專利名稱：作為廣譜人類乳頭狀瘤病毒(hpv)疫苗的乳頭狀瘤病毒樣顆粒(vlp)的制作方法
技術領域：
本申請要求于2009年4月10日提交的美國臨時專利申請61/168，445的申請日的權(quán)益，將其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。本發(fā)明是在國家癌癥研究所授予的基金號為P50CA098252的政府支持下完成的。 政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術：
目前已鑒定的超過一百種人類乳頭狀瘤病毒(HPV) (de Villiers等^)04) Virology 22,670-80)是皮膚和粘膜乳頭狀瘤或疣的病原。持續(xù)感染高危粘膜型通常為 HPV16和HPV18，導致全世界女性第二大致命癌癥——宮頸癌，其每年導致274，000人死亡。 大量發(fā)病率由其它非宮頸HPV相關的疾病引起，如生殖器疣，外陰、陰道、陰莖、肛門或口咽癌。目前預防性乳頭狀瘤病毒疫苗的開發(fā)由重組性表達的主要衣殼蛋白Ll自組裝到病毒樣顆粒(VLP)上的觀察資料而發(fā)起。這些空病毒衣殼由360個Ll分子構(gòu)成，結(jié)構(gòu)和免疫原性均與天然病毒體類似，但無致癌性和感染性。此外，由于在制備VLP的細胞中僅包含Ll而無其它乳頭狀瘤病毒基因，因此VLP不能復制。亞單元VLP疫苗誘導針對構(gòu)象Ll 表位的高效價和類型限制性的抗體應答(Christensen等(1990) J Virol M，3151-3156)； Kirnbauer 等(1992) Proc Natl Acad Sci USA 巡，12180-12184 ;Rose 等(1994) J Gen Virol 匹，2445-9 ;Suzich等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 巡，11553-11557)。在感染前將針對最流行的高危型HPV16和HPV18的現(xiàn)有疫苗用于婦女時，證明對持續(xù)感染和由所包括的類型引起的有關疾病高達100%有效，因此可潛在預防約70%的宮頸高度發(fā)育異常和癌癥。因此，使用目前許可的Ll疫苗需要對女性進行持續(xù)的細胞學宮頸癌篩查。預防96% 的宮頸癌需要對7種高危HPV型(16/18/31/33/45/52/58)具有免疫力(Munoζ等Q004) Int J Cancer 111,278-85)以及開發(fā)更多價(可能較昂貴)的Ll VLP疫苗。對可替代的更廣譜免疫原的尋找引起了對次要衣殼蛋白L2的注意，其在共表達的Ll和L2衣殼中為免疫原性亞優(yōu)勢種(Roden等Q000) Virology 270,254-257) 使用L2的氨基(N)-末端肽對動物進行的免疫證明了其引發(fā)低效價中和抗體的能力，該中和抗體可防止體內(nèi)同源乳頭狀瘤病毒(PV)類型(Embers等(2002) J Virol 76,9798-805 ； Gaukroger 等(1996) JGen Virol 77 (Pt 7)，1577-83)，體外交叉中和異源 PV 類型(Kawana 等(1999) J Virol 73,6188-90 ；Pastrana 等(2005a) Virology MI, 365-72 ；Roden 等 (2000)(同上))的激發(fā)，并提供體內(nèi)的交叉保護(Gambhira的.O007a)J Virol 81, 11585-92)。需要開發(fā)針對廣譜HPV類型顯示高效價中和抗體的免疫原或疫苗原。


圖1顯示了對嵌合L1-L2融合蛋白A-J的總結(jié)。將具有標示的氨基酸殘基的HPV16 L2肽插入至BPVl Ll蛋白(在殘基133/134之間)，或HPV16L1蛋白(在殘基136/137之間)的DE環(huán)中。實線表示Ll蛋白?？招臈l表示L2蛋白。*表示2個氨基酸(Pro和Arg) 將N末端和C末端分別加至由用于克隆的限制性內(nèi)切酶位點所產(chǎn)生的肽上。圖表未按比例繪制。圖加顯示對嵌合融合蛋白的分析(通過感染了重組桿狀病毒的Sf-9細胞裂解液的蛋白質(zhì)免疫印跡法)。在45-60KD范圍內(nèi)，MAb AUl或Camvir-I檢測到嵌合蛋白VLP的 BPVl Ll或HPV16 Ll為主要條帶。對較低麗條帶的反應可能是由于蛋白水解降解產(chǎn)物。 兩種mAb均不與未感染的Sf-9細胞裂解液或wt桿狀病毒(AcMNPV)感染的昆蟲細胞裂解液反應。野生型BPVl Ll或HPV 16 Ll蛋白用作對照。圖沘顯示分別使用mAb RG-I (A， B, J)或抗 HPV16 L2 aa 1-88 (C)禾口 HPV16 L2 aa 11-200 (D，E，F(xiàn)，G，H，I)的多克隆兔血清證實了所并入的L2肽的抗原性。D，E，F(xiàn)用作梯度純化的融合蛋白。圖3顯示純化的顆粒制劑的透射電子顯微鏡(TEM)，χ 30，000 組裝至VLP中的嵌合蛋白 BL1-16L2 18-31 (A)，17-36 (B)，2-22 (C)，75-112 (E)，115-154 (F)，149-175 (G)和 172-200 (H)和 16L1-16L2 17-36 (J)，大小約為 50_60nm。BL1-16L2 35-75 (D)和 BL1-16L2 13-107(1)未明確地形成殼?；騐LP。圖4顯示使用弗氏或明礬-MPL佐劑的BPV L1-HPV16 L2 (BL1-16L2) 17-36兔和小鼠免疫，和使用明礬-MPL佐劑的HPV16L1-HPV16L2 (16L1-16L2) 17-36兔免疫通過L2肽 ELISA進行評價。一式三份對100至7，812，500的5倍連續(xù)血清稀釋液進行ELISA。使用合成肽HPV16 L2 aa 18-31作為抗原進行ELISA。BL1-16L2 17-36抗血清的數(shù)據(jù)表明在NZW 中使用弗氏佐劑的L2特異性抗體效價為62，500-312, 500 (圖如)，在NZW中使用明礬-MPL 的效價為12，500 (圖4b)，在Balb/c中使用明礬-MPL作為佐劑的效價為2，500-12, 500 (圖 4c)。16L1-16L2 17-36抗血清的數(shù)據(jù)表明在NZW中使用明礬-MPL的L2特異性抗體效價為 12，500(圖 4d)。MAb RG-I 針對 HPV16 L2aa 17-36(18)。數(shù)據(jù)顯示為平均 0D+/-SD。圖5顯示使用抗RGl-VLP (HPV 16L1/L2 (17-36))血清對天然HPV2a病毒粒進行中和(RT-PCR中和試驗)。HPMa病毒粒分離自人類跖疣，在終稀釋度為1 400的指定血清存在或未存在下孵化，并加至HaCaT細胞中道)。RNA逆轉(zhuǎn)錄至cDNA中，并且通過兩輪巢式PCR檢測到剪接的病毒RNA，通過一輪PCR檢測到作為對照的β-肌動蛋白RNA。 1道僅有HaCaT細胞；2道僅有HPV2，未加入血清；3道為抗-HPV2L1-VLP ；4道為預免疫的抗RGl-VLP ；5道為免疫的抗RGl-VLP ；6道為抗_HPV16wt Ll/wt L2-VLP。在終稀釋度為 1 400下對血清進行檢測。圖6顯示來自多個(并非所有)人類和動物乳頭狀瘤病毒類型的L2肽的序列比對，其與HPV 16 L2的氨基酸17-36相對應。表中序列從上到下由SEQ ID NO :3至23表

具體實施例方式本發(fā)明人在此處說明數(shù)個來自L2蛋白N末端的L2肽(表位)，例如HPV16 L2的氨基酸殘基17-36的肽，或來自其它乳頭狀瘤病毒(PV)類型的類似(等價)序列，當納入乳頭狀瘤病毒(PV)Ll蛋白的DE表面環(huán)中時，形成重組融合(嵌合)蛋白并組裝至VLP中；當這些嵌合L1-L2VLP引入動物中時，可誘導針對大范圍的粘膜高危型、低危型、皮膚型和β 型乳頭狀瘤病毒的廣譜中和抗體應答。強烈而持久的免疫應答遠高于對線性融合蛋白的免疫應答。不希望被任何特定機制所約束，認為這些強烈的免疫應答是由在VLP的密集重復陣列上的表位展示所引起的。發(fā)明人還表明HPV16 L2的氨基酸殘基17-36的肽，或來自其它乳頭狀瘤病毒(PV) 株的類似(等價)序列，當引入至Ll的其它位點，并使得L2肽暴露于所形成的VL P表面時，也可組裝至嵌合L1-L2 VLP，當引入動物中時，其(該嵌合L1-L2 VLP)誘導針對大范圍的粘膜高危型、低危型、皮膚型和β型乳頭狀瘤病毒的廣譜中和抗體應答。因此，L2肽的特定序列和/或引入了 L2肽的Ll位點，是有助于本發(fā)明所述VLP誘導強烈而廣譜的交叉反應/中和的因素。在本發(fā)明的方面中，一個或多個本發(fā)明的VLP組合物用作免疫原性或疫苗組合物。在本發(fā)明的實施方式中，VLP組合物可用于預防(例如預防)或治療乳頭狀瘤病毒感染和相關疾病，和/或可與藥學載體結(jié)合。在某些方面中，在暴露于病毒之前、之后和/或過程中給予個體組合物以最小化或防止病毒感染或降低感染的嚴重程度并延緩或終止疾病進程，或通過免疫已感染宿主或未感染個體來防止病毒從已感染宿主傳播至未感染該病毒的另一個體。本發(fā)明的VLP組合物，以及使用其免疫對象的方法的優(yōu)勢包括L2部分可引發(fā)針對廣譜的HPV的中和抗體應答，而不干擾VLP誘導高效價抗Ll抗體水平的能力。VLP Ll疫苗載體具有良好的耐受性并提供長期免疫原性(目前至少6年)。因此，基于作為L2表位載體的HPV 16 Ll VLP的疫苗以單一結(jié)構(gòu)提供了誘導針對HPV16 Ll的類型限制性抗體和交叉反應中和抗L2抗體的優(yōu)勢。廣泛的交叉反應性減少了對確定HPV感染和/或上皮內(nèi)瘤樣病變的篩選試驗的需要，也減少了為覆蓋所有致病HPV類型而制備Ll VLP疫苗的高度多價配方的需要，從而降低了成本。本發(fā)明的組合物提供了低成本，具有廣泛保護性的疫苗， 其穩(wěn)定，可大規(guī)模生產(chǎn)，并且可無針給予。低成本可實現(xiàn)在發(fā)展中國家的使用，其中80%的全球?qū)m頸癌費用(負擔)發(fā)生在發(fā)展中國家。本發(fā)明涉及例如病毒樣顆粒(VLP)組合物，其組裝自(包括)(一個)嵌合多肽 (由嵌合多肽組成)，該嵌合多肽包括乳頭狀瘤病毒(PV)Ll蛋白，其中所述乳頭狀瘤病毒 (PV) Ll蛋白中插入了由來自乳頭狀瘤病毒L2蛋白的以下序列組成的表面展示肽a)(D/Q/H/E)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(Τ/Ν) CPPD(I/V)(I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L)(SEQ ID NO :1)，或b)abYcdCKefghCPPDijklm(SEQ ID NO :2)，其中 a = (D/Q/H/E) ；b = (L/I) ；c = (K/P/R/Q/S) ；d = (T/S/A/G) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N) ；i =(I/V) ； j = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I/L)，或c)與 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 具有至少 50，60，70，75，80，85，90 或 95% 同一性的序列。如此處所使用，除非本文另有明確規(guī)定，單數(shù)形式的“一個”，“一個”和“這個”包括復數(shù)指代對象。因此，例如，如上使用的術語“組裝自(一個)嵌合多肽”包括一個以上的嵌合多肽。通過比對來自多個PV物種的L2蛋白該部分的高度保守序列，本發(fā)明人之一和共同研究者首先在Gambhira等Q007b) J Virol墜，13927-31中建立了 L2的這一部分的共有序列。該原始比對顯示在本文的圖6中，并作為彩圖IA發(fā)表于Gambhira(2007b)論文中， 以引用方式并入本文，尤其參照該圖和來自其的共有序列。隨后，本發(fā)明人對比對進行擴展以包括更多PV物種，如下表1中所示，并相應地對共有序列進行修飾。已修飾(修改)的共有序列由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2表示。表 1HPV16 L2表位RGl (L2 17-36)在粘膜(對高危型下劃線)和皮膚型HPV中高度保守，并誘導交叉中和(V )
SEQID
(NO9) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV HPV16 - RGl (L2 17 - 36) V
(NO:24) QLYKTCKQAGTCPPDVIPKV HPV73 (95%)
(NO:25) QLYKTCKQSGTCPPDIIPKV HPV34 (95%)
(NO:26) QLYKTCKQAGTCPPDVIPKI 北極熊(Ursus maritimus) PV (90%)
(NO:22) DLYRTCKQAGTCPPDVIPKV 牛 PV 1/2 (89%) V
(NO:27) DLYRTCKQAGTCPPDVIPKV HPV72 (89%)
(NO:28) DLYRTCKQAGTCPPDIIPRV HPV2 (89%) V
(NO:29) DLYRTCKQAGTCPPDIIPRL HPV27 (89%)
(NO:30) DLYRTCKQAGTCPPDIIPRV HPV57 (89%)
(NO: 16) QLYRTCKA AGTCPPDVIPKV HPV35 (85%)
(NO:31) ELYKTCKAAGTCPPDVIPKV HPV77 (85%)
(NO:32) QLYQTCKAAGTCPPDVIPKV HPV67 (85%)
(NO:33) QLYRTCKAAGTCPPDVIPKV HPV3 (85%) V
(NO:34) QLYRTCKAAGTCPPDVIPKV HPV28 (85%)
(NO:35) ELYKTCKVAGTCPPDVIPKV HPV29 (85%)
(NO:36) QLYSTCKAAGTCPPDVIPKV HPV82 (85%)
(NO:37) QLYQTCKAAGTCPSDIIPKV HPV44 (85%)
(NO:38) QLYQTCKAAGTCPSDIIPKV HPV55 (85%)
(NO:39) QLYQTCKAAGTCPPDVVNKV HPV7 (80%)
(NO: 10) DLYKTCKQSGTCPPDVVPKV HPV 18 (80%) V
(N0:40) QLYRTCKASGTCPPDVIPKV HPVl 17 (80%)
(NO:41) QLYRTCKASGTCPPDVIPKV HPV94 (80%)(NO:42) QLYRTCKASGTCPPDVIPKV HPVlO (80%) (NO:43) ELYKTCKQSGTCPPDVINKV HPV68 (80%) (NO:44) DLYRTCKAAGTCPPDVIPKV HPV 102 (80) (NO: 14) QLYQTCKASGTCPPDVIPKV HPV52 (80%) V (NO:15) QLYQTCKASGTCPPDVIPKV HPV58 (80%) V (NO:45) DLYKTCKAAGTCPPDVIPKI HPV69 (80%) (NO:46) DLYKTCKAAGTCPPDVIPKI HPV26 (80%) (NO:47) QLYQTCKASGTCPPDVIPKV HPV42 (80%) (NO:48) QLYQTCKASGTCPPDVIPKV HPV13 (80%) (NO:7) QLYQTCKLTGTCPPDVIPKV HPV6 (80%) V (NO:8) QLYQTCKATGTCPPDVIPKV HPVl 1 (80%) V (NO: 13) QLYQTCKA TGTCPPDVIPKV HPV33 (80%) V (NO:49) DLYRTCKQSGTCPPDVVPKV HPV61 (75%) (NO:5) HIYQTCKQAGTCPPDVINKV HPV5 (75%) V (NO: 6) HIYQTCKQ AGTCPPD VINKV HPV8 (75%) (NO: 12) QLYQTCKAAGTCPSDVIPKI HPV31 (75%) V (NO: 11) DLYRTCKQSGTCPPDVINKV HPV45 (75%) V (N0:50) QLYQTCKASGTCPPDVIPKI HPV32 (75%) V (NO:51) HIYQSCKAAGTCPPDVLNKV HPV76 (60%) V (NO: 52) DIYRGCKASNTCPPDVINKV HPV38 (55%) 0 (NO:3) DIYP S CKI SNTCPPDIQNKI HPVl (50%) (NO:53) NLYAKCQLSGNCLPDVKNKV HPV4 (50%) (NO:21) DIYPTCKIAG.NCPADIQNKF CRPV (55%) 0L2序列可來自任意多種PV物種。典型的合適的L2肽包括，例如列于圖6和表1 中的那些。在本發(fā)明的一個實施方式中，L2肽選自本文所示的交叉反應(交叉中和)的肽。 在本發(fā)明的其它實施方式中，L2肽選自粘膜高危型(例如，導致宮頸癌的最常見類型HPV 16，18，31，33，45，52或58)，或選自皮膚型HPV。例如，合適的L2肽包括來自HPV16 L2蛋白的氨基酸17-36的肽，其具有氨基酸序列 QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV(SEQ ID NO 9)；來自HPV18 L2蛋白的相應氨基酸的肽，其具有氨基酸序列 DLYKTCKQSGTCPPDVVPKV(SEQ ID NO 10)；來自BPVl L2蛋白的相應氨基酸的肽，其具有氨基酸序列 DLYRTCKQAGTCPPDVIPKV(SEQ ID NO 22)；來自HPV38 L2蛋白的相應氨基酸的肽，其具有氨基酸序列 DIYRGCKASNTCPPDVINKV(SEQ ID NO :52)；來自HPVl L2蛋白的相應氨基酸的肽，其具有氨基酸序列
1DIYPSCKISNTCPPDIQNKI(SEQ ID NO :3)；或來自HPV4 L2蛋白的相應氨基酸的肽，其具有氨基酸序列 NLYAKCQLSGNCLPDVKNKV(SEQ ID NO :53)。在本發(fā)明該方面的實施方式中，將L2肽插入至Ll蛋白的環(huán)中，以使L2肽展示在所形成的VLP表面上。例如，可將L2肽插入至Ll蛋白的DE環(huán)或螺旋b4環(huán)中。在本發(fā)明的實施方式中，Ll蛋白來自HPV16(包括HPV16而不是本文舉例說明的114K變體)，L2肽插入至 Ll蛋白DE環(huán)的氨基酸136和137間(HPV16 Ll蛋白的序列為SEQ ID NO 85)；或Ll蛋白來自BPVl，L2肽插入至Ll蛋白DE環(huán)的氨基酸133和1；34間(BPV16 Ll蛋白的序列為SEQ ID NO 83)。本發(fā)明的另一個方面是組裝自(包括，由其組成)包括HPV16 Ll蛋白的嵌合多肽， 其中所述HPV16 Ll蛋白的DE環(huán)中插入了由以下序列組成的肽a)(D/Q/H/E)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(Τ/Ν) CPPD (I/V)(I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L)EG(SEQ ID NO 力4)，或b) abYcdCKefghCPPDi jklmEG(SEQ ID NO :55)，其中 a = (D/Q/H/E) ；b = (L/I) ；c =(K/P/R/Q/S) ；d = (T/S/A/G) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N)； i = (I/V) ； j = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I/L)，或c) SEQ ID NO力4或SEQ ID NO :55的變體，其N末端缺少一個氨基酸和/或C末端缺少一個或兩個氨基酸，或d)與 SEQ ID N0:54 或 SEQ ID NO :55 至少 50，60，70，75，80，85，90 或 95% 同一的
序列，或e)與針對HPV 16 L2 (17-36) (SEQ ID NO 9)的抗血清(例如，兔抗血清)，或與針對肽HPV16 L2 (17-36) (SEQ ID NO 9)的單克隆抗體反應的肽。在本發(fā)明的實施方式中，插入至DE環(huán)的肽由來自HPV16 L2 (氨基酸17-38)的以下序列組成QLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(SEQ IDNO :56)；或 SEQ ID NO :56 的變體，其 N末端缺少一個氨基酸和/或C末端缺少一個或兩個氨基酸。該變體肽的實例包括HPV16 L2肽 (17-36)，其序列為 QLYKTCKQAGTCPPDIIH(V(SEQ ID NO 9)，以及 HPV16 L2 肽(18-38)，其序列為 LYKTCKQAGTCPPDIIH(VEG(SEQ ID NO :57)。在本發(fā)明該方面的實施方式中，L2肽插入至Ll的DE環(huán)中，Ll蛋白來自HPV16，L2肽插入至Ll蛋白DE環(huán)的氨基酸136和137之間。出于參考目的，在本文其它地方提供了完整的HPV16 Ll氨基酸序列，其為SEQ ID NO :85 ；或Ll蛋白來自BPV1，L2肽插入至Ll蛋白DE環(huán)的氨基酸133和134之間。出于參考目的，在本文其他地方提供了完整的BPV16 Ll氨基酸序列，其為SEQ ID NO :83。對于任意本發(fā)明所述的VLP組合物，可使用Ll和L2蛋白/肽的各種組合。例如，Ll和L2蛋白可來自人類乳頭狀瘤病毒(HPV)；Ll蛋白可來自BPV，如BPV1，非常密切相關的BPV2，或已鑒定的至少10種BPV類型之一(例如，BPV4)；或Ll蛋白和/或L2蛋白可來自PV而不是HPV。在本發(fā)明的方面中，Ll蛋白是本文舉例說明的Ll的變體。在本文的其它地方對CN 102458440 A說明書7/36 頁
某些該變體進行了討論。這些包括，例如來自不同HPV類型的作為骨架的Ll基因嵌合體， 以及組裝至VLP或殼粒中的Ll的截短形式。在本發(fā)明的方面中，本發(fā)明的VLP為免疫原性組合物，其誘導例如抗原特異性或固有性體液或細胞免疫應答。本發(fā)明所述的VLP可具有針對1，2，3，4，5或更多個乳頭狀瘤病毒的粘膜高危型(例如HPV 16，18，31，33，45，52，58，68或76)，粘膜低危型(例如HPV 6和11)，導致赫克病(口腔黏膜局灶性上皮增生)的HPV13、32，導致皮膚疣的皮膚低危型 (親皮膚型)(例如 HPV1，2，3，4，7，10，27，57 等)和 / 或皮膚 β 型(例如 HPV5，8，9，12，14， 15，38等)或動物乳頭狀瘤病毒的免疫原性。在PV命名方面，所有β-PV為皮膚型。然而， 通常認為皮膚型是誘發(fā)常見，手掌，足底或扁平皮膚疣的那些(這些是α，γ，μ，ν型)。 β型通常僅在EV患者或免疫抑制患者中誘發(fā)皮膚疣(或皮膚癌)。本發(fā)明的另一個方面是進一步包括佐劑的本發(fā)明所述的VLP或殼粒組合物，或包括本發(fā)明所述VLP組合物和佐劑的疫苗。本發(fā)明所述疫苗可有效對抗人類乳頭狀瘤病毒 (例如，對抗粘膜高危型，低危型，皮膚型和β型(例如，β型HPV 5)乳頭狀瘤病毒)。本發(fā)明所述疫苗可以多種方式配制，包括凍干或粉末形式，通過吸入、口服(例如，丸劑)，在病毒或細菌載體中，或作為性交潤滑劑組分的方式給予的配方。一種給予模式與目前現(xiàn)有的HPV疫苗相似，與佐劑(例如，明礬或明礬-MPL) —起肌肉注射接種。對于缺乏足夠冷凍設備的發(fā)展中國家，凍干、吸入、口服，或病毒或細菌載體的配方將更合適。本發(fā)明的另一個方面是包括乳頭狀瘤病毒(PV)Ll蛋白(例如，HPV16L1蛋白)的嵌合多肽，其中所述乳頭狀瘤病毒(PV) Ll蛋白中插入了由來自乳頭狀瘤病毒L2蛋白的以下序列組成的表面展示肽a) (D/Q/H/E) (L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(Τ/Ν) CPPD(I/V)(I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L)(SEQ ID NO :1)，或b)abYcdCKefghCPPDijklm(SEQ ID NO :2)，其中 a = (D/Q/H/E) ；b = (L/I) ；c = (K/P/R/Q/S) ；d = (T/S/A/G) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N) ；i =(I/V) ； j = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I/L)，或c)與 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 具有至少 50，60，70，75，80，85，90 或 95% 同一性的序列，或組裝自(包括，由其組成)乳頭狀瘤病毒(PV)Ll蛋白的嵌合多肽，其中所述乳頭狀瘤病毒(PV) Ll蛋白的DE環(huán)中插入了由以下序列組成的肽d) (D/Q/H/E) (L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A/G)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N) CPPD (I/V)(I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L)EG(SEQ ID NO 力4)，或e) abYcdCKefghCPPDi jklmEG(SEQ ID NO :55)，其中 a = (D/Q/H/E) ；b = (L/I) ；c =(K/P/R/Q/S) ；d = (T/S/A/G) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N)； i = (I/V) ； j = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I/L)，或f) SEQ ID NO力4或SEQ ID NO :55的變體，其N末端缺少一個氨基酸和/或C末端缺少一個或兩個氨基酸，或g)與 SEQ ID N0:54 或 SEQ ID NO :55 至少 50，60，70，75，80，85，90 或 95% 同一的
序列，或h)與針對HPV 16 L2 (17-36) (SEQ ID NO 9)的抗血清(例如，兔抗血清)，或與針對肽HPV16 L2 (17-36) (SEQ ID NO 9)的單克隆抗體反應的肽。本發(fā)明的其它方面為編碼本發(fā)明所述多肽的核酸(例如DNA、RNA、或其它形式的核酸)；包括該核酸的表達載體(例如，來自病毒或細菌的控制序列)，其可操作地連接于表達控制序列；和包括該多肽、核酸或表達載體的宿主細胞。本發(fā)明的另一個方面是制備VLP或殼粒組合物的方法，其包括在合適條件下孵化如上所述的嵌合多肽以自組裝。本發(fā)明的另一個方面是免疫或接種對象以對抗PV (例如HPV)的方法，其包括給予對象有效量的如本發(fā)明所述的VLP或殼粒組合物。本發(fā)明的另一個方面是誘導對象體內(nèi)針對HPV的免疫應答的方法，其包括給予對象有效量的如本發(fā)明所述的VLP或殼粒組合物(例如免疫原性組合物或疫苗)。免疫應答為抗原特異性或固有性體液免疫應答或細胞免疫應答。本發(fā)明的另一個方面是用于治療已感染PV或具有暴露于PV的風險的對象的方法，其包括給予對象有效量的本發(fā)明所述的VLP或殼粒組合物(例如免疫原性組合物或疫苗)。本發(fā)明的另一個方面是用于預防對象的宮頸癌，生殖器癌，口咽癌或初癌的方法， 其包括給予對象有效量的如本發(fā)明所述的VLP組合物。此處所使用的“初癌”是指宮頸癌和其它生殖器癌的前體，如高度和低度上皮內(nèi)病變，HSIL，LSIL(或CIN，VIN，AIN等，分別與解剖區(qū)域?qū)m頸，外陰和肛門有關)。已知可通過現(xiàn)有的Ll VLP疫苗預防這些疾病，并有望通過本發(fā)明所述的VLP組合物預防。本發(fā)明的另一個方面是試劑盒，其包括如本發(fā)明所述的VLP或殼粒組合物，或包括結(jié)合了本發(fā)明所述VLP組合物的抗體。本發(fā)明的另一個方面是通過接種如本發(fā)明所述的VLP組合物而產(chǎn)生的預防性或治療性抗體或免疫血清，可將其分別給予健康或患病對象以預防或治療PV感染。本發(fā)明的另一個方面是殼粒組合物，其包括自組裝至殼粒(殼粒，五聚體Ll結(jié)構(gòu)亞單元)而不組裝至VLP的本發(fā)明所述的L1/L2嵌合多肽。產(chǎn)生該殼粒的方法在本領域中常見。參見例如 J Virol 1998 Jan ；72(1) :32-41 ;J Virol 1998 Mar ；72 (3) :2160-7; Thones 等 Q007) Virology 369，375-388 ；或Bishop 等(2007)，The Journal of Bioogical Chemistry ■，31803-31811，將所有文獻以引用方式并入，尤其是其對產(chǎn)生殼粒的方法的描述。產(chǎn)生殼粒的一種方法是截短Ll蛋白，或使用抑制其形成VLP能力的突變的Ll基因 (例如，攜帶突變體C175A abd C428A)。參見例如J MoI Bio 2001 Marl6 ；307(1) :173-82; J Virol 1997 Apr ；71(4) J988-95，將兩者以引用方式并入，尤其是與該方法相關的。本發(fā)明的另一個方面是誘導對象體內(nèi)針對α皮膚型HPV (例如HPV2，3)的免疫反應(保護免受其感染)，其包括給予對象有效量的本發(fā)明所述的VLP組合物。HPV2與HPV27 和57型密切相關，其連同HPVl是皮膚疣中最常見的類型。HPV3和密切相關的HPVlO型是低危皮膚α型，常見于immimcompent患者、或免疫受損(例如腎移植)或EV患者的扁平皮膚疣中。如此處所使用，本發(fā)明所述的嵌合“病毒樣顆粒(VLP) ”是指由乳頭狀瘤病毒Ll蛋白分子構(gòu)成的空病毒衣殼，在所述乳頭狀瘤病毒Ll蛋白分子中插入次要(minor，較小)病毒衣殼肽L2。所插入的肽插入至Ll蛋白的適當區(qū)域以使其展示在VLP的表面。在本發(fā)明
13的一個實施方式中，L2肽插入至Ll的DE環(huán)中，例如，BPVl的氨基酸133和134間，HPV16L1 的氨基酸136和137間，或來自其它乳頭狀瘤病毒的Ll分子的等價位點間。所插入的肽包括一個或多個與廣譜PV類型交叉反應的表位(例如，中和表位)。在一個實施方式中，L2 肽包括HPV16 L2蛋白的氨基酸17-36，或來自另一個乳頭狀瘤病毒的氨基酸的等價序列。 嵌合Ll蛋白自發(fā)地組裝至VLP中，并且結(jié)構(gòu)和免疫原性均與天然病毒體類似，但缺乏核酸， 從而無致癌性和感染性。插入了 L2肽的Ll蛋白可來自任意多種乳頭狀瘤病毒(PV)類型(菌株)。例如， VLP用于保護任意多種動物免受PV感染，包括，例如家畜或犬科動物；對于該VLP，Ll可來自已知會感染那些動物的PV菌株，例如BPV1，BPV2, BPV4, BPV6或犬口腔乳頭狀瘤病毒 (COPV)。在一個實施方式中，VLP用于保護人類免受HPV感染；對于該VLP，Ll可來自任意類型的HPV(例如HPV 16，18，45，6，11，1，2，4，5或8)。另外，BPV是用于人類的合適的疫苗載體，尤其是先前暴露于通常用于形成VLP的HPV菌株的患者。本文舉例說明了 Ll蛋白來自BPV和HPV 16的VLP ；包括Ll蛋白的其它來源的結(jié)構(gòu)對于技術人員是顯而易見的。在本文的實施例中，除了插入的L2肽，Ll蛋白基本上是野生型。然而，技術人員將認識到也可使用Ll蛋白的變體，只要該蛋白可耐受合適L2肽的插入而不失去抗原性，并且可組裝至VLP中，或至少組裝至五聚體(殼粒)中。已描述幾個該變體的實例。例如， 一個實例可使用截短的Li，其N端缺少多達10個氨基酸或C末端缺少多達30個氨基酸。 (參見例如 J MoI Bio 2001 Mar 16 ；307(1) 173-82，或 Bishoop 等 Q007) The Journalof Biological Chemistry 282, 31803-31811,將兩者對制備和使用該截短Ll蛋白的公開以弓丨用方式并入。)在另一個實施方式中，可使用具有約60個氨基酸的小型融合肽。(參見例如Virology 1997 Jul 21 ；234(1) :93_111，將其對該融合肽的公開以引用方式并入。)在另一個實施方式中，可使用雜交Ll分子，其中來自第一PV菌株的分子的一部分替換為來自第二 PV菌株的Ll分子。例如，Ll分子的某些功能性部分，如暴露在蛋白外部的“環(huán)”，可替換為來自不同PV菌株的分子。對于該雜交Ll蛋白的實例，見例如Virology 2001 Dec 20 :291(2) :324-34 或 Oroczo 等(2005) J Virol 巡，9503-9514，將兩者對該雜交 Ll 蛋白的公開以引用方式并入。其它類型的變體對于技術人員是顯而易見的。參見例如J Virol 2006May ；80 (10) :4664-72 ；White 等(1999) J Virology 73,4882-4889 ；或Roden 等(1997) J Virol 11,6247-52，將所有文獻中對合適Ll變體的其它類型的公開以引用方式并入。只要插入物展示在VLP表面并且插入物不干擾Ll蛋白的抗原性或蛋白組裝至VLP 中的能力，就可以在Ll蛋白的任意多個位點將L2肽插入Ll蛋白中。Ll HPV16 VLP的結(jié)晶顯示了病毒衣殼的原子結(jié)構(gòu)，特別是包含免疫顯性和構(gòu)象依賴性表位的高度易變的表面環(huán)，所述表位可被中和抗體識別并決定病毒的血清型(Chen等Q000)Molecular Cell 5, 557-567)。因此，L2肽插入至Ll蛋白的合適的位點對于技術人員是顯而易見的。這些包括，例如螺旋b4環(huán)(例如，在HPV16 Ll的氨基酸430和433之間)。在本發(fā)明的實施方式中，L2肽插入至DE環(huán)中(例如，在本文舉例說明的BPV的氨基酸133/134之間，或HPV的等價氨基酸136/137之間)。也可使用其它PV的等價插入位點。任意多種L2肽可插入Ll蛋白中以形成本發(fā)明所述的VLP。在一個實施方式中，肽延伸自 HPV16 L2 的氨基酸 17-36，并具有序列 QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO 9)。技術人員應認識到該序列在多種PV菌株中高度保守，并且類似肽可選自任意多種L2蛋白的等價區(qū)域以插入Ll蛋白中。例如，HPV L2表位可包括等價序列，其來自乳頭狀瘤病毒的α型，或β，γ, δ， ε,ζ,η,θ,ι,κ,λ,μ,ν,ξ,ο,πΜ(參見例如 de Villiers 等 Q004) Virology 324,17-27)；禾口 / 或來自人類乳頭狀瘤病毒:HPV1, HPV2，HPV3，HPV4，HPV5，HPV6，HPV7, HPV8, HPV9, HPVlO, HPV11，HPV12，HPV13, HPV14, HPV15, HPV16, HPV17, HPV18, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99, HPV100 至 HPV127 ；和 / 或動物乳頭狀瘤病毒牛乳頭狀瘤病毒1型(BPVl)，牛乳頭狀瘤病毒2型(BPM)，牛乳頭狀瘤病毒4型 (BPV4)，棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)，鹿乳頭狀瘤病毒(DPV)，歐洲麋鹿乳頭狀瘤病毒，犬口腔乳頭狀瘤病毒(COPV)，獼猴乳頭狀瘤病毒(IihPV)和兔口腔乳頭狀瘤病毒(ROPV)。本發(fā)明所述HPV抗原或表位或肽可包括連續(xù)氨基酸序列，從HPV 16L2多肽SEQ ID NO 81 的氨基酸 χ 至氨基酸 y，其中 χ 為 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21 或 22，y 為氨基酸 26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42 或 43。本發(fā)明所述 HPV 抗原或表位或肽可包括約20個氨基酸，例如15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25個連續(xù)氨基酸。在某些實施方式中，L2肽為HPV16表位(SEQ ID NO 9), HPV18表位(SEQ ID N0:10)，或HPV45表位(SEQID N0:11)。在其它方面，L2肽包括SEQ ID NO :81的氨基酸 17-36 (HPV16L217-36 (SEQ ID NO :9))。雖然該片段指定為基于HPV16的17-36，但來自其它HPV類型的實際氨基酸位置會不同，但易通過與本文所公開的HPV16序列進行比對而鑒定(“等價”或“類似”序列)。在某些方面，L2肽至少或超過50%，60%，70%，80%，85%， 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%與 SEQ ID N0:9 相同。在某些實施方式中，L2肽包括共有氨基酸序列(D/Q/H/E) (L/I) Y (K/P/R/Q/S) (T/S/A/G) CK (Q/I/V/L/A) (A/S/T) (G/N) (T/N) CPPD (I/V) (I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L)(SEQ ID NO 1),或 abYcdCKefghCPPDijklm(SEQ ID NO :2)，其中 a = (D/Q/H/E) ；b = (L/I) ；c = (K/P/R/Q/S) ；d = (T/S/A/G) ；e = (Q/I/ V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N) ；i = (I/V) ；j = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I/L)。如此處所使用，術語“抗原”是能夠被抗體或T細胞受體結(jié)合的分子?？乖€能夠誘導體液免疫應答和/或細胞免疫應答，導致B和/或T淋巴細胞的激活。引起生物應答的抗原的結(jié)構(gòu)方面在本文中是指“抗原決定簇”或“表位”，兩者含義相同。B淋巴細胞通過產(chǎn)生抗體應答外來抗原決定簇，而T淋巴細胞介導細胞免疫。因此，抗原決定簇或表位是被抗體識別的抗原部分，或?qū)τ贛HC，是被T細胞受體識別的抗原部分?？乖瓫Q定簇或表位不必是毗鄰的/連續(xù)的蛋白質(zhì)序列或片段，并且可能包括各種彼此不緊鄰的序列。對于特定氨基酸序列，“表位”是一組涉及被特定免疫球蛋白識別的氨基酸殘基， 或?qū)τ讦蛹毎?，那些殘基是被T細胞受體蛋白和/或主要組織相容性復合體(MHC)受體識
15別所必要的。表位的氨基酸殘基不必毗鄰/連續(xù)。在體內(nèi)或體外免疫系統(tǒng)裝置中，表位是分子的共同特征，如一級，二級和三級肽結(jié)構(gòu)，和電荷一起形成的被免疫球蛋白、T細胞受體或HLA分子所識別的位點。在整個公開中，“表位”和“肽”常交替使用。如此處所使用，“B細胞表位”或“靶表位”(例如HPV L2)，是指在針對包括該抗原 (例如HPV L2表位(免疫原或靶表位))的肽的免疫原性應答中，B細胞受體所識別的肽或蛋白的特征。如此處所使用，“輔助性T細胞表位”或“Th表位”是指在啟動針對包括該抗原的肽的免疫應答時，T細胞受體所識別的肽或蛋白的特征。通常認為T細胞對T細胞表位的識別是通過一種機制進行的，其中T細胞識別抗原的肽片段，其連接于在抗原呈遞細胞上表達的I類或II類主要組織相容性復合體(MHC)分子。在本發(fā)明的某些實施方式中，如本文所描述的已鑒定的表位或表位片段用于檢測具有能夠結(jié)合和展示表位或片段的MHC分子的抗原呈遞細胞。如此處所使用，“HPV”和“人類乳頭狀瘤病毒”是指能夠感染人類的乳頭狀瘤病毒家族的成員。有兩個由其趨向性定義(生殖器/粘膜和皮膚族)的主要HPV族，每個家族包含多個病毒“型”或“株”(例如HPV 16，HPV 18，HPV 31，HPV 32等)。本發(fā)明特別關注的是與生殖器感染和惡性腫瘤相關的HPV型，以及在粘膜和皮膚上產(chǎn)生良性乳頭狀瘤，導致患者發(fā)病的HPV型。術語“疫苗”是指包含1、2、3、4、5或多個本發(fā)明所述VLP組合物的配方。VLP組合物通常以能夠給予對象的形式存在，并誘導保護性或治療性免疫應答，其足以誘導免疫力以防止和/或改善感染和/或降低至少一種感染癥狀和/或提高另一種抗HPV治療或預防的功效。通常，疫苗包括常用的生理鹽水或緩沖水溶液介質(zhì)，本發(fā)明所述組合物懸浮或溶解在其中，雖然也考慮給予干粉，例如通過吸入，甚至與其它佐劑如明礬共同配制后給予。本發(fā)明所述組合物可方便地用于防止、改善或治療感染。在引入宿主后，本發(fā)明所述的免疫原性組合物(例如，疫苗)能夠引發(fā)免疫應答，包括但不限于抗體和/或細胞因子的產(chǎn)生和/ 或細胞毒性T細胞、抗原呈遞細胞、輔助性T細胞、樹突狀細胞的活化和/或其它細胞應答。 通常，該應答在多種乳頭狀瘤病毒類型之間具有交叉反應性，包括但不限于本文所描述的 2、3、4、5、6、7、8、9、10或多個HPV型。本文在別處討論了特定的交叉反應的HPV型。如此處所使用，“預防性”和“預防性的”疫苗，抗體或免疫血清是設計并給予以防止由病原性生物，特別是HPV所導致的或與其相關的感染，疾病和/或任何有關的后遺癥的疫苗，抗體或免疫血清。如此處所使用，“治療性”疫苗是設計并給予已感染病原性生物如至少一種HPV菌株的患者的疫苗。治療性疫苗(例如，治療性HPV疫苗)用于防止和/或治療這些已感染個體中良性或惡性腫瘤的發(fā)展。當用于權(quán)利要求和/或說明書中時，術語“抑制”，“降低”或“防止”或這些術語的任意變體，包括任意可測量的減少或完全抑制以達到所需的結(jié)果，如抑制、降低或防止病毒感染、病毒播散、病毒生長或病毒傳播。在本申請中，術語“約”用于表示數(shù)值包括所采用的測定數(shù)值的裝置或方法的誤差的標準偏差。認為本文所提供的列表中的一個或多個成員可特別地從要求保護的發(fā)明中排除或包括在要求保護的發(fā)明中。此處所使用的“對象”，包括任何感染了或具有感染乳頭狀瘤病毒風險的動物。合適的對象(患者)包括實驗動物(如小鼠，大鼠，兔，豚鼠或豬)，耕畜(如牛)，競技動物 (如狗或馬)和家畜或?qū)櫸?如馬，狗或貓)。包括非人類靈長類和人類患者。此處所使用的術語“蛋白”，“多肽”和“肽”不局限于任意特定數(shù)量的氨基酸；這些術語有時在本文中交替使用。已熟知并且可通過常規(guī)方法測定本發(fā)明所述的蛋白性質(zhì)和氨基酸序列以及編碼它們的核酸的性質(zhì)和序列，也可從多種已知數(shù)據(jù)庫中下載。見，例如NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫。本文提供了一些序列。此信息在提交該申請時是準確的。然而，某些序列信息會定期進行更新(例如，糾正之前條目中的錯誤)，因此本申請也包括對關于蛋白和編碼蛋白的核酸的信息的更新(糾正)。本文討論的序列數(shù)據(jù)庫所提供的信息以引用方式并入本申請中。本文所討論的嵌合蛋白有時在本文中稱為“本發(fā)明所述蛋白(或本發(fā)明的蛋白)”。本發(fā)明的一個方面是制備本發(fā)明的VLP (或其多肽組分)的方法。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用根據(jù)特定氨基酸序列進行調(diào)整的常用方法合成HPV表位。該技術包括，例如，肽合成領域技術人員熟知的方法，例如液相合成[見Firm等ftOteinsd1^ Ed. ,Neurath and Hill(Eds), AcademicPress, NY, 2,105-253,1976],或固相合成[見 Barany 等=The Peptides,Grossand Meienhofer(Eds. ),Academic Press,NY,3-284,1979],或 Merrifield 等[(1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154]報導的逐步固相合成，將其內(nèi)容以引用方式并入本文。關于肽合成技術的其它文獻包括通過Lu等人在(1981) J. Org. Chem.堅，3433 所公開的固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式進行肽合成，使用Fmoc/tBu程序進行肽合成 (Atherton 等Solid Phase PeptideSynthesis :A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989)。 Fmoc氛基酸可購自多個供應商，例如Chem—Impex International (伍德代爾，111，USA)，Merck Biosciences (諾丁漢，UK)，和 Bachem UK Ltd.(圣海倫斯，UK)。另外，可重組地制備本發(fā)明所述多肽。本發(fā)明提供包含DNA的重組克隆和表達載體，以及包含重組載體的宿主。包括DNA的表達載體可用于制備本發(fā)明所述的由DNA所編碼的多肽或多肽片段。制備多肽的方法包括在能夠促進多肽表達的條件下，對已被編碼所述多肽的重組表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞進行培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)物中回收所表達的多肽。技術人員將認識到根據(jù)所采用宿主細胞的類型，以及多肽是膜結(jié)合的還是宿主細胞所分泌的可溶性形式等因素，純化所表達多肽的程序會有所不同。本發(fā)明所述多肽可包括各種前導序列，其引導運輸或協(xié)助純化?？刹捎萌我夂线m的表達系統(tǒng)。載體包括編碼本發(fā)明所述多肽或片段的DNA，可操作地連接于合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控核苷酸序列，如來自哺乳動物細胞，微生物，病毒，昆蟲基因的核苷酸序列。調(diào)控序列的實例包括轉(zhuǎn)錄啟動子，操縱子，或增強子，mRNA核糖體結(jié)合位點，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的啟動和終止的合適序列。當調(diào)控序列與DNA序列功能相關時，可操作地連接核苷酸序列。因此，如果啟動子核苷酸序列控制DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子核苷酸序列可操作地連接于DNA序列。通常將賦予在所需宿主細胞中復制的能力的復制起點，和用于鑒定轉(zhuǎn)化株的選擇基因并入表達載體中。用于表達多肽的合適的宿主細胞包括原核生物，酵母或高等真核細胞。通常優(yōu)選哺乳動物或昆蟲細胞用作宿主細胞。用于細菌，真菌，酵母和哺乳動物細胞宿主的合適的克隆和表達載體描述于，例如Pouwels等Cloning Vectors :A Laboratory Manual, Elsevier, NY，1985。也可使用來自本文所公開的DNA結(jié)構(gòu)的RNA，采用無細胞翻譯系統(tǒng)制備多肽。通常，本文所提及的分子生物學方法為本領域所熟知并描述于，例如Sambrook等， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,現(xiàn)行版，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY,禾口Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley & sons, New York, NY。可實現(xiàn)多肽組裝至VLP的方法和對其進行純化以用于對象的方法是熟知而常見的。對于“自組裝的合適條件”參見例如在本文實施例中所描述的方法，或Kirnbauer等 (1993)J Virol 67,6929-6936 ；Volpers ^ (1994)Virology 200,504-512 ；或 J MoI Biol 2001 Mar 16 ；307(1) :173_82，將所有文獻對該方法的描述以引用方式并入。本發(fā)明所述方法包括預防和/或治療由乳頭狀瘤病毒感染導致的或與其有關的病或疾病(例如，HPV感染)?？山o予結(jié)合相同的免疫原性HPV肽和/或抗體以在已感染或懷疑曾暴露于HPV或具有感染HPV風險的對象中誘導或提供保護性和/或治療性應答。對于暴露于HPV且測試呈陽性的個體或根據(jù)可能的暴露而被認為具有感染風險的個體，可采用該方法。在某些實施方式中，在佐劑或載體或其它抗原(HPV抗原或來自其它病原體的抗原)的存在下給予治療。此外，在某些實例中，治療包括給予常用于對抗病毒感染的其它藥物，如一種或多種抗病毒劑?？赏ㄟ^使用其它非特異性免疫應答刺激因子增強VLP組合物的免疫原性，其稱為佐劑。合適的佐劑包括所有可接受的免疫刺激性化合物，如細胞因子，毒素，或合成成分如明礬。許多佐劑可用于增強針對本文所描述的VLP的抗體應答。佐劑可用于(1)在體內(nèi)捕獲抗原，導致緩慢釋放；( 將涉及免疫應答的細胞吸引至給予部位；C3)誘導免疫系統(tǒng)細胞的增殖或活化；或(4)提高抗原在對象體內(nèi)的散布。佐劑包括但不限于，水包油乳劑，油包水乳劑，礦物鹽，多核苷酸和天然物質(zhì)?？墒褂玫奶禺愋宰魟┌↖L-I，IL-2，，IL-4，IL-T, IL-12，Y -干擾素，GM-CSF，BCG，鋁鹽，如氫氧化鋁或其它鋁化合物，MDP化合物，如thur-MDP和nor_MDP，CGP (MTP-PE)，類脂A，和單磷酰脂質(zhì)A(MPL)，或滅活的微生物菌劑。RIBI是在2%鯊烯/吐溫80乳劑中，包含提取自細菌的三種組分，MPL，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和細胞壁骨架(CWQ。甚至可使用MHC抗原。 其它佐劑或方法在美國專利6，814，971，5，084，269,6, 656，462中舉例說明，將其每一個以引用方式并入本文。各種實現(xiàn)佐劑對疫苗作用的方法包括使用藥物如氫氧化鋁或磷酸鋁(明礬)，通常在磷酸鹽緩沖鹽水中作為約0. 05至0. 1 %的溶液使用，與作為約0. 25%溶液使用的合成性糖聚合物(CARBOPOL )混合，通過在溫度范圍為約70°至約101°C下分別熱處理30 秒至2分鐘使疫苗中蛋白聚集。可采用使用胃蛋白酶處理的(Fab)白蛋白抗體再活化而聚集；與革蘭氏陰性菌的細菌細胞(例如，微小隱孢子蟲)，內(nèi)毒素或脂多糖成分混合；在生理上可接受的油溶媒中進行乳化(例如，二縮甘露醇一油酸(Aracel A))；或使用用作封閉替代物的全氟化碳(FLUOSOL-DA )的20%溶液進行乳化以產(chǎn)生佐劑效應。典型的佐劑是
18完全弗氏佐劑(含有已殺滅的結(jié)核分枝桿菌)，不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁。對于人類的給藥，各種合適的佐劑對技術人員是顯而易見的。這些包括作為佐劑的明礬-MPL，或類似的配方AS04，其用于已批準的HPV Ll疫苗Cervarix ，AS03，AS02， MF59，montanide，基于皂苷的佐劑，如GPI-0100，基于CpG的佐劑，或咪喹莫特。在本發(fā)明的實施方式中，佐劑物理耦合至VLP，或包封在VLP中，而不是簡單地與其混合。除了佐劑，可能需要共給予生物應答調(diào)節(jié)劑(BRM)以增強免疫應答。已顯示BRM 可上調(diào)T細胞免疫性或下調(diào)抑制細胞活性。該BRM包括但不限于，西咪替丁(CIM ;1200mg/ d) (Smith/Kline, PA)或低劑量環(huán)磷酰胺(CYP ；300mg/m2) (Johnson/Mead, NJ)和細胞因子如Y-干擾素，IL-2，或IL-12或編碼涉及免疫輔助功能蛋白的基因，如B-7。在本發(fā)明的實施方式中，這些基因包封于VLP中，以幫助其傳送至對象。應用方式可大不相同?？蓱萌魏谓o予疫苗的常規(guī)方法。認為其包括在生理上可接受的固體基質(zhì)上或在生理上可接受的分散劑中口服給予，通過注射，吸入粉末，經(jīng)皮貼齊IJ，經(jīng)陰道灌注等腸道外給予。疫苗的劑量取決于給予途徑并根據(jù)對象的大小和健康情況有所不同。包含多肽或肽序列作為活性成分的疫苗的制備在本領域中通常是眾所周知的，在美國專禾Ij 4，608，251 ；4，601，903 ；4，599，231 ；4，599，230 ；4，596，792 和 4，578，770 中舉例說明，將所有文獻已引用方式并入本文。通常，將該疫苗制備為液態(tài)溶液或混懸劑形式的注射劑也可制備注射前適合溶于或混懸于液體的固體形式。制劑也可是乳化的。通常將活性免疫原性成分與藥學上可接受并且與活性成分相容的輔料混合。合適的輔料為，例如水， 鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇或類似物及其組合。此外，如果需要，疫苗可包含一定量的輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑，PH緩沖劑，或增強疫苗效果的佐劑。在具體實施方式
中，將疫苗配制為物質(zhì)的組合物，如美國專利6，793，923和6，733，754所描述，將其以引用方式并入本文?？赏ㄟ^吸入給予疫苗。在某些實施方式中，疫苗可作為氣霧劑給予。此處所使用的術語“氣霧劑”或“霧化組合物”是指在氣體中懸浮的固體或液體顆粒。通常使用該術語來指被汽化，霧化或由固體或液體形式轉(zhuǎn)變?yōu)榘☉腋」腆w或液體藥物顆粒的可吸入形式的組合物。該氣霧劑可用于通過呼吸系統(tǒng)傳送疫苗。如此處所使用，“呼吸系統(tǒng)”是指體內(nèi)負責攝入氧氣和呼出二氧化碳的器官系統(tǒng)。該系統(tǒng)通常包括從鼻到肺泡的所有呼吸道。在哺乳動物中，通常認為其包括肺，支氣管，細支氣管，氣管，鼻道和膈。出于本發(fā)明公開的目的， 將疫苗傳送至呼吸系統(tǒng)表示將藥物傳送至一個或多個呼吸系統(tǒng)的呼吸道中，特別是傳送至肺中。適合其它給予模式的其它配方包括栓劑(肛門或陰道使用)和在某些情況下口服制劑。對于栓劑，傳統(tǒng)的粘合劑和載體可包括，例如聚亞烷基二醇或甘油三酯該栓劑可由混合物形成，其包含的活性成分范圍為約0. 5%至約10%，優(yōu)選為約至約2%。口服制劑包括通常采用的輔料如，例如藥物級甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。這些組合物可采用溶液劑，混懸劑，片劑，丸劑，膠囊劑緩釋制劑或粉末劑的形式，并含有約10%至約95%活性成分，優(yōu)選約25%至約70%。VLP組合物可配制為中性或鹽形式的疫苗。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基形成)和與無機酸例如鹽酸或磷酸，或有機酸如醋酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可來自無機堿如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機堿如異丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因等。在許多情況下，需要多次給予疫苗，通常最多，最少或不超過1，2，3，4，5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14，15或更多次包括在其間的所有范圍的接種。接種通常間隔1，2，3，4，5，6， 7，8，9，10，11，12周/月/年，包括其間的所有值和范圍，通常間隔為三至五周。通常會需要間隔1-15年，通常為十年的定期加強以維持抗體的保護水平?？赏ㄟ^測定針對抗原的抗體追蹤免疫過程，如在前所述的美國專利3，791，932 ；4, 174，384和3，949，064，其對該類型的測定進行了描述。本發(fā)明的組合物和有關方法，特別是將包括HPV L2表位的VLP給予患者/對象， 也可與傳統(tǒng)HPV篩查和/或其它疫苗組合使用，包括例如抗體或抗體片段，巴氏涂片，PCR, DNA印跡法，給予CERV ARIX , GARDASIL , HPV或其它傳染原的疫苗，HPV病變的消融療法， HPV病變的免疫調(diào)節(jié)療法(例如Aldara )等。在某些實施方式中，給予對象藥物組合物。本發(fā)明的不同方面涉及給予對象有效量的組合物。在本發(fā)明的某些實施方式中，將包括HPV L2表位的VLP給予患者以保護其防止或治療一種或多種HPV病原體感染。該組合物通常溶解或分散于藥學上可接受的載體或水性介質(zhì)中。如此處所使用，術語“藥學上可接受的”或“藥理上可接受的”是指在全面醫(yī)學評價的范圍內(nèi)，化合物、材料、成分和/或劑型適合與人類和動物的組織接觸而無過多的毒性、 刺激性、過敏性反應或其它難處理的并發(fā)癥，其相當于合理的收益/風險比。術語“藥學上可接受的載體”是指藥學上可接受的、涉及運送或轉(zhuǎn)運化學藥物的材料、成分或媒介物，如液體或固體填充劑，稀釋劑，賦形劑，溶劑或包封材料。藥學上可接受的載體包括任意和所有溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗菌劑和抗真菌劑，等滲和吸收延緩劑等。本領域熟知該介質(zhì)和藥物針對藥學活性物質(zhì)的使用。除非任意常用介質(zhì)或藥物與活性成分不相容，否則可考慮其用于免疫原性和治療性組合物?？膳渲票景l(fā)明所述活性化合物用于腸道外給藥，例如配制通過靜脈，肌內(nèi)，皮下， 或甚至腹膜內(nèi)途徑注射。除了配制用于氣霧劑或腸道外給予的化合物，如用于靜脈或肌內(nèi)注射的那些，其它藥學上可接受的形式包括，例如用于口服給予的片劑或其它固體；延時釋放膠囊。作為游離堿或藥理上可接受的鹽的活性化合物的溶液可通過在水中與表面活性劑適當混合來制備，如羥丙基纖維素。也可在甘油，液態(tài)聚乙二醇，其混合物和油中制備分散劑。在普通條件下儲存和使用時，該制劑包含防腐劑以防止微生物的生長。適合注射用途的藥學形式包括無菌水溶液或分散劑；包括芝麻油，花生油或水性丙二醇的配方；以及用于即時制備無菌注射液或分散劑的無菌粉末。在所有情況下劑型必須無菌并且其流動程度必須易于注射。其還應在生產(chǎn)和儲存條件下穩(wěn)定，并且必須保存以免受微生物如細菌和真菌的污染作用?？蓪LP組合物配制為中性或鹽的形式。藥學上可接受的鹽，包括酸加成鹽(與蛋白的游離氨基形成)和與無機酸例如鹽酸或磷酸，或有機酸如醋酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可來自無機堿如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機堿如異丙胺，三乙胺，組氨酸，普魯卡因等。載體也可為溶劑或分散介質(zhì)，其包括例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，其合適的混合物，和植物油?？赏ㄟ^例如使用包衣如卵磷脂，在分散劑的情況下通過保持所需的微粒大小，通過使用表面活性劑來維持適當?shù)牧鲃有浴？赏ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑來實現(xiàn)微生物作用的防止，例如對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸， 硫柳汞等。在許多情況下優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可通過在組合物中使用延緩吸收的物質(zhì)實現(xiàn)注射組合物的持久吸收，例如單硬脂酸鋁和明膠。通過將活性化合物加入具有如上列舉的各種成分的所需量的合適溶劑中來制備無菌注射液，如需要，隨后進行過濾滅菌。通常，通過將各種滅菌的活性成分加入含有基本分散介質(zhì)和所需的如上列舉的其它成分的無菌媒介物中來制備分散劑。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術，由先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性物質(zhì)及任何其它所需成分的粉末。通常通過任意常見途徑給予如本發(fā)明所述的組合物。這包括但不限于口服，鼻或含服給予。另外，給予可通過原位，皮內(nèi)，皮下，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，呼吸道或靜脈給予。在某些實施方式中，可吸入疫苗組合物(例如，美國專利6，651，655，以引用方式特意將其并入本文)。該組合物通常作為藥學上可接受的組合物給予，其包括生理上可接受的載體，緩沖液或其它輔料。對于在水溶液中腸道外給予，應對溶液進行例如適當?shù)木彌_，如必要，使用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液特別適合用于靜脈，肌內(nèi)，皮下和腹膜內(nèi)給予。在這方面，本領域技術人員根據(jù)本公開將知悉可采用的無菌水性介質(zhì)。例如，將一個劑量溶于等滲NaCl溶液中并加入至皮下輸液流體中或在建議的輸注位置進行注射(參見例如Remington' s Pharmaceutical Sciences，1990)。根據(jù)對象的條件，劑量必然會發(fā)生一些變化。負責給予的人在任何情況下都應確定針對個別對象的合適劑量。根據(jù)預期目標確定治療性或預防性組合物的有效量?！坝行Я俊笔悄軌蛴行У禺a(chǎn)生所需結(jié)果(例如，可測定量的免疫應答的誘導，對象的免疫等)的量。術語“單位劑量”或 “劑量”是指適用于對象的完全分離的單位，每個單位包含預定量的組合物，通過計算以產(chǎn)生如上所討論的與給予相關的所需應答，即合適的途徑和方案。根據(jù)治療次數(shù)和單位劑量， 待給予的量取決于所需的保護。組合物的精確的量還取決于醫(yī)師的判斷，并且對每個個體是特有的。影響劑量的因素包括對象的身體和臨床狀態(tài)，給予途徑，治療的預期目標(癥狀減輕與治愈)，和特定組合物的效價，穩(wěn)定性和毒性。配制后，以與劑量配方相容的方式并且以治療或預防有效的劑量給予溶液。以多種劑型容易地給予配方，如上面所述的注射液類型。 在本發(fā)明的一個實施方式中，通過給予有效量的編碼本發(fā)明所述嵌合蛋白的重組減毒細菌(如沙門氏菌)將VLP給予對象。VLP隨后在體內(nèi)通過細菌復制所在的腸道產(chǎn)生。 對于使用該細菌載體實施方法的指導，參見例如Nardelli-Haefliger (2007)Clin Vaccine Immunol 11，1285_1四5，以引用方式將其特別針對該公開的內(nèi)容并入。產(chǎn)生可在細菌(細菌載體)內(nèi)表達的重組結(jié)構(gòu)的方法是常見的；某些典型方法在本文其它地方有所描述。凍干的細菌可容易地運送到發(fā)展中國家，在那里可進行重懸并給予對象。該給予模式對于缺乏冷凍能力而需要其它VLP配方的國家是有利的。在另一個實施方式中，VLP在減毒病毒中給予，如減毒腺病毒，或本領域技術人員熟知的其它病毒載體。生產(chǎn)合適的可在病毒宿主中表達的重組核酸的方法是常見，在本文其它地方對某些這樣的方法進行了討論。本發(fā)明包括用于防止或減輕HPV感染的組合物。因此，本發(fā)明期望疫苗用于主動和被動免疫的實施方式中。本發(fā)明的一個實施方式是制備用于預防或治療HPV感染的免疫球蛋白的方法，其包括用本發(fā)明所述疫苗對受體進行免疫，以及從受體中分離免疫球蛋白或抗體，和/或重組性地制備該免疫球蛋白或其片段的步驟。通過該方法制備的免疫球蛋白是本發(fā)明的另一個方面。包括本發(fā)明所述的免疫球蛋白和藥學上可接受的載體的藥物組合物是本發(fā)明的另一個方面，可用于生產(chǎn)治療或預防HPV感染的藥物。包括給予患者有效量的本發(fā)明所述的藥物制劑的步驟的治療或預防HPV感染的方法是本發(fā)明的另一個方面。通常通過將抗原組合物分散于生理上可耐受的稀釋劑如鹽水或其它適合人類使用的佐劑中以形成水性組合物來制備多克隆抗體產(chǎn)品的接種物。將免疫刺激量的接種物給予哺乳動物，例如人類，然后將已接種對象保持足以使抗原組合物誘導保護性抗體的時間。 可通過眾所周知的技術如親和色譜法分離抗體至所需程度(Harlow和Lane，Antibodies =A LaboratoryManual 1988)?？贵w可包括來自各種常用動物的抗血清制劑，例如山羊，靈長類，驢，豬，馬，豚鼠， 大鼠或人。將動物放血并回收血清。根據(jù)本發(fā)明所制備的免疫球蛋白可包括全抗體，抗體片段或亞片段?？贵w可為任意型的全免疫球蛋白，例如IgG，IgM, IgA, IgD或IgE，具有針對兩種或多種本發(fā)明所述抗原的雙重特異性的嵌合抗體或雜交抗體。其也可為片段，例如包括雜交片段的F(ab' )2, Fab'，F(xiàn)ab，F(xiàn)v等。免疫球蛋白也可包括天然，合成或基因工程蛋白，其通過結(jié)合于特異性抗原而形成復合物以起到抗體的作用?？蓪⒈景l(fā)明所述HPV組合物或疫苗給予受體，其隨后充當由于應答HPV組合物的激發(fā)而產(chǎn)生的免疫球蛋白的來源。這樣處理的對象將提供血漿，通過常見的血漿分離方法從中獲得超免疫球蛋白。將超免疫球蛋白給予另一個對象以賦予其抵抗HPV感染的能力或治療HPV感染。本發(fā)明所述的超免疫球蛋白特別用于治療或預防嬰兒，免疫受損的個體或需要治療而沒有時間應答接種而產(chǎn)生抗體的個體的HPV感染。本發(fā)明的另一個方面是包括一種或多種單克隆抗體(或其片段；優(yōu)選人類或人源化的)的藥物組合物，其對抗本發(fā)明所述的免疫原性組合物的成分，可用于治療或預防多種HPV類型的感染。本領域熟知制備單克隆抗體的方法，可包括脾細胞與骨髓瘤細胞的融合(Kohler 等(1975) Nature 256,495 ；Harlow ^ Antibodies :A LaboratoryManual，1988)。另夕卜，可通過篩選合適的噬菌體展示庫獲得單克隆Fv片段(Vaughan等(1998)Nat Biotech 16, 535-539)。單克隆抗體可為人的，人源化的，或通過已知方法部分人源化的。本發(fā)明的另一個方面是本發(fā)明所述的用于接種或治療的試劑盒。在一個具體實施方式
中，試劑盒包括藥瓶和可選的指導給予的藥品說明書，藥瓶包括根據(jù)本發(fā)明所述方法給予的VLP組合物或疫苗。試劑盒中可包括本文所述的任意組合物。在非限制性實例中，試劑盒中可包括用于制備VLP和/或給予VLP的試劑，或通過接種VLP而產(chǎn)生的抗體。試劑盒可進一步包括用于評估VLP體內(nèi)或體外活性的試劑。因此試劑盒可包括在合適容器中的VLP組合物。在
22某些方面，試劑盒可包括用于給予的試劑和/或裝置，例如吸入器或霧化器。其也可包括一種或多種緩沖液，化合物或制備待給予的組合物的裝置。試劑盒的組分可在水性介質(zhì)中或以干粉形式包裝。試劑盒的容器裝置通常包括至少一個藥瓶，試管，燒瓶，瓶，注射器或其它容器裝置，將組分置于其中，優(yōu)選進行適當分裝。 當試劑盒中有一種以上組分時，試劑盒可通常包括第二、第三或其它容器，單獨放置其它組分。然而，在藥瓶中可能包括多種組分的組合。本發(fā)明所述試劑盒通常也包括在密閉條件下包含容器的裝置，以供商業(yè)銷售。該容器可包括注塑或吹塑塑料容器，其中保存所需的藥瓶。當在一種和/或多種液體溶液中提供試劑盒的組分時，液體溶液為水溶液，特別優(yōu)選無菌水溶液。然而，試劑盒的組分可作為干粉提供。當試劑和/或組分作為干粉提供時，可通過加入合適溶劑將粉末復溶?？梢灶A見也在另一容器中提供溶劑。試劑盒也可包括使用試劑盒組分以及使用任意其它未包括在試劑盒中的試劑的使用說明。使用說明可能包括可以實施的變形?？煽紤]該試劑為本發(fā)明所述試劑盒的實施方式。然而，該試劑盒不限于如上確定的特定項目，并可包括任意用于制備和/或給予本發(fā)明所述VLP疫苗的試劑。對于其它用途，本發(fā)明所述試劑盒可用于實驗性應用。技術人員可識別適于實施本發(fā)明所述方法的試劑盒的組分。在之前的和以下實施例中，所有溫度均表示為未校正的攝氏度；除非另有說明，所有部分和百分比均按重量計。實施例實施例I材料和方法A.桿狀病毒表達嵌合L1-L2蛋白通過基因工程方法將HPV16的L2肽引入BPVl Ll (通過插入至aal33/134之間) 或HPV16 Ll (在136/137之間)的DE表面環(huán)中。在構(gòu)建中使用的引物對如下(1.)5 ‘ ~ctg ttt gca tgt ttt ata aag ggt gac ttt tct att cac att ttc tgc-3' (SEQ IDNO :58)(編碼 HPV16 L2 aa 18-24/BPV Ll aa 125-133)5 ‘ -gca ggt aca tgt cca cct gac acc caa aca aca gat gac agg-3‘ (SEQ IDNO :59)(編碼 HPV16 L2 aa 25-31/BPV Ll aa 134-140)(2.)5 ‘ -ccg ctg aat tea ata tgg cgt tgt ggc aac aag-3 ‘ (SEQ ID NO :60) (1 碼 EcoRI-BPV Ll aal-6)5' -gca tga ggt acc get ttt att tct ttt tct ttt ttg cag gc_3' (SEQ ID NO 61)(編碼Kpnl-終止-BPV Llaa 489-495，野生型BPVl Ll ORF序列的胸腺嘧啶 [nt] 1476和[nt] 1482被胞嘧啶代替)(3.)5 ‘ -gta taa tgt cag gtg gac atg tac ctg cct gtt tgc atg ttt tat aaa Rtt RRR tgactt ttc tat tea c_3' (SEQ ID NO :62)(編碼 HPV16 L2 aa 17-33/BPV Ll aal28-133)
5 ‘ -cta_agg_tta ccc aaa caa cag atg aca gga aac aaa cag gcc_3' (SEQ IDNO 63)(編碼 HPV16 L2 aa 34-36/BPV Ll aa 134-145)(4.)5' -egg ccg egg ggt gac ttt tct att c_3' (SEQ ID NO :64)(編碼&tII_BPV Ll aa 129-133)5' -egg ccg egg acc caa aca aca gat g_3' (SEQ ID NO :65) (^5 SstII-BPV Llaa 134-138)(5.)5' -ggc gac aca aac gtt ctg caa aac gca caa aac gtg cat egg cta ccc aac tttata aaa cat gcc cgc~3' (SEQ ID NO :66)(編碼 HPV 16 L2 aa 2~22-SstII)5' -ggg cat gtt tta taa agt tgg gta gcc gat gca cgt ttt gtg cgt ttt gca gaa cgtttg tgt CRC crc-3' (SEQ ID NO 67)(編碼 HPV 16 L2 aa 2-22-SstII)(6.)5' -gga agg ttg aag gca aaa cta ttg ctg ate aaa tat tac aat atg gaa gta tgg gtgtat ttt ttg gtg ggt tag gaa ttg gaa cag ggt egg gta cag gcg gac gca ctg ggt ata ttccat tgc cgc~3' (SEQ ID NO :68)(編碼 HPV16 L2 aa 35-75-SstII)5' ggc aat gga ata tac cca gtg cgt ccg cct gta ccc gac cct gtt cca att cct aaccca cca aaa aat aca ccc ata ctt cca tat tgt aat att tga tea gca ata gtt ttg cct tea accttcc gc-3' (SEQ ID NO :69)(編碼 HPV16 L2 aa 35-75-SstII)(7.)5' -gca tga ccg egg ttg gga aca agg cct ccc aca get ac~3' (SEQ ID NO 70)(編碼 SstII-HPV16 L2 aa 75-83)5' -gca tga ccg egg agt ttc ttc cac taa aga aac~3' (SEQ ID NO :71) (1 碼 SstII-HPV16 L2 aa 106-112)(8.)5' -gca tga ccr crr att gat get ggt gca cca ac_3' (SEQ ID NO :72)(編碼 SstII-HPV16 L2 aa 115-121)5' -gca tga ccg egg agt agt aac agt att att aat atc~3' (SEQ ID NO :73) (編碼 SstII-HPV16 L2 aa 147-154)(9.)5' -gca tga ccg egg aat aat act gtt act act gtt act ac_3' (SEQ ID NO
74)(編碼SstII_HPV16 L2 aa 149-156)5' -gca tga ccr crr ttc tgc agg tgt tgg agg ctg caa tac_3' (SEQ ID NO
75)(編碼SstII-HPV16 L2 aa 167-175)(10.)5' -gca tga ccg egg cca aca cct gca gaa act gga g-3' (SEQ ID NO :76) (編碼 SstII-HPV16 L2 aa 172-178)5' -gca tga ccg egg tgt ate cat agg aat ttc ttc ata att atg-3' (SEQ IDNO 77)(編碼 ktII-HPV16 L2 aa 191-200)
(11.)5 ‘ -gca tga ccr crr Rca tcg get acc caa ctt tat aaa ac~3' (SEQ ID NO
78)(編碼SstII-HPV16 L2 aa 13-21)5' -gca tga ccr crr aga aac tat aga agg ate aga agg gc~3' (SEQ IDNO
79)(編碼SstII-HPV16 L2 aa 99-107)生成這些引物的編碼HPV16L2和BPVLl的序列，和所編碼的蛋白的序列為HPV16(114) L2 核酸(SEQ ID NO 80)ATGCGACACAAACGTTCTGCAAAACGCACAAAACGTGCATCGGCTACCCAACTTTATAAAACATGCAAACAGGCAGGTACATGTCCACCTGACATTATACCTAAGGTTGAAGGCAAAACTATTGCTGATCAAATATTACAATATG GAAGTATGGGTGTATTTTTTGGTGGGTTAGGAATTGGAACAGGGTCGGGTACAGGCGACCACTGGGTATATTCCATTGGGAACAAGGCCTCCCACAGCTACAGATACACTTGCTCCTGTAAGACCCCCTTTAACAGTAGATCCTGTGGGCCCTTCTGATCCTTCTATAGTTTCTTTAGTGGAAGAAACTAGTTTTATTGATGCTGGTGCACCAACATCTGTACCTTCCATTCCCCCAGATGTATCAGGATTTAGTATTACTACTTCAACTGATACCACACCTGCTATATTAGATATTAATAATACTGTTACTACTGTTACTACACATAATAATCCCACTTTCACTGACCCATCTGTATTGCAGCCTCCAACACCTGCAGAAACTGGAGGGCATTTTACACTTTCATCATCCACTATTAGTACACATAATTATGAAGAAATTCCTATGGATACATTTATTGTTAGCACAAACCCTAACACAGTAACTAGTAGCACACCCATACCAGGGTCTCGCCCAGTGGCACGCCTAGGATTATATAGTCGCACAACACAACAAGTTAAAGTTGTAGACCCTGCTTTTGTAACCACTCCCACTAAACTTATTACATATGATAATCCTGCATATGAAGGTATAGATGTGGATAATACATTATATTTTTCTAGTAATGATAATAGTATTAATATAGCTCCAGATCCTGACTTTTTGGATATAGTTGCTTTACATAGGCCAGCATTAACCTCTAGGCGTACTGGCATAAGGTACAGTAGAATTGGTAATAAACAAACACTACGTACTCGTAGTGGAAAATCTATAGGTGCTAAGGTACATTATTATTATGATTTTAGTACCATTGATCCTGCAGAAGAAATAGAATTACAAACTATAACACCTTCTACATATACTACCACTTCACATGCAGCCTCACCTACTTCTATTAATAATGGATTATATGATATTTATGCAGATGACTTTATTACAGATACTTCTACAACCCCGGTACCATCTGTACCCTCTACATCTTTATCAGGTTATATTCCTGCAAATACAACAATTCCTTTTGGTGGTGCATACAATATTCCTTTAGTATCAGGTCCTGATATACCCATTAATATAACTGACCAAGCTCCTTCATTAATTCCTATAGTTCCAGGGTCTCCACAATATACAATTATTGCTGATGCAGGTGACTTTTATTTACATCCTAGTTATTACATGTTACGAAAACGACGTAAACGTTTACCATATTTTTTTTCAGATGTCTCTTTGGCTHPV16(114)L2 蛋白(SEQ ID NO:81) (NC_001522)MRHKRSAKRTKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVETSFIDAGAPTSVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYSRTTQQVKVVDPAFVTTPTKLITYDNPAYEGIDVDNTLYFSSNDNSINIAPDPDFLDIVALHRPALTSRRTGGIRYSRIGNKQTLRTRSGKSIGAKVHYYYDFSTIDPAEEIELQTITPSTYTTTSHAASPTSINNGLYDIYA
DDFITDTSTTPVPSVPSTSLSGYIPANTTIPFGGAYNIPLVSGPDIPINITDQAPSLIPIVPGSPQYTIIADAGDFYLHPSYYMLRKRRKRLPYFFSDVSLAABPVl Ll 核酸(SEQ ID NO:82):atggcgttgtggcaacaaggccagaagctgtatctccctccaacccctgtaagcaaggtgctttgcagt gaaacctatgtgcaaagaaaaagcattttttatcatgcagaaacggagcgcctgctaactataggacatccatattacccagtgtctatcg gggccaaaactgttcctaaggtctctgcaaatcagtatagggtatttaaaatacaactacctgatcccaatcaatttgcactacctgacaggact gttcacaacccaagtaaagagcggctggtgtgggcagtcataggtgtgcaggtgtccagagggcagcctcttggaggtactgtaactgggcac cccacttttaatgctttgcttgatgcagaaaatgtgaatagaaaagtcaccacccaaacaacagatgacaggaaacaaacaggcctagatgct aagcaacaacagattctgttgctaggctgtacccctgctgaaggggaatattggacaacagcccgtccatgtgttactgatcgtctagaa aatggcgcctgccctcctcttgaattaaaaaacaagcacatagaagatggggatatgatggaaattgggtttggtgcagccaacttcaaagaa attaatgcaagtaaatcagatctacctcttgacattcaaaatgagatctgcttgtacccagactacctcaaaatggctgaggacgctgctggt aatagcatgttcttttttgcaaggaaagaacaggtgtatgttagacacatctggaccagagggggctcggagaaagaagcccctaccacagattt ttatttaaagaataataaaggggatgccacccttaaaatacccagtgtgcattttggtagtcccagtggctcactagtctcaactgataat caaatttttaatcggccctactggctattccgtgcccagggcatgaacaatggaattgcatggaataatttattgtttttaacagtgggggacaat acacgtggtactaatcttaccataagtgtagcctcagatggaaccccactaacagagtatgatagctcaaaattcaatgtataccatagacatat ggaagaatataagctagcctttatattagagctatgctctgtggaaatcacagctcaaactgtgtcacatctgcaaggacttatgccctctgtg cttgaaaattgggaaataggtgtgcagcctcctacctcatcgatattagaggacacctatcgctatatagagtctcctgcaactaaatgtgcaa gcaatgtaattcctgcaaaagaagacccttatgcagggtttaagttttggaacatagatcttaaagaaaagctttctttggacttagatcaatt tcccttgggaagaagatttttagcacagcaaggggcaggatgttcaactgtgagaaaacgaagaattagccaaaaaacttccagtaagcctgcaaaa
3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3. 3.3.BPVl Ll 蛋白(SEQ ID NO :83)MALWQQGQKLYLPPTPVSKVLCSETYVQRKSIFYHAETERLLTIGHPYYPVSIGAKTVPKVSANQYRVFKIQLPDPNQFALPDRTVHNPSKERLVWAVIGVQVSRGQPLGGTVTGHPTFNALLDAENVNRKVTTQTTDDRKQTGLDAKQQQILLLGCTPAEGEYWTTARPCVTDR
26
LENGACPPLELKNKHIED⑶MMEIGFGAANFKEINASKSDLPLDIQNEICLYPDYLKMAEDAAGNSMFFFARKEQVYVRHIWTRGGSEKEAPTTDFYLKNNK⑶ATLKIPSVHFGSPSGSLVSTDNQIFNRPYWLFRAQGMNNGIAWNNLLFLTV⑶NTRGTNLTISVASDGTPLTEYDSSKFNVYHRHMEEYKLAFILELCSVEITAQTVSHLQGLMPSVLENWEIGVQPPTSSILEDTYRYIESPATKCASNVIPAKEDPYAGFKFWNIDLKEKLSLDLDQFPLGRRFLAQQGAGCSTVRKRRISQKTSSKPAKKKKK用于構(gòu)建圖1所示的結(jié)構(gòu)J的編碼HPV16L1的序列，和所編碼的蛋白序列為HPV16(114K)L1 核酸(SEQ ID NO 84)ATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAAGCACGGATGAATATGTTGCACGCACAAACATATATTATCATGCAGGAACATCCAGACTACTTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCCTATTAAAAAACCTAACAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGTATCAGGATTACAATACAGGGTATTTAGAATACATTTACTGACCCCAATAAGTTTGGTTTTCCTGACACCTCATTTTATAATCCAGATACACAGCGGCTGGTTTGGGCCTGTGTAGGTGTTGAGGTAGGTCGTGGTCAGCCATTAGGTGTGGGCATTAGTGGCCATCCTTTATTAAATAAATTGGATGACACAGAAAATGCTAGTGCTTATGCAGCAAATGCAGGTGTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGGATTACAAACAAACACAATTGTGTTIAATTGGTTGCAAACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCCCATGTACCAATGTTGCAGTAAATCCAGGTGATTCTCCACCATTAGAGTTAATAAACACAGTTATTCAGGATGGTGATATGGTTGATACTGGCTTTGGTGCTATGGACTTTACTACATTACAGGGCTAACAAAAGTGAAGTTCCACTGGATATTTGTACATCTATTTGCAAATATCCAGATTATATTAAAATGGTGTCAGAACCATATGGCGACAGCTTATTTTTTTATTTACGAAGGGAACAAATGTTTGTTAGACATTTATTTAATAGGGCTGGTACTGTTGGTGAAAATGTACCAGACGATTTATACATTAAAGGCTCTGGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGTTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAACCTTATTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCACTATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTTGTAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAATACACTTTTTGGGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAAATTTTTACTACAAGCAGGATTGAAGGCCAAACCAAAATTTACATTAGGAAAACGAAAAGCTACACCCACCACCTCATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACGTAAGCTGTAAHPV16(114K)L1 蛋白(SEQ TD NO 85)MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCT
NVAVNP⑶CPPLELINTVIQD⑶MVDTGFGAMDFITLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPY⑶SLFFYLRREQMFVRHLFNRAGTVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTWDTTRST 匪 SLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL通過反向降落(inverse-touchdown) PCR，使用桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體BPVl Ll-pEVmod 將逆向(背對背)合成的編碼HPV16 L2 aa 18-31的寡核苷酸(1.，見上述引物對)插入 BPVl Ll pEVmod 中(Kirnbauer 等(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89,12180-12184) 為避免非特異性產(chǎn)物，七個循環(huán)中將退火溫度降低1. 5°C，接著以最終降落溫度進行另外30 個循環(huán)。隨后，插入的L2序列通過平末端連接而結(jié)合。通過O.)將靜默突變引入C末端Ll 0RF(poly-A tract)以避免擴增引物的突變。將突變的L1-L2序列再克隆至載體pEVmod， 并且通過再次應用PCR(3.)進一步延長所插入的L2表位。采用通過反向降落PCR使用引物對新建立的插入aa 133/134中的 Sstll(ccgcgg)限制性酶切位點，將以下一系列貫穿HPV16 L2的N末端的肽并入BPVl Ll pEVmod中。編碼HPV16 L2肽aa 2-22(5·)，aa35_75 (6.)的雙鏈寡核苷酸(具有側(cè)面 SstII位點)通過合成寡核苷酸退火，或通過生成分別編碼HPV16 L2 aa 75-112(7.), aa 115-154(8.) ,aal49-175(9.) ,aa 172-200(10.) ,aa 13-107(11.)的 PCR 擴增引物來生成， 并克隆至BPV Ll(aa 133/134)的SstII位點。SstII (ccgcgg)編碼脯氨酸(P)-精氨酸 (R)，添加至所翻譯的融合蛋白的L2兩端。編碼HPV16Ll (來自基因克隆 114KQ7))-HPV16 L2 aa 17-36 (也稱為 16L1-16L2 17-36)的質(zhì)粒通過將密碼子優(yōu)化的合成寡核苷酸(Geneart，德國)亞克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體 pSynwtVI-的 BgIII 到 KpnI 位點來生成(Kirnbauer 等(1993) J Virol 位，69四-36)。 通過雙向測序來證實重組表達載體(VBC-Biotech，維也納，奧地利)。通過用轉(zhuǎn)移載體和線性桿狀病毒DNA(BaculoGold，BD Biosciences)共轉(zhuǎn)染Sf_9 昆蟲細胞來生成重組桿狀病毒。如Kirnbauer等(199 (同上)之前所述進行VLP的表達和純化。簡言之，通過用擴增的桿狀病毒原種感染3天來表達嵌合蛋白。隨后，在PBS/0.8M NaCl/2mM CaC12/ImMPMSF中超聲溶解收獲的細胞。加入0. 5% Brij58后，將蛋白在4°C下孵化過夜。通過在蔗糖/PBS墊層(35%Wt/V0l)和CsCl/PBS 29% (wt/wt)密度梯度下超速離心來純化高分子質(zhì)量結(jié)構(gòu)，每次至少M小時。在還原條件下通過大量透析至IOmM TrisHCl pH 7. 9/10mMDTT/7. 5% 2-巰基乙醇 (2-ME)中，可實現(xiàn)將VLP裂解為五聚體殼粒(由McCarthy等(1998) J Virol 72,32-41 整)。用再透析至不含2-ΜΕ的等量緩沖液的五聚體進行免疫。為了使用變性的抗原進行免疫，用 PBS(0. 5MNaCl/ImM CaC12/0. 02%吐溫 80)透析 VLP，并在 4% SDS 中煮沸。B.蛋白免疫印跡法將Sf-9細胞感染3天，收獲，在裂解緩沖液2-ME)中變性并通過SDS-Page和蛋白免疫印跡法分析。通過識別線性BPV Ll表位DTYRYI (BAbCO) (SEQ ID NO 93)的單克隆抗體(mAb)AUl或所培育的抗HPV16 Ll的Camvir-I (BD Pharmingen)來證實Ll蛋白的表達。為證實L2肽的抗原性，使用針對HPV16 L2 aa 17-36的mAb RG-I (Gambhira等.Q007b)J Virol 81,13927-31)，或所培育的抗 His 標記的 HPV16 L2 aa 1-88 或 His 標記的 HPV16 L2 aa 11-200 的多克隆兔血清(Pastrana 等(2005a) Virology 337,365-72)來檢測樣品。C.透射電子顯微鏡(TEM)將純化的顆粒裝載于輝光放電的碳包被的銅網(wǎng)上，用2. 5%戊二醛固定，用醋酸鈾酰負染，通過JEOL 1010電子顯微鏡在80kV和χ 30，000放大倍率下觀察。D.免疫使用含有0. 5M NaCl/lmM CaC12/0. 02 %吐溫80的PBS大量透析蛋白。使用每種50yg在完全弗氏佐劑(CFA)中的天然或SDS變性顆粒對兩只新西蘭白兔(NZW)進行免疫，接著在四周，六周和八周后使用在不完全弗氏(IFA) (Charles River ;KiSSlegg，德國)中的顆粒進行加強。另外，免疫原在根據(jù)生產(chǎn)商的方案配制的氫氧化鋁凝膠(A8222， Sigma-Aldrich)和單磷酰脂A (S6322，Sigma-Aldrich) 10 1 的混合物中(稱為明礬-MPL) 給予。給予Balb/c小鼠IOyg抗原，并在第一次注射后四周，八周和十周進行加強。末次加強后的14天，收集血清并儲存在-20°C。Ε. ELISA使用His標記的HPV16 L2 aa 1-88或HPV16 L2 aa 11-200多肽包被微量滴定板,通過 ELISA 測定所培育的抗 BPVl L1-HPV16 L2 (也稱為 BL1-16L2) aa 2-22，75-112， 115-154，149-175，172-200血清中的特異性抗體效價。使用轉(zhuǎn)化至 E. coli Rosetta DE3 (Novagen)中的 pET28A 載體(Pastrana 等 (2005a)(見上))生成這些抗原，經(jīng)IPTG誘導并在Ni-NTA柱Oiiagen)上親和純化。收集洗脫的蛋白，通過蛋白免疫印跡法確證，通過BCA蛋白含量測定試劑盒(Pierce)定量并儲存于-20°C。如前所述進行ELISA(Gambhira 等(2007b) J Virol 81,13927-31)。使用 0. 1 μ g/ 孔的在碳酸鹽緩沖液中的L2肽將Maxisorb板(Nunc)包被過夜，并用1 % BSA-PBS封閉。一式三份地在孔中將十倍稀釋的抗血清在BSA/PBS/0.05%吐溫20(Tw-20)中孵化。 用PBS/0. 05 %吐溫20洗滌三次后，加入在BSA/PBS/0. 05 %吐溫20中的過氧化物酶標記的抗體(1 5000)并在室溫下孵化(溫育)1小時。最后，對板進行洗滌并加入底物 ABTS (Boehringer Mannheim)顯影。使用酶標儀(Dynatech)測定 405nm 處的光密度(OD)。F.使用合成生物素標記的HPV16 L2 aa 18-31肽的ELISA使用生物素標記的肽HPV16 L2 aa 18-31 (LYKTCKQAGTCPPD (SEQID NO 94) JPT Peptide Technologies ；柏林，德國)作為抗原，通過ELISA測定所培育的抗BL1-16L2 aa 18-31, BL1-16L2 aa 17-36，16L1-16L2 aal7_36 抗血清(Slupetzky 等 0007) Vaccine 25, 2001-10)。以1 μ g肽/孔加至Nunc鏈霉親和素板過夜(如Nunc鏈霉親和素常用包被方案中具體說明)。用PBS洗滌板，以0.5%脫脂干奶粉/PBS在4°C下封閉過夜，并以連續(xù)稀釋的抗血清室溫下孵化1小時。用PBS洗滌三次后，加入1 10，000稀釋的標記物(conjugate， 結(jié)合物)，洗滌板，用ABTS顯影并在405nm處測定0D。G.偽病毒體中和試驗如Buck等稍作修改后描述，在細胞中產(chǎn)生偽病毒體并在Optipr印梯度系統(tǒng)(Sigma)中純化(見全球網(wǎng)站:ccr. cancer, gov/lco/protocols. asp)。使用了以下用于表達Ll和L2衣殼蛋白或分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的質(zhì)粒
包裝質(zhì)粒:HPV5:p5sheLL ；HPV6 :p6sheLL ；HPV16 :pl6Llh，pl6L2h ；HPV18 peLlfB, peL2bhb ；HPV45 :p45shell，CRPV :pCRPVLl, pCRPVL2 (由 J. khiller，NIH 提供，質(zhì)粒圖譜禾口文獻參見全球網(wǎng)站:home. ccr. cancer. gov/Lco/plasmids. asp)，HPV31 :p31Llh, p31L2h(Konda 等(2007)Virology 358,266-72) ；HPV52 :p52Llh， p52L2h (未公布)HPV58 :p58Llh，p58L2h (Konda 等(2007)(同上))(由 Kanda 提供，東京)HPVll =HPV =IlLl,HPVll L2,HPVll L1/L2，未發(fā)表(由 Μ. Muller 提供，海德爾堡)靶質(zhì)粒ρYSEAP(由 J. Schiller, NIH 提供)包裝衣殼蛋白的表達載體與報告質(zhì)粒pYSEAP共轉(zhuǎn)染，并通過比色法檢測衣殼的產(chǎn)生。根據(jù)調(diào)整的方案進行中和試驗(參見全球網(wǎng)站ccr. cancer, gov/lco/ neutralizationassay.htm)。一式兩份地在孔中使用1 2連續(xù)稀釋的血清以1 100開始在冰上孵化偽病毒體1小時。用偽病毒體感染后，在37°C下將細胞孵化72小時，并在405nm處用比色法測定澄清細胞上清液中SEAP的活性(Alphs等OOOSWroc Natl Acad Sci USA M，5850-5)。中和效價報告為導致每個試驗中SEAP與相同稀釋度的預免疫血清相比活性降低50%的最高稀釋度的倒數(shù)。當在1 100稀釋度時SEAP的減小接近50%， 在1 50對血清進行了再評估。實施例II.結(jié)果以往的研究已報導使用HPV16 L2的肽aa 1-88誘導針對同源性HPV的低效價體液免疫應答和體外異源類型的交叉中和(Pastrana等(2005a)(同上))，以及使用HPV16 L2的肽aa 11-200接種可在體內(nèi)產(chǎn)生針對CRPV和ROPV的激發(fā)的交叉保護(Gambhira等 (2007a) J Virol虹，11585-92)。為提高免疫所產(chǎn)生的抗體效價，將L2肽并入Ll的表面展示位點，可能引起衣殼表面上L2的360倍陣列。之前曾成功地通過BPVl VLP表面的DE環(huán)成功表達長度達9aa的肽，而未損害其組裝至免疫原性 VLP 中的能力(Handisurya 等 Q007)FEBSJ 274,1747-1758 ；Slupetzky 等0007)(同上))。因此，選擇Ll的DE環(huán)進行插入以在組裝的嵌合BPVl VLP表面展示 L2肽(圖1)。使用BPVl衣殼作為載體可避免誘導中和抗HPV Ll抗血清，該中和抗HPV Ll抗血清可掩蓋低效價抗HPV16 L2(交叉)中和抗體的檢測。將九個部分重疊的HPV16 L2 月太 aa 18-31 (A), aa 17-36 (B，相當于 mAb RG-I 的表位)；aa 2-22 (C)，aa 35-75 (D)，aa 75-112 (E), aa 115-154 (F), aa 149-175 (G)，aa 172-200 (H)，aa 13-107(1)的編碼序列插入BPVl Ll的密碼子133和1；34之間。也生成了另外的HPV16 L2 aa 17-36插入至HPV16 Ll的嵌合L1-L2融合蛋白(16L1-16L2 17-36) (J)的表達載體。由于HPV16是最重要的高危型，其引起全世界50%的宮頸癌，我們認為使用HPV16 LlVLP作為HPV 16 L2的載體可誘導組合高效價的抗HPV 16 Ll和廣泛交叉中和抗L2免疫應答。此處，通過序列比對選擇插入至HPV16 Ll的DE環(huán)的密碼子136和137之間。生成重組桿狀病毒并用于感染Sf-9昆蟲細胞。三天后，將細胞裂解并通過 SDS-PAGE進行分析。使用mAb AUl (抗BPV Li)和Camvir-I (抗HPV16 Li)對重組蛋白的蛋白免疫印跡顯示在45-60KD范圍內(nèi)遷移(圖2a，A-J)。正如所預期的，大多數(shù)L1-L2融合蛋白的遷移比野生型Ll蛋白稍慢。通過mAb RG-I (抗HPV16 L2 aa 17_36)或必要時通過所培育的抗HPV16 L2 aa 1-88或HPV16 L2 aa 11-200多克隆兔血清確證所插入HPV16 L2肽的抗原性(圖沘)。一些更快的遷移條帶可能是由蛋白降解所引起的。與亞單元五聚體相比，天然Ll VLP引發(fā)更高效價的中和抗體，并且五聚體的免疫原性顯著高于單體變性Ll蛋白。因此通過TEM測定嵌合L1-L2蛋白的組裝狀態(tài)。在形態(tài)形成模糊的情況下，進一步通過用構(gòu)象依賴的mAb 5B6進行的ELISA來區(qū)分在殼粒中的組裝，其中該mAb 5B6的結(jié)合依賴于組裝至五聚體中的BPVl Ll (Slupetzky等OOOl) J Gen Virol 型，2799-804)。如圖3 所示，TEM 顯示 BL1-16L2 18-31 (A)，17-36 (B)，2-22 (C)，75-112 (E)， 115-154 (F)，149-175 (G)和 172-200 (H)，和 16L1-16L217-36 (J)組裝至全尺寸 VLP 中(直徑約50-60nm)。嵌合蛋白BL1-16L235-75 (D)和BL1-16L2 13-107(1)以有序性稍差的構(gòu)象存在，表明存在Ll五聚體或蛋白聚集。為了進一步區(qū)分這些可能性，進行了使用mAb 5B6 (38)和mAb AUl的ELISA。缺少VLP的蛋白制劑(D和I)均不與5B6反應，表明嵌合蛋白 D和I不能組裝至五聚體中。此外，結(jié)果顯示與天然制劑相比，mAb AUl與變性的BL1-16L2 13-107(1)結(jié)合增強，但BL1-16L235-75(D)卻沒有，表明前者(I)而不是后者蛋白(D)的部分構(gòu)象依賴性形成(未顯示數(shù)據(jù))。因此我們避免使用BL1-16L2 35-75進行免疫。十個嵌合蛋白中總計有八個能夠組裝至VLP中，分別在BPVl Ll的DE表面環(huán)中顯示多達44個16L2的aa(BLl-16L2 115-1 (F)，加上側(cè)面限制性內(nèi)切酶位點SstII編碼的 4 個 aa)，在 HPV16 Ll(J)中顯示 20 個 aa(圖 1,3) L2特異性血清抗體通過免疫NZW兔來測定嵌合L1-L2 VLP的免疫原性和針對展示L2肽的體液免疫應答。為了測定顆粒結(jié)構(gòu)對免疫原性的影響，將每個抗原作為天然顆?；騍DS變性抗原給予。 使用強力的弗氏佐劑(CFA/IFA)進行免疫。使用人類適用的明礬-MPL作為佐劑，進一步給予誘導廣泛交叉中和抗體應答的抗原。此外，為了包括另一個哺乳動物系統(tǒng)，使用抗原-明礬-MPL配方對近交系Balb/c小鼠進行接種。使用BL1-16L2 18-31 (A)，17-36 (B)，2-22 (C)，75-112 (E)，115-154 (F)， 149-175 (G)，172-200 (H)，其每個作為天然或SDS變性制劑，在CFA/IFA中對兩只NZW兔進行免疫。由于組裝不完全，BL1-16L2 13-107(1)蛋白僅作為天然制劑進行接種。分別使用合成肽HPV16 L2 aa 18-31，或細菌表達的HPV16 L2 aa 1-88或aa 11-200蛋白作為抗原，通過ELISA檢測L2特異性免疫應答(表2)。除了 BL1-16L2 2-22(C)， 所有VLP制劑可誘導顯著的抗體應答(效價范圍為2，500-312, 500)，而相應的變性蛋白每一種所引發(fā)的抗體水平通常低五倍(效價為500-12，500)。預免疫血清在所有情況下均無反應性。這些結(jié)果顯示與類似的變性蛋白相比，存在于天然VLP上的表位具有增高的免疫原性。通過BL1-16L2 2-22 (C)免疫而針對L2的可檢測體液應答的完全缺失表明在兔體內(nèi) HPV16 L2的N末端的20個aa不代表B細胞表位。此外，BL1-16L2 13-107(1)不能組裝至 VLP可能是僅誘導適中的抗L2免疫應答的原因(效價為500)(表2)。表2通過HPV 16 L2肽ELISA評價兔抗血清。使用弗氏佐劑(CFA/IFA)作為佐劑，用作為天然VLP或SDS破壞的制劑的標明嵌合BL1-16L2蛋白對兩只NZW兔進行接種。使用HPV16 L2 1-88(對于所培育的抗 BL1-16L2 2-22 血清)，HPV16 L2 aa 18-31 (BL1-16L2 18-31，BL1-16L217-36), HPV16 L2 aa 11-200(BL1-16L2 75-112， BL1-16L2 115-154， BL1-16L2 149-175，BL1-16L2 172-200，BL1-16L2 13-107)作為 ELISA 抗原進行 ELISA。連續(xù)終點稀釋血清并一式三份進行測試。SDS破壞的蛋白BL1-16L2 13-107未用作免疫原(X)。
兔抗血清___抗BL1-16L2抗血清(L2-ELISA)__
CFA/IFA18-31 17-36 2-22 75-112 115-154 149-175 172-200 13-107
__(A)^JB)^ (C) (E)_JF)_JG)_JH)__(I)_
天然蛋白 NZW 62,500 62,500 0 2,500 62,500 62,500 312,500 500 #1_________
NZW #2__62,500 62,500 0 2,500 62,500 62,500 312,500 500
變性蛋白 NZW 12,500 2,500 0 500 2,500 12,500 12,500 X #3_________
NZW #4_ 12,500 I 100 0 500 2,500 2,500 12,500 X體夕卜中禾口偽病毒體中和試驗利用基于乳頭狀瘤病毒的基因轉(zhuǎn)移載體(偽病毒體)模擬體外乳頭狀瘤病毒感染及其抑制(Buck等(20(^)Methods MolMed 119，445-62)。用殼體包裹了報告質(zhì)粒PYSEAP的L1/L2衣殼感染細胞培養(yǎng)物，引起分泌性堿性磷酸酶(SEAP)的表達，可在上清液中測定，而用中和抗體預孵化偽病毒體可預防感染并降低SEAP的量。已顯示中和抗體與在體內(nèi)保護動物免受病毒激發(fā)有關(Alphs等Q008)(同上)；Gambhira等.Q007b) (同上))。使用L2同源型HPV16和L2離散高危型HPV18進行中和試驗(表3a)。不進一步對無法中和任一類型感染的血清進行評價。在1 100-1 100，000的10倍連續(xù)稀釋度下測定所有血清，對顯示較低抗體水平的血清在1 50的血清稀釋度下進行重新評價，而認為<50的效價無意義。表 3a使用弗氏佐劑(CFA/IFA)作為佐劑，所培育的抗指定的天然或變性(denat.) BL1-16L2蛋白的兔血清的偽病毒體中和試驗。分別顯示了兩只動物的效價。對于不中和 HPV16和HPV18的血清，未對剩余的偽病毒體類型進行測試(X)。使用稀釋度為1 100至 1 100，000的血清進行試驗。當對較低效價的中和抗體存在疑問時，在1 50的稀釋度下重新評價。
3權(quán)利要求
1.一種由包括乳頭狀瘤病毒(PV)Ll蛋白的嵌合多肽組裝而成的病毒樣顆粒(VLP)組合物，其中所述乳頭狀瘤病毒(PV)Ll蛋白中插入了由來自乳頭狀瘤病毒L2蛋白的以下序列組成的表面展示肽a)(D/Q/H/E) (L/I)Y(K/P/R/Q/S) (T/S/A/G)CK (Q/I/V/L/A) (A/S/T) (G/N) (T/N) CPPD (I/V) (I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I/L)(SEQ ID NO :1)，或b)abYcdCKefghCPPDijklm(SEQID NO :2)，其中 a = (D/Q/H/E) ；b = (L/I) ；c = (K/P/ R/Q/S) ；d = (T/S/A/G) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N) ；i = (I/ V) ； j = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I/L)，或c)與SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 至少 80，85，90 或 95% 同一的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所插入的L2肽為列于圖6或表1中的肽之一。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所插入的L2肽來自HPV16L2蛋白，并具有氨基酸序列 QLYKTCKQAGTCPPDIIH(V(SEQ IDNO 9)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所插入的L2肽至少80，85，90或95%與SEQID NO 9 同一。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所插入的L2肽來自HPV18L2蛋白，并具有氨基酸序列 DLYKTCKQSGTCPPDWH(V (SEQ IDNO :10)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所插入的L2肽來自BPV1/2L2蛋白，并具有氨基酸序列 DLYRTCKQAGTCPPDVIH(V (SEQ IDNO :22)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中L2肽插入至Ll蛋白的DE環(huán)或螺旋b4環(huán)中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述Ll蛋白來自HPV16，并且所述L2肽插入至所述Ll蛋白的DE環(huán)中的氨基酸136和 137 之間(SEQ ID NO 85)；或所述Ll蛋白來自BPVl，并且所述L2肽插入至Ll蛋白的DE環(huán)中的氨基酸133和134 之間(SEQ ID NO 83)。
9.一種由包括HPV16L1蛋白的嵌合多肽組裝而成的病毒樣顆粒(VLP)組合物，其中所述HPV16 Ll蛋白的DE環(huán)中插入由以下序列組成的肽a)(D/Q/H)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)CPPD(I/V) (I/V/Q) (P/N/D) (K/R) (V/I)EG(SEQ ID NO :54)，或b)abYcdCKefghCPPDi jklmEG(SEQ ID NO :55)，其中 a = (D/Q/H) ；b = (L/I) ；C = (K/ P/R/Q/S) ；d = (T/S/A) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N) ；i = (I/ V) ;J = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；I = (K/R) ；m = (V/I)，或c)SEQ ID NO力4或SEQ ID NO :55的變體，其N末端缺少一個氨基酸和/或C末端缺少一個或兩個氨基酸，或d)與SEQ ID N0:54 或 SEQ ID NO :55 至少 80，85，90 或 95% 同一的序列，或e)與針對肽HPV16 L2 (17-36) (SEQ ID NO 9)的抗血清、或與針對肽HPV16L2 (17-36) (SEQ ID NO 9)的單克隆抗體反應的肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的VLP，其中所插入的肽為HPV16L2 (17-36)肽，具有序列 QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV(SEQ ID NO :9)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的VLP，其中所插入的肽為HPV16L2 (17-38)肽，具有序列QLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(SEQ ID NO :56)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的VLP，其中所插入的肽為HPV16L2 (18-38)肽，具有序列 LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(SEQ ID NO :57)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的VLP，其中所述Ll蛋白來自HPV16，并且所述L2肽插入在所述Ll蛋白的DE環(huán)中的氨基酸136和 137 之間(SEQ ID NO 85)；或所述Ll蛋白來自BPVl，并且所述L2肽插入在所述Ll蛋白的DE環(huán)中的氨基酸133和 134 之間(SEQ ID NO 83)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的VLP組合物，其中所述Ll和L2蛋白來自人類乳頭狀瘤病毒(HPV)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的VLP組合物，其中所述Ll蛋白來自BPV。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的VLP組合物，其中所述Ll蛋白和/或所述L2蛋白來自 PV而不是HPV。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的VLP組合物，其中所述Ll蛋白為變體，以致所述Ll蛋白能夠耐受合適L2肽的插入而不失去其抗原性，并且能夠組裝到VLP中，或至少組裝到殼粒中。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的VLP組合物，其為免疫原性組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的VLP組合物，其對粘膜高?；虻臀Ｐ?、皮膚低危型和/或皮膚β型乳頭瘤狀病毒具有免疫原性。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的VLP組合物，其對三種或更多種以下乳頭狀瘤病毒具有免疫原性粘膜高危型HPV 16，18，31，33，45，52，58，68或76 ；粘膜低危型HPV 6，11 ；HPV型 13，32 ；皮膚低危型 HPV 1，2，3，4，7，10，27，57 ；和 / 或 β 型 HPV 5，8，9，12，14，15，38。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的VLP組合物，進一步包括佐劑。
22.—種疫苗，包括根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的VLP組合物和佐劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其對人類乳頭狀瘤病毒有效。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其對粘膜高危型、低危型、皮膚型和/或β型乳頭狀瘤病毒有效。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述組合物被配制成通過吸入、口服，在病毒或細菌載體中，或作為性交潤滑劑的組分的方式給予。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述組合物在用于肌肉內(nèi)(i.m.)注射的配方中。
27.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述組合物為凍干或粉末形式。
28.一種嵌合多肽，包括插入了由來自乳頭狀瘤病毒L2蛋白的以下序列之一組成的表面展示肽的乳頭瘤狀病毒(PV)Ll蛋白a)(D/Q/H)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)CPPD(I/V) (I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/1) (SEQ ID NO :1)，或b)abYcdCKefghCPPDijklm(SEQID NO :2)，其中 a = (D/Q/H) ；b = (L/I) ；c = (K/P/R/ Q/S) ；d = (T/S/A) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N) ；i = (I/V) ;j =(I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I)，或c)與SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 至少 80，85，90 或 95% 同一的序列；或者一種嵌合多肽，包括在DE環(huán)中插入了由以下組成的肽的乳頭瘤狀病毒Ll蛋白d)(D/Q/H)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)CPPD(I/V) (I/V/Q) (P/N/D) (K/R) (V/I)EG(SEQ ID NO :54)，或e)abYcdCKefghCPPDi jklmEG(SEQ ID NO :55)，其中 a = (D/Q/H) ；b = (L/I) ；c = (K/ P/R/Q/S) ；d = (T/S/A) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N) ；i = (I/ V) ； j = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I)，或f)與SEQ ID NO :54 或 SEQ ID NO :55 至少 80，85，90 或 95% 同一的序列。
29.—種編碼根據(jù)權(quán)利要求28所述的嵌合多肽的核酸。
30.一種包括根據(jù)權(quán)利要求四所述的核酸的表達載體，其操作性地連接于表達控制序列。
31.一種宿主細胞，包括根據(jù)權(quán)利要求觀所述的嵌合多肽、根據(jù)權(quán)利要求四所述的核酸、或根據(jù)權(quán)利要求30所述的表達載體。
32.—種制備VLP或殼粒組合物的方法，包括在合適條件下溫育根據(jù)權(quán)利要求觀所述的嵌合多肽以自組裝。
33.一種用于免疫或接種對象以對抗PV的方法，包括給予所述對象有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的VLP組合物。
34.一種用于誘導對象體內(nèi)針對HPV的免疫應答的方法，包括給予對象有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的VLP組合物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述免疫應答為抗原特異性或固有性的體液免疫應答、細胞免疫應答。
36.一種用于治療已感染PV或具有暴露于PV的風險的對象的PV感染的方法，包括給予所述對象有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的VLP組合物。
37.一種用于預防對象的宮頸癌、生殖器癌、口咽癌或初癌的方法，包括給予所述對象有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的VLP組合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，所述方法為預防宮頸癌的方法。
39.一種通過接種根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的VLP組合物而產(chǎn)生的預防性或治療性抗體或免疫血清。
40.一種用于分別治療或預防健康或患病對象的PV感染的方法，包括給予所述對象根據(jù)權(quán)利要求39所述的預防性或治療性抗體或免疫血清。
41.一種試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的VLP組合物。
42.一種試劑盒，包括與根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的VLP組合物結(jié)合的抗體。
43.一種殼粒組合物，由包括乳頭狀瘤病毒(PV)Ll蛋白的嵌合多肽組裝而成，其中所述乳頭狀瘤病毒(PV) Ll蛋白中插入了由來自乳頭狀瘤病毒L2蛋白的以下序列之一組成的表面展示月太a)(D/Q/H)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)CPPD(I/V) (I/V/Q)(P/N/D)(K/R)(V/I) (SEQ ID NO :1)，或b)abYcdCKefghCPPDi jklm(SEQ ID NO :2)，其中 a = (D/Q/H) ；b = (L/I) ；c = (K/P/R/Q/S) ；d = (T/S/A) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (Τ/Ν) ；i = (I/V) ;j =(I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I)，或c)與SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 至少 80，85，90 或 95% 同一的序列； 或者由包括在DE環(huán)中插入了由以下組成的肽的PV Ll蛋白的嵌合多肽組裝而成d)(D/Q/H)(L/I)Y(K/P/R/Q/S)(T/S/A)CK(Q/I/V/L/A)(A/S/T)(G/N)(T/N)CPPD(I/V) (I/V/Q) (P/N/D) (K/R) (V/I)EG(SEQ ID NO :54)，或e)abYcdCKefghCPPDi jklmEG(SEQ ID NO :55)，其中 a = (D/Q/H) ；b = (L/I) ；c = (K/ P/R/Q/S) ；d = (T/S/A) ；e = (Q/I/V/L/A) ；f = (A/S/T) ；g = (G/N) ；h = (T/N) ；i = (I/ V) ； j = (I/V/Q) ；k = (P/N/D) ；1 = (K/R) ；m = (V/I)，或f)與SEQ ID NO :54 或 SEQ ID NO :55 至少 80，85，90 或 95% 同一的序列。
44. 一種用于誘導對象體內(nèi)針對皮膚型HPV的免疫反應的方法，包括給予所述對象有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的VLP組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及例如由包括乳頭狀瘤病毒(例如人類乳頭狀瘤病毒，或HPV)L1主要衣殼蛋白的嵌合多肽組裝而成的病毒樣顆粒(VLP)組合物，所述乳頭狀瘤病毒L1主要衣殼蛋白中插入了包括乳頭狀瘤病毒L2蛋白的中和表位的表面展示肽。描述了包括VLP的疫苗組合物，以及使用VLP誘導對象體內(nèi)針對乳頭瘤狀病毒的免疫應答的方法(例如接種)，和用于實施本發(fā)明方法的包括VLP的試劑盒。
文檔編號A61K39/12GK102458440SQ201080025772
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者克里斯蒂娜·舍倫巴赫, 理查德·B·S·羅登, 賴因哈德·基爾恩鮑爾 申請人:約翰·霍普金斯大學