異(圖6A和C)。然而，需要層粘連蛋白存在的肽所引起的任何可能的影響有一個有趣的趨勢。肽2(表幻顯示了最顯著的生物學效果，其具有降低細胞活力超過2倍的能力并且和對照有顯著的差異(P<0. 05)(圖6B)。在ApoOne半胱天冬蛋白酶3/7測定中沒有看到任何組有顯著的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，針對先前所描述的 OFA/iLRP表位(稀釋于DMS0/PBS中的氨基酸49-60)制備的肽盡管能夠增殖T細胞，卻不能影響細胞活力或誘導細胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
本實驗的目標是測定任何預測為具有免疫活性的OFA/iLRP肽是否對細胞活力有任何影響。當DU145細胞在肽2存在的條件下生長時，對比于肽稀釋液對照(20% DMS0/80%的PBS)，肽2似乎對細胞活性具有顯著的影響。然而，這不依賴于半胱天冬蛋白酶3/7激活并且在ApoOne法中沒有見到顯著的變化(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，之前顯示為良好表位的肽(Rohrer，2006#l)不影響細胞活力(氨基酸49-60，數(shù)據(jù)未顯示)。這表明，所述肽可能具有治療活性，從而使得其能夠用于免疫方法或可能的細胞活力靶方法。
可以不偏離本發(fā)明的精神和范圍做出如前文中所闡述的許多修改和變化，并因此只應如所附權利要求書所表明的進行限制。
所有在本說明書中引用的的專利和參考文獻以其整體通過弓I用并入本文。
表1.用于樹突狀細胞治療的假定OFA/iLRP序列的初始篩選。列出的序列可單獨或聯(lián)合地用于樹突狀細胞治療或其他臨床應用的免疫刺激作用。
權利要求
1.選自VLQMKEEDV、QMKEEDVLK、QMEQYHKR、GIYIINLKR、KLLLAARAI、LLLAARAIVA、 LLAARAIVA, LAARAIVAI, AAATGATPI、TPGTFTNQI、RLLWTDPR、DPRADHQPL、QPLTEASYV、 PLTEASYVNL、MLAREVLRM、LRMRGTI SR. EIEKEEQAA、EKEEQAAAEK、KEEQAAAEK、EEQAAAEKA、 QAAAEKAVTK、AAAEKAVTK、VPSVPIQQF的分離的肽和其混合物，其中所述肽能夠致敏樹突狀細胞。
2.權利要求1的肽，其中所述肽在其N-端、C-端或兩端分別包括多至三個的額外的氨基酸。
3.權利要求2的肽，其中所述肽是PRADHQPLTEASYVNLPT(129)、 FREPRLLffTDPRADHQPLTEA (117)、GRFTPGTFTNQIQAAFREPT(lOl)、 EEIEKEEQAAAEKAVTKEEFQG(208)、TDPRADHQPLTEASYVNLPT(129-a)或 TffEKLLLAARAIVAIENPADV(54)。
4.權利要求1的肽，其中所述肽含有半胱氨酸或其它使得其與載體綴合的功能團。
5.權利要求3的肽，其中所述肽包含半胱氨酸或其它使得其與載體綴合的功能團。
6.權利要求1的肽，其中所述肽與提高所述肽的免疫刺激作用、穩(wěn)定性和/或可溶性的載體綴合。
7.權利要求6的肽，其中所述載體選自匙孔槭血藍蛋白(KLH)、血清白蛋白、生物學聚合物、抗體、化療、碳納米管、微電子/電流體裝置、分子機器、氨基酸MAP聚合物、樹枝狀聚合物、生物學活性脂質(zhì)、生物學活性糖分子/聚合物和膠體顆粒。
8.權利要求1的肽，其中所述肽被修飾以包括乙?；?、脂肪酸化、肉豆蔻酸化、棕櫚?；?、芐氧羰基化、酰胺化、對硝基苯胺、AMC、琥珀?；?、NHS、CMK/FMK、D-氨基酸、二硝基苯甲?；?、甲基化、磷酸化、AHX、S03H2、辛酸、生物素、FITC、GAM、丹磺?；CA、HYNIC、DTPA、成環(huán)或多抗原肽系統(tǒng)(MAP)。
9.源自OFA/iLRP二聚化區(qū)域的分離的肽，其中所述肽能夠致敏樹突狀細胞。
10.包含權利要求1的肽的藥物組合物。
11.包含權利要求3的肽的藥物組合物。
12.權利要求11的組合物，其進一步包含藥物學可接受的載體。
13.由權利要求1的肽或其混合物致敏的樹突狀細胞。
14.由權利要求3的肽或其混合物致敏的樹突狀細胞。
15.包含權利要求1的分離的肽的疫苗。
16.包含權利要求3的分離的肽的疫苗。
17.治療患有OFA/iLRP相關癌癥的對象的方法，其包括步驟(a)用權利要求1的肽或其混合物致敏樹突狀細胞，(b)以足夠誘導免疫應答的量給對象施用致敏的樹突狀細胞，所述免疫應答減少OFA/iLRP相關癌癥的發(fā)展。
18.治療患有OFA/iLRP相關癌癥的對象的方法，其包括步驟(a)用權利要求3的肽或其混合物致敏樹突狀細胞，(b)以足夠誘導免疫應答的量給對象施用致敏的樹突狀細胞，所述免疫應答減少OFA/iLRP相關癌癥的發(fā)展。
19.治療患有OFA/iLRP相關癌癥的對象的方法，其包括以足夠減少OFA/iLRP相關癌癥發(fā)展的量給對象施用權利要求1的肽或其混合物。
20.權利要求19的方法，其中所述肽在對象中誘導減少OFA/iLRP相關癌癥發(fā)展的免疫應答。
21.治療患有OFA/iLRP陽性癌癥的對象的方法，其包括以足夠減少OFA/iLRP陽性癌癥發(fā)展的量給對象施用權利要求3的肽或其混合物。
22.測定樣品中針對OFA/iLRP的抗體的量的方法，其包括(a)在使得抗體與權利要求1的肽結合形成復合物的條件下使權利要求1的肽或其混合物與樣品接觸，(b)測定樣品中形成的復合物的量。
23.測定樣品中針對OFA/iLRP的抗體的量的方法，其包括(a)在使得抗體與權利要求3的肽結合形成復合物的條件下使權利要求3的肽與樣品接觸，(b)測定樣品中形成的復合物的量。
24.監(jiān)測對象中OFA/iLRP相關癌癥疫苗接種治療進展的方法，其包括步驟(1)給對象的部位皮下或皮內(nèi)施用權利要求1的肽或其混合物，施用的量足以檢測對象對治療的免疫應答，(2)監(jiān)測施用部位的反應直徑。
25.監(jiān)測對象中OFA/iLRP相關癌癥疫苗接種治療進展的方法，其包括步驟(1)給對象的部位皮下或皮內(nèi)施用權利要求3的肽或其混合物，施用的量足以檢測對象對治療的免疫應答，(2)監(jiān)測施用部位的反應直徑。
26.離體監(jiān)測對象中OFA/iLRP相關治療進展的方法，其中所述治療誘導T細胞相關應答、B細胞相關應答或兩種應答都誘導，所述方法包括步驟(1)提供接受治療的對象的生物流體，(2)在使得本發(fā)明的肽與T細胞、B細胞或由T細胞或B細胞產(chǎn)生的產(chǎn)物相互作用的條件下使本發(fā)明的肽與所述生物流體接觸，( 通過ELISA、ELISpot、熒光偏振、共振或FACS 方法測定相互作用的量。
全文摘要
本發(fā)明涉及制造肽或肽混合物的方法，所述肽或肽混合物可用于針對癌胚胎抗原/未成熟層粘連蛋白受體蛋白(OFA/iLRP)脈沖處理樹突狀細胞。更具體來說，樹突狀細胞可以來自一系列不同的來源，其可指導免疫系統(tǒng)攻擊特定抗原。一旦致敏，無論離體、體內(nèi)或體外，樹突狀細胞將幫助個體自身免疫系統(tǒng)防止或治療所有類型的OFA/iLRP相關癌癥。所述肽還可用于檢測、診斷和監(jiān)測以及治療OFA/iLRP相關癌癥。
文檔編號A61K38/08GK102510756SQ201080023286
公開日2012年6月20日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權日2009年3月26日
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