專利名稱：治療衰老相關(guān)疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)細(xì)胞壽命的方法以及涉及用于治療衰老相關(guān)疾病的方法和藥物。
背景技術(shù)：
酵母是一種非常好的模式系統(tǒng)，其中可以研究衰老及其調(diào)控途徑，與人類非常相
關(guān)1O衰老有兩種類型。一種稱為復(fù)制衰老并被定義為細(xì)胞能夠分裂的次數(shù)。每種細(xì)胞類型都具有特征性復(fù)制壽命(RLQ，其可以通過如卡路里限制(caloric restriction, CR, 一種熟知的延長(zhǎng)在從酵母到小鼠大范圍內(nèi)的生物體中的壽命的方法))等介入來延長(zhǎng)。復(fù)制衰老是干細(xì)胞壽命中的一個(gè)重要特征。另一種類型的衰老是世代衰老，世代衰老被定義為在細(xì)胞停止分裂后其保持代謝活性或和生存力的時(shí)間長(zhǎng)度。成熟哺乳動(dòng)物中的很多細(xì)胞已經(jīng)停止分裂并且它們的CLS是衰老的一個(gè)重要特征。和復(fù)制衰老類似的是，世代衰老也受到卡路里限制的影響3’4。去乙酰化酶(sirtuin)如酵母中的Sir2保持細(xì)胞的RLS?？赡艽嬖趯?duì)具有株遺傳背景特異性的 CLS的較小影響。然而，Sir2在野生型背景中一般不直接調(diào)控CLS5’6。衰老、衰老相關(guān)疾病和細(xì)胞壽命調(diào)控之間的聯(lián)系突出了在包括代謝型疾病、糖尿病、炎性疾病、骨質(zhì)疏松癥、癌癥、心血管疾病等在內(nèi)的很多疾的治療處置中的細(xì)胞壽命的調(diào)節(jié)物的潛在作用。用于細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)利用度、各種生長(zhǎng)因子、脅迫和能量狀態(tài)的信號(hào)通過包括PI3-激酶Torl或Tor2在內(nèi)的復(fù)合物TORCl (雷帕霉素復(fù)合物的標(biāo)靶)9_11被集成并翻譯為細(xì)胞生長(zhǎng)。來自TORCl的信號(hào)通過包括激酶和轉(zhuǎn)錄因子Sch9、Snfl和Rtg2等在內(nèi)的底物介導(dǎo) 14O Snfl激酶的標(biāo)靶之一是Gcn5 (Kat2)，其是一種賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶，也是SAGA和SLIK 復(fù)合物兩者的組分15_18。SAGA和SLIK復(fù)合物調(diào)控多族基因響應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)。 Rtg2是TORCl的底物，線粒體反饋反應(yīng)的已知調(diào)節(jié)物19，與衰老關(guān)聯(lián)，并且是SLIK復(fù)合物的亞基19。SAGA和SLIK復(fù)合物兩者的另一個(gè)重要亞基是Spt7，Spt7在只有SLIK復(fù)合物的情況下由WdpS剪接17_2°。SAGA復(fù)合物的活性由SpW單獨(dú)控制15。已知由卡路里限制的備選方法導(dǎo)致的TORCl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下調(diào)通過基因表達(dá)的重大變化而提高酵母和其它生物體的壽命9’1(1。然而，這種調(diào)控的機(jī)制尚未知道并且目前還在研究當(dāng)中。在酵母中，S6激酶(Sch9)的突變導(dǎo)致世代壽命和復(fù)制壽命的延長(zhǎng)。當(dāng)敲除小鼠或C. elegans中的類似基因時(shí)，也觀察到壽命的延長(zhǎng)。在本發(fā)明中，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定到參與細(xì)胞壽命控制的另外因子，并且已經(jīng)證明這種因子對(duì)CLS和RLS均具有作用。本發(fā)明還鑒定到酵母中的Ydr026c對(duì)染色質(zhì)中的高級(jí)結(jié)構(gòu)的保持是必需的。這種高級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)牽涉到由于其在通過實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)控制基因表達(dá)中的作用而在衰老中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了藤霉素在制造用于治療衰老相關(guān)疾病的藥物中的用途。優(yōu)選的是，所述衰老相關(guān)疾病選自包括以下疾病的組代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂(如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機(jī)酸代謝紊亂 (有機(jī)酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)；嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征(Lesch-Nyhan syndrome))；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征(Kearns-Sayre syndrome))；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂(adipose disorder)，包括肥胖癥、脂肪相關(guān)代謝紊亂和肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于提高細(xì)胞的復(fù)制壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽或與SEQ ID No :1、3或 5具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物，或與SEQ ID No :1、3或5具有一個(gè)或若干個(gè)氨基酸增加、缺失或取代差異的多肽。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了提高細(xì)胞世代壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的基因的功能包含SEQ ID No :1或3的多肽或與SEQ ID No :1或3具有至少 70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物，或與SEQ ID No :1、 3或5具有一個(gè)或若干個(gè)氨基酸增加、缺失或取代差異的多肽。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了提高細(xì)胞的世代壽命和/或復(fù)制壽命的方法，所述方法包括使用藤霉素處理所述細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了用于在治療衰老相關(guān)疾病中使用的藤霉素。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的是，所述疾病與細(xì)胞的世代壽命和/或復(fù)制壽命相關(guān)。在另外的實(shí)施方式中，所述疾病選自包括以下疾病的組代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂(如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機(jī)酸代謝紊亂(有機(jī)酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)； 嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征)；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征)；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關(guān)代謝紊亂和肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于本發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)不表達(dá)多肽Ydr026c (SEQ ID NO :3)的酵母細(xì)胞具有明顯提高的世代壽命(與表達(dá)該多肽的細(xì)胞相比)。本發(fā)明還基于如下另一個(gè)發(fā)現(xiàn)不表達(dá)多肽Ydr026c (SEQ ID NO :3)的細(xì)胞也具有明顯提高的復(fù)制壽命(與表達(dá)該多肽的細(xì)胞相比)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚的是，術(shù)語“世代壽命”是指細(xì)胞保持代謝活性和生存力但不分裂的時(shí)間的長(zhǎng)度。還應(yīng)該清楚的是，術(shù)語“復(fù)制壽命”是指細(xì)胞能夠分裂的次數(shù)。因此，不難理解的是，提高涉及細(xì)胞保持生存力而沒有復(fù)制的時(shí)間的長(zhǎng)度的提高或者細(xì)胞變老前能夠復(fù)制的次數(shù)的提高。在此使用的基因名稱YDR026C和OBDl是同義詞并且可以互換。編碼該多肽的基因位于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)中的YDR(^6C基因座。在此使用的術(shù)語“衰老相關(guān)疾病”涉及在患者衰老中具有其病因?qū)W因子的任何疾病。應(yīng)當(dāng)理解的是，衰老可能是眾多因子中的一個(gè)因子，但是結(jié)合后導(dǎo)致疾病的發(fā)展。這些疾病的實(shí)例包括但不限于代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂 (如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機(jī)酸代謝紊亂(有機(jī)酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)；嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征)；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征)；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、II型糖尿病、內(nèi)分泌紊亂(例如甲狀腺紊亂)、癌癥、炎癥疾病、自體免疫紊亂、心血管疾病、I型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化，包括阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關(guān)代謝紊亂和肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)不同方面，提供了藤霉素在制備用于治療衰老相關(guān)疾病的藥物中的用途。優(yōu)選的是，所述衰老相關(guān)疾病選自包括包括以下疾病的組代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂(如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機(jī)酸代謝紊亂(有機(jī)酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)； 嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征)；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征)；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關(guān)代謝紊亂、肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述疾病選自阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述疾病選自少肌癥或惡病質(zhì)。向細(xì)胞中添加藤霉素導(dǎo)致CLS的提高和RLS的提高。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是，CLS和/或RLS中的這種提高涉及到與衰老關(guān)聯(lián)的疾病的治療。所述藥物包含本發(fā)明的治療有效量的一種或多種試劑，并且優(yōu)選還包含藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(包括它們的組合)。所述藥物可以在人類醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)中用于人類或動(dòng)物用途，并且一般包含任意一種或多種藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑在藥學(xué)領(lǐng)域是已知的，并且在例如Remington' s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co. (A.R.Gennaro編，198 中有描述。藥學(xué)載體、賦形劑或稀釋劑可以根據(jù)目標(biāo)施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐進(jìn)行選擇。所述藥物可以包括作為載體、賦形劑或稀釋劑的以下物質(zhì)或除了載體、賦形劑或稀釋劑之外還包括以下物質(zhì)任意適合的一種或多種粘合劑、一種或多種潤(rùn)滑劑、一種或多種懸浮劑、一種或多種涂層劑、一種或多種加溶劑。在所述藥物中可以提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料甚至是芳香劑。防腐劑的實(shí)例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸酯。還可使用抗氧化劑和懸浮劑。根據(jù)不同的遞送系統(tǒng)，可能有不同的組成/配制要求。舉例來說，本發(fā)明的所述藥物可以配制成使用微型泵或通過粘膜途徑例如作為噴鼻劑或吸入用氣霧劑或可吸收溶液施用，或者通過腸胃外施用，其中組合物以可注射形式配制通過例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下途徑遞送?？蛇x的是，制劑可以設(shè)計(jì)成通過若干種途徑施用。在所述試劑擬通過粘膜方式經(jīng)由胃腸道粘膜施用的情況下，該試劑在經(jīng)由胃腸道穿過的過程中應(yīng)該能夠保持穩(wěn)定；例如，該試劑應(yīng)該耐受蛋白酶降解，在酸性PH下穩(wěn)定并且耐受膽汁的去污作用。在合適的情況下，所述藥物可以通過吸入施用、以栓劑或陰道栓的形式施用、以洗劑、溶液、霜?jiǎng)?、軟膏或塵粉劑的形式局部施用、采用皮膚貼劑施用、以如下形式口服施用 含有諸如淀粉或乳糖之類的賦形劑的片劑的形式、或單獨(dú)的或與賦形劑混合的膠囊或藥胚 (ovule)的形式、含有芳香劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮劑的形式，或者它們可以腸胃外注射，例如通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用。對(duì)于腸胃外施用，所述組合物最好可以以無菌水溶液施用，所述水溶液可以含有其他物質(zhì)，如足夠的鹽或單糖以使該溶液與血液等滲。對(duì)于口腔或舌下施用，所述組合物可以以片劑或錠劑的形式施用，所述片劑或錠劑可以以常規(guī)方式配制。如果所述試劑是蛋白，則所述蛋白可以在受治對(duì)象中原位制得。在這一方面，可以通過使用非病毒技術(shù)(例如通過使用脂質(zhì)體)和/或病毒技術(shù)(例如通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)遞送編碼所述蛋白的的核苷酸序列，使得所述蛋白由所述核苷酸序列表達(dá)?！胺€(wěn)定的”制劑是其中的多肽或蛋白在保存時(shí)基本保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)活性的制劑。在現(xiàn)有技術(shù)中可以利用各種分析技術(shù)來測(cè)量蛋白穩(wěn)定性，這些技術(shù)可以參見肽和蛋白藥物遞送(Peptide and Protein Drug Delivery) (247-301, Vincent Lee 編，Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y. , Pubs. (1991))禾口 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(199；3)。穩(wěn)定性可以在選定的溫度下在選定的時(shí)間內(nèi)測(cè)得。對(duì)于快速篩查， 目標(biāo)制劑可以在40°C保存1周至1月，此時(shí)對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)量。凍干保存后凝聚程度可以用作肽和/或蛋白穩(wěn)定性的指標(biāo)。例如，“穩(wěn)定的”制劑是這樣的制劑其中有少于約10%， 優(yōu)選少于約5%的肽或蛋白以凝聚體存在于制劑中。可以確定凍干制劑在凍干保存后凝聚制劑的增加。例如，“穩(wěn)定的”凍干制劑可以是這樣的制劑其中當(dāng)凍干制劑在40°C溫育至少1周后，該凍干制劑中的凝聚體的增加小于約5%或小于約3%?？梢允褂蒙锘钚詼y(cè)定法例如本文所述的結(jié)合測(cè)定法測(cè)量融合蛋白制劑的穩(wěn)定性。根據(jù)又一方面，提供了用于提高細(xì)胞的復(fù)制壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的多核苷酸或基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽或與SEQ ID No :1、3 或5具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物，或與 SEQ ID No :1、3或5具有一個(gè)或若干個(gè)氨基酸增加、缺失或取代差異的多肽。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多核苷酸或基因包含如在SEQ ID No :4、6或7中所示的核苷酸序列，或由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID No:4、6或7具有至少70%、 80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的序列，或與SEQ ID No :4、6或7相比具有一個(gè)或若干個(gè)核苷酸增加、缺失或取代差異的序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞。更優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。最優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是人類干細(xì)胞。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明使用的術(shù)語“細(xì)胞”是指動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞，也指回體(ex Vivo)保持的細(xì)胞或細(xì)胞群，或者在適用的情況下可選的是，是指體內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞群。應(yīng)當(dāng)注意的是，SEQ ID NO :1和5 (TTFl)以及SEQ ID NO :3(Ydr026c)是相同蛋白的人類和酵母同系物。另外，SEQ ID N0:3(本發(fā)明)和小鼠同系物(Shiue，C-N等，(2009) Oncogene, 28,1833-1842)均已經(jīng)顯示出調(diào)控基因環(huán)形成。還應(yīng)當(dāng)理解的是，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 5是人類TTFl的剪接變體。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了提高細(xì)胞的世代壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的多核苷酸或基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽；或與SEQ ID No: 1、3或5具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物； 或與SEQ ID No :1、3或5相比具有一個(gè)或若干個(gè)氨基酸增加、缺失或取代差異的多肽。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多核苷酸或基因包含如在SEQ ID No :4、6或7中所示的核苷酸序列；或與SEQ ID No :4、6或7具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98% 或99%的同一性的序列；或由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性不同于SEQ ID No :4、6或7的序列； 或與SEQ ID No :4、6或7相比具有一個(gè)或若干個(gè)核苷酸增加、缺失或取代差異的序列。應(yīng)當(dāng)理解的是，所述同系物可以是異體同源肽或異源肽，即來自相同或不同物種的肽。在本發(fā)明的上下文中，同系物理解為包括與主題序列可以具有至少50^^60%、 70^^75^^80^^85%或90%的同一性的氨基酸序列，優(yōu)選包括與主題序列具有至少 95 %、97 %、98 %或99 %的同一性的氨基酸序列。通常，同系物應(yīng)包含與主題氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。盡管同源性還可以認(rèn)為是相似性(即氨基酸殘基具有相似的化學(xué)性質(zhì)/ 功能)，但是在本發(fā)明的情況下，優(yōu)選將同源性表示為序列同一性。同源性比較可以通過肉眼進(jìn)行，或者更常用的是借助于容易獲得的序列比較程序進(jìn)行。這些可以商購(gòu)獲得的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩條以上序列之間的同源性百分比(％)。同源性百分比可以在相鄰的序列上進(jìn)行計(jì)算，即一條序列與另一條序列比對(duì)，并且一條序列中的每個(gè)氨基酸直接與另一條序列的對(duì)應(yīng)氨基酸比較，一次比較一個(gè)殘基。這就是所謂的“無間隙”比對(duì)。通常，這種無間隙比對(duì)僅在數(shù)目相對(duì)較少的殘基上進(jìn)行。雖然這是一種非常簡(jiǎn)單和具有一致性的方法，但是該方法沒有考慮到，例如如果在相同的一對(duì)序列中，一個(gè)插入或缺失將導(dǎo)致隨后的氨基酸殘基沒有比對(duì)，因此可能導(dǎo)致在全局比對(duì)時(shí)同源性百分比顯著降低。因此，最大同源性百分比的計(jì)算首先需要把間隙罰分考慮在內(nèi)而形成最優(yōu)比對(duì)。 用于執(zhí)行這種比對(duì)的合適的計(jì)算機(jī)程序是Vector NTI (Invitrogen Corp.)。能夠執(zhí)行序列比較的軟件的實(shí)例包括但不限于BLAST包(參見Ausubel等，1999，分子生物學(xué)中的短程序(Short Protocols in Molecular Biology)，第 4 版第 18 章)、BLAST 2(例如參見 FEMS Microbiol Lett 1999174(2) :247-50 ；FEMS Microbiol Lett 1999177(1) :187-8 和 tatianaincbi. nlm. nih. rov)、FASTA (Altschul 等，1990，J. Mol. Biol. 403-410)以及 AlignX0至少有BLAST、BLAST 2和FASTA可以離線獲得并且可以在線檢索(參見Ausubel 等，1999，第7-58頁至第7-60頁)。應(yīng)當(dāng)理解的是，術(shù)語“破壞功能”是指破壞多核苷酸或基因的表達(dá)，或者破壞編碼多肽的活性。還應(yīng)當(dāng)理解的是，可以破壞轉(zhuǎn)錄起始至成熟蛋白的生成之間任意階段的基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，這包括通過控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來控制基因表達(dá)的后生 (epigenetic)手段以及通過控制基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和后翻譯手段。應(yīng)當(dāng)理解的是，在此使用的破壞基因表達(dá)是指通過本領(lǐng)域已知的任何手段防止或抑制功能性多肽的生成，并且破壞編碼多肽的活性是指破壞功能性多肽與其一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配偶體的相互作用使得所述多肽不執(zhí)行其功能。所述生成或功能可以部分或全部受阻。 在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選基因產(chǎn)物的生成或功能完全受阻，即，沒有活性基因產(chǎn)物。在一些情況中，基因產(chǎn)物的生成或功能可以被破壞使得僅保留野生型表達(dá)水平的約5%、約10%、 約 20%、約 30%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%或約 95%。在此使用的抑制功能性多肽的生成是指可以通過如下方式防止或抑制基因產(chǎn)物的生成(a)敲除所述基因；(b)通過例如使用iRNA或反義RNA使所述基因在后轉(zhuǎn)錄階段沉默(基因沉默)；(c)通過例如后生技術(shù)使所述基因在轉(zhuǎn)錄階段沉默；(d)通過導(dǎo)入至少一個(gè)點(diǎn)突變防止或改變基因產(chǎn)物的功能；(e)使基因產(chǎn)物在后翻譯階段失活。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過iRNA破壞基因或同系物的表達(dá)。優(yōu)選的是，在啟動(dòng)子的控制下使用編碼iRNA的質(zhì)粒/載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)清楚的是，該啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子和/或組織特異性啟動(dòng)子。在此使用的術(shù)語“ iRNA”是指RNA干擾(RNAi)。這是通過直接導(dǎo)入dsRNA誘導(dǎo)真核生物中的后轉(zhuǎn)錄基因沉默(PTGS)的方法(Fire A等，(1998))。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在轉(zhuǎn)錄/DNA水平上破壞基因的表達(dá)。優(yōu)選的是，所述破壞通過將至少一個(gè)核苷插入到基因中或者使基因至少缺失一個(gè)核苷來實(shí)現(xiàn)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，基因的破壞通過導(dǎo)入至少一個(gè)點(diǎn)突變來實(shí)現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解的是，在破壞多肽與其一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配偶體的相互作用的情況中，這種破壞可以采用任何合適的方法進(jìn)行，例如采用競(jìng)爭(zhēng)抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、混合抑制或無競(jìng)爭(zhēng)性抑制。根據(jù)本發(fā)明，提供了提高細(xì)胞的世代壽命和/或復(fù)制壽命的方法，所述方法包括使用藤霉素處理所述細(xì)胞。如上所述，所述細(xì)胞可以是植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。本發(fā)明還提供用于在治療衰老相關(guān)疾病中使用的藤霉素。優(yōu)選的是，所述疾病與細(xì)胞的世代壽命和/或復(fù)制壽命相關(guān)。優(yōu)選的是，所述疾病選自包括以下疾病的組代謝紊亂，例如，糖代謝紊亂(如糖原累積病)；氨基酸代謝紊亂(如苯丙酮尿癥、戊二酸血癥等)；有機(jī)酸代謝紊亂(有機(jī)酸尿癥，如尿黑酸尿癥)；脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂(如戊二酸血癥，II型)；嘌呤和嘧啶代謝紊亂(如萊施-尼漢綜合征)；線粒體功能紊亂(例如，卡恩斯-塞爾綜合征)；過氧化物酶體功能紊亂(例如澤爾韋格氏綜合征)、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關(guān)代謝紊亂肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述疾病選自阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述疾病選自少肌癥或惡病質(zhì)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，藤霉素(Π(-506)是ー種免疫抑制抗生素藥物，主要在器官移植后使用。據(jù)信藤霉素是通過抑制鈣調(diào)磷酸酶的活性來發(fā)揮作用的(Griffith， J. P.等，[1995]Cell，82(3) ,507-522)。阿爾茨海默氏癥不僅是一種衰老疾病，而且還是ー種通過破壞調(diào)控衰老途徑應(yīng)當(dāng)能夠逆轉(zhuǎn)的ー種疾病。例如，秀麗隱桿線蟲(C.eleagns)中的Daf2的突變能夠減緩秀麗隱桿線蟲模型中阿爾茨海默氏癥的進(jìn)程。這種突變破壞了 IGF-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并導(dǎo)致壽命的延長(zhǎng)。在小鼠中進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)提出了相同的假說。阿爾茨海默氏癥還與毒性蛋白聚集體的累積有關(guān)。諸如延長(zhǎng)世代壽命的Π(-506(藤霉素)之類的化合物可以減少這些聚集體的累積，因此可以用于治療阿爾茨海默氏癥和相關(guān)疾病，如癡呆癥和臨床抑郁癥。除非另有說明，否則所有在此使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同涵義。從業(yè)者具體可以查閱分子生物學(xué)通用程序(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel))中的技術(shù)定義和術(shù)語。氨基酸殘基的縮略詞是標(biāo)準(zhǔn)的3字母和/或單字母代碼，該代碼在本領(lǐng)域中用來表示20個(gè)常用L-氨基酸中的一個(gè)氨基酸。另外需要注意的是，在本說明書中使用的“ー個(gè)”、“ー種”以及“所述”除非另有明確而沒有疑義地說明表示的是ー個(gè)所指物，否則包括多個(gè)所指物。術(shù)語“或”除非語境另有明確表示，否則可以與術(shù)語“和/或”互換使用。另外，在此使用的“部分”和“片段”可以互換使用，表示多肽、核酸或其他分子結(jié)構(gòu)體的部分。本文使用的“多肽”和“蛋白，，可以互換使用，用于描述可能包含部分或全長(zhǎng)蛋白的蛋白分子。如本領(lǐng)域中已知的那梓，“蛋白”、“肽”、“多肽”和“寡肽”是氨基酸(通常為L(zhǎng)-氨基酸)鏈，其α-碳原子通過肽鍵連接，所述肽鍵通過ー個(gè)氨基酸的α-碳原子的羧基與另一個(gè)氨基酸的α-碳原子的氨基之間的縮合反應(yīng)形成。通常，形成蛋白的氨基酸按順序編號(hào)，從蛋白的氨基末端殘基開始向蛋白的羧基末端殘基方向増加。“核酸”是多核苷酸，例如脫氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。該術(shù)語用以包括單鏈核酸、雙鏈核酸以及由核苷或核苷類似物構(gòu)成的RNA和DNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語“質(zhì)粒/載體”是指核酸分子，該核酸分子可以用于將另 ー個(gè)核酸分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體允許插入到該載體中的DNA序列復(fù)制。所述載體可以包含啟動(dòng)子以增強(qiáng)核酸分子在至少ー些宿主細(xì)胞中表達(dá)。載體可以自動(dòng)(染色體外)復(fù)制，或者可以整合到宿主細(xì)胞染色體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體可以包括能夠生成衍生自被插入到該載體中的核酸序列的至少一部分的蛋白的表達(dá)載體。在此使用的“有效量”是指試劑的能夠在受治對(duì)象中產(chǎn)生期望效果的量。術(shù)語“治療有效量”表示藥物或藥學(xué)試劑的引發(fā)動(dòng)物或人類所追求的治療性響應(yīng)的量。包含有效量的實(shí)際劑量可以取決于施用途徑、受治對(duì)象的大小和健康狀況和所治療的疾病等。本文使用的術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”可以指適合用于人類或動(dòng)物受治對(duì)象的化合物和組合物，例如施用以治療目標(biāo)紊亂或疾病的藥學(xué)組合物。


下文將參考附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述，其中
圖1顯示由酵母中的YDR(^6C基因座生成的Ydr026c基因產(chǎn)物作為酵母中后生調(diào)控的的一部分直接參與基因上高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。圖2A顯示了在厭氧條件下在ydr026c耗竭(depleted)突變體中世代壽命的延長(zhǎng)，但是在fobl耗竭突變體的野生型中沒有延長(zhǎng)。圖2B作為經(jīng)標(biāo)校的生長(zhǎng)曲線顯示了相同的結(jié)果。圖3顯示了在通氣(頂圖)和脫氧(底圖)條件下野生型(BW741)、ydr026c Δ 和fobl Δ酵母株的世代壽命。圖4顯示了藤霉素對(duì)世代壽命的影響。圖5顯示了 Π(_506對(duì)秀麗隱桿線蟲的壽命的影響。圖6顯示了 Π(-506對(duì)人類纖維原細(xì)胞系MRC5中的細(xì)胞分裂速度的影響。圖7顯示了缺失obdl和sir2對(duì)細(xì)胞的世代壽命的影響。
實(shí)施例實(shí)例1圖1顯示了 YDR026C基因產(chǎn)物對(duì)基因高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，這形成了基因座的穩(wěn)定性的后生調(diào)控的一部分(以rDNA為例)。Ydr026c及其功能的喪失導(dǎo)致后生高級(jí)染色體結(jié)構(gòu)的喪失(通過染色體構(gòu)象捕獲測(cè)定法測(cè)量)(圖1B)。在野生型中觀測(cè)到的正常高級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失與后生失調(diào)和基因座穩(wěn)定性喪失有關(guān)。Fobl (Ydr026c的相互作用配偶體)的喪失導(dǎo)致高級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的提高。圖IA顯示了在酵母rDNA基因座的上游和下游帶有兩個(gè)YDR026C結(jié)合位點(diǎn)的酵母 rDNA基因座、在標(biāo)準(zhǔn)染色體構(gòu)象捕獲測(cè)定法中使用的Bfal限制位點(diǎn)的位置(豎線)和PCR 引物標(biāo)記Ter、25c、5. 8c、18c和Pro的位置(小箭頭)，還顯示由該基因座構(gòu)成的rRNA轉(zhuǎn)錄本(大箭頭(block arrow)) 圖IB顯示了染色體構(gòu)象捕獲測(cè)定法(3C)的測(cè)定結(jié)果。在野生型中，這顯示了使用野生型的引物對(duì)Ter-Pro經(jīng)33個(gè)循環(huán)后特異性產(chǎn)物的生成。在fobl缺失株中經(jīng)28個(gè)循環(huán)之后也看到相同的產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)注意的是，在ydr026C缺失株中即使經(jīng)過33個(gè)循環(huán)之后也沒有見到產(chǎn)物。這表明Ydr026c的喪失導(dǎo)致由酵母中的rDNA基因座進(jìn)行的野生型正常轉(zhuǎn)錄中所觀察到的特征性后生高級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失。還表明fobl的缺失(其與Ydr026c相互作用)導(dǎo)致高級(jí)結(jié)構(gòu)的高度穩(wěn)定性，使得它們?nèi)菀自?C測(cè)定的早期的PCR循環(huán)檢測(cè)到。實(shí)施例2讓細(xì)胞在含有2%葡萄糖的培養(yǎng)基中在沒有通氣(氧剝奪)的情況下生長(zhǎng)所示天數(shù)并以10倍稀釋液鋪板以監(jiān)測(cè)生存力。本實(shí)驗(yàn)表明，Ydr026c耗竭突變體具有延長(zhǎng)的壽命(與野生型或fobl耗竭突變體相比)。附圖顯示在厭氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天后，野生型和Afobl株不再具有生存力，而 ydr026c Δ株仍然顯示出生長(zhǎng)。實(shí)施例3在該實(shí)驗(yàn)中，在通氣或脫氧(AN)培養(yǎng)條件下，在含有3%葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所示天數(shù)后，將野生型、ydr026cA和foblA酵母細(xì)胞鋪板在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。從圖中可以看出，在通氣和厭氧兩種條件下，ydr026cA突變體顯示出分別為33天和20天的提高的世代壽命。實(shí)施例4從圖4中可以看出，Π(_506(藤霉素)延長(zhǎng)了釀酒酵母(S. cerevisiae)的世代壽命。以0. lng/ml向培養(yǎng)基中添加藤霉素對(duì)細(xì)胞的世代壽命沒有顯著的影響(與對(duì)照相比)，但是添加lng/ml以上具有顯著的影響，提高了酵母細(xì)胞的平均壽命(與對(duì)照相比)。 使用 Murakami，C.和 Kaeberlein，Μ. ((2009) J. Vis. Exp, 27)所述的生長(zhǎng)暈法(outgrowth method)測(cè)量壽命。簡(jiǎn)而言之，酵母的世代壽命表示為衰老酵母培養(yǎng)物隨時(shí)間的生存力曲線。為了對(duì)此進(jìn)行測(cè)量，使這種酵母培養(yǎng)物生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)基中知道葡萄糖碳源耗盡并且細(xì)胞停止分裂。此時(shí)，使用Bioscreen C機(jī)(0y Growth Curves Ab Ltd，芬蘭)通過觀察衰老培養(yǎng)物的新鮮接種物的生長(zhǎng)暈特征來測(cè)量存活細(xì)胞與能夠分裂的細(xì)胞的比例。比較各個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)的生存カ來確定培養(yǎng)物的世代壽命。實(shí)施例5從圖5可以看出，添加Π(-506以劑量依賴模式延長(zhǎng)了秀麗隱桿線蟲的壽命，添加4yg/ml導(dǎo)致生物體的生存力(世代壽命)的顯著提高。在同步產(chǎn)卵階段(timed egg laying stage)將 FK-506 添加到秀麗隱桿線蟲中，并按 Sutphin, G. L.和 Kaeberlein, M.， ((2009) J. Vis. Exp, 27.)所述的方法測(cè)量壽命。簡(jiǎn)而言之，該方法包括使蟲群同步并在一定范圍的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量活蟲的百分比，根據(jù)它們能夠響應(yīng)物理刺激的能力對(duì)活蟲進(jìn)行打分。實(shí)施例6圖6顯示，F(xiàn)K-506呈現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)MRC5人類纖維原細(xì)胞系中的細(xì)胞分裂速度的衰老依賴型降低。這表明Π(506提高了這些細(xì)胞的復(fù)制壽命。使用Fairweather，D. S.，M. Fox 和 G. P. Margison ((1987)，Exp Cell Res, 168(1)第 153-9 頁)的方法測(cè)量細(xì)胞分裂速度。 簡(jiǎn)而言之，通過將MRC5細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面上生長(zhǎng)直到達(dá)成匯合(此時(shí)它們以1 2的比例分裂，即以1稀釋為2、測(cè)量MRC5細(xì)胞的復(fù)制壽命。培養(yǎng)物分裂的次數(shù)等于細(xì)胞能夠經(jīng)歷的分裂次數(shù)，這就是培養(yǎng)物復(fù)制壽命。MCR5細(xì)胞僅能夠分裂有限的次數(shù)，并且隨著它們到達(dá)它們生命的末期，它們經(jīng)歷細(xì)胞分裂所需的時(shí)間增加。在這種情況中，細(xì)胞分裂的速度被當(dāng)作衰老指標(biāo)使用。可以看出，在39次分裂后添加Π(-506導(dǎo)致分裂時(shí)間的降低(與沒有添加Π _506 的對(duì)照相比)。在較高濃度，F(xiàn)K506對(duì)細(xì)胞具有毒性，因此限制了細(xì)胞復(fù)制能力。數(shù)據(jù)表明，Π(506在人類和秀麗隱桿線蟲中均能夠延遲衰老的開始。秀麗隱桿線蟲的衰老主要是肌肉和腸細(xì)胞的衰老。數(shù)據(jù)顯示Π(506延長(zhǎng)了秀麗隱桿線蟲的壽命，因此必然延遲了這些組織的衰老。這表明Π(506將延遲人類肌肉細(xì)胞衰老的影響，并且將可用于治療諸如少肌癥之類的疾病。這種疾病的發(fā)展是與臥床休息或化學(xué)療法(惡病質(zhì))關(guān)聯(lián)的肌肉喪失，這被機(jī)械地認(rèn)為是ー種非常類似的過程。數(shù)據(jù)還表明，Π(-506能夠延遲衰老的開始，因此可以用于提高受誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞和直接人造細(xì)胞(directly converted cell)的效率，這可以在干細(xì)胞治療中加以利用。
實(shí)施例7通過使YDR 026c基因座缺失提高分裂干細(xì)胞的復(fù)制壽命(RLQ。使用顯微操縱器(Singer Instruments)測(cè)量復(fù)制壽命。這包括物理解剖由在YPD瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖，2%酵母提取物，細(xì)菌用蛋白胨，2%瓊脂)生長(zhǎng)的單個(gè)母細(xì)胞的生命期產(chǎn)生的每個(gè)姐妹細(xì)胞。由10至50個(gè)母細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)求平均值以得到每株及其野生型親本的平均壽命。需要謹(jǐn)慎以確保由小的(因而是年輕的)母細(xì)胞生成初始處女型細(xì)胞[Kaeberlein， Μ.，Kirkland，K. Τ.，F(xiàn)ields, S. &Kennedy，B. K.，基因確定在長(zhǎng)存活遺傳背景中的酵母復(fù) Κ Ι壽命(Genes determining yeast replicative life span in a long—lived genetic background). Mech Ageing Dev 126，491-504 Q005)和 Kaeberlein，M.等。通過 TOR 和 Sch9 響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)而調(diào)控酵母復(fù)制壽命(Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9in response to nutrients). Science 310,1193-1196(2005)]。表權(quán)利要求
1.藤霉素在制造用于治療與細(xì)胞的世代壽命和/或復(fù)制壽命相關(guān)的疾病的藥物中的用途，所述疾病選自包括以下疾病的組代謝紊亂、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II 型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關(guān)代謝紊亂、肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥。
2.一種提高細(xì)胞的復(fù)制壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的多核苷酸或基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽或與SEQ ID No :1、3或5具有至少70%、80%、 90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞是人類干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述細(xì)胞是受誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
6.一種提高細(xì)胞的世代壽命的方法，所述方法包括破壞編碼以下多肽的多核苷酸或基因的功能包含SEQ ID No :1、3或5的多肽；或與SEQ ID No 1、3或5具有至少70%、80%、 90%、95%、97%、98%或99%的同一性的多肽或其同系物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因或同系物的功能通過iRNA 進(jìn)行破壞。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因的功能在轉(zhuǎn)錄/DNA水平上進(jìn)行破壞。
9.一種提高細(xì)胞的世代壽命和/或復(fù)制壽命的方法，所述方法包括使用藤霉素處理所述細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
12.—種組合物，所述組合物包含用于在治療衰老相關(guān)疾病中使用的藤霉素。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，所述組合物在其中所述疾病與細(xì)胞的世代壽命和 /或復(fù)制壽命相關(guān)的情況中使用。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，所述組合物在其中所述疾病選自包括以下疾病的組的情況中使用代謝紊亂、炎癥疾病、心血管疾病、I型糖尿病、II型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥、癡呆癥、臨床抑郁癥、脂肪紊亂，包括肥胖癥、脂肪相關(guān)代謝紊亂、肌肉萎縮癥、少肌癥、惡病質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥。
15.如權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及藤霉素在治療與細(xì)胞的世代壽命和/或復(fù)制壽命相關(guān)的疾病中的用途，本發(fā)明還涉及提高細(xì)胞的復(fù)制壽命的方法，所述方法包括破壞編碼包含SEQ ID No1、3或5的多肽的多核苷酸或基因的功能。
文檔編號(hào)A61K38/13GK102573841SQ201080031099
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者喬納森·艾林, 亞歷山大·阿庫(kù)利特切瓦, 伊麗莎白·簡(jiǎn)·梅勒, 邁克爾·尤德爾 申請(qǐng)人:克羅諾斯治療有限公司