專利名稱：：基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于基因轉(zhuǎn)移和治療應(yīng)用的基因載體，并涉及產(chǎn)生所述基因載體的方法及其用途。_2]
背景技術(shù)：
：對于若干遺傳性病癥和獲得性病癥，來自正常供體的造血細(xì)胞移植(HCT)是治療性治療。然而，移植受限于匹配供體可獲得性差和與同種異體手術(shù)有關(guān)的死亡率(大多與移植物抗宿主病-GvHD有關(guān))。在某些病癥(例如溶酶體貯積病(LSD))中，HCT的功效非常低。為了提高同種異體移植的安全性和功效，并鑒定用于缺乏匹配供體的患者的備選方案，需要基于基因糾正的自體造血干細(xì)胞(HSC)移植的基因治療方法。作為同種異體HCT的備選方法，在患者自身的造血細(xì)胞中通過基因治療可糾正遺傳性遺傳缺陷。然而，難以將相關(guān)基因的功能性拷貝遞送至機(jī)體的全部受累細(xì)胞中。干細(xì)胞基因治療的構(gòu)思基于相對較少數(shù)目的干細(xì)胞的遺傳修飾，所述干細(xì)胞通過進(jìn)行自我更新分裂長期保留在機(jī)體內(nèi)，并產(chǎn)生眾多的經(jīng)遺傳糾正的子代，因此確保了在患者有生之年不斷供應(yīng)經(jīng)糾正的細(xì)胞。造血干細(xì)胞(HSC)構(gòu)成基因治療的優(yōu)良的靶標(biāo)群，因?yàn)樗鼈兛扇菀锥踩孬@自骨髓(BM)或動員的外周血?？蓪Ψ蛛x的HSC進(jìn)行遺傳修飾，并作為自體移植物再輸回給患者。長期益處需要移植極充足數(shù)目的基因修飾的HSC，其可使經(jīng)調(diào)理的骨髓進(jìn)行種群恢復(fù)，產(chǎn)生所有造血譜系經(jīng)糾正的血細(xì)胞。自體同種異型HSC使得可對所有患者進(jìn)行移植手術(shù)，并且避免了導(dǎo)致GvHD的免疫相容性問題。另外，一些疾病像原發(fā)性免疫缺陷需要糾正部分HSC及其子代。預(yù)處理(conditioning)方案(所謂的“非清髓性”或“微型(mini)”預(yù)處理方案)的強(qiáng)度降低，這產(chǎn)生對患者更好的耐受性和更少的副作用。簡化的預(yù)處理方案與標(biāo)準(zhǔn)同種異體移植較不相容，因?yàn)樵谕N異體背景下，由于與宿主衍生的免疫細(xì)胞的免疫拮抗作用，所以混合供體嵌合狀態(tài)通常是不穩(wěn)定。HSC及其子代的有效的長期基因修飾需要允許糾正性DNA穩(wěn)定整合到基因組而又不影響HSC功能的技術(shù)。最有效的遞送系統(tǒng)是病毒載體。例如，造血祖細(xì)胞(HSPC)中溶酶體酶半乳糖腦苷脂酶(在球狀細(xì)胞性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(GloboidLeukodystrophy,GLD)或克拉伯病(Krabbedisease)中缺乏)的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)引起轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡和功能受損，妨礙用于治療所述病癥的基于HSPC的基因治療方法的發(fā)展(見下文)。因此，用于基因治療的未來的表達(dá)盒應(yīng)類似于生理表達(dá)模式，并且避免可導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞毒性、清除甚至惡性轉(zhuǎn)化的異位和/或非生理性轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這對于其生物學(xué)必須不被遺傳干預(yù)擾亂的干細(xì)胞這種保證基因治療的長期功效的關(guān)鍵靶細(xì)胞類型特別重要?？傊壳暗脑煅蛑委煵呗孕枰狧SC的轉(zhuǎn)導(dǎo)以保證造血系統(tǒng)的長期糾正，但可明顯獲益于調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒在HSC中不會異位表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，卻只在作為遺傳疾病的靶標(biāo)的分化子代(例如SCID中的淋巴細(xì)胞、CGD中的粒細(xì)胞和GLD中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)中“開啟(switchon)”。實(shí)現(xiàn)這種造血基因治療策略的一種方法是使用譜系特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件例如基因座的內(nèi)源啟動子以驅(qū)動載體中治療基因的表達(dá)。然而，啟動子常常散布在長距離的DNA內(nèi)，而且表征不足，因此可能在載體構(gòu)建體中不易以其整體重構(gòu)。此外，基因轉(zhuǎn)移載體中重構(gòu)的組織特異性啟動子的表達(dá)水平常常不足以實(shí)現(xiàn)表型糾正，最可能是因?yàn)榘腚S機(jī)載體整合位點(diǎn)上染色質(zhì)的不完全重構(gòu)和/或不利影響。因此，迫切需要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的其它策略。發(fā)明陳沭按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于基因治療的基因載體，所述基因載體包含至少一個(gè)在造血祖細(xì)胞(HSPC)中具有相應(yīng)miRNA的與核苷酸序列有效連接的miRNA序列靶標(biāo)，所述相應(yīng)miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSPC中表達(dá)但并不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于基因治療的基因載體，所述基因載體包含至少一個(gè)在造血干細(xì)胞(HSC)中具有相應(yīng)miRNA的與核苷酸序列有效連接的miRNA序列靶標(biāo)，所述相應(yīng)miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSC中表達(dá)但并不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。換句話說，本發(fā)明提供適用于造血基因治療的基因載體，所述基因載體包含至少一個(gè)以有效量存在于造血祖細(xì)胞或造血干細(xì)胞中的miRNA的miRNA序列靶標(biāo)，并任選包含轉(zhuǎn)基因。所謂有效量，我們意指內(nèi)源miRNA的濃度足以降低或防止與相應(yīng)的miRNA靶序列有效連接的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。因此本發(fā)明利用在諸如HSPC和HSC等細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)但不在例如髓系和淋巴系的分化子代中表達(dá)的miRNA，這防止或降低可能的毒性轉(zhuǎn)基因在敏感干細(xì)胞群中表達(dá)，冋時(shí)保持在患病子代中表達(dá)和治療功效。miRNA與轉(zhuǎn)基因“有效連接”。術(shù)語“有效連接”意指所述組分處于允許以其預(yù)定方式發(fā)揮其作用的關(guān)系。干細(xì)胞能夠分化成許多細(xì)胞類型。能夠分化成所有細(xì)胞類型的細(xì)胞稱為全能細(xì)胞。在哺乳動物中，只有受精卵和早期胚細(xì)胞是全能細(xì)胞。干細(xì)胞是存在于大多數(shù)(如果不是全部的話)多細(xì)胞生物中的細(xì)胞。它們的特征在于通過細(xì)胞有絲分裂自我更新并分化成多種特化細(xì)胞類型的能力。哺乳動物干細(xì)胞的兩大類型是自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的胚胎干細(xì)胞和成體組織中存在的成體干細(xì)胞。在正在發(fā)育的胚胎中，干細(xì)胞可分化成所有的特化胚胎組織。在成體生物中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞起機(jī)體修復(fù)系統(tǒng)、補(bǔ)充特化細(xì)胞但也保持再生器官(例如血液、皮膚或腸組織)正常更新的作用。造血干細(xì)胞(HSC)是產(chǎn)生全部血細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞，血細(xì)胞包括髓系(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹突細(xì)胞)和淋巴系(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)。祖細(xì)胞具有分化成特定細(xì)胞類型的能力。然而，與干細(xì)胞不同，它們早已是非常特異性的它們被推動分化成其“目標(biāo)”細(xì)胞。干細(xì)胞和祖細(xì)胞之間最重要的差別是干細(xì)胞可無限復(fù)制，而祖細(xì)胞只可分裂有限的次數(shù)。只能通過功能性體內(nèi)測定法(即移植和證明其可在長時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生全血譜系)中，將HSPC與HSC嚴(yán)格區(qū)分開來。細(xì)胞表面標(biāo)記例如c-Kit(⑶117)、Sca-I的檢測和一組譜系標(biāo)記的缺乏/低表達(dá)，結(jié)合最近披露的屬于SLAM受體家族的一類分子(⑶150和⑶48)，可富集HSC和HSPC亞群，當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)功能測定法測定時(shí)，達(dá)到50%的純度(Kiel等)。分化細(xì)胞是與干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比變得更加特化的細(xì)胞。分化發(fā)生在多細(xì)胞生物的發(fā)育期間，同時(shí)生物從單個(gè)受精卵變成組織和細(xì)胞類型的復(fù)雜系統(tǒng)。分化也是成體的普遍過程成體干細(xì)胞在組織修復(fù)期間和在正常細(xì)胞更新期間分裂并產(chǎn)生完全分化的子細(xì)胞。分化顯著改變細(xì)胞的大小、形狀、膜電位、代謝活動和對信號的響應(yīng)性。這些變化大多數(shù)都是由于基因表達(dá)的高度受控修飾引起的。換句話說，分化細(xì)胞是具有特定結(jié)構(gòu)并且由于涉及特定基因的活化和失活的發(fā)育過程而執(zhí)行某些功能的細(xì)胞。在這一點(diǎn)上，分化細(xì)胞包括造血細(xì)胞譜系的分化細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。例如，可通過檢測在未分化細(xì)胞上不表達(dá)或表達(dá)較少的細(xì)胞表面分子，來將造血細(xì)胞譜系的分化細(xì)胞與HSC和HSPC區(qū)分開來。合適的譜系標(biāo)記的實(shí)例為例如CDllb、Grl、CD19、Terll9和CD3。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于基因治療的基因載體，所述基因載體包含至少一個(gè)與核苷酸序列有效連接的與選自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA相應(yīng)的miRNA序列祀標(biāo)。miR-126靶標(biāo)在較原始的HSPC中和(在人中)在紅細(xì)胞譜系(erythroidlineage)中最有效地阻斷表達(dá)。miR-126可能特別適于依靠在髓系和淋巴系中進(jìn)行穩(wěn)健轉(zhuǎn)基因表達(dá)的基因治療應(yīng)用。miR-130a靶標(biāo)在較原始的HSPC中最有效地阻斷表達(dá)(類似于miR-126)，miR-130a可能最特別適于依靠在髓系、淋巴系和紅細(xì)胞譜系中進(jìn)行穩(wěn)健轉(zhuǎn)基因表達(dá)的基因治療應(yīng)用。在人⑶34細(xì)胞中，miR-126可強(qiáng)于miR_130a，但是在分化子代中也可具有非特異性的活性。包含miR-130aT序列(優(yōu)選2_4個(gè)拷貝)和“半個(gè)”miR_126T(優(yōu)選2個(gè)拷貝)的組合祀標(biāo)使操作窗(operatingwindow)最大化,所述操作窗由在HSPC中的阻抑和在髓樣細(xì)胞子代中的表達(dá)之比確定。此外，當(dāng)使用組合靶標(biāo)時(shí)，兩種獨(dú)立的miRNA確保了轉(zhuǎn)基因在HSPC中減量調(diào)節(jié)，而且干擾內(nèi)源miRNA調(diào)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)降低，因此提高了靶序列的安全性和功效。miR-223祀標(biāo)在骨髓定型祖細(xì)胞(myeloidcommittedprogenitor)中最有效地阻斷表達(dá)和在較原始的HSPC中至少部分地阻斷表達(dá)。與miR-126和miR_130a不同，miR-223靶標(biāo)在包括粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、髓樣樹突細(xì)胞在內(nèi)的分化髓樣細(xì)胞中完全并強(qiáng)烈阻斷表達(dá)。miR-223靶標(biāo)可能特別適于依賴在淋巴系或紅細(xì)胞譜系中進(jìn)行穩(wěn)健轉(zhuǎn)基因表達(dá)的基因治療應(yīng)用。miR-223靶標(biāo)還可在人HSC中非常有效地阻斷表達(dá)。優(yōu)選miRNA序列祀標(biāo)對應(yīng)于mir_130a和mir-126。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因載體包含控制載體的表達(dá)的核苷酸序列。換句話說，內(nèi)源微小RNA在某些細(xì)胞類型(HSC^PHSPC)中阻止病毒的表達(dá)或增殖，但允許在其它細(xì)胞類型中表達(dá)或增殖。例如，mir-126、mir-130和mir-223在造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中防止基因載體或溶瘤病毒的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中,基因載體包含作為轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因轉(zhuǎn)移載體呈非病毒基因轉(zhuǎn)移載體的形式。在這個(gè)實(shí)施方案中，基因轉(zhuǎn)移載體可包含含有與核苷酸序列有效連接的miRNA靶序列的表達(dá)載體或質(zhì)粒，或者呈含有與核苷酸序列有效連接的miRNA靶序列的表達(dá)載體或質(zhì)粒的形式。本文描述的表達(dá)載體包含含有能夠被轉(zhuǎn)錄的序列的核酸區(qū)。因此，該定義包括編碼mRNA、tRNA和rRNA的序列。可使用本發(fā)明的基因載體或基因轉(zhuǎn)移載體將轉(zhuǎn)基因遞送至目標(biāo)位點(diǎn)或目標(biāo)細(xì)胞。可通過病毒或非病毒載體將本發(fā)明的載體遞送到靶位點(diǎn)。載體是允許或有利于將實(shí)體從一種環(huán)境轉(zhuǎn)移到另一種環(huán)境的工具。舉例來說，用于重組DNA技術(shù)的一些載體允許將實(shí)體(例如DNA區(qū)段(例如異源DNA區(qū)段，例如異源cDNA區(qū)段))轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞。任選一旦進(jìn)入靶細(xì)胞，載體便可在細(xì)胞內(nèi)起維持異源DNA的作用，或者可起DNA復(fù)制單元的作用。用于重組DNA技術(shù)的載體的實(shí)例包括質(zhì)粒、染色體、人工染色體或病毒。非病毒遞送系統(tǒng)包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染方法。在此，轉(zhuǎn)染包括使用非病毒載體將基因遞送至靶哺乳動物細(xì)胞的過程。典型的轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、DNA生物射彈、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、密集DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(compactedDNA-mediatedtransfection)、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、脂轉(zhuǎn)染(Iipofectin)、陽離子劑介導(dǎo)的、陽離子表面兩親分子(cationicfacialamphiphiles,CFA)(NatureBiotechnology199614；556)及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因載體是病毒載體。病毒遞送系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。載體的其它實(shí)例包括離體遞送系統(tǒng)，其包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染方法，例如電穿孔、DNA生物射彈、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、密集DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。術(shù)語“載體顆?！笔侵竷?yōu)選能夠結(jié)合并進(jìn)入靶細(xì)胞的經(jīng)包裝的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。正如已對載體所做的論述一樣，可根據(jù)野生型反轉(zhuǎn)錄病毒，對顆粒的組分進(jìn)行修飾。例如，顆粒的蛋白質(zhì)外殼中的Env蛋白可經(jīng)遺傳修飾以改變其靶向特異性或?qū)崿F(xiàn)一些其它所需要的功能。優(yōu)選病毒載體優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)某一細(xì)胞類型或某些細(xì)胞類型。更優(yōu)選病毒載體是靶向載體，也就是說具有與天然病毒相比已被改變的組織向性，使得載體靶向特定細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因載體可得自慢病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因載體包含組織特異性啟動子。優(yōu)選組織特異性啟動子選自CDllb和c-Fes及來源于細(xì)胞色素b-245重鏈(CYBB,gp91phox)基因座和TEK(Tie2)的啟動子。TEK(Tie2)啟動子可與miR-126靶序列結(jié)合，這種結(jié)合可供在腫瘤浸潤性髓樣細(xì)胞亞類中進(jìn)行特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因載體包含編碼酶的轉(zhuǎn)基因。優(yōu)選酶選自溶酶體酶半乳糖腦苷脂酶和gp91Phox0按照本發(fā)明，可用來遞送免疫調(diào)節(jié)分子，例如干擾素-α。優(yōu)選這些載體在骨髓移植后將免疫調(diào)節(jié)分子遞送至腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選這些載體含有Tie2啟動子加miR-126T序列。重要的是，Tie2啟動子在造血干細(xì)胞中具有活性，而且已知免疫調(diào)節(jié)分子(例如干擾素-α)對HSC有毒性。因此，為了通過Tie2表達(dá)來特異性地遞送生物活性分子至腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞而不干擾HSC功能，HSC特異性miRT的使用一如本專利申請所述一變得是必須的，而不是選項(xiàng)。已知Tie2啟動子在HSC中比在我們的整個(gè)研究中使用的PGK啟動子弱，我們預(yù)期在HSC中，126T/130aT序列完全阻止由Tie2啟動子表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的毒性。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一組用于產(chǎn)生病毒載體顆粒的DNA構(gòu)建體，包括編碼可包裝的病毒載體基因組的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)本發(fā)明的miRNA序列靶標(biāo)，并任選包含轉(zhuǎn)基因。所謂可包裝的載體基因組，我們意指載體基因組處于其中可將其包裝成病毒載體顆粒的環(huán)境下。這通常需要Gag-Pol和Env的存在。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于制備病毒載體顆粒的方法，所述方法包括將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體組導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并得到病毒載體顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含相應(yīng)的miRNA。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的病毒載體顆粒。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供包含本發(fā)明的基因載體或顆粒以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體的藥物組合物。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用本發(fā)明的基因載體或顆粒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。細(xì)胞可在體內(nèi)或體外情況進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染。細(xì)胞可來源于動物(優(yōu)選哺乳動物，例如人或小鼠)或形成動物(優(yōu)選哺乳動物，例如人或小鼠)的組成部分。因此，應(yīng)了解的是，本發(fā)明可用于提供轉(zhuǎn)基因動物，例如用作疾病模型。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動物是非人類哺乳動物。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供至少兩個(gè)不同的與選自mir_130a、mir-126和mir-223的miRNA相應(yīng)的miRNA序列祀標(biāo)的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，miRNA序列靶標(biāo)同時(shí)、單獨(dú)或序貫使用。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供本發(fā)明的基因載體、本發(fā)明的顆粒、本發(fā)明的藥物組合物、本發(fā)明的細(xì)胞或本發(fā)明的組合用于在造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞中防止或降低轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供本發(fā)明的基因載體、本發(fā)明的顆粒、本發(fā)明的藥物組合物、本發(fā)明的細(xì)胞或本發(fā)明的組合用于治療選自球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、慢性肉芽腫病和重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的疾病。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供本發(fā)明的基因載體、本發(fā)明的顆粒、本發(fā)明的藥物組合物、本發(fā)明的細(xì)胞或本發(fā)明的組合用于提高與基因治療相關(guān)的造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞存活的機(jī)會。可通過這些細(xì)胞的基因的特異性脫靶表達(dá)來增加HSC或HSPC的存活機(jī)會。具體地講，對HSC或HSPC有毒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的脫靶可有益于這些細(xì)胞的存活。同樣，在宿主中可引起不良免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的脫靶，可導(dǎo)致細(xì)胞的存活機(jī)會增加。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供本發(fā)明的基因載體、本發(fā)明的顆粒、本發(fā)明的藥物組合物、本發(fā)明的細(xì)胞或本發(fā)明的組合用于提高基因治療的安全性和/或功效?；蛑委煱踩缘奶岣甙ㄔ谀承┘?xì)胞類型(例如HSC和HSPC)中防止或降低轉(zhuǎn)基因的不良表達(dá)或載體的表達(dá)。特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)基因或載體表達(dá)的脫靶可降低可能伴隨基因治療的不良反應(yīng)或副作用?；蛑委煿πУ奶岣甙ㄔ谒枰募?xì)胞類型(例如分化造血細(xì)胞)中更有效地表達(dá)轉(zhuǎn)基因，因?yàn)橛赏ㄟ^微小RNA靶序列免于轉(zhuǎn)基因毒性和不良免疫反應(yīng)的基因修飾的未分化細(xì)胞更有效地產(chǎn)生這些細(xì)胞。具體地講，如果可避免轉(zhuǎn)基因的表達(dá)直到細(xì)胞分化，則涉及HSC或HSPC移植的基因治療可更安全和更有效。9按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供本發(fā)明的基因載體、本發(fā)明的顆粒、本發(fā)明的藥物組合物、本發(fā)明的細(xì)胞或本發(fā)明的組合用于防止造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，其中細(xì)胞凋亡是由轉(zhuǎn)基因的表達(dá)引起的。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供本發(fā)明的基因載體、本發(fā)明的顆粒、本發(fā)明的藥物組合物、本發(fā)明的細(xì)胞或本發(fā)明的組合用于監(jiān)測造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段。mir-126,mir-223和mir_130a的存在表示HSC或HSPC。更準(zhǔn)確地講，mir-126表示原始HSPC，還在人中表示紅細(xì)胞譜系的細(xì)胞。Mir-130a表示較原始的HSPC。Mir-223表示骨髓定型祖細(xì)胞和較原始的HSPC。Mir-223也表示分化髓樣細(xì)胞，包括粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和髓樣樹突細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因載體用于造血細(xì)胞治療。造血細(xì)胞治療包括造血干細(xì)胞移植。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供與選自mir-130a、mir_126和mir-223的miRNA相應(yīng)的miRNA序列祀標(biāo)用于基因治療。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供測定造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段的方法，所述方法包括測定細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平，其中miRNA對應(yīng)于與核苷酸序列有效連接的miRNA靶序列，其中miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖細(xì)胞(HSPC)或造血干細(xì)胞(HSC)中表達(dá)，但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。例如，mir-130a和mir-126的表達(dá)表明細(xì)胞是HSPC或HSC，而miR-223的表達(dá)表明屬于髓系，即粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，包括其前體細(xì)胞和衍生細(xì)胞。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供測定造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段的方法，所述方法包括測定細(xì)胞中至少兩種不同miRNA的表達(dá)水平，其中miRNA對應(yīng)于與核苷酸序列有效連接的miRNA靶序列，其中miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖細(xì)胞(HSPC)或造血干細(xì)胞(HSC)中表達(dá)但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)；和對不同miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較。此外，可使用表達(dá)兩種標(biāo)記基因(每一種含有不同的微小RNA靶序列)的雙向載體，同時(shí)和彼此獨(dú)立地測定兩種微小RNA的表達(dá)。例如，不同的微小RNA可與不同的標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記)連接。不同顏色可表示代表不同分化階段的微小RNA表達(dá)的不同混合物(例如綠色標(biāo)記+miR-126T，紅色標(biāo)記+miR-223T。如果細(xì)胞為紅色或黑色一>HSPC;如果細(xì)胞為黃色一>淋巴細(xì)胞；如果細(xì)胞為綠色分化髓系細(xì)胞)。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供測定造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段的方法，所述方法包括測定轉(zhuǎn)基因在所述造血干細(xì)胞或所述造血祖細(xì)胞中的表達(dá)水平，其中轉(zhuǎn)基因與miRNA序列靶標(biāo)有效連接，由此相應(yīng)的miRNA防止或降低轉(zhuǎn)基因在造血祖細(xì)胞(HSPC)或造血干細(xì)胞(HSC)中表達(dá)，但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。此外，選自miR-126、miR_130a和miR-223的miRNA的報(bào)道載體(reportervector)可用于在目的是從誘導(dǎo)的多潛能細(xì)胞(iPS)或胚胎干細(xì)胞(ES)中獲得造血譜系細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中鑒定造血干細(xì)胞和/或其直接前體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的miRNA包括選自mir_130a、mir-126和mir-223的miRNA。本發(fā)明的一#其它關(guān)鍵優(yōu)勢本發(fā)明教導(dǎo)可如何將適于基因治療的基因載體設(shè)計(jì)成受HSC和HSPC的內(nèi)源miRNA調(diào)節(jié)用于控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)載體的特異性表達(dá)概況。本發(fā)明提供這些載體的廣泛應(yīng)用，因?yàn)樗鼈兛捎兄谠贖SC和HSPC中防止轉(zhuǎn)基因毒性，因此有利于開發(fā)治療各種疾病的基因治療策略。所述載體特別適于涉及對HSC或HSPC有毒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的基因治療。本發(fā)明人提供對所選miRNA在多種造血細(xì)胞亞類(包括稀少的HSPC群)內(nèi)的活性進(jìn)行概況分析的新方法，因此向廣泛采用但限于之前純化的混合群落(bulkpopulation)的常規(guī)miRNA表達(dá)概況分析方法加入了新尺度。這種方法以HSPC用慢病毒miRNA報(bào)道載體轉(zhuǎn)導(dǎo)為基礎(chǔ)，所述報(bào)道載體用作miRNA活性的活的遺傳指示物，可容易通過流式細(xì)胞術(shù)在單一細(xì)胞水平和在多細(xì)胞群中平行定量測量。采用這種方法，本發(fā)明人鑒定出在小鼠和人HSPC(包括富集最原始干細(xì)胞的亞類)中高度有功能的兩種miRNA。在分化時(shí)，一種miRNA在早期祖細(xì)胞水平快速減量調(diào)節(jié)，而另一種則在粒細(xì)胞生成和單核細(xì)胞生成期間被進(jìn)一步誘導(dǎo)，但是在淋巴細(xì)胞中和在巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞分化期間急速減量調(diào)節(jié)。此外，本發(fā)明人利用在HSPC中高表達(dá)的兩種miRNA之一來克服阻礙通過基于慢病毒載體的造血干細(xì)胞基因療法有效治療鼠模型的球狀細(xì)胞性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(GLD)(—種由于溶酶體酶半乳糖腦苷脂酶一GALC的活性缺陷而引起的溶酶體貯積癥)的主要問題。與其它溶酶體酶不同，GALC在HSPC中的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)引起由于作為酶表達(dá)結(jié)果的生物活性鞘脂的胞內(nèi)含量失衡所致的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡和功能受損。髓系和淋巴系的分化細(xì)胞不受GALC表達(dá)的影響，這就表明HSPC對酶毒性有特有的敏感性。用于報(bào)道載體的miRNA反應(yīng)性序列允許調(diào)節(jié)治療上相關(guān)的GALC轉(zhuǎn)基因的表達(dá)概況、使轉(zhuǎn)基因表達(dá)從其中表達(dá)關(guān)聯(lián)miRNA的細(xì)胞(HSPC)中脫靶，同時(shí)允許在不受GALC表達(dá)毒性影響的分化子代中進(jìn)行完全治療性表達(dá)。用miRNA調(diào)節(jié)的GALC慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的HSPC受到保護(hù)免于酶毒性，并且保持其在體外和體內(nèi)兩者的功能。初步結(jié)果表明這種方法在糾正小鼠模型疾病表現(xiàn)中具有治療功效。優(yōu)選使用下列miRNA靶序列以在人造血系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)需要在髓系中表達(dá)的基因治療應(yīng)用(例如慢性肉芽腫病、溶酶體貯積癥(例如克拉伯病)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良等)126T/130aT(2+2個(gè)靶序列)一對在HSPC中的最大阻抑最優(yōu)化；126T(2個(gè)靶序列)一對在髓樣細(xì)胞子代中的最低背景活性最優(yōu)化。需要在紅細(xì)胞譜系中表達(dá)的基因治療應(yīng)用(例如地中海貧血、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、鐮狀細(xì)胞病等)130aT(4個(gè)靶序列)或223T(2個(gè)或4個(gè)靶序列)。后一靶標(biāo)在較原始的BFU-E和CFU-E中可能具有某種活性(<5χ)。需要在淋巴系中表達(dá)的基因治療應(yīng)用(例如RAG1/RAG2缺乏癥、BTK缺乏癥、X-SCID、ADA-SCID)223Τ(2個(gè)或4個(gè)靶序列)，可能與126T/130aT(2+2個(gè)靶序列)或126T(2個(gè)靶序列)組合)。為了被對HSC和HSPC而言是細(xì)胞內(nèi)源的內(nèi)源miRNA識別，可用miRNA靶序列對用于基因轉(zhuǎn)移和治療的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的載體(例如病毒載體，包括慢病毒載體)進(jìn)行工程改造，從而在細(xì)胞亞類中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外，可使用miRNA靶序列的組合以獲得具有高特異性細(xì)胞表達(dá)模式的載體。除非另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)施將應(yīng)用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。文獻(xiàn)中對這類技術(shù)進(jìn)行了解釋。參見例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,MolecularCloningALaboratoryManual,第2版，第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.Μ.等(1995和定期增刊；CurrentProtocolsinMolecularBiology,%9、13和16章，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,JohnWiley&Sons；J.M.Polak和James0’D.McGee,1990,InSituHybridization!PrinciplesandPractice；0xfordUniversityPress;M.J.Gait(編輯)，1984,OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.I,EdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManual,EdHarlow(編輯)，DavidLane(編輯)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855.HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes編輯(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9);以及LabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams和LindaRodgers編輯，2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些整體原文的每一份都通過引用結(jié)合到本文中。附圖描沭將參照的其優(yōu)選實(shí)施方案，僅以舉例方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中圖I:雙向miRNA調(diào)節(jié)的慢病毒報(bào)道載體的示意圖。該圖表示miRNA調(diào)節(jié)的雙向載體(Bd.LV)的代表性結(jié)構(gòu)，其含有綠色熒光蛋白(GFP)作為miRNA報(bào)道分子和人低(Ioe)親和力神經(jīng)生長因子受體(NGFR)的截短形式作為組成型表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化分子(normalize!·)。盡管Bd.LV-ctr不含任何miRNA靶序列(miRT)，但Bd.LV-223T和Bd.LV-126T通過加入含有21bp的分別與miR-223或miR-126完全互補(bǔ)的4個(gè)串聯(lián)重復(fù)來構(gòu)建。圖2:細(xì)胞系中miRNA報(bào)道分子Bd.LV的評價(jià)。a)在HEK293T、U937和通過用含有在遍在啟動子控制下的pri-mir-126的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)異位表達(dá)miR-126的HEK293T細(xì)胞(HEK293T.LV.miR-126)中，對miR-223和miR-126表達(dá)水平(拷貝/pg)進(jìn)行定量分析。b)用指定miRNA調(diào)節(jié)的Bd.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK-293T、U937、HUVEC和HEK293T.LV.miR-126細(xì)胞的代表性FACS分析。對細(xì)胞的GFP“miRNA報(bào)道分子“和NGFR“標(biāo)準(zhǔn)化分子”表達(dá)進(jìn)行了分析。c)在蛋白質(zhì)水平上和在RNA水平上，報(bào)道基因表達(dá)的miRNA介導(dǎo)的倍數(shù)阻抑(foldrepression)的計(jì)算公式。直方圖表示miR-223和miR-126在細(xì)胞系中的活性，計(jì)算為蛋白質(zhì)水平上的GFPFR值。菱形表示RNA水平上的GFPFR。圖3miRNA報(bào)道分子BdLV的體內(nèi)評價(jià)。譜系骨髓(BM)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞(HSPC)用miR-223和miR-126的雙向miRNA報(bào)道分子慢病毒載體(BdLV)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并移植入受者小鼠中。通過FACS分析穩(wěn)定植入攜帶miRNA報(bào)道分子的細(xì)胞的小鼠外周血細(xì)胞。а)用于鑒定來源于鼠外周血的主要白細(xì)胞群的門控策略粒細(xì)胞(CDllb+，SSC高)、單核細(xì)胞(0)1化+，55(低)、8細(xì)胞(CD19+)和T細(xì)胞(CDllb_CD19b_)。b)鼠外周血亞類內(nèi)GFP和NGFR表達(dá)的代表性FACS分析。c)來源于用轉(zhuǎn)導(dǎo)有Bd.LV-ctr(η=5)、Bd.LV-223T(η=б)或Bd.LV-126T(n=4)的HSPC移植小鼠的外周血亞群內(nèi)的GFPFR值(平均值+/-SD)。圖4:(a)譜系_/ffi骨髓(BM)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞(HSPC)用雙向miRNA報(bào)道分子慢病毒載體(BdLV)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并移植入經(jīng)致死照射的小鼠中。BdLV共表達(dá)通過完全互補(bǔ)的miRNA靶(miRT)序列的4個(gè)串聯(lián)重復(fù)使之對特異性miRNA有反應(yīng)的去穩(wěn)定GFP(d4GFP)報(bào)道分子和截短的NGFR標(biāo)記基因(ANGFR)。移植后8_12周使小鼠安樂死，如所示通過免疫表型分析對多個(gè)BMHSPC亞群進(jìn)行前瞻性鑒定(HSC:造血干細(xì)胞；MPP:多能祖細(xì)胞；GMLP:粒細(xì)胞-單核細(xì)胞-淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞；GMP:粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞；eMEP:早期巨核細(xì)胞-紅細(xì)胞祖細(xì)胞；EP:紅細(xì)胞前體)。(b)代表性FACS圖表示從(a)中所述移植小鼠的BM中新鮮分離的HSPC亞群中，對照-BdLV(無miRT或133aT、肌肉特異性miRT)和miR-126(126T)、miR_130a(130aT)、miR_196b(196bT)、miR-10a(IOaT)、miR-223(223T)、miR-19a(19aT)、miR-93(93T)、miR-17_5p(17T)和let_7a(Let7aT)的報(bào)道分子BdLV的表達(dá)。每行表示上述分化階段的HSPC中，指定BdLV的報(bào)道分子表達(dá)的代表性模式。每行右邊的柱狀圖表示根據(jù)報(bào)道分子平均熒光強(qiáng)度計(jì)算的平均倍數(shù)抑制(FR)土sem(對照n=9;126Tn=10；130aTn=4；196bTn=4；10aT:除其中n=I因此統(tǒng)計(jì)數(shù)為n/a的HSC和MPPl以外，η=4；223Tη=6，其中5種具有eGFP報(bào)道分子；19aTn=3；93Tη=2；17Τη=3；let7aTη=1，3只小鼠的合并物)。使用各報(bào)道分子BdLV組的EP作為參比，通過單因素方差分析和Bonferroni事后檢驗(yàn)校正進(jìn)行HSPC亞群間miRNA活性的統(tǒng)計(jì)比較(***:ρ<O.OOl;**0.Ol>P>O.OOl;*p<O.05)。圖5:(a)從移植小鼠分離的多個(gè)細(xì)胞群中，通過指定報(bào)道分子BdLV的平均倍數(shù)阻抑(FR)測定的8種miRNA的造血活性。譜系Μ亞類見圖4;譜系+BM亞類ProBCD19+CD43.；CD43_B:CD19+CD43-；TLyCD3+;單核細(xì)胞CDllb+CD48+;粒細(xì)胞:CDllb+CD48l0；外周血粒細(xì)胞=CDllb+側(cè)向角散射(sidescatter)111;單核細(xì)胞=CDllb+側(cè)向角散射lQ；BLy:CD19+；TLy:CD3。(b)將含有4拷貝miR_130aT和2拷貝miR_126T(130a/126T;n=4只小鼠)的組合靶序列與4拷貝miR-126T(126T;n=10只小鼠)或4拷貝miR_130aT(130aT；η=4只小鼠)進(jìn)行了比較。柱狀圖表示譜系標(biāo)記陰性骨髓群(圖4圖例)中和外周血白細(xì)胞中通過這些miRT序列得到的倍數(shù)阻抑土sem。注意，在HSC中130a/126T達(dá)到比僅126T更好的阻抑，而PB白細(xì)胞的背景阻抑減少。圖6:通過miRNA靶序列調(diào)節(jié)自殺基因的表達(dá)。(a)將與miR-142、miR-223、miR-126或miR-130a完全互補(bǔ)的miRT序列加入去穩(wěn)定胸苷激酶(dTK)轉(zhuǎn)錄物中。對于(b)使用單向慢病毒自殺載體(各載體圖的右半部)，而(c)中使用GFP標(biāo)記與miRNA調(diào)節(jié)的TK偶聯(lián)或NGFR標(biāo)記與對照-TK偶聯(lián)的雙向自殺載體。(b)譜系-/低HSPC用指定慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，并接種到+/_更昔洛韋(GCV)的半固體培養(yǎng)基中(LV-GFPn=2；CTRL-TKn=8；TK-142Tη=4;ΤΚ_223Τη=6;ΤΚ_126Τη=4;TK_130aT:η=2)。10天后，統(tǒng)計(jì)骨髓(CFU-GM、CFU-G,CFU-GM)和類紅細(xì)胞(BFU-E、CFU-E)集落數(shù)。箱須圖表示含有GCV的培養(yǎng)物中的集落數(shù)除以相應(yīng)無GCV的對照培養(yǎng)物的集落計(jì)數(shù)(第10-90百分位數(shù))。'無GCV'數(shù)據(jù)點(diǎn)表示接種差異(platingvariability)(各無GCV處理的培養(yǎng)物的集落計(jì)數(shù)除以所有無GCV處理的培養(yǎng)物的平均集落計(jì)數(shù)；n=26)。對GCV處理的LV-GFP組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較；ns，無顯著不同;**，0·OOl<P<O.Ol:林*，p<O.001。(c)來源于CD45.1+小鼠的譜系_/低HSPC用TK對照載體(經(jīng)NGFR標(biāo)記)或miRNA調(diào)節(jié)的TK載體(經(jīng)GFP標(biāo)記；Exp#lTK.126Τ；Εχρ#2ΤΚ.142Τ)轉(zhuǎn)導(dǎo)。以I:I比率將LV.NGFR/對照TK轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和LV.GFP/TK-miRT轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞混合，并移植入⑶45.2+同類小鼠中，移植后第3天起，小鼠用GCV治療(Exp#ln=6只小鼠；Exp#2n=5只小鼠)7-14天，或不治療(Exp#ln=4；Exp#2:n=3)。代表性FACS圖表示⑶45.1+供體細(xì)胞內(nèi)的GFP/NGFR嵌合狀態(tài)。圖表表示對于在7-8個(gè)月時(shí)間內(nèi)各種血細(xì)胞類型，GCV治療(紅色)和未治療(黑色)小鼠血液中轉(zhuǎn)導(dǎo)的供體衍生細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP的細(xì)胞的部分。注意，GCV組中顯著較多的細(xì)胞為GFP+(***.p<O.001，兩因素方差分析)，這就表明受到保護(hù)免于自殺和用GFP/TK.126T或GFP/TK.142T轉(zhuǎn)導(dǎo)的HSC的選擇性優(yōu)勢。因此，加到轉(zhuǎn)基因的miR_126T序列克服了由高毒性轉(zhuǎn)基因引起的HSPC毒性(甚至自遍在啟動子表達(dá)時(shí))，具有改善基于HSPC的基因治療的安全性和功效的重大潛力。此外，這些結(jié)果正式證實(shí)了miR-126在長期植入性造血干細(xì)胞中有活性，正如功能性種群恢復(fù)測定法(functionalrepopulationassay)所證實(shí)的一樣。圖7:(a)為了呈現(xiàn)利用miR-126調(diào)節(jié)用于基因治療的安全性，通過將闡述的LV顯微注射入受精卵的卵周隙，來產(chǎn)生含有miR-126報(bào)道分子(Tg.126T)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。年青的成熟轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓的FACS分析表明，GFP表達(dá)在Kit+Sca+譜系標(biāo)記_(KSL)細(xì)胞(直方圖中的藍(lán)色圖)中最低，而GFP表達(dá)在Kit+Sca_Lin_祖細(xì)胞(直方圖中的黑色和紅色圖)開啟。測定Tg.126T小鼠和對照GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的GFPMFI以計(jì)算指定HSPC亞群中miR-126報(bào)道分子的FR(平均值土sem，η=10只Tg.126Τ小鼠；林*ρ<O.001;**0.01>P>O.001，與EP相比)。(b)盡管攜帶miR-126的兩個(gè)敲除等位基因的小鼠由于血管生成缺陷所致，表現(xiàn)出明顯的胚胎致死性，但是培育我們的Tg.126T集落導(dǎo)致在反映親代之一的后代中出現(xiàn)正常的每窩產(chǎn)仔數(shù)和預(yù)期的載體拷貝數(shù)(VCN)分布，這就表明了miR-126T序列自PGK啟動子的適度表達(dá)不干擾發(fā)育期間天然miR-126靶標(biāo)的調(diào)節(jié)。(c)來源于⑶45.2+Tgl26T小鼠和⑶45.I+野生型(WT)小鼠的BM細(xì)胞通過⑶117的陽性選擇富集HSPC，并競爭性移植(II比率)到經(jīng)致死照射的⑶45.2+受者(η=4)中。對移植小鼠定期采血，并測定各種外周血細(xì)胞譜系中的CD45.1/CD45.2嵌合狀態(tài)(粒細(xì)胞=CDllb+側(cè)向角散射ω;單核細(xì)胞=CDllb+側(cè)向角散射；B細(xì)胞CD19+；T細(xì)胞CD3+)。這些數(shù)據(jù)表明對于安全利用miR-126調(diào)節(jié)有一個(gè)寬裕的治療窗。圖8(A)CD34+HSPC從人臍血(CB)中純化，并用對照-BdLV(對照)或miR-126(126T)、miR-130a(130aT)或miR-223(223T)的miRNA報(bào)道分子BdLV轉(zhuǎn)導(dǎo)(η=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)/組)。在支持HSPC短期維持的條件下將細(xì)胞保持在液體培養(yǎng)物中，在⑶34+CD38T1SPC和⑶34+CD38+祖細(xì)胞(左起頭兩欄)中轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天，測定BdLV標(biāo)記表達(dá)。然后細(xì)胞或在液體培養(yǎng)中分化6天(CD34—CD38+細(xì)胞；中間欄)或在半固體培養(yǎng)基中分化16天(⑶13+髓樣細(xì)胞，⑶235+類紅細(xì)胞)。顯示代表性FACS圖。底部的柱狀圖表示在相應(yīng)亞群中定量測定的miR-126、miR-130a和miR-223活性(η=3;平均倍數(shù)阻抑+/-sem；**，0·001<P<O.01:_，p<O.001)。(B)臍血CD34+細(xì)胞用對照雙向自殺載體或含有miR-223(TK-223T)或miR-126(TK-126T，另見圖2)的miRNA靶序列的miRNA調(diào)節(jié)的雙向自殺載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在前藥GCV的存在或不存在下，在CFC測定法中以一式四份接種。接種后14天，統(tǒng)計(jì)GFP+類紅細(xì)胞(CFU-E、BFU-E)或骨髓(CFU-G、CFU-M、CFU-GM)集落數(shù)，并歸一化至'無GCV'培養(yǎng)的統(tǒng)計(jì)數(shù)。箱須圖表示第10-90百分位數(shù)。GCV完全阻止CTR-TK轉(zhuǎn)導(dǎo)的集落的生長。(C)將miR-126T和miR_130aT序列(分別為4+4和2+2個(gè)串聯(lián)重復(fù))的組合以及僅miR-126T的2個(gè)串聯(lián)重復(fù)與分別使用miR_126T或miR_130aT的4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)miRT設(shè)計(jì)進(jìn)行比較。人臍血細(xì)胞用相應(yīng)的報(bào)道分子BdLV轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天，在原始干細(xì)胞/祖細(xì)胞區(qū)室(⑶34+⑶38-)和祖細(xì)胞區(qū)室(⑶34+⑶38+)中，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)后10-14天在髓樣細(xì)胞子代(⑶13+)和紅細(xì)胞子代(⑶235+)中，測定報(bào)道分子的倍數(shù)阻抑。126T(4個(gè)靶標(biāo))、126T/130aT(4+4個(gè)靶標(biāo))和126T/130aT(2+2個(gè)靶標(biāo))在干細(xì)胞/祖細(xì)胞區(qū)室中同樣充分阻抑。然而，126T/130aT(4+4個(gè)靶標(biāo))在髓樣細(xì)胞子代中具有較高的背景抑制活性。(D)G-CSF誘導(dǎo)體外分化時(shí)，在原始區(qū)室中(如在C中)和后期骨髓分化階段(中幼粒細(xì)胞⑶Ilb+/⑶16-;晚幼粒細(xì)胞⑶Ilb+/⑶16+/SSC低；粒細(xì)胞⑶Ilb+/⑶16+/SSC高)中126T(4個(gè)靶標(biāo))、126T/130aT(2+2靶標(biāo))和126T(2靶標(biāo))的抑制活性。培養(yǎng)物的May-Griinwald/Giemsa染色的細(xì)胞離心涂片(cytospin)樣品上驗(yàn)證分化階段。通過將CD34+/CD38-干細(xì)胞/多能細(xì)胞區(qū)室中相應(yīng)miRT的倍數(shù)阻抑除以晚幼粒細(xì)胞中的倍數(shù)阻抑，來計(jì)算調(diào)節(jié)指數(shù)(右圖)。通過126T(2個(gè)靶標(biāo))獲得轉(zhuǎn)基因表達(dá)在髓樣細(xì)胞子代中的最佳“釋放”，而在干細(xì)胞/祖細(xì)胞區(qū)室的阻抑(類似于130aT(4個(gè)靶標(biāo)))與126T(4個(gè)靶標(biāo))和126T/130aT(2+2個(gè)靶標(biāo))相比略少。至于后2個(gè)靶序列，126T/130aT(2+2個(gè)靶標(biāo))優(yōu)于126T(4個(gè)靶標(biāo))，因?yàn)樗o出最大調(diào)節(jié)指數(shù)。此外，通過2個(gè)獨(dú)立的miRNA確保了轉(zhuǎn)基因減量調(diào)節(jié)，進(jìn)一步降低了干擾內(nèi)源miRNA調(diào)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)，因此提高了miRT的安全性和功效。圖9:溶酶體酶在HSPC中的過量表達(dá)。在LV轉(zhuǎn)導(dǎo)后，將在mHSPC(A)和hHSPC(B)中的酶表達(dá)水平歸一化至野生型。與ARSA和IDUA相比，GALC表達(dá)顯著較低。圖10:在LV介導(dǎo)的GALC表達(dá)時(shí)鼠HSPC的功能受損。(A)對用GALC和對照LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC的CFC測定。統(tǒng)計(jì)集落數(shù)(#)/板(Y左軸，柱)，并測定整合的LV拷貝數(shù)/細(xì)胞(VCN)(Y右軸，點(diǎn))。與GFP.LV(η=10)和ARSA.LV(η=8)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的-/-mHSPC(η=12次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))產(chǎn)生顯著較低的集落數(shù)。當(dāng)mHSPC用mirl42TGALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)(η=6)，未觀察到這種損害。*ρ<0.001，集落數(shù)/板和VCN兩者的單因素方差分析。給出了平均值土SD。用-/_和+/+mHSPC得到類似結(jié)果。(B)對轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC測定GALC活性。在GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)后，GALC-/-(從此為-/-)(η=5)和GALC+/+(從此為+/+)(η=5)mHSPC顯示GALC活性提高至野生型水平(用GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的+/+mHSPC，η=5)的2倍。用mirl42調(diào)節(jié)的GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC(mirl42T)(η=3)中未檢測到活性提高。圖11:在LV介導(dǎo)的GALC表達(dá)時(shí)人HSPC的功能受損。㈧對用GALC和對照LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的hHSPC的CFC測定。統(tǒng)計(jì)集落數(shù)(#)/板(Y左軸，柱)，測定整合的LV拷貝數(shù)/細(xì)胞(VCN)(Y右軸，點(diǎn))。與對照細(xì)胞(η=5)相比，GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的n.d.(η=4)和GLDhHSPC(η=4)在集落形成中出現(xiàn)顯著損害,這在下面的mirl42TGALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)(η=4)中未觀察到。當(dāng)與GFP/ARSA/GALCmirl42T.LV對照相比時(shí)，由GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的hHSPC獲得的集落具有顯著較低的載體含量。*集落數(shù)/板和VCN兩者的單因素方差分析的P<0.001。給出了平均值土SD。(B)對轉(zhuǎn)導(dǎo)的hHSPC測定的GALC活性。在GLDhHSPC(η=3)中，GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)允許在n.d.水平上重建GALC活性，而n.d.hHSPC的轉(zhuǎn)導(dǎo)(CB的η=4，BM的η=3)導(dǎo)致酶超過GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)水平(η=3)的過量表達(dá)。在用mirl42調(diào)節(jié)的GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的hHSPC(mirl42T)(η=3)中未檢測到活性提高。圖12:在HSCT時(shí)twi小鼠的存活。(A)GFP.LV和GALC.LV的示意圖。(B)接受15HSCT的twi小鼠的平均存活期。與未治療對照(UT)(η=10)相比，移植有全BM(TBM)(η=12)或GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)+1+mHSPC和未轉(zhuǎn)導(dǎo)Scal-祖細(xì)胞(GFP.LV+l+Lin-&+l+Scal_，η=7)或GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)+1+mHSPC和GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)Scal-祖細(xì)胞(GFP.LV+l+Lin-&GFP.LV+1+Scal-，η=5)的twi小鼠，獲得較長的存活期。與TBM或+Ι+Lin-和Scal-移植小鼠相比，接受GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)-I-mHSPC和+Ι+Scal-祖細(xì)胞的小鼠(η=7)的生命期限顯著較長。相反，用GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的-I_Lin-&-I-Scal-(n=13)移植不會導(dǎo)致生命期限延長。對照組移植有GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)+l+HSPC(+l+Lin-)的小鼠(η=10);移植有GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)+Ι+Scal-祖細(xì)胞的小鼠(η=8)。*單因素方差分析檢驗(yàn)的P<O.01。(C)表示移植有GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的+Ι+mHSPC和Scal-祖細(xì)胞的twi小鼠的外周血中GFP+植入細(xì)胞百分比的代表圖。圖13FVB/twi小鼠中mHSPC的體內(nèi)功能受損。按規(guī)定接受mHSPC移植的小鼠的平均存活期。與未治療對照(UT)相比，移植有GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的+/+mHSPC的-/-小鼠(η=11)獲得較長的存活期；相反，在致死照射后，移植有GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的-/-mHSPC的-/-(η=9)和+/_(°)(η=5)的小鼠無法存活。表2:移植后20天和120天(η=3/時(shí)間點(diǎn))移植有所列出的mHSPC(用GALC.LV或GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo))的-/-或+/-小鼠BM中檢測的平均VCNSD0(。)+/_宿主.(§)使用+/+mHSPC得到類似結(jié)果。圖14:表達(dá)GALC的鼠和人HSPC的細(xì)胞凋亡。(A-B)在基因轉(zhuǎn)移后2天和5天，對-/-mHSPC(左)和hHSPC(右)(來源于n.d.CB和GLDBM)進(jìn)行的TUNEL測定。報(bào)導(dǎo)了相對于有核細(xì)胞總數(shù)的％TUNEL+核。8個(gè)視野和100個(gè)細(xì)胞為統(tǒng)計(jì)條件。使用+/+mHSPC得到類似結(jié)果。(A)在轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天和5天，大部分GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC和hHSPC均為TUNEL陽性。⑶在用指定LV轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天和(mHSPC)天，對mHSPC和hHSPC的核進(jìn)行TUNEL測定(紅色)和ToProCTPIII，藍(lán)色)染色代表性照片(通過三激光共焦顯微鏡-Radiance2100，BioRad獲得照片；從單一光學(xué)切片序貫獲得熒光信號，并通過AdobePhotoshopCS軟件分析；放大倍數(shù)IOOx)。(C)對mHSPC(上圖)(來自-/-供體小鼠)和hHSPC(下圖)(來自n.d.CB)進(jìn)行的膜聯(lián)蛋白V染色的細(xì)胞突光測定分析(Cytofluorimetricanalysis)。與GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)對照相比，在GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC和hHSPC中凋亡細(xì)胞的部分較高。CMT=喜樹堿(Camptotecin)治療的陽性對照。用FACSCalibur2,BecktonDickinson進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。對至少10，000個(gè)事件進(jìn)行了評分，數(shù)據(jù)用Flowjo8.5.3軟件進(jìn)行處理。給出了得自-/-mHSPC和n.d.CB(且GLDBM用于TUNEL)的數(shù)據(jù)，但是與-/-細(xì)胞相比，在+/+mHSPC的GALC轉(zhuǎn)導(dǎo)后得到類似研究結(jié)果，以及在n.d.BM(TUNEL和膜聯(lián)蛋白V)和在GLDBM(膜聯(lián)蛋白V)hHSPC中與CB細(xì)胞相比，得到類似的研究結(jié)果。圖15=IGFl處理防止表達(dá)GALC的HSPC凋亡。(A)對用或未用IGFI處理的GALC.LV和ARSA.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC進(jìn)行的CFC測定。對集落數(shù)(#)/板(Y左軸，柱)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，測定了整合的慢病毒載體拷貝數(shù)/細(xì)胞(VCN)(Y右軸，點(diǎn))。與GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的未處理細(xì)胞(η=4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))相比，IGFI處理誘導(dǎo)較高集落數(shù)的生長。在抗凋亡處理時(shí)，GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的VCN接近ARSA.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)對照細(xì)胞的VCN(對于CFC數(shù)和VCN單因素方差分析*=P<0.001，關(guān)于處理的GALC轉(zhuǎn)導(dǎo)mHSPC與未處理GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的比較；p>0.05，關(guān)于處理的GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)mHSPC與ARSA.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的比較)。(B)自處理的mHSPC生長的集落還顯示出大小增大(右照片，放大倍數(shù)5x)。(C)對用或未用IGFl處理的GALC.LV和ARSA.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC的TUNEL測定。8個(gè)視野和100個(gè)細(xì)胞為統(tǒng)計(jì)條件。大多數(shù)處理細(xì)胞為TUNEL陰性(單因素方差分析p<O.001，與未處理GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比；p>O.05，與ARSA.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比)。(D)對來自-/-或+/+小鼠的轉(zhuǎn)導(dǎo)mHSPC所測得的GALC活性。當(dāng)與轉(zhuǎn)導(dǎo)的未處理對照(η=6)相比時(shí)，IGFl處理不顯著影響GALC表達(dá)水平(η=3)。給出了平均值SD。圖16:轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中組織蛋白酶D活化的分析。如所表明的，在基因轉(zhuǎn)移后以不同間隔，對GFP.LV或GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC和U937細(xì)胞的組織蛋白酶D的蛋白質(zhì)印跡分析。活化形式相當(dāng)于30kDa膜結(jié)合的同種型，用箭頭表示。與GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，在基因轉(zhuǎn)移后的GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中，未觀察到組織蛋白酶D的活性形式明顯蓄積。在培養(yǎng)7天(GFP7d)后，前體(48kDa，箭頭)在GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中蓄積，而其蓄積在GALC(GALC5d)存在下較不明顯，7天后前體和成熟形式兩者最終消失?？辜拥鞍子米鞯鞍踪|(zhì)加樣的對照。圖17:不同細(xì)胞類型的基礎(chǔ)GALC活性。歸一化至野生型mHSPC水平的基礎(chǔ)GALC活性。與mHSPC相比，初生野生型少突膠質(zhì)細(xì)胞(η=4)和小膠質(zhì)細(xì)胞(η=4)兩者均具有較高的GALC活性。圖18:在髓樣細(xì)胞中對GALC從頭表達(dá)的敏感性。轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天，TUNEL測定(相對于總有核細(xì)胞的％TUNEL+細(xì)胞，位于Y左軸，柱)、GALC活性測定(位于Y右軸，點(diǎn))、可能時(shí)對(A)人單核細(xì)胞，(B)單核細(xì)胞人細(xì)胞系U，(C)鼠巨噬細(xì)胞和D)鼠小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行的專用染色的結(jié)果。在全部測定條件下，TUNEL染色表明發(fā)生較少細(xì)胞凋亡/不發(fā)生細(xì)胞凋亡(每種條件下統(tǒng)計(jì)>6個(gè)視野和>250個(gè)細(xì)胞)，盡管高效轉(zhuǎn)導(dǎo)(在(C)中通過對巨噬細(xì)胞的抗HA染色評價(jià))，并且在所有其它樣品(ARSA.LV-或GFP.LV-轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞)中達(dá)到高于基礎(chǔ)水平的持續(xù)GALC表達(dá)。給出了平均值土SD。(C和D)對GALC/GALC-HA.LV或GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞(C)和小膠質(zhì)細(xì)胞⑶進(jìn)行TUNEL測定的代表性照片。通過三激光共焦顯微鏡(Radiance2100,BioRad)獲得照片。序貫獲取單一光學(xué)切片的熒光信號，并通過AdobePhotoshopCS軟件分析。放大倍數(shù)C中80x,D中IOOx0圖19:淋巴細(xì)胞中對GALC從頭表達(dá)的敏感性。轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天，對T和B淋巴細(xì)胞進(jìn)行的TUNEL測定(相對于總有核細(xì)胞的％TUNEL+細(xì)胞，位于Y左軸，柱)、GALC活性測定(位于Y右軸，點(diǎn))的結(jié)果。TUNEL染色表明發(fā)生較少細(xì)胞凋亡/不發(fā)生細(xì)胞凋亡(每種條件統(tǒng)計(jì)>6個(gè)視野和>250個(gè)細(xì)胞)，盡管高效轉(zhuǎn)導(dǎo)(見高于基礎(chǔ)水平的持續(xù)GALC表達(dá))。給出了平均值土SD。圖20:少突膠質(zhì)細(xì)胞中對GALC從頭表達(dá)的敏感性。㈧轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天進(jìn)行的TUNEL測定(相對于總有核細(xì)胞的％TUNEL+細(xì)胞，位于Y左軸，柱)、GALC活性測定(位于Y右軸，點(diǎn))。TUNEL染色表明發(fā)生較少細(xì)胞凋亡/不發(fā)生細(xì)胞凋亡(每種條件統(tǒng)計(jì)>6個(gè)視野和>250個(gè)細(xì)胞)，盡管高效轉(zhuǎn)導(dǎo)(見高于基礎(chǔ)水平的持續(xù)GALC表達(dá))。給出了平均值土SD。(B)GALC.LV或GFP.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞的TUNEL測定的代表性照片。通過對非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(UT)的NG2和Gal-Cer染色來證實(shí)少突膠質(zhì)細(xì)胞制備物的純度，同時(shí)針對GALC.LV-轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞用F4/80對小膠質(zhì)細(xì)胞染色；使用T0Pr0(TPIII)對核染色。通過三激光共焦顯微鏡(Radiance2100，BioRad)獲得照片。序貫獲取單一光學(xué)切片的熒光信號，并通過AdobePhotoshopCS軟件分析。放大倍數(shù)40x。圖21:通過miRNA126對GALC表達(dá)的調(diào)節(jié)。⑷GALC.miRNA126Tag.LV的示意圖。(B-C)對用GALC.miRNA126Tag.LV(GALC.126miT)或用GALC.LV或GFP.miRNA126Tag.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的-I-mHSPC進(jìn)行的GALC活性測定和CFC測定。(B)根據(jù)+1+水平(第一欄)使活性歸一化。用GALC.miRNA126Tag.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞以超生理水平過量表達(dá)GALC。(C)統(tǒng)計(jì)集落數(shù)(#)/板(Y左軸，柱)，并測定整合的慢病毒載體拷貝數(shù)/細(xì)胞(VCN)(Y右軸，點(diǎn))。與GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，通過miRNA126阻抑GALC表達(dá)允許較高集落數(shù)的生長(η=4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。*ρ<O.01,單因素方差分析檢驗(yàn)。圖22=GALC表達(dá)的miRNA126調(diào)節(jié)阻止mHSPC凋亡。(A)對GALC.miRNA126Tag.LV或GALC.LV和GFP.miRNA126Tag.LV-轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC進(jìn)行的TUNEL測定。每種條件下統(tǒng)計(jì)彡8個(gè)視野和彡100個(gè)細(xì)胞。大多數(shù)GALC.miRNA126Tag.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞呈TUNIEL陰性。(B)轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天，對GALC.miRNA126Tag.LV或GALC.LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mHSPC-/-的核進(jìn)行的TUNEL測定(紅色)和ToProCTPIII，藍(lán)色)染色代表性照片(通過三激光共焦顯微鏡-Radiance2100，BioRad獲得照片；序貫獲取單一光學(xué)切片的突光信號，并通過AdobePhotoshopCS軟件分析；放大倍數(shù)40x)。圖23=HSPC中從頭GALC表達(dá)的毒性和通過miR-126調(diào)節(jié)拯救。使用指定LV(A)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲自Galc-/-(-/-)和野生型(+/+)小鼠的鼠HSPC和人HSPC，以及分別得自正常供體的臍血(CB)和骨髓(BM)。測定轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠(上圖)和人(下圖)HSPC的體外培養(yǎng)子代中的GALC活性⑶和載體拷貝數(shù)(VCN)(C)(-/-和+/+HSPC的匯總數(shù)據(jù)見上圖C)。(D)報(bào)導(dǎo)了在用指定LV轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)束時(shí)對鼠-/-(上圖)和人(下圖)HSPC進(jìn)行的集落形成試驗(yàn)(clonogenicassay,CFC)得到的集落數(shù)(#)。(E)用指定LV轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天,對鼠-/-HSPC(上圖)和來自正常供體的CB和BM的⑶34+細(xì)胞(下圖)進(jìn)行TUNEL測定。對轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的頻率進(jìn)行評價(jià)TUNEL+細(xì)胞)。每個(gè)點(diǎn)表示獨(dú)立的樣品(B-E)。在E中，每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)彡8個(gè)視野和彡100個(gè)細(xì)胞。*:p<0.05#p<0.01;#*p<0.001。(F)給出了對GFPLV轉(zhuǎn)導(dǎo)HSPC和GALCLV轉(zhuǎn)導(dǎo)HSPC的代表性TUNEL染色。放大倍數(shù)100X。圖24=HSC基因治療后GLD小鼠的生存期延長。將Galc-/-或+/+鼠HSPC用指定載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，并按照㈧的實(shí)驗(yàn)方案，靜脈內(nèi)移植到Trs小鼠中。給出轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的平均存活期土SD和平均植入(η=4-26/組)，測定為在120天或死亡時(shí)在移植小鼠的BM中檢測的％GFP+細(xì)胞或VCN(土SD)。(§)使用+/+mHSPC得到類似結(jié)果。第一行表示未治療GLD小鼠的存活期(*=未照射；n.a.=不適用)。(B)將人原始單核細(xì)胞、B和T淋巴細(xì)胞和鼠小膠質(zhì)細(xì)胞用指定載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。測定轉(zhuǎn)導(dǎo)后>5天培養(yǎng)細(xì)胞的GALC活性(用與未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞-UT的倍數(shù)表示)(中圖)，并且在轉(zhuǎn)導(dǎo)后2天進(jìn)行TUNEL測定(用％TUNEL+細(xì)胞表示)(右圖)。報(bào)道了得自GALC轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠和人HSPC的數(shù)據(jù)(來源于圖5)和GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中的％TUNEL+細(xì)胞用于比較。每個(gè)點(diǎn)表示單獨(dú)的樣品，其中對彡6個(gè)視野和彡250個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。(C)如所示用GALCLV或GFPLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的TUNEL染色以及針對小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記F4/80(GALC轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞)的染色或GFP的代表性照片。核用ToproIII(TPIII)標(biāo)記。放大倍數(shù)100X。(D)用經(jīng)GALC-126TLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的Galc-/-HSPC(n=26)或經(jīng)GFPLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的Galc+/+HSPC(η=10)移植的Trs小鼠和未治療患病對照(UT)(η=15)的Kaplan-Meier生存曲線。在成對比較的時(shí)序檢驗(yàn)(logranktest)中，GALC-126T對比GFPp=O.002；GALC-126對比UTp<O.0001。(E)根據(jù)在死亡時(shí)間對全BM細(xì)胞測定的VCN，將GALC-126T移植小鼠分為2組。給出了在BM細(xì)胞中攜帶小于(平均值土SD=67±13天)或大于(平均值土SD=117±43天)5個(gè)LV拷貝的動物的存活期，在整群治療小鼠的BM中測定的平均VCN為5。(F-I)對GALC-126T移植小鼠和對照小鼠腦切片的GALC活性(淺藍(lán)色)進(jìn)行了定性評價(jià)。給出了與野生型和未治療Trs小鼠相比較，GALC-126T移植小鼠海馬(F，G)和腦橋(H，I)的代表性切片。將GALC測定與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞Ibal標(biāo)記(F，G)和與造血標(biāo)記⑶45(H，I)聯(lián)合。在未治療和GALC-126T移植Trs小鼠中存在活化造血細(xì)胞的明顯浸潤，后者表示在轉(zhuǎn)導(dǎo)HSPC造血子代(G和I中的箭頭表示GALC[藍(lán)色]與棕色的Ibal[G]和CD45[I]共染色)內(nèi)和在Ibal_，CD45—非造血細(xì)胞兩者的GALC活性。(F，H)的放大倍數(shù)為20x,(G，I)的為40x。微小RNA(miRNA)遺傳信息自DNA流向mRNA再流向蛋白質(zhì)一直以來都是生物學(xué)的中心法則。換句話說，一直認(rèn)為基因編碼蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)所有細(xì)胞功能，包括基因表達(dá)程序的調(diào)節(jié)。然而，在高等真核生物中僅有少數(shù)RNA轉(zhuǎn)錄物(2-3%)編碼蛋白質(zhì)，這對蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的唯一效應(yīng)物的中心法則提出了異議(Mercer等，2009)。實(shí)際上，目前有不斷出現(xiàn)證據(jù)表明一類非編碼的小RNA(稱為“微小RNA”)在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。微小RNA(miRNA)是(Biffi等，2004；SadelainM.，2006；Sadelain等，2005；Gaziev等，2005；YesilipekMA.，2006;Abonour等，2000)的核苷酸長的非編碼RNA，它通過引發(fā)稱為RNA干擾(RNAi，見下文)的過程而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)(BartelDP.，2004)。最早在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)發(fā)現(xiàn)了lin_4和let_7形式的微小RNA,研究表明它們調(diào)節(jié)幼蟲發(fā)育的時(shí)機(jī)(Lee等，1993;Reinhart等,2000)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了對高等真核生物中控制基因表達(dá)的類似非編碼RNA的尋找。所有生物均表達(dá)miRNA(其中許多是種間系統(tǒng)發(fā)育上保守的)的發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是生物學(xué)領(lǐng)域的革命。根據(jù)參比微小RNA數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/),在編寫本發(fā)明時(shí)，已在人中鑒定出695種不同miRNA。微小RNA參與幾乎所有生物學(xué)過程，包括發(fā)育、分化、增殖和細(xì)胞凋亡(Xiao和RajeWsky，2009)。它們還在諸如癌癥、心力衰竭和代謝紊亂等疾病中起重要作用(Xiao等，2009；Divaka等，2008；Krutzfeldt等，2006)。微小RNA基因分散在除Y染色體以外的所有人染色體中。它們位于基因組的非編碼區(qū)或蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子內(nèi)。大約50%的miRNA以轉(zhuǎn)錄為多順反子初級轉(zhuǎn)錄物的聚簇出現(xiàn)(Lagos-Quintana等,2003)。與蛋白質(zhì)編碼基因類似，miRNA通常從聚合酶-II啟動子轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生所謂的初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)。這種pri_miRNA然后通過一系列的內(nèi)核分離(endonucleolyticcleavage)步驟加工,該步驟由屬于RNA酶III型家族的兩種酶Drosha和切酶(Dicer)進(jìn)行。自pri-miRNA,長約60個(gè)核昔酸的莖環(huán)(^ISmirna前體(pre-mirna)),被由Drosha和DiGeorge綜合征臨界區(qū)基因(DGCR8)組成的特異性核復(fù)合體切離，所述核復(fù)合體在原始莖環(huán)堿基附近剪切兩條鏈，留下5’磷酸和2bp長的3’突出端。然后，通過RAN-GTP和核輸出蛋白將pre-mirna從核主動運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)(Yi等，2003；Lund等，2004)。然后，切酶在不受Drosha切割限定的莖環(huán)末端實(shí)施雙鏈切割，產(chǎn)生由成熟miRNA和雙鏈體的相反鏈組成的19-24bp雙鏈體，稱為miRNA*(BartelDP.，2004)。與熱動力學(xué)不對稱規(guī)則一致，僅雙鏈體的一條鏈選擇性加載到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)上，并作為成熟微小RNA蓄積。該鏈通常是其5’端與其互補(bǔ)鏈較不緊密配對的鏈，正如通過引入siRNA雙鏈體各鏈5’端的單一核苷酸錯(cuò)配所證實(shí)的一樣(Tomari等，2005)。然而，有一些支持雙鏈體兩條鏈以相似程度蓄積的miRNA(Schwarz等，2003)。微小RNA引發(fā)RNAi，與廣泛用于實(shí)驗(yàn)基因敲減的小干擾RNA(siRNA)非常相像。miRNA和siRNA間的主要差異是其生物發(fā)生。一旦加載到RISC上，小RNA分子的指導(dǎo)鏈與優(yōu)先存在于蛋白質(zhì)編碼基因3'非翻譯區(qū)(3'UTR)的mRNA靶序列相互作用。研究表明，從miRNA的5'端起計(jì)第2_8個(gè)核苷酸(所謂的種子序列)是引發(fā)RNAi所必需的(Brennecke等，2005)。如果整個(gè)指導(dǎo)鏈序列與mRNA靶完全互補(bǔ)，對于siRNA和植物miRNA通常正是這種情況，則mRNA通過小RNA雙鏈體的Argonaute(Ago)蛋白(也稱為“切片機(jī)(slicer)”)參與到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)中而被內(nèi)核分離。DGRC(DiGeorge綜合征臨界區(qū)基因8)和TRBP(TAR(HIV)RNA結(jié)合蛋白2)是分別通過Drosha和切酶RNA酶III酶促進(jìn)成熟miRNA生物發(fā)生的雙鏈RNA結(jié)合蛋白。miRNA雙鏈體的指導(dǎo)鏈摻入到通過不完全堿基配對識別特異性靶標(biāo)和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的效應(yīng)物復(fù)合體RISC中。對這種調(diào)節(jié)方式提出了若干機(jī)制miRNA可誘導(dǎo)翻譯起始的阻抑、通過脫腺苷化標(biāo)志靶標(biāo)mRNA用于降解或?qū)袠?biāo)隔離在胞質(zhì)P體(P-body)中。另一方面，如果僅種子序列與靶標(biāo)mRNA完全互補(bǔ)但保留具有不完全配對的堿基，則RNAi通過導(dǎo)致翻譯阻抑的多種機(jī)制起作用(BartelDP.，2004；PillaiRS.，2005；BartelDP.，2009)。真核mRNA降解主要通過如下過程產(chǎn)生縮短mRNA3’端的聚A尾，5’端脫帽(de-capping)，接著5’_3’外切核酸酶消化，且miRNA在富集mRNA衰變途徑的組分的分散胞質(zhì)區(qū)域(所謂的P體)中蓄積(Lui等，2005)?？捎糜诒景l(fā)明的miRNA是在造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞中表達(dá)但不在分化細(xì)胞中廣泛表達(dá)的miRNA。優(yōu)選的實(shí)例包括mir-130a、mir-126和mir-223。其它合適的微小RNA包括在胚胎干細(xì)胞和所謂的iPS細(xì)胞中表達(dá)的微小RNA。例如miR-302a、miR-373和miR-292在多潛能細(xì)胞(ES，iPS)中特異性表達(dá)，但不在成體類型干細(xì)胞或分化細(xì)胞中表達(dá)。let-7家族微小RNA在除多潛能細(xì)胞(ES，iPS)以外的所有細(xì)胞中表達(dá)。miR-124a在神經(jīng)元中特異性表達(dá)?；蜉d體MiRNA可與合適的基因載體，即適于遞送目標(biāo)基因(轉(zhuǎn)基因)的載體(例如病毒載體)一起使用。適于基因治療的病毒載體是本領(lǐng)域眾所周知的?？捎糜诒景l(fā)明的病毒載體的實(shí)例參見W02007/000668。已對來源于若干不同科的病毒進(jìn)行修飾以產(chǎn)生用于基因遞送的病毒載體?？捎糜诒景l(fā)明的病毒包括反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、單純皰疫病毒、小RNA病毒和甲病毒。本發(fā)明優(yōu)選使用反轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒。本發(fā)明可用于控制載體中所包括的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。本發(fā)明還可用于控制載體的表達(dá)。例如，可被本發(fā)明的mir-RNA控制的載體為溶瘤病毒。造血干細(xì)胞移棺造血干細(xì)胞移植(HSCT)是來源于骨髓(在這種情況下稱為骨髓移植)或血液的血液干細(xì)胞的移植。干細(xì)胞移植是血液學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域的醫(yī)學(xué)手術(shù)，最常為患有血液、骨髓疾病或某些癌癥類型的人實(shí)施。由于干細(xì)胞生長因子GM-CSF和G-CSF的可得性，大多數(shù)造血干細(xì)胞移植手術(shù)目前使用自外周血而不是自骨髓采集的干細(xì)胞進(jìn)行。采集外周血干細(xì)胞提供較大的移植物，不需要給供體進(jìn)行全身麻醉來采集移植物，導(dǎo)致較短的植入時(shí)間，并可得到較低的長期復(fù)發(fā)率。造血干細(xì)胞移植仍然是一種具有許多可能的并發(fā)癥的危險(xiǎn)手術(shù)；其在傳統(tǒng)上為患有危及生命的疾病的患者而保留。雖然不時(shí)在實(shí)驗(yàn)上用于非惡性和非血液適應(yīng)癥，例如嚴(yán)重致殘的自身免疫病和心血管病，但致命并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)似乎太高以至于得不到更廣泛的認(rèn)可。許多HSCT的接受者是不能受益于用化學(xué)治療的長期治療或已對化學(xué)治療有抗性的多發(fā)性骨髓瘤或白血病患者。HSCT的候選人包括其中患者患有先天缺陷(例如重度聯(lián)合免疫缺陷或伴有缺陷型干細(xì)胞的先天性中性粒細(xì)胞減少癥)的兒科病例，以及患有再生障礙性貧血的兒童或成人(他們在出生后喪失干細(xì)胞)。用干細(xì)胞移植治療的其它病況包括鐮狀細(xì)胞病、骨髓增生異常綜合征、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、淋巴瘤、尤因肉瘤(Ewing'sSarcoma)、結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤和霍奇金病(Hodgkin'sdisease)。最近已開發(fā)出需要較少劑量的預(yù)備性化療和放射治療的非清髓性即所謂的“微移植”手術(shù)。這允許HSCT在老年人和另外被認(rèn)為太虛弱而承受不了常規(guī)治療方案的其它患者中進(jìn)行。本發(fā)明的目的在于通過提高其安全性和/或功效而拓寬這類治療的治療應(yīng)用。疾疽本發(fā)明特別可用于基因治療。具體地講是涉及可能有毒的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的治療。可根據(jù)本發(fā)明治療的疾病包括溶酶體貯積癥(LSD)，例如球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(GLD)。通過本發(fā)明可治療的疾病的另一個(gè)實(shí)例是慢性肉芽腫病(CGD)。球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(GLD)或克拉伯病是由GALC基因的突變引起的，其引起稱為半乳糖神經(jīng)酰胺酶的酶缺乏。未代謝的脂質(zhì)的積累影響神經(jīng)的保護(hù)性髓鞘(隔離許多神經(jīng)的覆蓋物)的生長，并引起運(yùn)動技能嚴(yán)重退化。作為一組稱為腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的病癥的部分，克拉伯病由髓鞘的不完全生長和發(fā)育引起。GLD的基因治療包括將GALC基因引入患者中。例如，可將GALC導(dǎo)入HSPC或HSC中，然后將之移植入患者中。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在LV介導(dǎo)的GALC基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)后，鼠和人HSPC的毒性及體內(nèi)、外功能受損。這種毒性可通過使用本發(fā)明的基因載體來克服。通過本發(fā)明的載體系統(tǒng)遞送的一種或多種治療基因可單獨(dú)使用或與其它治療或治療的組成部分聯(lián)用。例如，本發(fā)明的載體可用來遞送一種或多種用于治療W0-A-98/05635中所列病癥的轉(zhuǎn)基因。為了容易查閱，下面提供該疾病列表的部分癌癥、炎癥或炎性疾病、皮膚病癥、發(fā)熱、心血管作用(cardiovasculareffects)、出血、凝血和急性期反應(yīng)、惡病質(zhì)、食欲缺乏、急性感染、HIV感染、休克狀態(tài)、移植物抗宿主反應(yīng)、自身免疫病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛和阿司匹林依賴性抗血栓形成；腫瘤生長、侵襲和擴(kuò)散、血管生成、轉(zhuǎn)移瘤、惡性腫瘤、腹水和惡性胸腔積液；腦缺血、缺血性心臟病、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、哮喘、多發(fā)性硬化、神經(jīng)變性、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)、動脈粥樣硬化、中風(fēng)、脈管炎、克羅恩病(Crohn'sdisease)和潰瘍性結(jié)腸炎；牙周炎、銀炎；銀屑病、特應(yīng)性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮松解；角膜潰瘍、視網(wǎng)膜病和手術(shù)傷口愈合；鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、濕疹、過敏反應(yīng)；再狹窄、充血性心力衰竭、子宮內(nèi)膜異位癥、動脈粥樣硬化或內(nèi)皮硬化(endosclerosis)。另外，或在備選方法中，本發(fā)明的載體可用來遞送一種或多種用于治療W0-A-98/07859中所列病癥的轉(zhuǎn)基因。為了容易查閱，下面提供該列表的部分細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治療免疫缺陷，包括被人免疫缺陷病毒感染；調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞生長；治療癌癥和許多自身免疫病，并防止移植排斥或誘導(dǎo)腫瘤免疫力)；調(diào)節(jié)造血作用，例如治療骨髓病或淋巴??；促進(jìn)骨、軟骨、腱、韌帶和神經(jīng)組織的生長，例如用于傷口愈合、治療燒傷、潰瘍和牙周病和神經(jīng)變性；抑制或激活促卵泡激素(調(diào)節(jié)生育力)；趨化/趨化因子活性(例如用于將特定細(xì)胞類型動員到損傷或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治療血友病和中風(fēng))；抗炎活性(用于治療例如敗血癥性休克或克羅恩病)；作為抗微生物藥；例如代謝或行為(behaviour)的調(diào)節(jié)劑；鎮(zhèn)痛藥；治療特定營養(yǎng)缺乏癥；用于治療例如銀屑病、用于人用或獸用藥物。另外，或在備選方法中，本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于遞送一種或多種用于治療TO-A-98/09985中所列病癥的轉(zhuǎn)基因。為了容易查閱，下面提供該列表的部分巨噬細(xì)胞抑制和/或T細(xì)胞抑制活性及因而的抗炎活性；抗免疫活性，即針對細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答(包括與炎癥無關(guān)的反應(yīng))的抑制作用；抑制巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞粘附胞外基質(zhì)組分和纖連蛋白的能力，以及增量調(diào)節(jié)fas受體在T細(xì)胞中的表達(dá)；抑制不良免疫反應(yīng)和炎癥，包括關(guān)節(jié)炎，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、超敏反應(yīng)相關(guān)炎癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膠原病和其它自身免疫病、動脈粥樣硬化相關(guān)炎癥、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心臟停搏、心肌梗死、血管炎性疾病、呼吸窘迫綜合征或其它心肺病、與消化性潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎和胃腸道的其它疾病相關(guān)的炎癥、肝纖維化、肝硬化或其它肝病、甲狀腺炎或其它腺病、腎小球性腎炎或其它腎病和泌尿科疾病、耳炎或其它耳鼻喉病、皮炎或其它皮膚病、牙周病或其它牙病、睪丸炎或附睪-睪丸炎、不育癥、睪丸創(chuàng)傷或其它免疫相關(guān)的睪丸疾病、胎盤功能障礙、胎盤功能不全、習(xí)慣性流產(chǎn)、子癇、先兆子癇和其它免疫和/或炎癥相關(guān)性婦科疾病、后葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、前葡萄膜炎、結(jié)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)炎、眼內(nèi)炎癥例如視網(wǎng)膜炎或囊樣黃斑水腫、交感性眼炎、鞏膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎、退行性眼底病變(degenerativefondusdisease)的免疫和炎性成分、眼外傷的炎性成分、由感染引起的眼炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病、急性缺血性視神經(jīng)病變、例如青光眼濾過手術(shù)后的過度瘢痕形成、對眼植入物的免疫和/或炎癥反應(yīng)及其它免疫和炎癥相關(guān)性眼科疾病、其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或任何其它器官兩者中免疫和/或炎癥抑制可能有益的與自身免疫病或病況或病癥有關(guān)的炎癥、帕金森病(Parkinson'sdisease)、因帕金森病治療引起的并發(fā)癥和/或副作用、艾滋病相關(guān)癡呆綜合癥、HIV相關(guān)腦病、德維克病、小舞蹈病、阿爾茨海默病和CNS的其它變性疾病、病況或病癥、中風(fēng)的炎性成分、脊髓灰質(zhì)炎后綜合征、精神障礙的免疫和炎性成分、脊髓炎、腦炎、亞急性致硬化性全腦炎、腦脊髓炎、急性神經(jīng)病、亞急性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病、格-巴綜合征(Guillaim-Barresyndrome)、小舞蹈病、重癥肌無力、假腦瘤、唐氏綜合征、亨廷頓舞蹈病(Huntington'sdisease)、肌萎縮性側(cè)索硬化、CNS壓迫或CNS創(chuàng)傷或CNS感染的炎性成分、肌萎縮和營養(yǎng)不良的炎性成分、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的免疫和炎癥相關(guān)疾病、病況或病癥、創(chuàng)傷后炎癥、敗血癥性休克、感染性疾病、手術(shù)的炎癥并發(fā)癥或副作用、骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和/或副作用、基因治療的炎癥和/或免疫并發(fā)癥和副作用(例如因病毒載體感染所致)或愛滋病相關(guān)炎癥、用于阻抑或抑制體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答、通過減少單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的量治療或改善單核細(xì)胞或白細(xì)胞增殖性疾病(例如白血病)、在移植天然或人工細(xì)胞、組織和器官(例如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起博器、天然或人工皮膚組織)的情況下用于預(yù)防和/或治療移植排斥。本發(fā)明還提供通過基因治療治療個(gè)體的藥物組合物，其中組合物包含治療有效量的本發(fā)明的載體或由所述載體產(chǎn)生或得到的病毒顆粒，所述載體包含一種或多種可遞送治療性和/或診斷性轉(zhuǎn)基因。藥物組合物可用于人或動物。醫(yī)師通?？纱_定最適于個(gè)體受試者的實(shí)際劑量，該劑量將隨具體個(gè)體的年齡、體重和反應(yīng)而變化。組合物可任選包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔料?？筛鶕?jù)預(yù)定的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐進(jìn)行藥用載體、賦形劑或稀釋劑的選擇。藥物組合物可包含以下作用劑作為載體、賦形劑或稀釋劑或者除載體、賦形劑或稀釋劑以外還包含以下作用劑任何合適的粘合劑、潤滑劑、助懸劑、包衣劑、增溶劑和可有助于或增加病毒進(jìn)入靶位點(diǎn)的其它載體物質(zhì)(例如脂質(zhì)遞送系統(tǒng))。適當(dāng)時(shí)，可通過以下的任一種或多種給予藥物組合物吸入、呈栓劑或陰道劑的形式；局部施用，呈洗劑、溶液劑、乳膏劑、軟膏劑或撲粉劑形式；通過使用皮膚貼劑；口服，含有諸如淀粉或乳糖等賦形劑的片劑形式、或呈單獨(dú)或與賦形劑混合的膠囊劑或丸劑(ovule);或含有矯味劑或著色劑的酏劑、溶液劑或混懸劑的形式；或它們可經(jīng)諸如海綿體內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下等胃腸外注射。對于胃腸外給予，組合物可能最好以含有其它物質(zhì)的無菌水溶液的形式使用，所述其它物質(zhì)為例如足夠的鹽或單糖使所述溶液與血液等滲。對于口腔或舌下給予，組合物可以可按常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式給予。通過本發(fā)明的載體系統(tǒng)對一種或多種治療基因的遞送可單獨(dú)使用或與其它治療或治療的組成部分聯(lián)用。可治療的疾病包括但不限于癌癥、神經(jīng)疾病、遺傳疾病、心臟病、中風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、病毒感染和免疫系統(tǒng)疾病。合適的治療基因包括編碼腫瘤阻抑蛋白、酶、前藥激活酶、免疫調(diào)節(jié)分子、抗體、工程改造的免疫球蛋白樣分子、融合蛋白、激素、膜蛋白、血管活性蛋白或肽、細(xì)胞因子、趨化因子、抗病毒蛋白、反義RNA和核酶的基因。實(shí)施例核苷酸序列黑體字與miRNA互補(bǔ)的靶序列。總體來說，我們使用被4_6個(gè)核苷酸的接頭分隔開的4拷貝的miRNA靶標(biāo)。然而，可使之最優(yōu)化。miR-126UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGmiR_126T序列權(quán)利要求1.一種用于基因治療的基因載體，所述基因載體包含至少一個(gè)在造血祖細(xì)胞(HSPC)中具有相應(yīng)miRNA的與核苷酸序列有效連接的miRNA序列靶標(biāo)，所述相應(yīng)miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSPC中表達(dá)但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。2.一種用于基因治療的基因載體，所述基因載體包含至少一個(gè)在造血干細(xì)胞(HSC)中具有相應(yīng)miRNA的與核苷酸序列有效連接的miRNA序列靶標(biāo)，所述相應(yīng)miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSC中表達(dá)但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。3.一種用于基因治療的基因載體，所述基因載體包含至少一個(gè)與核苷酸序列有效連接的與選自mir-130a、mir-126、mir-223、126/130aT(2/2組合)和126T(2個(gè)靶標(biāo))的miRNA相應(yīng)的miRNA序列靶標(biāo)。4.權(quán)利要求3的基因載體，其包含與mir-130a和mir_126相應(yīng)的miRNA序列靶標(biāo)。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的基因載體，其中所述核苷酸序列控制載體的表達(dá)。6.權(quán)利要求1-5的基因載體，其中所述核苷酸序列是轉(zhuǎn)基因。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的基因載體，其中所述載體是病毒載體。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的基因載體，其中所述載體可來源于慢病毒。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的基因載體，其中所述載體包含組織特異性啟動子。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的基因載體，其中所述組織特異性啟動子選自CDllb、c-Fes和CYBB和TEK。11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的基因載體，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼酶。12.權(quán)利要求11的基因載體,其中所述酶選自溶酶體酶半乳糖腦苷脂酶、gp91phox和干擾素-α。13.—組用于產(chǎn)生病毒載體顆粒的DNA構(gòu)建體，包括編碼可包裝的病毒載體基因組的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)定義的miRNA序列靶標(biāo)，并任選包含轉(zhuǎn)基因。14.一種用于制備病毒載體顆粒的方法，所述方法包括將權(quán)利要求13的DNA構(gòu)建體組導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并得到病毒載體顆粒。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述宿主細(xì)胞包含相應(yīng)的miRNA。16.一種病毒載體顆粒，其通過權(quán)利要求14或15的方法制備。17.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-12或16中任一項(xiàng)的基因載體或顆粒。18.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞用權(quán)利要求1-12或16中任一項(xiàng)的基因載體或顆粒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。19.權(quán)利要求18的細(xì)胞，所述細(xì)胞是造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞。20.至少兩個(gè)不同的與選自以下的miRNA相應(yīng)的miRNA序列祀標(biāo)的組合mir_130a、mir-126、mir-223和126/130aT(2/2組合)和126T(2個(gè)靶標(biāo))。21.權(quán)利要求20的組合，其中所述miRNA序列靶標(biāo)同時(shí)、單獨(dú)或序貫使用。22.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合在制備用于在造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞中防止或降低轉(zhuǎn)基因表達(dá)的藥物中的用途。23.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合在制備用于治療選自以下的疾病的藥物中的用途球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、慢性肉芽腫病、重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)和實(shí)體瘤。24.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合在制備用于提高與基因治療相關(guān)的造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的存活機(jī)會的藥物中的用途。25.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合在制備用于提高基因治療的安全性和/或功效的藥物中的用途。26.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合在制備用于防止造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的藥物中的用途，其中所述細(xì)胞凋亡由轉(zhuǎn)基因的表達(dá)引起。27.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合在制備用于監(jiān)測造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段的藥物中的用途。28.權(quán)利要求22-27中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物用于造血細(xì)胞治療。29.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合，其用于防止或降低轉(zhuǎn)基因在造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞中表達(dá)。30.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合，其用于治療選自以下的疾病球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、慢性肉芽腫病、重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)和實(shí)體瘤。31.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合，其用于提高與基因治療相關(guān)的造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的存活機(jī)會。32.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合，其用于提高基因治療的安全性和/或功效。33.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合，其用于防止造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，其中所述細(xì)胞凋亡由轉(zhuǎn)基因的表達(dá)引起。34.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的基因載體、權(quán)利要求16的顆粒、權(quán)利要求17的藥物組合物、權(quán)利要求18-19的細(xì)胞或權(quán)利要求20-21的組合，其用于監(jiān)測造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段。35.權(quán)利要求29-34中任一項(xiàng)的基因載體，其用于造血干細(xì)胞治療。36.與選自mir-130a、mir-126、mir-223、126/130aT(2/2組合)和126T(2個(gè)靶標(biāo))的miRNA相應(yīng)的miRNA序列靶標(biāo)在制備用于基因治療的藥物中的用途。37.用于基因治療的與選自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA相應(yīng)的miRNA序列靶標(biāo)。38.測定造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段的方法，所述方法包括測定細(xì)胞中的miRNA的表達(dá)水平，其中所述miRNA對應(yīng)于與核苷酸序列有效連接的miRNA靶序列，其中所述miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖細(xì)胞(HSPC)或造血干細(xì)胞(HSC)中表達(dá)，但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。39.測定造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段的方法，所述方法包括測定細(xì)胞中的至少兩種不同miRNA的表達(dá)水平，其中所述miRNA對應(yīng)于與核苷酸序列有效連接的miRNA靶序列，其中所述miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖細(xì)胞(HSPC)或造血干細(xì)胞(HSC)中表達(dá)，但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)；和對不同miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較。40.測定造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的分化階段的方法，所述方法包括測定轉(zhuǎn)基因在所述造血干細(xì)胞或所述造血祖細(xì)胞中的表達(dá)水平，其中所述轉(zhuǎn)基因與miRNA序列靶標(biāo)有效連接，由此相應(yīng)的miRNA防止或降低所述轉(zhuǎn)基因在造血祖細(xì)胞(HSPC)或造血干細(xì)胞(HSC)中的表達(dá)，但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。41.權(quán)利要求38-40的方法，其中所述miRNA選自mir_130a、mir-126,mir-223,126/130aT(2/2組合)和126T(2個(gè)靶標(biāo))。全文摘要一種用于基因治療的基因載體，所述基因載體包含至少一個(gè)在造血祖細(xì)胞(HSPC)或造血干細(xì)胞(HSC)中具有相應(yīng)miRNA的與核苷酸序列有效連接的miRNA序列靶標(biāo)，所述相應(yīng)miRNA防止或降低該核苷酸序列在HSPC或HSC中表達(dá)，但不防止或降低其在分化細(xì)胞中表達(dá)。文檔編號A61P35/00GK102596255SQ201080030337公開日2012年7月18日申請日期2010年4月30日優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日發(fā)明者A·比菲,B·R·金特納,L·納爾迪尼申請人:圣拉斐爾德爾蒙特塔博基金中心,泰萊托恩基金會