專利名稱：遞送遺傳物質(zhì)的組合物的制作方法
遞送遺傳物質(zhì)的組合物發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及遞送核酸或遺傳物質(zhì)的組合物。具體地，本發(fā)明涉及裝載有遺傳物質(zhì)的外來體及其生產(chǎn)方法。
發(fā)明背景
核酸在基因治療中常規(guī)地用于替換非功能基因[1]以及經(jīng)由RNA干擾(RNAi)效應(yīng)分子諸如miRNAs[2]、shRNAs[3]和siRNAs[4]中和致病突變。因為裸DNA和RNA由于迅速的清除[5]，核酸酶W]，缺乏器官特異性分布以及低效率的細胞攝取而難以在體內(nèi)遞送，專門的基因遞送運載體通常被用于遞送。
病毒載體和陽離子脂質(zhì)體處于遞送運載體技術(shù)的最前沿，并且已經(jīng)相對成功，其中這些遞送運載體中的許多已經(jīng)處于臨床試驗[7]。盡管有這些成功，但是仍然存在限制許多應(yīng)用的重大局限，其中最重要的是對大部分病毒載體的免疫識別[8，9，10]和對病毒諸如慢病毒(Ientiviruses)的誘變整合[11]；以及對脂質(zhì)體的炎癥毒性和迅速清除[12，13， 14，15]。通過先天免疫系統(tǒng)的識別導(dǎo)致急性炎癥應(yīng)答，其可能需要使用免疫抑制策略以克服潛在地將患者暴露于不需要的(unwarranted)機會感染風(fēng)險的現(xiàn)有策略[16，17，18]的攝取和再給藥問題。針對遞送運載體產(chǎn)生的抗體也顯著地降低了隨后給藥時的轉(zhuǎn)基因表達 [19]。
現(xiàn)有策略的固有風(fēng)險和局限性一般將它們限定于危及生命的疾病，其治療益處明顯重于風(fēng)險，諸如重度聯(lián)合免疫缺陷癥[20]；限定于特殊環(huán)境中的疾病，諸如免疫豁免部位如眼睛[1]；或基因疫苗[21]。然而，對于慢性且使人虛弱但不危及生命的遺傳性疾病， 諸如肌強直性營養(yǎng)不良，更低風(fēng)險概況和維持矯正基因治療數(shù)十年而不是幾年的能力對于治療干預(yù)是必需的。這類疾病潛在地不能接受的風(fēng)險的實例是上面所討論的免疫抑制策略，該免疫抑制策略中突出的是健康患者在最近的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的AAV基因治療試驗中的死亡，這是由于對象攝取了試驗管理者未知的免疫抑制劑[22]所引起的機會感染。隨著顯示具有遺傳成分的疾病——包括肥胖、心臟病和精神病——數(shù)目的增加，非常有可能改變易感性基因用于優(yōu)先遺傳解決辦法(preemptive genetic solution)，但僅在風(fēng)險被進一步降低并且獲得長期可持續(xù)性的情況下。因此，為了將基因治療的應(yīng)用擴大到致命疾病之外，有必要開發(fā)能夠避免免疫識別和炎癥同時保留良好遞送功效的技術(shù)。
一種解決辦法在于使用基因遞送的外來體。外來體是內(nèi)吞(胞吞)起源的小的膜結(jié)合小泡(30-100nm)，其在多泡體與質(zhì)膜融合后被釋放到胞外環(huán)境中。已經(jīng)描述了許多免疫細胞，包括B細胞、T細胞和樹突細胞(DCs)的外來體生產(chǎn)。源自B淋巴細胞和成熟DCs 的外來體表達MHC-II、MHC-I、⑶86和ICAM-I [23，24]，并且已經(jīng)被用于在實驗?zāi)Ｐ秃团R床試驗中誘導(dǎo)特異性抗腫瘤T細胞毒反應(yīng)和抗腫瘤免疫性[24，25]。外來體介導(dǎo)的基因遞送的潛能已經(jīng)顯示有將鼠mRNAs和miRNAs遞送至人肥大細胞[26]，并且已經(jīng)證實神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生的外來體[27]將外源DNA質(zhì)粒產(chǎn)生的mRNAs轉(zhuǎn)移至異種細胞，但是外源DNA、siRNAs 和其它修飾寡核苷酸的裝載和遞送至今還沒有證實。
發(fā)明概述
本發(fā)明人已經(jīng)成功地將外來體裝載有外源遺傳物質(zhì)，尤其是外源質(zhì)粒DNA、SiRNA 和修飾寡核苷酸。因此，本發(fā)明涉及將外來體裝載有外源遺傳物質(zhì)的方法，裝載有這樣的外源遺傳物質(zhì)的外來體，以及其在基因治療和基因沉默的核酸遞送中的應(yīng)用。
本發(fā)明人還已經(jīng)成功地將靶向部分引入外來體，以使外來體可靶向所選組織。因此本發(fā)明涉及在其表面表達有靶向部分的外來體，和包含外來體跨膜蛋白質(zhì)和靶向部分的融合蛋白，以及編碼這種融合蛋白的核酸構(gòu)建物。外來體可被裝載有外源遺傳物質(zhì)，并且被用于遞送基因治療和基因沉默的核酸。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供包含外來體的組合物，其中外來體被裝載有外源遺傳物質(zhì)。
在另一方面，本發(fā)明提供包括含有遺傳物質(zhì)的外來體的組合物，其中外來體源自未成熟的樹突細胞，其用于體內(nèi)遞送遺傳物質(zhì)的方法。
在另一實施方式中，本發(fā)明提供將外來體裝載上遺傳物質(zhì)的方法，其包括提供外來體的組合物，以及通過電穿孔將外來體裝載有遺傳物質(zhì)。
在另一實施方式中，本發(fā)明提供將外來體裝載上遺傳物質(zhì)的方法，其包括提供外來體的組合物；以及利用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑，通過轉(zhuǎn)染將外來體裝載上核酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含外來體的組合物，其中所述外來體包括在所述外來體表面上表達的靶向部分。
在另一方面，本發(fā)明提供包括外來體跨膜蛋白質(zhì)和異種靶向肽的多肽，其中所述靶向肽結(jié)合到待靶向細胞表面上存在的部分，并且其中當(dāng)所述多肽存在于外來體中時，所述靶向肽存在于外來體的表面上。
在另一實施方式中，本發(fā)明提供編碼多肽的多核苷酸，其中所述構(gòu)建物包括編碼 5’外來體跨膜信號序列——例如與編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸可操作地連接的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號肽——的多核苷酸。
在另一實施方式中，本發(fā)明提供將外來體靶向所選組織或細胞類型的方法，其包括用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細胞，在所述宿主細胞中表達構(gòu)建物，以及從構(gòu)建物已經(jīng)在其中表達的宿主細胞中獲得外來體。


圖1.來自未成熟樹突細胞的外來體的表征(a)用2%醋酸雙氧鈾染色的外來體 (負染色的外來體)的電子顯微圖；(b)用抗-Lamp2——外來體中存在的膜蛋白——探測的外來體的蛋白質(zhì)印跡；(c)從5種不同的純化中純化的樹突細胞外來體在PBS中的動態(tài)光散射大小測量
圖2.樹突細胞的轉(zhuǎn)染(a)修飾Lamp-2b用以轉(zhuǎn)染到樹突細胞中。(SP =信號肽； TP =靶向肽；TM =跨膜；CT =胞質(zhì)尾區(qū))；(b)使用抗-FLAG或抗-Lamp2在未轉(zhuǎn)染的樹突細胞(CTRL)或轉(zhuǎn)染有pLamp2b-FLAG(FLAG-Lamp2b)的細胞以及從這些細胞中收獲的外來體中的蛋白質(zhì)印跡；(c)利用對MSP和RVG序列特異的引物，用pLamp2b-MSP、-RVG或沒有東西轉(zhuǎn)染的樹突細胞的qRT_PCR;(d)在外來體拉下試驗(pull down assay)中，在正常外來體和FLAG外來體與抗-FLAG珠或抗-AGOl珠(非結(jié)合對照)溫育后使用抗-Lampl的蛋白質(zhì)印跡；(e)純化的MSP-外來體的動態(tài)光散射尺寸測量。
圖3.質(zhì)粒和外來體的電穿孔，隨后進行DNase保護試驗(a)在外來體和 pEGFP-NAD質(zhì)粒的不同處理后DNase保護試驗。線性DNA通過用EcoRI切割pEGFP-NAD制備。 (Pre =在加入質(zhì)粒前預(yù)電穿孔的外來體)(b)通過DNase對在不同電穿孔設(shè)定(setting) 下的環(huán)狀質(zhì)粒的DNase降解進行比較(c)pEGFP-NAD用不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染后的DNase保護試驗(d)外來體用轉(zhuǎn)染試劑1-3和pEGFP-NAD轉(zhuǎn)染后的DNase保護試驗(參見材料和方法)。
圖4.外來體介導(dǎo)的pEGFP-NAD向細胞的遞送(a) DNase處理后，相比單獨的質(zhì)粒，Neuro2A細胞用野生型外來體和用pEGFP-NAD轉(zhuǎn)染的表達RVG_Lamp2b的外來體 (RVG-外來體)的轉(zhuǎn)染。(b和c)相比單獨的轉(zhuǎn)染試劑，eGFP在用正常外來體、RVG-外來體或MSP-外來體轉(zhuǎn)染后折疊變化的qRT-PCR定量。
圖5.借助外來體介導(dǎo)的siRNA遞送，GAPDH的擊倒(knowdown) (a, b)施加到具有正常或修飾的外來體的Neuro2A(a)和C2C12(b)細胞上的Cy5_標(biāo)記的GAPDH siRNA的代表性圖像。未電穿孔的外來體和siRNA作為對照加入。(c，d)在用單獨的SiRNA(SiRNA)， siRNA 與 Iipofectamine 2000 (Invitrogen) (siRNA+LP)，正常外來體(Exosomes)，MSP 夕卜來體(MSP exos)和RVG外來體(RVG exos)轉(zhuǎn)染后2天收獲的Neuro2A細胞和C2C12細胞中 GAPDH水平的qPCR。Γρ < 0. 05) (e, f)類似轉(zhuǎn)染后GAPDH水平的代表性蛋白質(zhì)印跡。
圖6.借助外來體介導(dǎo)的siRNA遞送，親環(huán)蛋白B的擊倒(a，b)在用單獨的 siRNA(siRNA)， siRNA 與 Iipofectamine 2000(Invitrogen)(siRNA+LP),正常外來體 (Exosomes)，MSP 外來體(MSP exos)和 RVG 外來體(RVG exos)轉(zhuǎn)染后 2 天收獲的 Neuro2A 細胞和C2C12細胞中親環(huán)蛋白B水平的qPCR。Γρ < 0. 05) (c,d)類似轉(zhuǎn)染后親環(huán)蛋白B水平的代表性蛋白質(zhì)印跡。
圖7.用外來體電穿孔后Cy3和Cy5標(biāo)記的siRNA的保留a，熒光與siRNA質(zhì)量線性相關(guān)。b和c，在b，3yg siRNA與例如3 μ g的RVG-外來體在χ軸所示設(shè)定下在200 μ 1 緩沖液中電穿孔；c，3 μ gsiRNA與例如3 μ g的RVG-外來體在400V 125 μ F下在χ軸所示體積的緩沖液中電穿孔之后保留的標(biāo)記siRNA的絕對質(zhì)量。所有試驗都進行兩次。
圖8.用正常外來體的2’ -OMe寡核苷酸和嗎啉代核苷酸(morpholinos)的遞送 在Cy3-標(biāo)記的(a) 2’-0Me寡核苷酸或(b)用或沒用外來體的PMO轉(zhuǎn)染后M小時C2C12細胞的熒光成像。
圖9.用靶向外來體的siRNA體內(nèi)遞送導(dǎo)致CNS-特異的基因擊倒a，b，c, d，在靜脈注射150 μ g裸GAPDH siRNA或包封在未修飾的外來體、MSP-外來體或RVG-外來體中的siRNA之后3天小鼠的紋狀體、中腦、皮層、四頭肌、脾、肝、腎和心中的GAPDH qPCR，其相對于未處理的對照標(biāo)準(zhǔn)化(100% )。e，從未處理小鼠或者在第1天和第8天靜脈注射空RVG-外來體兩次然后在第25天將該小鼠處死(3次注射)之前的在第22天靜脈注射 RVG-外來體包囊的GAPDH siRNA(150 μ g)小鼠的紋狀體、皮層和中腦中提取的RNA的GAPDH qPCR。f,g,在處死前第6天和第3天在2個單獨的時機用RVG-外來體包囊的siRNA (150 μ g) 注射的小鼠的GAPDH qPCR和代表性蛋白質(zhì)印跡。小鼠在處死前3天靜脈注射150 μ g包囊在150 μ g RVG-外來體中兩種BACE-IsiRNAs的每一種，并且皮層部分用i，BACE-lqPCR，h， BACE-I蛋白質(zhì)印跡和j，β -淀粉樣蛋白1-42ELISA進行分析。所有qPCR被標(biāo)準(zhǔn)化成18S RNA水平。*表示相對于未處理的對照ρ <0.05。3只小鼠在各樣品組中都被注射并且所有的誤差條反映了標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及外來體，及它們作為基因遞送載體的應(yīng)用。外來體是內(nèi)吞起源的小的膜結(jié)合小泡，其在多泡體與質(zhì)膜融合后被釋放到胞外環(huán)境中。因此，本申請涉及包括這樣的外來體的組合物。一般地，外來體直徑在30和IOOnm之間并且可包括高達200nm類似起源的膜顆粒。如本文所用，外來體指從多泡體中分泌的內(nèi)體起源的納米顆粒。
外來體由許多不同種類的細胞——包括免疫細胞諸如B淋巴細胞、T淋巴細胞、樹突細胞(DCs)和大部分細胞產(chǎn)生。外來體也由例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、血小板、網(wǎng)狀細胞、神經(jīng)元、腸上皮細胞和腫瘤細胞產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明使用的外來體可衍生自任何合適的細胞，包括上面所確定的細胞。也已經(jīng)從生理流體諸如血漿、尿、羊膜液和惡性滲出液分離出外來體。
在本發(fā)明優(yōu)選的方面，外來體衍生自DCs，優(yōu)選地未成熟DCs。產(chǎn)生自未成熟DCs 的外來體不表達MHC-II、MHC-I或⑶86。由此，這樣的外來體不刺激幼稚T細胞至有效程度，并且不能在混合淋巴細胞反應(yīng)中誘導(dǎo)應(yīng)答。因此，產(chǎn)生自未成熟樹突細胞的外來體對于在遺傳物質(zhì)遞送中應(yīng)用——尤其體內(nèi)應(yīng)用，例如基因治療來說是理想的候選者。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供衍生自樹突細胞的外來體以用于遺傳物質(zhì)的體內(nèi)遞送。
在本發(fā)明的可選方面，外來體可獲自任何自體患者衍生的干細胞、異種單元型匹配的干細胞或異種干細胞，從而減少或避免外來體被遞送到其中的患者中的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。任何產(chǎn)生外來體的細胞可用于該特定目的。
如上所概述，外來體由許多不同種類的細胞產(chǎn)生并且也已經(jīng)從生理流體分離。因此，根據(jù)本發(fā)明，外來體可獲自如上討論的任何合適的細胞類型，或者通過從生理流體分離獲得。一般地，本發(fā)明的方法包括從細胞培養(yǎng)基或組織上清液分離外來體。
產(chǎn)生自細胞的外來體可通過任何合適的方法從培養(yǎng)基中收集。一般地，外來體可通過離心、過濾或這些方法的組合從細胞培養(yǎng)物或組織中制備。例如，外來體可通過差速離心制備其是低速(< 20000g)離心以沉淀(pellet)較大顆粒，接著高速(> IOOOOOg)離心以沉淀(pellet)外來體，用適當(dāng)?shù)臑V器(例如，0. 22μπι過濾器)大小過濾(粒度過濾， size filtration)；梯度超速離心(例如，使用蔗糖梯度)或這些方法的組合。
根據(jù)本發(fā)明，外來體被裝載有外源遺傳物質(zhì)。具體地，根據(jù)本發(fā)明，外來體被制備， 然后裝載有要遞送的期望遺傳物質(zhì)。
要遞送的合適遺傳物質(zhì)包括外源DNA質(zhì)粒和siRNA。合適的遺傳物質(zhì)也包括修飾的寡核苷酸和其他RNA干擾效應(yīng)部分諸如miRNA和shRNA。根據(jù)本發(fā)明的一方面，裝載到外來體中的遺傳物質(zhì)不是與外來體典型相關(guān)的遺傳物質(zhì)，例如，核酸優(yōu)選地不是在其從細胞中產(chǎn)生后并入外來體的mRNA或miRNA。具體地，本發(fā)明涉及將遺傳物質(zhì)裝載到已經(jīng)與細胞分離的外來體制備物中的能力。因此，外源遺傳物質(zhì)指包括與不與外來體常規(guī)相連的核酸在內(nèi)的遺傳物質(zhì)。在特別優(yōu)選的實施方式中，核酸物質(zhì)是質(zhì)粒DNA或其它核酸，諸如siRNA 和修飾的寡核苷酸，其在外來體中一般找不到。
摻入外來體中的核酸可以是單鏈的或雙鏈的。單鏈核酸包括具有磷酸二酯、 2’ 0-甲基、2’甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和/或硫代磷酸酯主鏈化學(xué)的那些。一般地，雙鏈核酸——包括例如質(zhì)粒DNA和小的干涉RNAs (siRNAs)被引入。
要被裝載到外來體中的遺傳物質(zhì)根據(jù)意圖要遞送到其中的細胞上的遺傳物質(zhì)的期望效果以及要實現(xiàn)該效果的機理進行選擇。例如，核酸在基因治療中可能是有用的，例如為了在細胞或細胞組中表達期望基因。這樣的核酸一般為質(zhì)粒DNA或病毒載體的形式， 其編碼期望的基因并且可操作地連接到合適的調(diào)節(jié)序列諸如啟動子、增強子等，從而一旦其被遞送至待處理細胞，質(zhì)粒DNA就被表達。容許基因治療的疾病的實例包括血友病 B (Factor IX)、囊性纖維化(CTFR)和脊髓性肌萎縮(SMN-1)。
核酸也可被用于例如賦予免疫性(immunisation)以表達一種或多種針對其期望產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原。因此，要裝載到外來體中的核酸可編碼一種或多種針對其期望產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原，包括但不限于腫瘤抗原、來自病原體諸如病毒、細菌或真菌病原體的抗原。
核酸也可用于基因沉默。這種基因沉默可用于治療以阻斷異?；虮磉_，或者用于動物模型研究以產(chǎn)生單個或更多個基因敲除。一般地，這樣的核酸以siRNAs形式提供。 例如，包括siRNAs的RNAi分子可用于在肌肉細胞中擊倒具有多個CUG重復(fù)的DMPK，用于治療肌強直性營養(yǎng)不良。在其他實例中，表達減少引起亨廷頓病(Huntington's disease) 的突變體亨廷頓基因(htt)的shRNA質(zhì)?？捎蒙窠?jīng)元特異性外來體進行遞送。其它靶基因包括用于治療阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)的BACE-1。一些癌基因也可用siRNA 或shRNAs靶向，諸如ras、c-myc和VEGFR-2。腦靶向siRNA裝載的外來體可能在阿爾茨海默病的BACE-I沉默中，在帕金森病(Parkinson’ s disease)的α-突觸核蛋白沉默中，在亨廷頓病的htt沉默中，以及在用于治療中風(fēng)以減少缺血性損傷的神經(jīng)元胱天蛋白酶-3沉默中特別有用。
可以使用包括2’ -O-Me化合物和PNA的反義修飾的寡核苷酸。例如，這樣的寡核苷酸可以被設(shè)計為誘導(dǎo)外顯子跳躍，例如突變體肌養(yǎng)蛋白基因可以被遞送到肌肉細胞，用于治療杜興肌營養(yǎng)不良(Ducherme Muscular Dystrophy)；抑制發(fā)夾環(huán)的反義寡核苷酸例如用于治療肌強直性營養(yǎng)不良；以及反式剪接寡核苷酸例如用于治療脊髓性肌萎縮。
外源遺傳物質(zhì)可通過許多不同的技術(shù)導(dǎo)入外來體。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，外來體通過電穿孔或使用轉(zhuǎn)染試劑進行裝載。本發(fā)明人已經(jīng)確定，盡管外來體尺寸小， 但是仍可能使用電穿孔將外來體裝載有外源遺傳物質(zhì)。鑒于外來體相比細胞小的尺寸，這是令人驚訝的。外推細胞電穿孔所用的電壓以將外來體的尺寸考慮在內(nèi)表明，過高的電壓對于外來體的電穿孔來說將是必須的。然而，令人驚訝地，本發(fā)明人已經(jīng)確定，采用電穿孔以將外來體裝載有質(zhì)粒DNA和siRNA是可能的。一般的電壓在20V/cm到lOOOV/cm的范圍內(nèi)，諸如20V/cm到100V/cm,其中電容一般在25 μ F禾口 250 μ F之間，諸如在25 μ F禾口 125 μ F 之間。
在本發(fā)明的可選方面，本發(fā)明人也已經(jīng)確定利用轉(zhuǎn)染試劑裝載外來體是可能的。 盡管外來體尺寸小，但是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑可用于轉(zhuǎn)染具有遺傳物質(zhì)的外來體。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選轉(zhuǎn)染試劑包括陽離子脂質(zhì)體。
靴向
本發(fā)明還涉及外來體靶向期望的細胞類型或組織。該靶向通過在外來體表面表達與在待靶向細胞表面上表達的細胞表面部分相結(jié)合的靶向部分來實現(xiàn)。一般地，靶向部分是肽，其被表達為具有一般在外來體表面上表達的跨膜蛋白的融合蛋白。
更具體地，外來體可通過在其表面表達靶向部分諸如肽而靶向特定細胞類型或組織。合適的肽是與細胞表面部分結(jié)合的那些，諸如在待靶向的細胞的細胞表面上見到的受體或其配體。合適的靶向部分的實例是短肽、scFv和完整的蛋白質(zhì)，只要靶向部分可被表達在外來體的表面上并且不干擾膜蛋白插入外來體。一般地，靶向肽與跨膜外來體蛋白是異源的。肽靶向部分一般地長度可小于100個氨基酸，例如長度小于50個氨基酸，長度小于30個氨基酸，至10、5或3個氨基酸的最小長度。
靶向部分可以被選擇以靶向特定的組織類型例如諸如肌肉、腦、肝、胰和肺，或靶向患病的組織諸如腫瘤。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，外來體靶向腦組織。
靶向部分的具體實例包括肌肉特異性肽，其通過噬菌體展示發(fā)現(xiàn)，[33]靶向骨骼??；狂犬病病毒糖蛋白的四個氨基酸片段，其與乙酰膽堿受體結(jié)合[36]；或者靶向其受體以靶向神經(jīng)元的神經(jīng)生長因子片段[37]；以及胰泌素肽，其與胰泌素受體結(jié)合，可用于靶向膽和胰上皮細胞[38]。作為可選方案，免疫球蛋白和其衍生物，包括scFv抗體片段，也可被表達為融合蛋白以靶向特異性抗原諸如VEGFR，用于癌基因治療。作為可選方案，受體的天然配體可被表達為融合蛋白以賦予特異性諸如結(jié)合NGFR的NGF，以及賦予神經(jīng)元特異性靶向。
肽靶向部分通過使其表達為具有外來體跨膜蛋白的融合蛋白而表達在外來體表面上。已知許多蛋白質(zhì)與外來體結(jié)合；也就是說，它們在其形成時被并入外來體。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選蛋白質(zhì)是作為跨膜蛋白的那些。實例包括但不限于Lamp-l、Lamp-2、⑶13、 CD86、閥蛋白、突觸融合蛋白-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、ICAM-1、整聯(lián)蛋白 α 4、LiCAM、LFA-l、Mac-l α 禾口 β、Vti—IA 禾口 B、CD3 ε 禾口 ζ、CD9、CD18、CD37、CD53、 CD63、CD81、CD82、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I 或 MHC-II 成分、TCRi3和四旋蛋白(四跨膜蛋白，tetraspanin)。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，跨膜蛋白選自Lamp-1、Lamp-2、⑶13、⑶86、閥蛋白、突觸融合蛋白-3。在特別優(yōu)選的實施方式中，跨膜蛋白是Lamp-2。Lamp-2的序列被列于SEQ ID No 1中。
下面的部分涉及本發(fā)明所有肽的一般特征，并且具體地涉及包括在本發(fā)明多肽中的氨基酸序列的變異、改變、修飾或衍生。應(yīng)當(dāng)理解，如本文所述的多肽的這種變異、改變、 修飾或衍生以下列要求為條件多肽保留任何進一步需要的活性或特征，如本公開后續(xù)部分具體說明的。
本發(fā)明多肽的變體可通過特定水平的氨基酸同一性限定，這在本公開后續(xù)部分中有更詳細的描述。氨基酸同一性可采用任何合適的算法計算。例如，PILEUP和BLAST算法可被用于計算同源性或比對序列(line up sequence)(諸如確定相當(dāng)?shù)幕蛳鄳?yīng)的序列(一般在其默認(rèn)設(shè)置下)，例如在 Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36 =290-300 ；Altschul, S, F et al(1990)J Mol Biol 215 :403-10中所述。進行BLAST分析的軟件通過美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)公共得到。這種算法包括首先通過在詢問序列中確定長度W的短字符來確定高得分序列對(HSI^s)，所述長度W的短字符當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字符比對時匹配或滿足一些正值閾得分Τ。T被稱為相鄰字符得分閾(Altschul等人，同上)。這些初始相鄰字符命中(hit)充當(dāng)啟動搜索的種子以尋找包含它們的HSI^s。字符命中沿著各個序列兩個方向延伸直至累積比對得分能增加。在下列時候字符命中在各方向的延伸停止累積比對得分從其最大所達到的值下降的量為X ；累計得分由于一個或多個負得分殘基比對而回到零或以下；或者達到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLAST程序采用默認(rèn)值字符長度(W)為11 ；BL0SUM62得分矩陣(參見HenikofT 和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919)比對(B)為 50，期望值(E) 為10，M = 5，N = 4和兩條鏈的比較。
BLAST算法進行兩序列之間相似性的統(tǒng)計分析；參見例如Karlin和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787。BLAST 算法所提供的相似性的一個量度是最小加和概率(P(N))，其提供了兩個多核苷酸或氨基酸序列間的匹配可偶然發(fā)生的概率指示。例如，如果是下列情況，一個序列被認(rèn)為與另一序列相似在比較第一序列與第二序列時最小加和概率小于約1，優(yōu)選地小于約0. 1，更優(yōu)選地小于約0. 01以及最優(yōu)選地小于約0.001?？蛇x地，UWGCG程序包提供BESTFIT程序，其可用于計算同源性(例如在其默認(rèn)設(shè)置下使用)(Devereux 等人(1984)Nucleic Acids Research 12,387-395)
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明多肽的變體也包括置換變體。置換變體優(yōu)選地涉及一個或多個氨基酸用相同數(shù)目的氨基酸置換和進行保守氨基酸置換。例如，氨基酸可用具有相似性質(zhì)的可選氨基酸——例如另一堿性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一帶電荷氨基酸、另一親水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一極性氨基酸、另一芳族氨基酸或另一脂肪族氨基酸——置換?？捎糜谶x擇合適取代基的20種主要氨基酸的一些性質(zhì)如下
權(quán)利要求
1.組合物，其包括外來體，其中所述外來體被裝載有外源遺傳物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述外來體衍生自樹突細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述外源遺傳物質(zhì)是編碼治療蛋白或免疫原的DNA質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述外源遺傳物質(zhì)是siRNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述質(zhì)粒編碼用于基因治療方法的治療蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述質(zhì)粒編碼免疫原，用于產(chǎn)生對免疫原免疫應(yīng)答的方法。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的組合物，其中所述外來體包括在所述外來體表面上表達的靶向部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述靶向部分包括與待靶向的細胞上存在的部分結(jié)合的肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述外來體包括外來體跨膜蛋白，其已經(jīng)被修飾以并入肽靶向部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述外來體跨膜蛋白選自Lamp-l、Lamp-2、 ⑶13、⑶86、閥蛋白、突觸融合蛋白-3。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述外來體跨膜蛋白是Lamp-2b。
12.組合物，其包括含有遺傳物質(zhì)的外來體，其中所述外來體衍生自未成熟的樹突細胞，用于體內(nèi)遞送遺傳物質(zhì)的方法。
13.在非人動物模型中基因沉默的方法，其包括給所述動物施用根據(jù)權(quán)利要求4所述的外來體，其中所述siRNA相對于待沉默的基因定向。
14.將外來體裝載有遺傳物質(zhì)的方法，其包括提供外來體的組合物，并且通過電穿孔用遺傳物質(zhì)裝載所述外來體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述電穿孔在20v/cm至lOOv/cm之間的電壓下進行。
16.將外來體裝載有遺傳物質(zhì)的方法，其包括提供外來體的組合物，并且采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑通過轉(zhuǎn)染用核酸裝載所述外來體。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16任一項所述的方法，其中所述外來體衍生自樹突細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及裝載有遺傳物質(zhì)的外來體及其生產(chǎn)方法，以及這種外來體用于體內(nèi)遞送遺傳物質(zhì)的應(yīng)用，具體地涉及這種外來體在基因治療或基因沉默的方法中的應(yīng)用。
文檔編號A61K48/00GK102497887SQ201080026864
公開日2012年6月13日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者L·奧瓦瑞茲, M·伍德, Y·賽奧 申請人:Isis創(chuàng)新公司