專利名稱：胃促胰酶的適配體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胃促胰酶的適配體、相同適配體的利用方法等。
背景技術(shù)：
人胃促胰酶(EC. 3. 4. 21. 39)，是一種胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶，其貯存在肥大細胞分泌顆粒中。當外界刺激時，肥大細胞經(jīng)歷脫粒，導(dǎo)致人胃促胰酶連同多種炎癥介質(zhì)一起釋放到細胞外。釋放的人胃促胰酶特異地識別包含在底物蛋白和肽中的芳香族氨基酸，諸如苯丙氨酸和酪氨酸，并且切割靠近所述氨基酸的肽鍵。人胃促胰酶的代表性底物是血管緊張肽I (AngI)。人胃促胰酶切割A(yù)ngI從而產(chǎn)生血管緊張肽II (AngII)，血管緊張肽 II是一種血管收縮因子。按系統(tǒng)發(fā)生哺乳動物胃促胰酶分類為兩個亞家族α和β。靈長類，包括人，只表達一種屬于α家族的胃促胰酶。同時，嚙齒類表達α和β兩個家族的胃促胰酶。在小鼠中，有很多種胃促胰酶，其中屬于β家族的小鼠肥大細胞蛋白酶4(mMCP_4)，從其底物特異性和組織中的表達模式判斷，被認為是與人胃促胰酶最密切相關(guān)的。在倉鼠中，同樣屬于β 家族的倉鼠胃促胰酶-1對應(yīng)于人胃促胰酶。同時，和人胃促胰酶同屬α家族的mMCP-5和倉鼠胃促胰酶_2，具有彈性蛋白酶類活性并且在底物特異性方面與人胃促胰酶不同。胃促胰酶與轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)的激活極為相關(guān)。TGF-β以潛伏態(tài)(潛伏-TGF-β)存在于上皮細胞和內(nèi)皮細胞周圍的細胞外基質(zhì)中，并且通過大潛伏TGF-β結(jié)合蛋白(LTBP)保留在細胞外基質(zhì)中。當需要并且被激活時TGF-β從細胞外基質(zhì)釋放，并且激活的TGF-β是對活體極為重要的細胞因子，據(jù)報道其參與細胞增殖和分化以及組織損傷后的組織修復(fù)和再生。它的信號的衰弱導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。據(jù)信在此過程中， 胃促胰酶涉及潛伏TGF-β從細胞外基質(zhì)的釋放以及潛伏TGF-β到活性TGF-β的轉(zhuǎn)化。已知胃促胰酶與眾多疾病相關(guān)，所述疾病包括纖維化、心血管疾病、炎癥、過敏性疾病和器官粘附(organ adhesion)。纖維化是這樣的疾病，其特征為在肺、心、肝、腎、皮膚等中細胞外底物的異常代謝，導(dǎo)致結(jié)締組織蛋白的過度沉積。在肺纖維化中，例如，結(jié)締組織蛋白諸如膠原蛋白過度沉積在肺中，導(dǎo)致肺泡難以收縮以及隨后的呼吸窘迫。已經(jīng)證明肺纖維化起因于由暴露于大量塵埃引起的肺塵埃沉著病、由使用藥物諸如抗癌藥劑引起的藥物誘導(dǎo)的肺炎、過敏性肺炎、肺結(jié)核、自身免疫疾病諸如諸如膠原蛋白病等。然而，有一些其中病因未知的情況。分子水平上的纖維化發(fā)生機制還未被闡明。通常，在正常狀態(tài)下，成纖維細胞的增殖和功能得到很好的控制。然而，在嚴重或持續(xù)炎癥或損傷的情況中，組織修復(fù)機制過度運行，導(dǎo)致成纖維細胞的異常增殖以及結(jié)締組織蛋白的超量生產(chǎn)。已知TGF-β是引起這些現(xiàn)象的因子。如表明其參與的證據(jù)，已經(jīng)有報道向纖維化的動物模型給藥抗TGF-β中和抗體導(dǎo)致膠原蛋白表達的減少和纖維化的顯著抑制。在具有先天肺纖維化的患者中，觀察到 TGF-β水平的增加和胃促胰酶陽性肥大細胞計數(shù)的提高。同時，胃促胰酶與纖維化的聯(lián)系已經(jīng)由使用動物模型的實驗證明。在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的倉鼠模型中，胃促胰酶抑制劑顯著減小了促進的胃促胰酶活性、增加的膠原蛋白III mRNA的表達、組織纖維化和其他現(xiàn)象。在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的小鼠模型中已經(jīng)觀察到同樣作用；胃促胰酶抑制劑的給藥抑制胃促胰酶活性并且減少羥基脯氨酸的含量?？梢允褂镁哂羞@些特征的胃促胰酶抑制劑作為胃促胰酶相關(guān)疾病諸如纖維化的預(yù)防或治療藥物。已經(jīng)開發(fā)出的胃促胰酶抑制劑包括小分子化合物諸如TPC-806、 SUN-13834、SUN-C8257、SUN-C8077 和 JNJ-10311795 (專利文獻 1)。近年來，應(yīng)用于治療藥物、診斷試劑和檢測試劑的RNA適配體已經(jīng)引起人們的注意；一些RNA適配體已經(jīng)處于臨床研究階段或?qū)嶋H使用中。在2004年十二月，世界上第一個 RNA適配體藥物，Macugen，在美國被批準作為年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration)的治療藥物。RNA適配體是指特異地結(jié)合目標分子諸如蛋白的RNA，并且能夠使用SELEX (指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化)方法來制備它(專利文獻2-4)。在SELEX方法中，特異結(jié)合目標分子的RNA選自具有大約IOw個不同核苷酸序列的RNA庫。所用的RNA 具有大約40個核苷酸的隨機序列，引物序列在所述隨機序列的側(cè)翼。允許此RNA庫與目標分子混合，并且只有與目標分子結(jié)合的RNA被使用過濾器等分離。通過RT-PCR擴增分離的 RNA，并且使用此作為下一輪的模板。通過重復(fù)此操作大約10次，可以獲得特異結(jié)合目標分子的RNA適配體。與抗體藥物相似，適配體藥物能夠以細胞外蛋白為目標。根據(jù)眾多科學文章和公共領(lǐng)域中的其他參考材料，判斷適配體藥物在一些方面超過抗體藥物。例如，適配體與抗體相比通常展示較高的對目標分子的親和性和特異性。適配體不太可能遭受免疫清除，而作為抗體特性的逆反應(yīng)，諸如依賴抗體的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和依賴補體的細胞毒性(CDC)，據(jù)報道不太可能在使用適配體時發(fā)生。從藥物遞送的角度，由于它們的分子尺寸大約是抗體的十分之一，所以適配體可能遷移到組織，這使得更容易將藥物遞送到目標位點。因為適配體通過化學合成制備，它們允許位點選擇性化學修飾，并且能夠通過大量生產(chǎn)來降低成本。適配體的其他優(yōu)勢包括長期貯存穩(wěn)定性、耐熱性和耐溶劑性。同時，適配體的血液半衰期通常短于抗體的血液半衰期；然而，考慮到毒性此性質(zhì)有時是有優(yōu)勢的。由這些事實得出這樣的結(jié)論，即即使當以同樣分子為目標時，適配體藥物可能勝過抗體藥物?，F(xiàn)有文獻專利文獻專利文獻1 :USB6500835專利文獻2 =WO9Izl98I3專利文獻3 :W094/08050專利文獻4 :W095/07364發(fā)明概述本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明關(guān)注于提供胃促胰酶的適配體和用于使用同樣適配體的方法等。解決問題的方法本發(fā)明人不懈地研究從而解決了上述問題并且成功地制備了用于胃促胰酶的優(yōu)質(zhì)適配體，其導(dǎo)致本發(fā)明的完成。因此，本發(fā)明提供以下各項
5
[1]與胃促胰酶結(jié)合從而抑制胃促胰酶活性的適配體。[2]根據(jù)[ι]的適配體，所述適配體包含由^C1GauagaN1N2UAAX2(SEQ ID NO 21 ；每個\和X2，不管是否相同，是A或G，而每個N1和N2,不管是否相同，是A、G、C、U或T)代表的核苷酸序列。[3]根據(jù)[2]的適配體，其中 N1N2 是 GA、GU、GC、UU、GT 或 CU0[4]根據(jù)[2]的適配體，其中&和)(2全部是A或全部是G。[5]根據(jù)[3]或W]的適配體，其中至少一個嘧啶核苷酸已經(jīng)被修飾或改變。[6]根據(jù)[1]的適配體，所述適配體包含以下的核苷酸序列(a)、(b)和(C)中的任一項(a)適配體，所述適配體包含選自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和69_72 (其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列；(b)適配體，所述適配體包含選自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和69-72 (其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列，其中1至5個核苷酸被取代、缺失、插入或添加；和(c)核苷酸序列，所述核苷酸序列與選自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和 69-72(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或更多的同一性。[7]根據(jù)W]的適配體，其中至少一個包含在適配體中的核苷酸已經(jīng)被修飾或改變。[8]根據(jù)[1]的適配體，所述適配體包含以下核苷酸序列(a’)、(b’ )和(C’ )中的任一項(a，)選自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61(1)、69(1)、69(2)、和72 (1)-72 (8)(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列；(b，)選自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61(1)、69(1)、69(2)和72 (1)-72 (8)(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列， 其中1至5個核苷酸被取代、缺失、插入或添加；和(C，)與選自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61 (1)、69 (1)、69 (2)和72 (1) -72 (8)(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或更多的同一性的核苷酸序列。[9]根據(jù)[1]的適配體，其中位于包含在所述適配體中的相應(yīng)嘧啶核苷酸的2’位置的每個羥基，不管是否相同，可以由選自由氫原子、氟原子和甲氧基組成的組的原子或基團取代。[10]根據(jù)[1]的適配體，其中位于包含在所述適配體中的相應(yīng)嘌呤核苷酸的2’位置的每個羥基，不管是否相同，可以由選自由氫原子、氟原子和甲氧基組成的組的原子或基團取代。。[11]包含適配體[1]至[10]中任一項和功能物質(zhì)的復(fù)合物。[12]根據(jù)[11]的復(fù)合物，其中所述功能物質(zhì)是親和性物質(zhì)、用于標記的物質(zhì)、酶、 藥物遞送載體或藥物。[13]包含所述適配體[1]至[10]或所述復(fù)合物[11]或[12]中任一項的藥物。
[14]根據(jù)[13]的藥物，所述藥物被用于預(yù)防或治療心血管疾病或纖維化。[15]包含所述適配體[1]至[10]或所述復(fù)合物[11]或[12]中任一項的診斷試劑。[16]包含所述適配體[1]至[10]或所述復(fù)合物[11]或[12]中任一項的胃促胰酶檢測探針。[17]包含所述適配體[1]至[10]或所述復(fù)合物[11]或[12]中任一項的胃促胰酶純化的固相載體。[18]檢測胃促胰酶的方法，所述方法包括使用所述適配體[1]至[10]或所述復(fù)合物[11]或[12]中的任一項。[19]純化胃促胰酶的方法，所述方法包括使用所述適配體[1]至[10]或所述復(fù)合物[11]或[12]中的任一項。本發(fā)明的作用本發(fā)明適配體或復(fù)合物可以用作藥物或試劑諸如用于由胃促胰酶引起的多種疾病諸如纖維化和心血管疾病的診斷試劑。本發(fā)明適配體或復(fù)合物也能夠用于純化和濃縮胃促胰酶，以及檢測和定量胃促胰酶。

圖1顯示由MFOLD程序預(yù)測的由SEQ ID NO :4、5、12-14、18顯示的適配體的二級結(jié)構(gòu)，其中圈中圍住的部分顯示由SEQ ID NO :21顯示的共同序列。圖2顯示由MFOLD程序預(yù)測的由SEQ ID NO 22-27顯示的適配體的二級結(jié)構(gòu)，其中圈中圍住的部分顯示由SEQ ID NO :21顯示的共同序列。圖3顯示由MFOLD程序預(yù)測的由SEQ ID NO 28-34顯示的適配體的二級結(jié)構(gòu)，其中圈中圍住的部分顯示由SEQ ID NO :21顯示的共同序列。圖4顯示由SEQ ID NO 12和13顯示的適配體如何結(jié)合到胃促胰酶，其中40N表示包含40個核苷酸的隨機序列的RNA庫。固定作為捕獲分子的每個適配體或陰性對照40N ； 注射作為分析物的人胃促胰酶。使用Biacore TlOO (由GE Healthcare制造)進行所述測量。圖5顯示由MFOLD程序預(yù)測的由SEQ ID NO :38_40、43、48顯示的適配體的二級結(jié)構(gòu)，其中圈中圍住的部分顯示由SEQ ID NO :21顯示的共同序列。圖6顯示由MFOLD程序預(yù)測的由SEQ ID NO :49、51、55_57顯示的適配體的二級結(jié)構(gòu)，其中圈中圍住的部分顯示由SEQ ID NO :21顯示的共同序列。圖7顯示由SEQ ID NO 13、55和56顯示的適配體如何結(jié)合到胃促胰酶，其中40N 表示包含40個核苷酸的隨機序列的RNA庫。將胃促胰酶固定到芯片表面上；注射作為分析物的每個適配體或陰性對照40N。使用Biacore TlOO (由GE Healthcare制造)進行所述測量。圖8顯示通過蛋白質(zhì)印跡法檢測的胃促胰酶如何降解LTBP-I以及列于表9中的適配體如何抑制LTBP-I降解的結(jié)果。道數(shù)1、8、9、23和31顯示標記；道數(shù)6、21和四顯示陰性對照(無抑制劑)的結(jié)果；道數(shù)7、22和30顯示不含胃促胰酶的對照的結(jié)果。實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明提供具有對胃促胰酶的結(jié)合活性的適配體。本發(fā)明適配體能夠抑制胃促胰酶的活性。
適配體是指對特殊的目標分子具有結(jié)合親和性的核酸分子。所述適配體也能夠通過結(jié)合到特殊的目標分子來抑制所述特殊的目標分子的活性。本發(fā)明適配體具有對胃促胰酶的結(jié)合活性，并且能夠抑制胃促胰酶的活性。本發(fā)明適配體可以是RNA、DNA、修飾的核酸或其混合物。本發(fā)明適配體還可以是直線型的或環(huán)型的。胃促胰酶，是公知的絲氨酸蛋白酶，其貯存于肥大細胞分泌顆粒中。胃促胰酶深入地涉及由肥大細胞介導(dǎo)的多種生物反應(yīng)，包括，例如，生物活性肽的制備和降解、細胞外基質(zhì)重建、細胞因子網(wǎng)絡(luò)和免疫。本發(fā)明適配體能夠展示對來源于任何哺乳動物的胃促胰酶的抑制活性。這種哺乳動物包括靈長類(例如人、猴)、嚙齒類(例如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠)和同伴動物、家養(yǎng)動物和工作動物(例如狗、貓、馬、牛、山羊、綿羊、豬)，優(yōu)選的是人。 人胃促胰酶的氨基酸序列由登錄號AAB26^8顯示，并且可以是具有一至多個突變殘基、其結(jié)構(gòu)域部分或其肽部分的序列。人胃促胰酶的結(jié)構(gòu)不僅可以是單體，還可以是二體或多聚體。本發(fā)明適配體在生理緩沖溶液中與胃促胰酶結(jié)合。盡管對緩沖溶液的選擇沒有限制，但是優(yōu)選的是具有大約5. 0-10. OpH的緩沖溶液。這種緩沖溶液包括，例如，下述溶液A 和溶液C(見實施例1和幻。本發(fā)明適配體以由下述任何檢測可檢測的強度與胃促胰酶結(jié)
I=I O使用Biacore TlOO (由GE Healthcare制造)來測量結(jié)合強度。在測量方法中，首先將所述適配體固定到傳感器芯片上，固定的量大約是1000RU。注射用作分析物的20 μ L 被制備成0. 2 μ M的胃促胰酶溶液，并且檢測胃促胰酶與所述適配體的結(jié)合。使用包含具有 30或40個核苷酸的隨機核苷酸序列的RNA作為陰性對照。如果與對照RNA相比胃促胰酶相等地或顯著更有力地與所述適配體結(jié)合，則判斷所述適配體具有結(jié)合胃促胰酶的能力。在另一個方法中，首先將胃促胰酶固定到傳感器芯片上，固定的量大約是4000RU。 注射用作分析物的20 μ L被制備成0. 01 μ g/ μ L的適配體溶液，并且檢測所述適配體與胃促胰酶的結(jié)合。使用包含具有30或40個核苷酸的隨機核苷酸序列的RNA作為陰性對照。 如果與對照RNA相比胃促胰酶相等地或顯著更有力地與所述適配體結(jié)合，則判斷所述適配體具有結(jié)合胃促胰酶的能力。對胃促胰酶的抑制活性是指對胃促胰酶具有的任何活性的抑制潛能。例如，抑制胃促胰酶功能之一的水解和切割肽鏈的酶活性。酶活性的可用底物不限于出現(xiàn)于活體中的蛋白和生物活性肽(例如AngI、潛伏TGF-β等)，還包括包含前述肽的部分氨基酸序列的肽、與發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)結(jié)合的肽。發(fā)色物質(zhì)和熒光物質(zhì)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。經(jīng)由蛋白或生物活性肽降解反應(yīng)發(fā)生的現(xiàn)象包括膠原蛋白I/III表達的增加、羥基脯氨酸含量的增加、IgE表達的增加等；其上的抑制作用也包括在對胃促胰酶的抑制活性中。此外， 對嗜中性白細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞遷移到胃促胰酶的抑制活性也包括在對胃促胰酶的抑制活性中。此外，對胃促胰酶誘導(dǎo)的組胺釋放促進、肥大細胞計數(shù)提高、增加的血管滲透性、組織纖維化、炎癥、血管發(fā)生、血管內(nèi)膜增厚等的抑制作用也包括在對胃促胰酶的抑制活性中。胃促胰酶的底物是指遭受胃促胰酶水解切割的肽、蛋白等。存在于活體中的已知胃促胰酶的底物包括肽和蛋白諸如AngI、潛伏TGF-β、干細胞因子(SCF)、前膠原、膠原酶原、纖連蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-1前體(pro-MMP-1)、pro-MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-1)、載脂蛋白A-I(apoA-I)、apoE、磷脂轉(zhuǎn)運蛋白、IL-Ιβ前體、大-內(nèi)皮素-1 (大-ET-1)、大-ET-2、結(jié)締組織激活肽III、IL-18前體、物質(zhì)P、血管活性腸肽(VIP)、 胰激肽、緩激肽和C3a。本文中，胃促胰酶的底物不限于它們，還包括人工設(shè)計的包含由胃促胰酶特異識別的氨基酸殘基的模型肽，諸如Phe和Tyr，以及與發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)結(jié)合的這些肽。通過例如下述三種測試方法可以確定適配體是否抑制胃促胰酶的酶活性。第一種方法采用合成底物。有用的胃促胰酶底物是 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA (4-甲基香豆基-7-酰胺基)(由 P印tide Institute, Inc.制造)，其包含胰凝乳蛋白酶類蛋白酶的標準底物4個氨基酸的肽“Ala-Ala-Pro-Phe”。使用 96 孔板(F16 Black Maxisorp Fluoronunc,由 Nunc 制造)在緩沖溶液(溶液C;見下面的實施例2)中進行測定，其中反應(yīng)混合物的體積為100 μ L。首先，在溶液C中制備各核酸以獲得50 μ L溶液。在添加10 μ L在溶液C中制備的ImM底物后，將所述板放置至Ij酶標儀(microplate reader) SpectraMaxl90 (由 Molecular Devices Corporation (分子設(shè)備公司)制造)，并在37°C孵育5分鐘。分別地，將0.05 μ g胃促胰酶(重組體，由SIGMA 制造)在溶液C中稀釋，并且使40 μ L此稀釋液在37°C孵育5分鐘。將所述胃促胰酶溶液添加到核酸和底物的混合物中從而啟動酶反應(yīng)。將含有所述反應(yīng)混合物的板放置于酶標儀 SpectraMaxl90(由 Molecular Devices Corporation 制造)，并且在 37°C檢查依賴于時間的熒光強度在5分鐘內(nèi)的變化(激發(fā)波長380nm，檢測波長460nm)。產(chǎn)生由胃促胰酶活性從所述底物釋放的AMC (7-氨基-4-甲基香豆素)的熒光增加的線性近似，并且將其斜率作為初始反應(yīng)速度。至于對照，在以下兩種情況中樣品以同樣的方式處理和分析使用包含具有30或40個核苷酸的隨機序列的核酸庫(陰性對照)，并且使用已知的胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶抑制劑一抑凝乳蛋白酶素(陽性對照)。將在沒有核酸和抑制劑存在情況下的初始反應(yīng)速度作為100%酶活性，計算每種測試物質(zhì)的抑制率，并且確定引起50%酶活性抑制所需的抑制劑濃度(IC5tl)。展示比已知抑制劑抑凝乳蛋白酶素更低的IC5tl值的適配體被判斷為具有優(yōu)秀的抑制活性。第二種評估方法采用天然底物。有用的胃促胰酶的天然底物是血管緊張肽I。此處，熒光衍生化由血管緊張肽I降解釋放的肽片段HiS-Leu,并定量來自其的熒光強度。在所述測定中，在50 μ L溶液C中進行酶反應(yīng)。首先，在溶液C中稀釋0.3-0. 75ng 胃促胰酶(重組體，由SIGMA制造；或天然的，由Calbiochem制造)從而獲得5 μ L胃促胰酶溶液。在溶液C中制備各核酸以獲得25 μ L溶液。將5yL各胃促胰酶稀釋液與25yL 各核酸溶液混合，然后將所述混合物在37°C孵育5分鐘。分別地，在溶液C中制備20 μ L、 125 μ M的血管緊張肽I (由P印tide Institute, Inc.制備)并且在37°C孵育5分鐘。將所述血管緊張肽I溶液添加到胃促胰酶和核酸的所述混合物中，并且啟動所述酶反應(yīng)。在使所述反應(yīng)在37°C進行90分鐘后，添加25 μ L用冰預(yù)冷的30%三氯乙酸溶液以終止所述反應(yīng)。使全部的混合物在4°C、14000rpm離心10分鐘，并且使用30 μ L所得的上清液用于隨后的熒光衍生化反應(yīng)。在將30 μ L所述上清液添加到96孔板(Black，由Costar制造)后，在每個孔中混合15 μ L甲醇中的2%的O-苯二醛(由SIGMA制造)溶液和170 μ L 0. 3Μ的NaOH溶液， 并且使所述板在室溫中靜止10分鐘。隨后，添加25yL 3M HCl溶液以終止所述反應(yīng)。將所述板放置到酶標儀SpectraMaxl90(由Molecular Devices Corporation制造)，并且在 355nm的激發(fā)波長和460nm的熒光波長確定熒光強度。至于對照，在兩種情況中以同樣的方式處理和分析樣品使用SEQ ID NO :58 (陰性對照)并且使用已知的胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶抑制劑一抑凝乳蛋白酶素(陽性對照)。在兩種情況中，在0分鐘反應(yīng)時間獲得的熒光強度充當空白測定。將在其中添加等體積溶液C代替各核酸的胃促胰酶酶反應(yīng)中檢測到的熒光強度設(shè)為100%，計算各測試物質(zhì)的抑制率，并且確定引起50%酶活性抑制所需的抑制劑濃度(IC5tl)。展示比已知抑制劑抑凝乳蛋白酶素更低的IC5tl值的適配體被判斷為具有優(yōu)秀的抑制活性。第三種評估方法采用包含在細胞培養(yǎng)物上清液中的天然底物。此處，通過蛋白質(zhì)印跡法來檢測胃促胰酶底物LTBP-I的降解。處于冰凍下的NHLF細胞(由Cambrex Bio Science制造)在37°C水浴中快速解凍，然后使其懸浮于培養(yǎng)基中(10% FBS/F-12)。在以 1200rpm離心5分鐘后，移去所得的上清液，將所述細胞重懸于培養(yǎng)基中。將總體積為IOmL 的培養(yǎng)基添加到經(jīng)離心的細胞，并且將所述細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)皿并且在存在5% CO2的條件下在37°C培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察所述細胞的形態(tài)學和增殖狀態(tài)。當所述細胞變得匯合時，用無血清培養(yǎng)基(0. 2% BSA/F-12)代替所述培養(yǎng)基。在代替所述培養(yǎng)基的兩天后，所述培養(yǎng)物上清液被收集、分裝并在-30°C的冷凍下貯存。在將在使用前剛解凍的40 μ L NHLF培養(yǎng)物上清液分裝到管中后，向其添加用溶液 C稀釋的5 μ L核酸溶液。至于陽性對照，用溶液C稀釋抑凝乳蛋白酶素，并且以同樣的方式添加此稀釋液。至于陰性對照，只添加溶液C。接下來，添加5 μ L在溶液E (溶液C+0. 1 % BSA、0. 05%疊氮化鈉)中的lOOng/mL胃促胰酶稀釋液。至于對照，準備不含胃促胰酶的管。 在攪拌后，將所述樣品在37°C孵育1小時，并將其與等體積的電泳裂解緩沖液混合以終止所述反應(yīng)。通過如下所述的蛋白質(zhì)印跡法的方法來檢測樣品中的LTBP-1。把混合于裂解緩沖液中的樣品煮3分鐘，使10μ L的所述樣品在5-20%的丙烯酰胺凝膠上經(jīng)歷電泳。在電泳完成后，將所述樣品轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜，此后用5%脫脂奶、 50mM Tris-HCl (pH 8. 0)和0. 05%疊氮化鈉封閉所述濾膜。所述濾膜與在2% BSA、PBS和 0. 05%疊氮化鈉中的2 μ g/mL抗LTBP-I單克隆抗體的稀釋液在室溫過夜反應(yīng)。將所述濾膜漂洗3次并且使其在室溫下與二抗溶液(用0. 1 %的BSA/PBS稀釋10000倍的HR標記的抗鼠IgG抗體)孵育2小時。將所述濾膜漂洗5次，并且使用化學發(fā)光底物進行檢測。如根據(jù)LTBP-I條帶密度和位置(分子量)確定的，來自不含胃促胰酶的孔的條帶充當陽性對照(+)，而來自陰性對照孔的條帶充當陰性對照(_)。通過目測檢查各測試物質(zhì)的抑制活性。對本發(fā)明適配體沒有限制，只要它能夠結(jié)合到胃促胰酶的任何部分從而抑制其活性。本發(fā)明適配體的長度是不受限的，并且通常可以是大約10至大約200個核苷酸， 并且可以是，例如，不超過大約100個核苷酸，優(yōu)選地不超過大約50個核苷酸，更優(yōu)選地不超過大約40個核苷酸，最優(yōu)選地不超過大約30個核苷酸。當核苷酸的總數(shù)較小時，化學合成和大量制備將更容易，并且在成本方面具有主要優(yōu)勢。同樣據(jù)認為化學修飾是容易的，在體內(nèi)的穩(wěn)定性是高的，并且毒性是低的。包含在本發(fā)明適配體中的各核酸，不管是相同的還是不同的，可以是包含核糖
10(例如嘧啶核苷酸的核糖、嘌呤核苷酸的核糖)2’位置的羥基的核苷酸(即，未被取代的核苷酸)，或是核糖2’位置由任何原子或基團取代的核苷酸。作為這種任何原子或基團的實例，可以提及由氫原子、氟原子或-0-烷基(例如-O-Me基)、-0-酰基(例如-O-COMe基) 或氨基(例如-NH2基)取代的核苷酸。本發(fā)明適配體具有由^GAUAGAN^UAAi^SEQ ID NO :21 ；其中&和)(2中的每一個， 不管是否相同，是A或G，而N1和隊中的每一個，不管是否相同，是A、G、C、U或T ；其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)代表的序列。具有此序列的適配體強有力地與胃促胰酶結(jié)合從而抑制胃促胰酶活性。在上式中，&和)(2優(yōu)選地都是A或都是G ；N1R優(yōu)選地是GA、GU、GC、UU、GT或CU (其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)。本發(fā)明適配體也可以是這樣的核苷酸，其中至少一種(例如1、2、3或4種)核苷酸在核糖的2’位置包含羥基或上述任何原子或基團，例如，至少兩種(例如2、3或4種) 選自由氫原子、氟原子、羥基和甲氧基組成的組的基團。在本發(fā)明適配體中，所有的嘧啶核苷酸可以是在核糖的2’位置由氟原子取代的核苷酸，或是在核糖的2’位置由以上提及的任何原子或基團取代的核苷酸，優(yōu)選地是在核糖的2’位置由選自由氫原子、羥基和甲氧基組成的組的相同或不相同的原子或基團取代的核苷酸。在本發(fā)明適配體中，所有的嘌呤核苷酸可以是在核糖的2’位置包含羥基的核苷酸，或在核糖的2’位置由以上提及的任何原子或基團取代的核苷酸，優(yōu)選地是在核糖的2’ 位置由選自由氫原子、甲氧基和氟原子組成的組的相同或不相同的原子或基團取代的核苷酸。本發(fā)明適配體也可以是這樣的個體，其中所有核苷酸在核糖的2’位置同樣地包含羥基，或以上提及的任何原子或基團，例如，選自由氫原子、氟原子、羥基和甲氧基組成的組的相同基團。本文中，在此說明書中，在對如何修飾核苷酸中的所述糖基的描述中構(gòu)成所述適配體的核苷酸被假定為RNA ( S卩，所述糖基被假定為核糖)。然而，這不意味著從構(gòu)成適配體的核苷酸中免除DNA，并且如適當?shù)膽?yīng)當把對RNA的修飾看作是對DNA的修飾。當構(gòu)成適配體的核苷酸是DNA時，例如，在核糖2’位置的羥基由X取代應(yīng)當看作是在脫氧核糖2’位置的一個氫原子由X取代。本發(fā)明適配體也可以是(a)包含選自SEQ ID NO :4-34、38-57、59_65和69-72 (其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的適配體；(b)包含選自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和69_72 (其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的適配體，其中1至5個核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列；或(c)包含與選自SEQ ID NO :4_34、38-57、59_65和69_72 (其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或以上(優(yōu)選地80%或以上，更優(yōu)選地90%或以上， 最優(yōu)選地95%或以上)同一性的核苷酸序列的適配體。本發(fā)明適配體還包括(d)選自由以下各項組成的組的偶聯(lián)物多個以上的適配體(a)的偶聯(lián)物、多個以上的適配體(b)的偶聯(lián)物、多個以上的適配體(c)的偶聯(lián)物、以及多個以上的適配體(a)、(b)和(c)的偶聯(lián)物。能夠與胃促胰酶結(jié)合和/或抑制胃促胰酶活性(胃促胰酶酶活性等)的不僅有以上的適配體(a)，而且還有適配體(b)至(d)。本發(fā)明的適配體也可以(a，)包含選自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61⑴、69⑴、69⑵和72⑴-72⑶(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列的適配體；(b，)包含選自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、56 (15)-56 (52)、 61(1)、69(1)、69(2)和72 (1)-72 (8)(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的適配體，其中 1至5個核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列；或(c，)包含與選自 SEQ ID NO :56 (1)-56 (7)、56 (9)、56 (11)、56 (12)、 56 (15) -56 (52) ,61(1),69 (1)、69 (2)和72 (1) -72 (8)(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或以上同一性的核苷酸序列的適配體。本發(fā)明適配體還包括(d’ )選自由以下各項組成的組的偶聯(lián)物多個以上的適配體(a’ )的偶聯(lián)物、多個以上的適配體(b’ )的偶聯(lián)物、多個以上的適配體(C’ )的偶聯(lián)物、以及多個以上的適配體(a’)、(b’ )和(c’ )的偶聯(lián)物。此外，本發(fā)明適配體還包括(e)由以下各項組成的偶聯(lián)物一個或多個選自由以上的(a)、(b)和(C)組成的組的適配體，和一個或多個選自由(a’)、(b’ )和(c’ )組成的組的適配體。以上的適配體(a’)-(d’ )和(e)也能夠與胃促胰酶結(jié)合和/或抑制胃促胰酶活性(胃促胰酶酶活性等)。在以上的(b)和(b’ )中，對被取代、缺失、插入或添加的核苷酸的數(shù)量沒有限制， 只要所述適配體能夠與胃促胰酶結(jié)合和/或抑制胃促胰酶活性(胃促胰酶酶活性等)。核苷酸的數(shù)量可以是，例如，不超過大約30，優(yōu)選地不超過大約20，更優(yōu)選地不超過大約10， 還更優(yōu)選地不超過5，最優(yōu)選地4、3、2或1。至于以上的(C)和(C’)，“同一性”是指在其中使用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的數(shù)學算法(優(yōu)選地，所述算法考慮在一個或兩個所述序列上引入空位(gap)以獲得最佳比對)來比對兩個核苷酸序列的最優(yōu)比對中相同核苷酸殘基與所有重疊核苷酸殘基的比率(％ )。在本說明書中可以通過以下方式來計算核苷酸序列的同一性，例如，在以下條件下(gap open(空位開啟)=5penalties (罰分)；gapextension (空位延長)= 2penalties (罰分)；x_dropoff (降低)=50 ；expectancy (其月望)=10 !filtering (過濾)=ON (開啟))使用同源計算算法 NCBIBLAST-2 (National Center for Biotechnology ^formation(美國國立生物技術(shù)信息中心)Basic Local Alignment Search Tool (基本局部比對搜索工具))來比對所述兩個核苷酸序列。在以上的(d)、(d’ )和(e)中，可以通過隨機結(jié)合來獲得偶聯(lián)。在所述偶聯(lián)中，可以使用連接體。核苷酸鏈(例如1至大約20個核苷酸)和非核苷酸鏈(例如-(CH2)n-連接體、-(CH2CH2O)n-連接體、六乙二醇連接體、TEG連接體、包含肽的連接體、包含-S-S-鍵的連接體、包含-CONH-鍵的連接體、包含-OPO3-鍵的連接體)可以作為連接體被提及。如在上述多個偶聯(lián)物中提及的多個不受具體的限制，只要它是兩個或更多，并且所述多個可以是，例如，2、3或4。在以上的(a)至(d)，(a’)至(d’)和(e)中的各核苷酸，不管是相同的還是不同的，可以是在核糖的2’位置包含羥基的核苷酸或在核糖(例如嘧啶核苷酸的核糖)的2’位置由任何基團(例如氫原子、氟原子或-O-Me基)取代的核苷酸。本發(fā)明的適配體可以是這樣的個體，其中各核苷酸的糖殘基(例如核糖)已被修飾從而增加了結(jié)合胃促胰酶的活性、穩(wěn)定性、藥物可遞送性等。用另一個原子代替在糖殘基的2’ -位置、3’ -位置和/或4’ -位置的氧原子的一個實例等可以作為糖殘基中被修飾位點的實例被提及。氟化、0-烷基化(例如0-甲基化、0-乙基化)、0-芳基化、S-烷基化 (例如S-甲基化、S-乙基化)、S-芳基化和氨基化(例如-NH2)可以作為修飾的實例被提及。這種糖殘基的改變可以通過本身已知的方法進行(見，例如，Sproat等人，(1991)Nucl. Acid. Res.(核酸研究)19，733-738 ;Cotton 等人，(1991) Nucl. Acid. Res.(核酸研究)19， 2629-2635 ；Hobbs 等人，(1973)Biochemistry (生物化學)12,5138-5145)。本發(fā)明的適配體還可以變更(例如化學取代)核酸堿基(例如嘌呤或嘧啶) 以增加胃促胰酶結(jié)合活性等。5-位置嘧啶變更、6-和/或8-位置嘌呤變更、用環(huán)外 (extracyclic)胺變更、用4_硫代尿苷取代以及用5_溴代或5_碘代-尿嘧啶取代可以作為這種變更的實例被提及?？梢愿淖儼诒景l(fā)明適配體中的磷酸基團從而給予對核酸酶和水解的抗性。例如，P (0) 0基團可以用以下基團取代=P (0) S (硫代物)、P (S) S ( 二硫代物)、P (0) NR2 (酰胺化物)、P (0) CH3> P (0) BH3> P (0) R、R (0) OR，、⑶或 CH2 (縮甲乙醛)或 3，-胺(-NH-CH2-CH2-) [其中R或R’的各單位是獨立的H或取代的或未取代的烷基(例如甲基、乙基)]。連接基團是，例如，-0-、-N-或-S-，而核苷酸能夠通過這些連接基團連接到鄰接的核苷酸。所述變更也可以包括變更諸如在3’和5’的加帽反應(yīng)?？梢酝ㄟ^給末端添加以下各項來進一步進行變更聚乙二醇、氨基酸、肽、反向 dT、核酸、核苷、肉豆蔻酰、石膽酰、二十二烷基(docosanyl)、月桂酰、硬脂酰、棕櫚酰、油酰、亞油酰(Linoleoyl)、其他脂質(zhì)、類固醇、膽固醇、咖啡因、維生素、色素、熒光物質(zhì)、抗癌藥劑、毒素、酶、放射性物質(zhì)、生物素等。對于這些變更，見，例如，US專利5，660，985和 5，756，703?？梢匀绫疚乃_的以及通過本領(lǐng)域中本身已知的方法合成本發(fā)明的適配體。合成方法采用RNA聚合酶?；瘜W合成具有所需序列和RNA聚合酶啟動子序列的DNA，通過公知方法轉(zhuǎn)錄作為模板的所述DNA以獲得所需的RNA。還能夠使用DNA聚合酶來合成本發(fā)明適配體?；瘜W合成具有所需序列的DNA，通過公知為聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的方法來擴增作為模板的所述DNA。通過公知方法聚丙烯酰胺電泳或酶處理使此變?yōu)閱捂?。當合成修飾的適配體時，可以通過使用在特定位點突變的聚合酶來增加延伸反應(yīng)效率。如此獲得的適配體能夠容易地通過公知方法來純化。適配體能夠通過化學合成方法諸如亞酰胺(amidite)法和亞磷酰胺法來大量合成。這些合成方法廣為人知，如在Nucleic Acid(核酸)(卷幻[1]核酸的合成和分析(由 Yukio Sugiura編輯，由Hirokawa出版社出版)等中描述的。實際上，使用合成器諸如 OligoPilotlOO 或 OligoProcess (由 GE Healthcare Bioscience 制造)。如此合成的適配體能夠通過本身已知的方法諸如層析法來純化。假如在化學合成的過程中通過亞磷酰胺法等來將活性基團諸如氨基基團引入適配體中，可以在所述合成后添加功能物質(zhì)。例如，通過將氨基基團引入到所述適配體的末
端，有可能縮合結(jié)合有羧基的聚乙二醇鏈。適配體以多種結(jié)合模式與目標分子結(jié)合，諸如基于磷酸基團的負電荷的離子鍵、 基于核糖的疏水鍵和氫鍵以及基于核酸堿基的氫鍵和堆積相互作用。尤其是，以與組成核苷酸的數(shù)目相同的數(shù)目出現(xiàn)的基于磷酸基團負電荷的離子鍵是強的，并且與出現(xiàn)在蛋白正電荷表面上的賴氨酸和精氨酸形成化學鍵。因此，可以取代不直接參與結(jié)合目標分子的核酸堿基。尤其是，因為莖結(jié)構(gòu)區(qū)域已經(jīng)形成堿基對并且朝向雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，所以核酸堿基不太可能直接結(jié)合目標分子。因此，即使當堿基對被另一個堿基對代替時，所述適配體的活性通常不減小。在其中沒有形成堿基對的結(jié)構(gòu)諸如環(huán)結(jié)構(gòu)中，假如核酸堿基不參與直接結(jié)合所述目標分子，則堿基置換是可能的。關(guān)于核糖2’ -位置的修飾，在核糖2’ -位置的功能基團很少直接與所述目標分子相互作用，但是在很多情況中，它不具有相關(guān)性，并且能夠由另一個修飾的分子取代。因此，除非涉及直接與所述目標分子結(jié)合的功能基團被取代或缺失，適配體通常保持其活性。同樣重要的是總的三維結(jié)構(gòu)不發(fā)生大的變化。能夠使用SELEX法或其改進版本來制備適配體(例如，Ellington等人，(1990) Nature (自然)，346，818-822 ；Tuerk 等人，(1990) kience (科學)，249，505-510)。在所述 SELEX法中，通過增加輪數(shù)或使用競爭性物質(zhì)來使所述選擇標準更嚴格，濃縮并選擇展示較強的對所述目標分子的結(jié)合潛能的適配體。因此，通過調(diào)整SELEX的輪數(shù)和/或改變競爭性條件，在一些情況中能夠獲得具有不同結(jié)合力的適配體、具有不同結(jié)合模式的適配體以及具有相同結(jié)合力或結(jié)合模式但是具有不同堿基序列的適配體。所述SELEX法包括通過PCR 擴增的過程；通過在所述過程中使用錳離子等來引起突變，有可能以較高的多樣性來進行 SELEX。通過SELEX獲得的適配體是展示對目標分子高親和性的核酸，但這不意味著抑制所述目標分子的生物活性。胃促胰酶是堿性蛋白，據(jù)認為核酸有可能與其非特異地結(jié)合，但是與那些不同有力地結(jié)合到胃促胰酶的特定位點的適配體不影響所述目標分子的活性。實際上，包含用作陰性對照的隨機序列的RNA不抑制胃促胰酶的酶活性，盡管它與胃促胰酶弱地結(jié)合?；谌绱诉x擇的活性適配體，可以進行SELEX以獲得具有較高活性的適配體。明確地，在制備其中具有確定序列的適配體被部分隨機化的模板或摻雜有10至30%的隨機序列的模板后，再次進行SELEX。通過SELEX獲得的適配體具有大約80個核苷酸的長度，并且實際上這難以作為藥物制備。因此，有必要重復(fù)試錯法(try-and-error)嘗試以使所述適配體縮短到50個核苷酸或更短的長度以使化學合成容易。依靠為通過SELEX獲得的適配體設(shè)計的引物，隨后的最小化操作的方便度改變。除非成功設(shè)計所述引物，否則隨后的開發(fā)將是不可能的，即使通過SELEX選擇具有活性的適配體。在本發(fā)明中，獲得了具有23個核苷酸卻保持活性的適配體。因為適配體允許化學合成所以能夠容易地修飾它們。對于適配體，通過使用MFOLD 程序來預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，或通過X射線分析或NMR分析來預(yù)測空間結(jié)構(gòu)，有可能在某種程度上預(yù)測可以取代或缺失那個核苷酸，以及在哪里插入新的核苷酸。能夠容易地化學合成預(yù)測的具有新序列的適配體，并且能夠使用現(xiàn)有的測定系統(tǒng)來確定所述適配體是否保持活性。
如果通過如上所述的重復(fù)的試錯法嘗試鑒定了對獲得的適配體與所述目標分子結(jié)合重要的區(qū)域，在很多情況中即使當將新的序列添加到所述序列的兩個末端時所述活性仍保持不變。所述新序列的長度不受具體的限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠獲得各種各樣的修飾的設(shè)計和變更，如序列。如上所述，適配體允許各種各樣的修飾的設(shè)計和變更。本發(fā)明也提供制備允許包含指定序列(例如相當于選自以下區(qū)域中的部分的序列莖區(qū)域、內(nèi)環(huán)區(qū)域、凸起區(qū)域、發(fā)夾環(huán)區(qū)域和單鏈區(qū)域下文中，當需要時簡稱為固定(fixed)序列)的適配體的各種各樣的設(shè)計或變更的適配體的方法。例如，這種適配體的制備方法包括通過使用一種核酸分子或多種核酸分子(例如具有不同數(shù)字“a”或“b”的核酸分子庫)來制備包含固定序列的適配體，所述多種核酸分子由下式顯示的核苷酸序列和分別相對于引物序列(i)和(ii)的引物對組成
弓丨物序列固定序列-(N)b- I引物序列(ii)[其中(N)a代表由“ a ”個單位的N組成的核苷酸鏈；(N) b代表由“ b ”個單位的N 組成的核苷酸鏈；每個單位的N，不管是相同的還是不同的，是選自由A、G、C、U和T (優(yōu)選地，A、G、C和U)組成的基團的核苷酸。各個“a”和“b”，不管是相同的還是不同的，可以是任何數(shù)字，并且可以是，例如，1至大約100，優(yōu)選地1至大約50，更優(yōu)選地1至大約30，還更優(yōu)選地1至大約20或1至大約10]。本發(fā)明還提供復(fù)合物，所述復(fù)合物包含本發(fā)明的適配體和與其結(jié)合的功能物質(zhì)。在本發(fā)明的復(fù)合物中所述適配體和所述功能物質(zhì)之間的鍵可以是共價鍵或非共價鍵。本發(fā)明的復(fù)合物可以是這樣的個體，其中本發(fā)明的適配體和一個或多個(例如2個或3個)同類或不同類的功能物質(zhì)結(jié)合在一起。所述功能物質(zhì)不受具體的限制，只要它以新的方式給予本發(fā)明的適配體特定的功能，或能夠改變(例如改進)本發(fā)明的適配體能夠具有的特定性質(zhì)。蛋白、肽、氨基酸、脂質(zhì)、糖、單糖、多核苷酸和核苷酸能夠作為所述功能物質(zhì)的實例被提及。親和性物質(zhì)(例如生物素、抗生蛋白鏈菌素、對目標互補序列具有親和性的多核苷酸、抗體、谷胱甘肽瓊脂糖凝膠、組氨酸)、用于標記的物質(zhì)(例如熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)、藥物遞送載體(例如脂質(zhì)體、微球、肽、聚乙二醇)、藥物(例如用于導(dǎo)彈療法(missile therapy) 的那些諸如刺孢霉素(calicheamycin)和duocarmycin ；氮芥類似物諸如環(huán)磷酰胺、美法侖(melphalan)、異環(huán)磷酰胺或或曲磷胺(trofosfamide)；氮丙啶(乙基enimines) 諸如塞替派(thiotepa)；亞硝基脲(nitrosoureas)諸如卡莫司汀(carmustine)；烷基化藥劑諸如替莫唑胺(temozolomide)或達卡巴嗪(dacartazine)；葉酸類代謝拮抗劑諸如甲氨蝶呤(methotrexate)或雷替曲塞(raltitrexed)；嘌呤類似物諸如硫鳥嘌呤 (thioguanine)、克拉屈濱(cladribine)或氟達拉濱(f ludarabine)；嘧啶類似物諸如氟尿嘧啶、替加氟或吉西他濱(gemcitabine)；長春花生物堿(vinca alkaloids)諸如長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)或長春瑞濱(vinorelbine)及其類似物； 鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物諸如足葉乙苷(etoposide)、紫杉烷類(taxans), 多西他賽(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)；安慈拉環(huán)素(anthracyclines)諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、伊達比星(idarubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)，及其類似物；其他細胞毒性抗生素諸如博來霉素和絲裂霉素；鉬化合物諸如順鉬(cisplatin)、卡波鉬(carboplatin)和奧沙利鉬(oxaliplatin)；噴司他丁 (pentostatin)、米替福新(miltefosine)、雌莫司汀(estramustine)、托泊替康 (topotecan)、伊立替康(irinotecan)和比卡魯胺(bicalutamide))以及毒素(例如蓖麻毒素、Iiatoxin和維羅毒素(Vero toxin))能夠作為所述功能物質(zhì)的實例被提及。在一些情況中這些功能分子最終被除去。此外，所述分子可以是能夠由酶諸如凝血酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和因子X識別和切割的肽，并且可以是能夠由核酸酶或限制性內(nèi)切酶切割的多核苷酸。本發(fā)明的適配體或復(fù)合物能夠被用作，例如，藥物或診斷試劑、檢測試劑或試劑。本發(fā)明的適配體和復(fù)合物能夠具有抑制胃促胰酶功能的活性。如上所述，胃促胰酶與纖維化和心血管疾病十分相關(guān)。因此，本發(fā)明的適配體和復(fù)合物作為用于治療或預(yù)防伴隨纖維化或心血管障礙的疾病的藥物是有用的。本發(fā)明的適配體和復(fù)合物能夠特異地結(jié)合胃促胰酶。因此，本發(fā)明的適配體和復(fù)合物作為用于檢測胃促胰酶的探針是有用的。所述探針在胃促胰酶體內(nèi)成像、胃促胰酶血濃度測量、組織著色、ELISA等中是有用的。所述探針作為用于涉及胃促胰酶的疾病(伴隨纖維化或心血管障礙等的疾病)的診斷試劑、檢測試劑、分析試劑等也是有用的?；谒鼈儗ξ复僖让柑禺惖慕Y(jié)合，本發(fā)明的適配體和復(fù)合物能夠用作純化胃促胰酶的配體。本發(fā)明的適配體和復(fù)合物能夠用作藥物遞送載體。涉及器官或組織纖維化的疾病包括肺纖維化、前列腺增生、心肌纖維化、肌骨骼纖維化、骨髓纖維化、子宮肌瘤、硬皮病、術(shù)后粘連、術(shù)后瘢痕、灼傷瘢痕、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩、特應(yīng)性皮炎、腹膜硬化、哮喘、肝硬化、慢性胰腺炎、胃硬癌(scirrhous gastric cancer)、肝纖維化、腎纖維化、血管纖維化疾病、歸因于糖尿病并發(fā)癥纖維化微血管炎 (fibrous microvasculitis)的視網(wǎng)膜炎、神經(jīng)癥、腎病、腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)腎炎、遺傳性腎病、動脈硬化周圍動脈炎等。心血管疾病包括血管病、主動脈瘤、腎功能不全、高血壓、動脈硬化、心肌梗塞、 心臟肥大、心力衰竭、歸因于經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty)等的血管病后再狹窄、糖尿病腎病和非糖尿病腎病、外圍循環(huán)疾病寸。胃促胰酶具有酶活性并且切割充當?shù)孜锏纳锘钚晕镔|(zhì)。目前已知的底物的實例包括AngI、潛伏TGF-β、SCF、前膠原、膠原酶原、pro-MMP-9、IL-li3前體等。胃促胰酶通過制備或降解這些生物活性肽的反應(yīng)展示生物學作用，所述反應(yīng)包括細胞外基質(zhì)重建、細胞因子網(wǎng)絡(luò)、免疫和血管收縮。同時，胃促胰酶自身激活肥大細胞并且促進組胺釋放，并且與炎癥密切相關(guān)。因此，本發(fā)明的適配體和復(fù)合物不限于上述底物，并且能夠被用作用于與由胃促胰酶接受的底物介導(dǎo)的生物學功能相關(guān)的疾病以及由胃促胰酶自身參與的疾病的藥物或診斷試劑、檢測試劑和分析試劑。本發(fā)明的藥物可以與藥用載體制備在一起。賦形劑諸如蔗糖、淀粉、甘露糖醇(marmit)、山梨糖醇(sorbit)、乳糖、葡萄糖、纖維素、滑石、磷酸鈣和碳酸鈣；粘合劑諸如纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚丙基吡咯烷酮、明膠、阿拉伯膠、聚
16乙二醇、蔗糖和淀粉；分解質(zhì)諸如淀粉、羧基甲基纖維素、羥丙基淀粉、乙二醇淀粉鈉 (sodium-glycol-starch)、碳酸氫鈉、磷酸鈣和檸檬酸鈣；潤滑劑諸如硬脂酸鎂、Aerosil, 滑石和十二烷基硫酸鈉；增味劑諸如檸檬酸、薄荷醇、甘草甜素銨鹽、甘氨酸和橘粉；防腐劑諸如苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、羥苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯；穩(wěn)定劑諸如檸檬酸、檸檬酸鈉和乙酸；助懸劑諸如甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮和硬脂酸鋁；分散劑諸如表面活性劑； 稀釋劑諸如水、生理鹽水和桔汁；底蠟諸如可可脂、聚乙二醇和煤油；等能夠作為藥用載體的實例被提及，但是這些不是限制性的。對本發(fā)明藥物的給藥途徑?jīng)]有限制，本發(fā)明的藥物能夠通過例如口服給藥和腸胃外給藥來給藥。適合口服給藥的制劑是通過將有效量的配體溶解在稀釋劑諸如水、生理鹽水或桔汁中制備的溶液；以固體或顆粒形式包含有效量的配體的膠囊、袋劑或片劑；通過將有效量的活性成分懸浮在合適的分散劑中制備的懸浮液；通過分散和乳化在合適分散劑中的有效量的活性成分的溶液制備的乳劑；促進水溶性物質(zhì)吸收的Cio等。當需要時能夠通過本身已知的用于遮味、腸溶、持續(xù)釋放等的方法來給本發(fā)明的藥物加包衣。作為用于包衣的涂層劑的實例，使用羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、羥基甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙二醇、吐溫80、普流羅尼克(PlUronic)F68、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、乙酸琥珀酸羥基甲基纖維素、Eudragit (由Rohm， Germany制造，甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)、色素(例如紅氧化鐵、二氧化鈦等)等。所述藥物可以是快速釋放制劑或持續(xù)釋放制劑。作為適于腸胃外給藥(例如，靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、局部給藥、腹膜內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥等)的制劑，可以獲得水成和非水成等滲無菌注射液，所述注射液包括抗氧化劑、緩沖溶液、抑菌劑、等滲劑等。水成和非水成無菌懸浮液也能夠被提及，其可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、殺菌劑等。所述制劑能夠以單位劑量容積或若干分開的劑量包含在容器諸如安瓿瓶或藥水瓶中。活性成分和藥用載體也能夠被凍干并且以這樣的狀態(tài)貯存，即正好在使用前可以溶解或懸浮于合適的無菌載體中。持續(xù)釋放制劑也是合適的制劑。持續(xù)釋放制劑的劑型包括從包埋于體內(nèi)的載體或容器諸如人造骨、生物可降解基質(zhì)(base)或非生物可降解海綿、袋等中持續(xù)釋放。用于從體外連續(xù)或間歇、全身或局部遞送的設(shè)備，諸如藥物泵和滲透壓泵，也包含在持續(xù)釋放制劑的范圍內(nèi)。生物可降解基包括脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體、聚(乳酸乙醇酸共聚物)酸(PLGA)、 atherocollagen、明膠、輕基磷灰石、多糖西佐口南(polysaccharide sizofiran)。除液體注射劑、懸浮劑和持續(xù)釋放制劑外，適合經(jīng)肺給藥的吸入劑、適合經(jīng)皮給藥的膏劑等是可接受的。在吸入劑的情況中，處于凍干狀態(tài)的活性成分被微粉化并通過使用適當?shù)奈朐O(shè)備吸入來給藥。當需要時能夠適當?shù)貙⑽雱┡c常規(guī)使用的表面活性劑、油、調(diào)味品、環(huán)糊精或其衍生物等制備在一起。能夠根據(jù)傳統(tǒng)方法制備吸入劑。特別地，能夠通過以下方法制備吸入劑將本發(fā)明的適配體或復(fù)合物粉末化或液化，將其混合在吸入推進劑和/或載體中，并且將其填充到適當?shù)奈肴萜髦?。當上述本發(fā)明的適配體或復(fù)合物是粉劑時，能夠使用普通的機械粉末吸入器；在液體的情況中，能夠使用吸入器諸如噴霧器。此處，能夠廣泛使用通常已知的個體作為推進劑；含氯氟烴系列化合物諸如含氯氟烴-11、含氯氟烴-12、含氯氟烴-21、含氯氟烴-22、含氯氟烴-113、含氯氟烴-114、含氯氟烴-123、含氯氟烴-142c、含氯氟烴-134a、含氯氟烴-227、含氯氟烴-C318和1，1，1，2-四氟乙烷，碳氫化合物諸如丙烷、異丁烷和正丁烷，醚諸如二乙醚，壓縮氣體諸如氣態(tài)氮和氣態(tài)二氧化碳等能夠被提及。此處，油酸、卵磷脂、二乙二醇二油酸酯、四氫糠基油酸酯(tetrahydroflufuryl oleate)、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、三油酸甘油酯、單月桂酸甘油酯、單油酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、單賴氨酸甘油酯(glyceryl monolysinoate)、十六烷醇、硬脂醇、聚乙二醇 400、氯化十六烷吡啶、三油酸山梨酯(商品名Span 85)、單油酸山梨酯(商品名Span 80)、 單月桂酸山梨酯(商品名20)、聚氧乙烯硬化蓖麻油(商品名HC0-60)、聚氧乙烯00)山梨糖醇酐單月桂酸酯(商品名吐溫20)、聚氧乙烯00)山梨糖醇酐單油酸酯(商品名吐溫 80)、天然來源卵磷脂(商品名EPICL0N)、油醇聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij 92)、硬脂醇聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij 72)、月桂醇聚氧乙烯(4)醚(商品名Brij 30)、油醇聚氧乙烯(2)醚(商品名GenapolO-020)、氧乙烯和氧丙烯嵌段共聚物(商品名Synperonic)等能夠作為表面活性劑的實例被提及。玉米油、橄欖油、棉籽油、葵花油等能夠作為油的實例被提及。在膏劑的情況中，將適當?shù)乃幱没鶆?黃凡士林、白凡士林、石蠟、plastibase、硅氧烷、白軟膏、蜂蠟、豬油、植物油、親水軟膏、親水凡士林、精制羊毛脂、水解羊毛脂、吸水軟膏、親水plastibase、聚乙二醇軟膏等)與活性成分本發(fā)明的適配體混合，并且將其用作制劑。取決于以下因素本發(fā)明藥物的劑量變化活性成分的種類和活性、疾病的嚴重度、 作為給藥受試者的動物物種、給藥受試者的藥物可允許性、體重、年齡等，而基于成人每日所需活性成分量的通常劑量，可以是大約0. 0001 大約100mg/kg，例如，大約0. 0001 大約10mg/kg，優(yōu)選地大約0. 005 大約lmg/kg。本發(fā)明還提供在其上固定的具有本發(fā)明的適配體和/或復(fù)合物的固相載體?；住渲?、平板(例如多孔板)、濾膜、藥筒、柱和多孔物質(zhì)能夠作為固相載體的實例被提及。 所述基底可以是用于DNA芯片、蛋白芯片等的基底；例如，鎳-PTFE(聚四氟乙烯)基底、玻璃基底、磷灰石基底、硅基底、氧化鋁基底等，而通過用聚合物等給這些基底加涂層制備的基底能夠被提及。作為樹脂的實例，瓊脂糖顆粒、二氧化硅顆粒、丙烯酰胺和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯交聯(lián)的二乙烯基苯顆粒、用表氯醇交聯(lián)的葡聚糖的顆粒、纖維素纖維、芳基葡聚糖(aryldextran)和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物、單分散性合成聚合物、單分散性親水聚合物、瓊脂糖、Toyopearl等能夠被提及，并且也包括通過將不同的功能基團與這些樹脂結(jié)合而制備的樹脂。本發(fā)明的固相載體能夠用于例如純化、檢測和定量胃促胰酶。通過本身已知的方法本發(fā)明的適配體和/或復(fù)合物能夠被固定到固相載體上。例如，能夠提到這樣的方法將親和性物質(zhì)(例如以上描述的那些)或預(yù)先確定的功能基團引入到本發(fā)明的適配體和/或復(fù)合物中，然后經(jīng)由親和性物質(zhì)或預(yù)先確定的功能基團將所述適配體或復(fù)合物固定到固相載體上。本發(fā)明也提供這樣的方法。所述預(yù)先確定的功能基團可以是能夠經(jīng)歷偶聯(lián)反應(yīng)的功能基團；例如，氨基、硫醇基、羥基和羧基能夠被提及。本發(fā)明也提供將這種功能基因引入其中的適配體。本發(fā)明也提供純化和濃縮胃促胰酶的方法。尤其是，本發(fā)明使胃促胰酶與其他家族蛋白的蛋白分離成為可能。本發(fā)明純化和濃縮的方法可以包括使胃促胰酶吸附到本發(fā)明的固相載體上，并且用洗脫液洗脫吸附的胃促胰酶。能夠通過本身已知的方法將胃促胰酶吸附到本發(fā)明的固相載體上。例如，將包含胃促胰酶的樣品(例如細菌或細胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液、血)引入到本發(fā)明的固相載體或包含同樣的組合物中?？梢允褂孟疵撘褐T如中性溶液將胃促胰酶洗脫。對中性洗脫液沒有限制，所述中性洗脫液的PH可以是，例如，大約6 大約9，優(yōu)選地大約6. 5 大約8. 5，以及更優(yōu)選地大約7 大約8。所述中性溶液還能夠包括，例如，尿素、螯合劑(例如EDTA)、鈉鹽(例如NaCl)、鉀鹽(例如KCl)、鎂鹽(例如MgCl2)、表面活性劑(例如吐溫20、Triton、NP40)和甘油。本發(fā)明純化和濃縮的方法可以進一步包括在胃促胰酶吸附后使用漂洗溶液漂洗所述固相載體。漂洗溶液的實例包括包含以下物質(zhì)的那些尿素、螯合劑(例如EDTA)、Tris、酸、堿、轉(zhuǎn)移RNA、DNA、表面活性劑諸如吐溫20、鹽諸如NaCl等。本發(fā)明純化和濃縮的方法可以仍然進一步包括加熱所述固相載體。此步驟能夠使所述固相載體再生和滅菌。本發(fā)明也提供檢測和定量胃促胰酶的方法。尤其是，本發(fā)明允許與其他家族蛋白的蛋白分離地檢測和定量胃促胰酶。本發(fā)明檢測和定量的方法可以包括通過利用本發(fā)明的適配體(例如通過使用本發(fā)明的復(fù)合物和固相載體)來測量胃促胰酶。能夠以與免疫學方法相同的方式來進行檢測和定量胃促胰酶的方法，除了使用本發(fā)明的適配體代替抗體以夕卜。因此，通過使用本發(fā)明的適配體代替抗體作為探針，以與以下方法相同的方式酶免疫測定(EIA)(例如直接競爭性ELISA、非直接競爭性ELISA、夾心式ELISA)、放射性免疫測定 (RIA)、熒光免疫測定(FIA)、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)、免疫組織化學染色法和細胞分選法，能夠進行檢測和定量。本發(fā)明的適配體也能夠用作PET等的分子探針。這些方法能夠用于，例如， 在活體或生物樣品中測量胃促胰酶含量，和診斷與胃促胰酶有關(guān)的疾病。在本文提及的所有出版物中的包括專利和專利申請說明書的公開內(nèi)容，通過本文的引用以這樣的程度結(jié)合于本發(fā)明中以致它們都已經(jīng)被清楚地給出。在下文中，通過以下實施例來更詳細地描述本發(fā)明，然而所述實施例絕不限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1 制備與胃促胰酶特異結(jié)合的RNA適配體(1)使用SELEX方法制備與胃促胰酶特異結(jié)合的RNA適配體。改進Ellington等人 (Ellington 和 Szostak, Nature (自然)346，818-822，1990)的方法和 Tuerk 等人(Tuerk 和Gold，Science (科學)249，505-510，1990)的方法來進行SELEX。使用固定在NHS活化的kpharose (瓊脂糖凝膠)4Fast Flow (由GE Healthcare制造)載體上的胃促胰酶(人皮膚，由Calbiochem制造)作為目標分子。如在說明書中由GE Healthcare指導(dǎo)的那樣將胃促胰酶固定到所述載體。使用SDS-PAGE通過在固定前檢驗胃促胰酶溶液和在固定后就檢測上清液來確認固定的量。作為SDS-PAGE的結(jié)果，在上清液中沒有檢測到胃促胰酶的條帶；確認幾乎所有使用的胃促胰酶都已經(jīng)被偶聯(lián)。這意味著大約167pmol的胃促胰酶被固定到大約3μ L的樹脂上。通過使用Dur必cribe T7轉(zhuǎn)錄試劑盒(由Epicentre制造)轉(zhuǎn)錄化學合成的DNA 來獲得在第一輪中使用的RNA(40N)。通過此方法獲得的RNA在嘧啶核苷酸的核糖的2’-位置被氟取代。使用以下的長度為70個核苷酸的DNA作為DNA模板，所述DNA在40個核苷酸的隨機序列的每個末端都具有引物序列。所述DNA模板和所用的弓I物通過化學合成來制備。DNA 模板5’-GCGGCCGCTCTTCTATGNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCCTACCG T-3，(SEQ ID NO 1)弓 I物 Fwd :5，-T AATACGACTCACTATAGGGACGGTAGGAA T T C-3，(SEQ ID NO :2)引物 Rev:5，-GCGGCCGCTCTTCTAT G_3，(SEQ ID NO :3)在所述DNA模板(SEQ ID NO 1)中連續(xù)的N是40個具有任何組合的核苷酸GON 每個N是A、G、C或T)，其產(chǎn)生所獲得的各適配體獨有的序列區(qū)域。所述引物Fwd包括T7RNA 聚合酶的啟動子序列。在第一輪中所用的RNA庫的變化理論上是1014。將所述RNA庫添加到固定有胃促胰酶的載體上，并且允許其在室溫下靜置30分鐘。然后，用溶液A漂洗所述樹脂以除去未與胃促胰酶結(jié)合的RNA。此處，所述溶液A是 145mM氯化鈉、5. 4mM氯化鉀、1. 8mM氯化鈣、0. 8mM氯化鎂和20mM Tris的混合溶液。使結(jié)合到胃促胰酶的RNA在95°C加熱10分鐘并添加溶液B作為洗脫液，并且從所述上清液中回收。此處，所述溶液B是7M尿素、3mM EDTA和IOOmM Tris-HCl (pH6. 6)的混合物。通過 RT-PCR擴增回收的RNA并且使用Dur必cribe T7轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄，并將此用作下一輪的庫。以此過程作為1輪，將同樣的操作進行多次。在完成SELEX后，將PCR產(chǎn)物克隆到 pGEM-T Easy載體(由Promega制造)中，并且用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5 α (由Toyobo制造)。在從單克隆中抽提出質(zhì)粒后，使用DNA測序儀(3130x1 Genetic Analyzer，由ABI制備)來確定克隆的堿基序列。在8輪SELD(后，測序44個克隆的序列；可見序列的趨同性。一些克隆的序列由 SEQ ID NO :4-20顯示。在所述序列中，存在6個由SEQ ID NO :4顯示的序列，2個由SEQ ID NO 5顯示的序列，和1個由SEQ ID NO 6-20顯示的序列。SEQ ID NO 6和8只有一個堿基的區(qū)別。發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO :4、13和14的序列包含由SEQ ID NO :21顯示的共有序列，所述共有序列出現(xiàn)在44個克隆中的9個中。使用MFOLD程序(M. Zuker，Nucleic Acids Res.(核酸研究)31 (13) ,3406-3415，200 來預(yù)測這些序列的二級結(jié)構(gòu)；由共有序列部分形成的部分具有相似的環(huán)結(jié)構(gòu)(loop structure)。具有由SEQ ID NO :4、5、12-14和18顯示的序列的適配體的推定的二級結(jié)構(gòu)在圖1中給出，其中由通過SEQ ID NO :21顯示的共有序列形成的各部分被圍在圈中。以下給出的是相應(yīng)的核苷酸序列。除非另外說明，以下各個序列以從5’到3’的方向顯示，其中嘌呤堿基(A和G)是以2’ -OH的形式，而嘧啶堿基(U和C)是以2’ -氟修飾的形式。在所述序列中，各N1和隊指示選自A、G、C和U的任何核苷酸，而\和\都是 A或都是G。SEQ ID NO 4 GGGACGGUAGGAAUUCGUCCAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAACAAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 5
20
GGGACGGUAGGAAUUCCCACUUGUCUUUGAGGCAAGAAAUUGUAUUCCGAAGAAGCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO :6:GGGACGGUAGGAAUUCUACGGUCUGUGUGAAAUUGAAACACACAAAGAACAAUAGACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO :7:GGGACGGUAGGAAUUCACCUUUCCAAUUGUGAAAGAAACACAAAAAGAAAUGACAUCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 8 GGGACGGUAGGAAUUCUACGGUCUGUGUGAAAUUGAAACACACAAAGAACAAUAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 9 GGGACGGUAGGAAUUCCCGAAAAGCAACAAGCUUGCUAAAAUGAUUCCGAAAAAACACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 10 GGGACGGUAGGAAUUCCGCCGCCUAAAAAACGACGAUAUUACAGAAACGUCAAAUACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 11 GGGACGGUAGGAAUUCCCGACACGAAAUGUGUGAUUAAUUCCGAACAACAAAGUAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 12 GGGACGGUAGGAAUUCGCCGUCAACGUUACAUAAUGUAUAUACCAGGGUAACUAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 13 GGGACGGUAGGAAUUCCGCAACCAUCCCGUAACUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 14 GGGACGGUAGGAAUUCUCGUUCCUGACAGCAUUUGAGAUAGAUUUAAACAAACGCACAUAGAAGAGCGGCCGC
SEQ ID NO 15 GGGACGGUAGGAAUUCCCAGAAAAUAAAUUCCGAAGAAAACAACAAUUUUUGCAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 16 GGGACGGUAGGAAUUCCCAUGACUGAAAAACGUCAGUAAAAUCCGAAAAUCAUAUCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 17 GGGACGGUAGGAAUUCCGUUCGCAGAAACGAACUUUUAAAAAAUGUACGUGGGAGCACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 18 GGGACGGUAGGAAUUCGAACGACAAAUUAUAGAACUUCGUUUGACAUUCCACACCACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 19 GGGACGGUAGGAAUUCCCACUGCAAUUCAGCAGAAAAAAUUCCGAAAAACACACACCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 20 GGGACGGUAGGAAUUCAAAAUCAGCUGAUUUGUAAUUUUUUUACACAGGCAAAACACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 21 X1GauagaN1N2UaaX2在上述的8輪后，在相似的條件下繼續(xù)SELEX。在第11輪完成后，測序93個克隆的序列。一些所述克隆的序列由SEQ ID NO :22-27顯示。若干序列與一些在8輪后獲得的序列相同；存在22個由SEQ ID NO 4顯示的序列和4個由SEQ ID NO 14顯示的序列。這意味著由SEQ ID NO :21顯示的共有序列集中了。也存在1個由SEQ ID NO :5顯示的序列、 3個由SEQ ID NO :22顯示的序列和2個由SEQ ID NO :23和M顯示的序列。一個序列由 SEQ ID NO 25-27顯示。SEQ ID NO 22和11只有一個堿基的區(qū)別。SEQ ID NO 26和4只有一個堿基的區(qū)別。由SEQ ID NO :21顯示的共有序列出現(xiàn)于93個克隆中的35個。在到第11輪為止新出現(xiàn)的序列中，由SEQ ID NO 25和沈顯示的那些包含由SEQ ID NO 21顯示的共有序列。具有由SEQ ID NO :22-27顯示的序列的適配體的推定的二級結(jié)構(gòu)在圖2中給出，其中由通過SEQ ID NO :21顯示的共有序列形成的各部分被圍在圈中。這些部分都具有如在圖1中的特征性的環(huán)結(jié)構(gòu)。以下給出的是相應(yīng)的核苷酸序列。除非另外說明，以下各個序列以從5’到3’的方向顯示，其中嘌呤堿基(A和G)是以2’ -OH的形式，而嘧啶堿基(U和C)是以2’ -氟修飾的形式。SEQ ID NO 22 GGGACGGUAGGAAUUCCCGACACAAAAUGUGUGAUUAAUUCCGAACAACAAAGUAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 23 GGGACGGUAGGAAUUCAUAUGUACUCCGUCCUGACAAAAUGUCAAUGACAAACGUUCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 24 GGGACGGUAGGAAUUCCCUUCAUAGUAGAAUGUUGGUUUCUACAAAAGCGACAAGCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 25 GGGACGGUAGGAAUUCAGCUGACUCCAAUGCACACGUAGAUAGAGUUAAAACGUUGCAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 26 GGGACGGUAGGAAUUCGUCGAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAACAAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 27 GGGACGGUAGGAAUUCCGUCAUCGGUUGCAAAUUGAAAAUACAAAACAAGGACAACCAUAGAAGAGCGGCCGC在上述8輪SELEX后，使用作為目標分子固定在H印arin kpharose (肝素瓊脂糖凝膠)6i^ast Flow(由GE Healthcare制造)載體上的胃促胰酶(人皮膚，由Calbiochem 制造)繼續(xù)SELEX。將溶液形式的胃促胰酶添加到所述載體并且在室溫保持30分鐘，由此將胃促胰酶固定到所述載體。使用SDS-PAGE通過在固定前檢驗胃促胰酶溶液和在固定后就檢測上清液來確認固定的量。SDS-PAGE的結(jié)果沒有在所述上清液中檢測到胃促胰酶的條帶，從而確認了幾乎所有使用的胃促胰酶都被固定。顯然大約IOOpmol的胃促胰酶被固定到大約3μ L的樹脂上?？寺〉?1輪的庫，并且確定79個克隆的序列。一些這些克隆的序列由SEQ ID NO 28-34顯示。有若干序列與在上述8輪后獲得的序列相同；存在9個由SEQ ID N0:4顯示的序列和1個由SEQ ID NO 19顯示的序列。有若干序列與在上述11輪后獲得的序列相同； 存在2個由SEQ ID N0:27顯示的序列。此外，存在4個由SEQ ID NO 顯示的序列，2個由SEQ ID NO 29顯示的序列，禾口 1個由SEQ ID NO :30-34顯示的序列。SEQ ID NO 30禾口 31只有一個堿基的區(qū)別。SEQ ID NO 32是由從SEQ ID NO 31缺失一個堿基產(chǎn)生的序列。 由SEQ ID NO :21顯示的共有序列存在于79個克隆中的14個。在到第11輪為止新出現(xiàn)的序列中，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO 30-32和34的序列包含由SEQ ID NO 21顯示的共有序列。具有由SEQ ID NO :28-34顯示的序列的適配體的推定的二級結(jié)構(gòu)在圖3中給出，其中由通過SEQ ID NO :21顯示的共有序列形成的各部分被圍在圈中。除了由SEQ ID N0:34顯示的克隆以夕卜，所有這些部分都具有如在圖1中的特征性的環(huán)結(jié)構(gòu)。以下給出的是分別由SEQ ID NO :28_34顯示的核苷酸序列。除非另外說明，以下各個序列以從5’到3’的方向顯示，其中嘌呤堿基(A和G)是以2’-OH的形式，而嘧啶堿基 (U和C)是以2’-氟修飾的形式。SEQ ID NO 28 GGGACGGUAGGAAUUCAAUUUCUUUCUAUUCUCACCUGAGUAUAUCAGGCACAGUACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 29 GGGACGGUAGGAAUUCACGACCGCCCAAAAAAUGGUGACAUUUUAGAAACACCGAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 30 GGGACGGUAGGAAUUCGUCCCUCUUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 31 GGGACGGUAGGAAUUCGUCCCUCAUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 32 GGGACGGUAGGAAUUCGUCCUCAUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGAAGAGCGGCCG CSEQ ID NO 33 GGGACGGUAGGAAUUCCUGUCUUUUCCCACGCAACAAAUUACAGAGCUUUGCAAAACAUAGAAGAGCGGCCGCSEQ ID NO 34 GGGACGGUAGGAAUUCUGCCGCAACCCAAUGAAAACGAAGAUAGAGAUAAAUCGAACAUAGAAGAGCGGCCGC通過表面等離子共振方法使用Biacore TlOO (由GE Healthcare制造)來確定由 SEQ ID NO :4-20和22-34顯示的核酸對胃促胰酶的結(jié)合活性。所用的傳感器芯片是在其上固定有抗生蛋白鏈菌素的SA芯片。將大約1500RU的在其5’端結(jié)合有生物素的16-核苷酸Poly dT結(jié)合到所述SA芯片上。所述配體核酸在其3’端添加有16-核苷酸Poly A，
24并且通過在T和A之間退火被固定到所述SA芯片。以20 μ L/min的流速注射20 μ L的各核酸，并且大約1000RU的核酸被固定。注射作為分析物的被制備成0. 2 μ M的20 μ L胃促胰酶。使用溶液A作為運行緩沖液。發(fā)現(xiàn)所有檢查的序列都與胃促胰酶結(jié)合(表1)。然而，在第1輪使用的包含充當陰性對照的40個核苷酸的隨機序列的核酸庫(40Ν)，也被發(fā)現(xiàn)展示對胃促胰酶弱的結(jié)合活性。因此，在表1中，具有比40Ν更高的結(jié)合活性的適配體由++代表，而與40Ν相比具有相等結(jié)合活性的那些由+代表。顯示由SEQ ID NO :12和13顯示的適配體如何結(jié)合到胃促胰酶的感應(yīng)圖(sensorgram)在圖4中給出。不管由SEQ ID NO :21顯示的共有序列是否出現(xiàn)，一些序列展示比40N更高的結(jié)合活性，而其他的展示與40N相比相等的結(jié)合活性。包含此共有序列的SEQ ID N0:4、13、14、 25、沈和30，展示比40N更高的結(jié)合活性，而包含相同共有序列的SEQ ID N0:31、32和34， 展示與40N相比相等的結(jié)合活性。發(fā)現(xiàn)包含在SEQ ID NO 21的序列中的N1N2可以是GA、 ⑶、UU或⑶，而包含在SEQ ID N0:21的序列中的&和)(2可以都是A。[表 1]
SEQ ID NO ““ 長度使用Biacore確定的結(jié)合活性
~73++
~~572++
~~673++
~~773++
““873++
~~974++
~1073++
~Π73++
~1273++
~1373++
~1473++
~1573++
~1672++
~1774++
權(quán)利要求
1.與胃促胰酶結(jié)合從而抑制胃促胰酶活性的適配體。
2.根據(jù)權(quán)利要求ι的適配體，所述適配體包含由^C1GAUAGAN1N2UAAX2(SEQ ID NO :2i ；X1 和\中的每個，不管是否相同，是A或G，而N1和N2中的每個，不管是否相同，是A、G、C、U 或T)代表的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的適配體，其中N1N2是GA、GU、GC、UU、GT或CU0
4.根據(jù)權(quán)利要求2的適配體，其中\(zhòng)和\都是A或都是G。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的適配體，其中至少一個嘧啶核苷酸已被修飾或變更。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的適配體，所述適配體包含以下核苷酸序列(a)、(b)和(c)中的任何一個(a)適配體，所述適配體包含選自SEQID N0:4-34、38-57、59-65和69-72(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列；(b)適配體，所述適配體包含選自SEQID N0:4-34、38-57、59-65和69-72(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列，其中1至5個核苷酸被取代、缺失、插入或添加； 禾口(c)核苷酸序列，所述核苷酸序列與選自SEQID N0:4-34、38-57、59-65和69-72(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或更多的同一性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的適配體，其中至少一個包含在所述適配體中的核苷酸已被修飾或變更。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的適配體，所述適配體包含以下核苷酸序列(a’)、(b’)和(c’)中的任何一個(a，)選自 SEQ ID NO :56(1)-56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)-56(52)、61(1)、69(1)、69 (2)、和72 (1) -72 (8)(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列；(b，)選自 SEQ ID NO :56(1)-56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)-56(52)、61(1)、 69(1),69(2)和72(1)-72(8)(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列，其中1 至5個核苷酸被取代、缺失、插入或添加；和(c，)與選自 SEQ ID NO :56(1)-56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)-56(52)、61(1)、 69(1),69(2)和72(1)-72(8)(其中規(guī)定尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)中的核苷酸序列具有70%或更多同一性的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的適配體，其中位于包含在所述適配體中的相應(yīng)嘧啶核苷酸的2’位置的每個羥基，不管是否相同，可以由選自由氫原子、氟原子和甲氧基組成的組的原子或基團取代。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的適配體，其中位于包含在所述適配體中的相應(yīng)嘌呤核苷酸的2’ 位置的每個羥基，不管是否相同，可以由選自由氫原子、氟原子和甲氧基組成的組的原子或基團取代。
11.包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的適配體和功能物質(zhì)的復(fù)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的復(fù)合物，其中所述功能物質(zhì)是親和性物質(zhì)、用于標記的物質(zhì)、 酶、藥物遞送載體或藥物。
13.包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的適配體或根據(jù)權(quán)利要求11或12的復(fù)合物的藥物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物，所述藥物被用于預(yù)防或治療心血管疾病或纖維化。
15.包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的適配體或根據(jù)權(quán)利要求11或12的復(fù)合物的診斷試劑。
16.包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的適配體或根據(jù)權(quán)利要求11或12的復(fù)合物的胃促胰酶檢測探針。
17.用于純化胃促胰酶的固相載體，所述固相載體包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的適配體或根據(jù)權(quán)利要求11或12的復(fù)合物。
18.檢測胃促胰酶的方法，所述方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的適配體或根據(jù)權(quán)利要求11或12的復(fù)合物。
19.純化胃促胰酶的方法，所述方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的適配體或根據(jù)權(quán)利要求11或12的復(fù)合物。
全文摘要
提供有與胃促胰酶結(jié)合從而抑制胃促胰酶活性的適配體；包含由X1GAUAGAN1N2UAAX2代表的核苷酸序列的適配體，其中X1和X2是相同的或不同的并且每個是A或G，而N1和N2是相同的或不同的并且每個是A、G、C、U或T；包含所述適配體和功能物質(zhì)(例如親和性物質(zhì)、標記物質(zhì)、酶、藥物遞送介質(zhì)、藥物等)的復(fù)合物；包含所述適配體或復(fù)合物的藥物或試劑；使用所述適配體或復(fù)合物等檢測和純化胃促胰酶的方法。
文檔編號A61P19/04GK102459588SQ20108002567
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者中村義一, 山崎聰子, 村口正宏, 池田壽子, 金玲 申請人:力博美科股份有限公司, 大塚制藥株式會社